CN114072521A - 用于等温dna扩增的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于扩增DNA模板的方法，包括在核糖核苷酸存在下用DNA依赖性RNA聚合酶培养DNA模板，和通过链置换DNA聚合酶扩增DNA模板。本发明还涉及RNA聚合酶用于在DNA模板上产生核糖核苷酸引物然后通过链置换DNA聚合酶扩增DNA模板的用途，以及部件试剂盒，包括RNA聚合酶和链置换DNA依赖性DNA聚合酶，以及部件试剂盒用于扩增DNA模板的用途。
Description
技术领域
本发明提供了用于在等温条件下复制或扩增天然或变性DNA模板的方法、组合物和试剂盒。更具体地，本发明涉及RNA聚.合酶在用于在不存在或减少外源添加的寡核苷酸引物之下扩增DNA模板的方法中的用途。
背景技术
存在几种用于扩增DNA分子的技术。这些技术包括聚合酶链反应(PCR)，这涉及在不同温度下的重复多轮反应，和几乎都会涉及链置换DNA聚合酶的等温反应。等温反应的实例包括滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)、环介导等温扩增(LAMP)(这涉及产生准环状DNA分子的特异性引物)、解旋酶依赖性扩增(HDA)和切口酶扩增反应(NEAR)(这涉及在用于启动复制的DNA分子中产生切口)。
DNA分子的复制需要游离羟基，作为DNA聚合酶添加脱氧核糖核苷酸的起点。通常，外源添加与模板DNA分子互补的短单链寡核苷酸或引物，以引发DNA分子通过DNA聚合酶的复制。所述单链引物可以包含特异性核苷酸序列以扩增特异性DNA模板，或包含一个或多个通用和/或简并核苷酸序列以半随机方式扩增DNA模板。所述通用核苷酸序列包括例如随机寡核糖核苷酸、随机六聚体和随机九聚体DNA引物。
作为替代方案，DNA复制可以由共价附连于蛋白质的脱氧核糖核苷单磷酸酯引发。所述蛋白质在自然界中被某些细菌或动物病毒用于宿主细胞中的基因组复制(Salas,1991.Annu.Rev.Biochem.60:39-71)，但目前缺乏其他用途的广泛应用。此外，称为引物酶-聚合酶(PrimPol)的一类单独的酶同时包含DNA聚合酶和DNA引物酶活性，并且既可以用于引物合成，又可以用于DNA分子复制。与常规引物酶不同，所述PrimPol会产生DNA引物(Lipps et al.,2003.EMBO J 22:2516–2525)。最近发现，由嗜热栖热菌(Thermusthermophiles)中分离的PrimPol与随机引发相比时在扩增来自单个细胞的全基因组方面提供了优异的结果(Picher et al.,2016.Nature Comm 7:13296)。
在现有技术中，DNA模板的体外复制，尤其是大DNA分子，如全基因组的体外复制，主要基于多重置换扩增(MDA)。MDA是一种等温扩增方法，采用寡核苷酸引物和链置换DNA聚合酶如Phi29 DNA聚合酶呈指数扩增模板DNA分子(Dean et al.,2001.Genome Res.11(6):1095–1099；Dean et al.,2002.Proc.Natl.Acad.Sci.99(8):5261–5266)。Phi29 DNA聚合酶结合了高持续合成能力(processivity)、链置换活性和3'-5'校对核酸外切酶活性，导致DNA片段>70kb的合成错误率非常低(Blanco et al.,1989.J Biol Chem 264:8935–8940；Garmendia et al.,1992.J Biol Chem 267:2594–2599；Esteban et al.,1993.J BiolChem 268:2719–26)。
尽管天然DNA通常以双螺旋结构存在，但特异性或简并随机寡核苷酸如六聚体引物的使用需要变性或单链DNA才能有效引发。通过加热或化学方法使DNA变性会导致链断裂，并且对初始模板DNA会产生其他有害损伤，这是非常不期望的，并且可能对下游分析有害。此外，使用随机引物通常会导致模板DNA的扩增有偏差，导致由于错误引发的测序错误和/或导致由随机寡核苷酸自引发所致的非特异性扩增(参见，例如，Hansen et al.,2010.Nucleic Acids Res 38:e131；van Gurp et al.,2013.PLoS ONE 8(12):e85583；Sabina and Leamon 2015.Methods Mol Biol.1347:15-41)。这些问题中的一些通过使用从嗜热栖热菌中分离的PrimPol而部分解决(Picher et al.,2016.Nature Comm 7:13296)，这种菌具有内在的引发酶活性，而无需外源添加寡核苷酸。然而，随机寡核苷酸和PrimPol都需要或倾向于使用单链或变性DNA作为模板以有效引发。变性可以通过升高温度或加入强碱性溶液，然后在复制前中和该溶液实现。所述额外变性步骤易于出现如模板DNA损坏或断裂的人工产物，并会增加污染的风险。因此，尤其是在高通量DNA复制方法中以及在DNA模板脆弱或稀缺的情况下，优选要避免额外的变性步骤。因此，仍然存在对于不需要寡核苷酸引物和/或使DNA模板分子变性的附加步骤的DNA复制方法的需要。
发明内容
本文提供了用于在寡核苷酸引物不存在或减量的情况下扩增模板或靶DNA的方法、组合物和试剂盒。靶DNA可以是环状分子，如质粒、粘粒或环状DNA锁式探针，或线性分子如基因组、一个或多个基因组片段或合成或酶促产生的核酸片段。模板DNA分子可以是单链或双链形式。
本发明提供了一种扩增模板DNA分子的方法，包括a)提供模板DNA分子；b)提供RNA聚合酶、DNA聚合酶以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合；c)将所述材料在合适的缓冲液中培养合适的时间以允许所述模板DNA分子的复制和扩增。
所述模板DNA分子、RNA聚合酶、DNA聚合酶和核苷酸优选在所述合适的缓冲液中在3℃、6℃或12℃范围内的恒定温度下培养合适的时间。
所述RNA聚合酶优选是单亚基RNA聚合酶家族的成员。优选的RNA聚合酶选自T7RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或其变体。
所述DNA聚合酶优选是具有链置换活性的DNA依赖性DNA聚合酶。优选的DNA聚合酶选自Phi29、Bst、Vent DNA聚合酶或其组合或变体。
在本发明的优选方法中，所述核糖核苷酸优选包括至少一种具有嘌呤核碱基的核糖核苷酸。
通过本发明的方法复制和扩增模板DNA分子还可以在至少一种与模板DNA分子互补的寡核苷酸引物、随机寡核苷酸引物的混合物或其组合的存在下进行。
在本发明的方法中，所述核苷酸或核糖核苷酸中的一种，优选地核苷酸或核糖核苷酸中的至少一种被修饰或标记，优选使用可检测的标记。
通过本发明的方法复制和扩增的扩增产物可以通过本领域已知的各种方法如通过DNA结合剂或DNA嵌入剂，或例如通过与模板DNA分子互补的生物素或荧光团标记探针如寡核苷酸或分子信标直接或间接检测。
本发明进一步提供了RNA聚合酶用于在DNA模板上提供引物和可选地在脱氧核糖核苷酸存在下通过链置换DNA聚合酶由引物扩增DNA模板的用途。所述引物的提供优选包括提供至少一种具有嘌呤核碱基的核糖核苷酸，更优选2或3个选自GTP、ATP和CTP的核糖核苷酸。
根据本发明的所述RNA聚合酶可以用于扩增线性或环状形式的单链或双链模板DNA分子，包括基因组DNA。根据本发明的RNA聚合酶的用途可以用于生物医学目的、治疗目的，包括但不限于基因治疗和疫苗，或用于法医或诊断目的，例如，微生物学或基因诊断、液相免疫分析测试和/或免疫组织化学，包括基因分型、DNA测序、病毒或细菌DNA检测或核酸突变检测。
本发明还提供了一种部件试剂盒，包括RNA聚合酶、链置换DNA聚合酶或其混合物，以及可选的包含合适缓冲液的部件。
所述部件试剂盒还可以包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或其混合物。
本发明还提供了根据本发明的部件试剂盒用于扩增模板DNA分子的用途。
附图说明
图1.RNA聚合酶引发DNA扩增。图1A.通过随机六聚体或不同RNA聚合酶的引发后环状质粒DNA的扩增产物。RNA聚合酶的引发在没有外源添加的寡核苷酸引物之下发生，并且似乎与其同源启动子序列无关。使用的模板：泳道1，无模板对照；泳道2，p53(无RNA聚合酶启动子)；泳道3：包含单个T7启动子的质粒p3；泳道4，包含两个反向的T7启动子的质粒pB327；泳道5，包含T3和T7启动子的质粒pBSK；泳道6，包含T7和SP6启动子的pGem-7质粒。图1B.限制性酶分析(BsaI)显示在存在或不存在嘌呤核糖核苷酸的情况下通过随机六聚体或不同RNA聚合酶引发后pB327质粒DNA的忠实扩增。泳道1，标记；泳道2，六聚体引物(H)；泳道3，六聚体引物和GTP/ATP；泳道4，T7 RNA聚合酶和GTP/ATP；泳道5，T3 RNA聚合酶和GTP/ATP；泳道6，SP6 RNA聚合酶和GTP/ATP；泳道7，不含GTP/ATP的T7 RNA聚合酶；泳道8，消化对照，250ng pB327模板。
图2.在存在不同核糖核苷酸的情况下通过RNA聚合酶的引发。图2A.RNA聚合酶的核糖核苷酸依赖性介导p53 DNA扩增的引发。泳道-，无核糖核苷酸；泳道G，0.5mM GTP；泳道A，0.5mM ATP；泳道U，0.5mM UTP；泳道C，0.5mM CTP；泳道Pu，0.25mM GTP和0.25mM ATP；泳道Py，0.25mM UTP和0.25mM CTP；泳道N，0.125mM的所有四种核糖核苷酸。图2B.质粒pB327在采用RNA聚合酶和降低核糖核苷酸浓度的条件下的DNA扩增。GTP和ATP的微摩尔浓度显示于每个泳道上方。(-)表示不含1mM GTP和ATP的模板对照。
图3.天然或变性pB327质粒DNA在RNA聚合酶存在的情况下以不同培养时间的扩增。泳道1-4中的反应含有10ng pB327天然非变性质粒DNA作为起始模板，泳道5-8含有在扩增前加热变性的10ng pB327。除了每个泳道上方指示的RNA聚合酶外，所有反应都包含50μM六聚体。
图4.单链环状M13mp18 DNA模板的扩增，然后通过XbaI消化。较低的带代表迁移约7kb的正确产品。泳道1，无引发对照；泳道2，50μM六聚体引物；泳道3，0.5U/μL T7RNA聚合酶；泳道4，0.5U/μL T3 RNA聚合酶；泳道5，0.5U/μL SP6 RNA聚合酶；泳道6，0.5U/μL T7RNA聚合酶和50μM六聚体引物；泳道7，0.5U/μL T3 RNA聚合酶和50μM六聚体引物；泳道8，0.5U/μL SP6 RNA聚合酶和50μM六聚体引物。
图5.基因组DNA的特异性扩增。图5A.1ng/μL HeLa基因组DNA模板的扩增。图5B.无模板的通过六聚体引物的非特异性扩增。泳道1，无引发对照；泳道2，50μM六聚体引物；泳道3，0.5U/μL T7 RNA聚合酶；泳道4，0.5U/μL T3 RNA聚合酶；泳道5，0.5U/μL SP6 RNA聚合酶；泳道6，0.5U/μL T7 RNA聚合酶和50μM六聚体引物；泳道7，0.5U/μL T3 RNA聚合酶和50μM六聚体引物；泳道8，0.5U/μL SP6 RNA聚合酶和50μM六聚体引物。
图6.RNA聚合酶增强和增加环状DNA模板六聚体引物扩增的产量。图6A.天然p53质粒DNA在RNA聚合酶(RNAP)存在下的增强扩增。泳道上方指示的是扩增时间，以小时为单位。图6B.(顶部和底部)DNA扩增的随时定量和RNA聚合酶的相对活性。图6C.在指定六聚体浓度(微摩尔)存在下的RNA聚合酶介导的变性p53质粒DNA的增强扩增。使用的模板是0.5ng/μL变性p53质粒DNA，其不包含T7、T3或SP6启动子序列。
图7.由不同商业供应商提供的RNA聚合酶和Phi29介导的DNA扩增。图7A.来自不同供应商的RNA聚合酶和phi29 DNA聚合酶。上图，来自Biolab Innovative ResearchTechnologies(供应商B)的Phi29；中图，来自New England Biolabs(供应商N)的Phi29；下图，来自Thermo Fisher(供应商T)的Phi29。泳道-是无引发对照，泳道H表示六聚体引发。使用从New England Biolabs(N)或Thermo Fisher(T)获得的T7、T3和SP6 RNA聚合酶，如每个泳道上方所示。每个反应中使用的模板是0.5ng/μL p53质粒DNA，其不包含T7、T3或SP6启动子序列。图7B.在存在不同缓冲系统下的扩增。
图8.如图所示，在所示的不同条件下扩增的DNA的转染效率和表达水平。上图显示人HEK293细胞的转染效率(表达GFP的细胞在总细胞群中的比例)和平均荧光强度(MFI)，下图显示小鼠B16F10细胞的结果。DNA扩增在不存在(分条的白条)或存在核糖核苷酸(分条的灰条)下由随机六聚体引发，或由T7 RNA聚合酶(黑色条)、T3 RNA聚合酶(灰条)或SP6 RNA聚合酶(白条)在核糖核苷酸存在下引发。
图9.注射质粒DNA或线性DNA的小鼠相对于对照小鼠的荧光素酶活性随时间的变化。所示的是每组4只小鼠的平均值和标准偏差。
图10.采用质粒DNA或线性DNA的疫苗接种。图10A.相对于对照，OVA表位特异性T细胞占总数或CD8阳性T细胞的百分比，这由质粒DNA或线性DNA诱导。图10B.接种疫苗后21天用B16-OVA肿瘤细胞挑战的疫苗接种小鼠的Kaplan-Meier图。
具体实施方式
4.1定义
如本文使用的，术语“模板DNA分子”或“DNA模板”是指待复制的DNA分子。所述DNA模板可以是任何DNA分子，包括单链或双链DNA分子、线性或环状DNA分子、小或大DNA分子，范围从小于10k碱基线性或环状质粒分子到大DNA分子如基因组DNA分子或BAC质粒。
如本文使用的，术语“合适的缓冲液”是指pH值几乎恒定的缓冲水溶液。用于复制反应的合适缓冲液包含二价金属盐，优选镁盐，如氯化镁、硫酸镁和/或乙酸镁。
如本文使用的，术语“RNA聚合酶”是指产生DNA模板化的RNA转录物的DNA依赖性RNA聚合酶。所述RNA聚合酶优选是包括许多噬菌体RNA聚合酶(T7、T3、K11、SP6、N4等)以及线粒体RNA聚合酶(McAllister and Raskin,1993.Mol Microbiol.10:1-6)的单个亚基RNA聚合酶家族的成员。优选的RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或其变体的组中。此类变体包括，例如，可以利用经典和非经典核糖核苷酸和脱氧核苷酸作为底物的突变T7 RNA聚合酶(Kostyuk et al.,1995.FEBS Lett.369:165-168；Sousa etal.,1995.EMBO J.14(18):4609-4621；Gudima et al.,1998.FEBS Lett.439:302-306；Padilla et al.,2002.Nucl.Acids Res.30(24):e138)，呈现出更高热稳定性的RNA聚合酶变体(Hi-T7TM RNAPolymerase,New England Biolabs；Boulain et al.,2013.Protein EngDes Sel.26(11):725-734)，或启动子特异性降低的突变RNA聚合酶(Ikeda et al.,1993.Biochemistry 32(35):9115-9124)。
如本文使用的，术语“DNA聚合酶”是指产生DNA模板化DNA分子的DNA依赖性DNA聚合酶。所述DNA聚合酶将脱氧核糖核苷酸添加到DNA链的3'-末端。
如本文使用的，术语“链置换DNA聚合酶”是指可以置换下游DNA链的DNA聚合酶。因此，所述酶可以在所述分子的复制期间对双链DNA分子解缠。所述聚合酶优选缺乏5'→3'外切核酸酶活性。合适的链置换DNA依赖性DNA聚合酶包括DNA聚合酶I的Klenow片段、称为Bst聚合酶的嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶的Klenow片段(New England Biolabs,Ipswich,MA)、BsmDNA聚合酶大片段(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)、BcaBEST DNA聚合酶(Takara Bio,Kusatsu,Japan)、热产硫化氢热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)(Tts)DNA聚合酶(US 5,744,312)、来自水生嗜热杆菌(Thermus Aquaticus)、黄栖热菌(Thermus flavus)或嗜热菌(Thermusthermophiles)的DNA聚合酶、称为SEQUENASE的T7 DNA-依赖性DNA聚合酶的变体(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)、T5 DNA依赖DNA聚合酶(Fujimura and Roop,1976.JBiol Chem 251:2168-2174)、aT4 DNA聚合酶全酶(Kaboord and Benkovic,1995.CurrBiol 5:149-157)、称为VENT聚合酶的来自极端耐热菌(Thermococcus litoralis)的DNA依赖性DNA聚合酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)、噬菌体M2 DNA聚合酶(Matsumoto etal.,1989.Gene 84:247)、噬菌体PRD1 DNA聚合酶(Jung et al.,1987.Proc Natl AcedSci USA 84:8287；Zhu and Ito,1994.Biochim Biophys Acta 1219:267-276)、Phi29 DNA聚合酶及其任何链置换DNA依赖性DNA聚合酶突变体，包括，例如，聚合酶与DNA结合蛋白的融合(de Vega et al.,2010.PNAS 107:16506-16511)。
如本文使用的，术语“核糖核苷酸”是指包含核糖基团、核碱基和至少一个磷酸酯基团的分子。所述核碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶及其任何修饰。核碱基腺嘌呤和鸟嘌呤统称为嘌呤，而胞嘧啶和尿嘧啶统称为嘧啶。术语核糖核苷酸包括核糖核苷酸类似物如荧光分子，例如，1,3-二氮杂-2-氧代吩噻嗪-核糖-5'-三磷酸酯(tCTP)，和/或其他类似物，如肌苷、黄苷、N4-羟基胞嘧啶、N4-甲氧基胞嘧啶和6H,8H-3,4-二氢嘧啶并[4,5-c][1,2]噁嗪-7-酮(Suzuki et al.,2005.Nucleic Acids Symp Series 49:97-98)。
如本文使用的，术语“脱氧核糖核苷酸”是指包含脱氧核糖基团、核碱基和至少一个磷酸酯基团的分子。所述核碱基包括天然存在的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷及其任何修饰。核碱基腺嘌呤和鸟嘌呤统称为嘌呤，而胞嘧啶和胸苷统称为嘧啶。术语脱氧核糖核苷酸包括所指的脱氧核糖核苷酸类似物如脱氧尿苷、脱氧肌苷和/或脱氧黄嘌呤核苷(deoxyxanthosine)。
如本文使用的，术语“核苷酸”是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其任何变体或修饰。应当理解的是，已经作出和描述的多种核苷酸修饰适用于本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语核苷酸涵盖这种化学、酶促或代谢修饰形式的核苷酸。
如本文使用的，术语“引物”是指可有效对模板DNA退火并引发所述模板DNA通过DNA聚合酶复制的寡核苷酸。所述寡核苷酸可以外源性添加到模板DNA中并且可以包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合或变体。或者，引物可以通过RNA聚合酶从DNA模板产生。所述引物可以由RNA聚合酶或其变体在一种或多种核苷酸存在下产生。所述核苷酸优选包含核糖核苷酸，优选1-3种选自GTP、ATP和CTP的物种，更优选包含至少一种嘌呤核碱基，如腺嘌呤或鸟嘌呤，或腺嘌呤和鸟嘌呤核碱基这两者。所述变体包括合成的寡核苷酸类似物如硫代磷酸酯、磷酸三酯、2-烷基化硫代磷酸酯和氨基磷酸酯类似物、核苷糖环的2'-位具有修饰的类似物，如2'-氟、O-甲基或甲氧基乙基肽核酸酸、桥接核酸和/或锁核酸分子。
如本文使用的，术语“挂锁探针(padlock probe)”是指末端与靶模板RNA或DNA分子上的相邻序列互补的寡核苷酸。挂锁探针与其靶标的杂交允许通过扎结进行环化。环化的挂锁探针随后可以用作扩增的模板DNA。
4.2本发明的方法
本发明是基于出乎意料的观察结果，即在没有共有T7启动子序列和外源添加的寡核苷酸引物的情况下，RNA聚合酶如T7 RNA聚合酶能够有效介导天然和变性DNA模板两者的引发，用于通过DNA聚合酶的后续扩增。随后发现，其他RNA聚合酶如SP6和T3 RNA聚合酶也能够分别在不存在共有SP6或T3启动子序列的情况下启动DNA扩增。此外，显示所述RNA聚合酶在单链DNA模板上启动引发。这些发现的不可预料性在于以下事实：如T7、T3和SP6 RNA聚合酶等的DNA依赖性RNA聚合酶的转录活性已被广泛描述为对它们各自的启动子序列具有高度特异性，并且在双链DNA启动子序列上仅发生所述RNA聚合酶的结合(Golomb et al.,1977.J Virol 21:743-752；Stump and Hall,1993.Nucleic Acids Res 21:5480-5484；Maslak and Martin,1993.Biochemistry 32:48581-422Li et al.,1996.Biochemistry35:3722-3727)。
根据本发明的方法由所述RNA聚合酶的引发取决于至少一种核糖核苷酸的存在。为了防止RNA转录物的延长聚合，该反应优选在至多3个核糖核苷酸存在下进行。所述至多3个核糖核苷酸优选包括至少一个嘌呤核糖核苷酸，如ATP或GTP，或其组合。优选的是，将CTP和/或UTP排除于反应混合物之外。
因此，本发明提供了一种扩增模板DNA分子的方法，包括a)提供模板DNA分子；b)提供RNA聚合酶、DNA聚合酶以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合；c)将所述材料在合适的缓冲液中培养合适的时间，以允许所述模板DNA分子的复制和扩增。并且，可选地，d)检测所述扩增产物。
所述RNA聚合酶可以是任何介导后续DNA聚合酶的延伸反应引发的RNA聚合酶。不受理论束缚，所述RNA聚合酶结合于模板DNA并结合可以用作DNA依赖性DNA聚合酶延伸的引物的单个RNA核苷酸。可替换地或另外，所述RNA聚合酶通过称为无效转录(abortivetranscription)的过程产生一小段RNA，其中RNA聚合酶与DNA分子结合并开始短mRNA转录物的合成。所述无效转录可能涉及DNA压缩(scrunching)(Revyakin et al.，2006.Science314：1139-1143)。所述短的无效mRNA转录物可以用作核糖核苷酸引物，并被DNA依赖性DNA聚合酶延长。
优选的RNA聚合酶是T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶。最优选的RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
所述链置换DNA依赖性DNA聚合酶优选是Phi29、Bst和/或Vent DNA聚合酶。Phi29聚合酶的最佳温度为约30℃。Bst聚合酶的最佳温度为60-65℃，而Vent聚合酶的最佳温度为约72℃。由于大多数天然RNA聚合酶在30-37℃下具有活性，因此与T3 RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶结合的首选酶是Phi29聚合酶。然而，本领域技术人员显而易见的是，更耐热的DNA依赖性RNA聚合酶可以在更高的培养温度下与Bst聚合酶或Vent聚合酶组合。
与Bst和/或Vent DNA聚合酶相比，Phi29 DNA聚合酶具有更高的持续合成能力和链置换能力。此外，Phi29 DNA聚合酶具有校对活性，可实现高度准确的复制(Garmendia etal.,1992.J.Biol.Chem.267,2594-2599)。因此，最优选的链置换DNA依赖性DNA聚合酶是Phi29聚合酶。然而，已知或将会知晓的其他链置换DNA依赖性DNA聚合酶也适用于本发明的方法。
本发明的方法进行合适的时间以扩增DNA模板。所述时间量优选为0.5-48小时，更优选1-24小时，更优选2-20小时，如至少5小时、至少8小时、至少12小时或至少16小时。
本发明的方法在合适的缓冲液中进行。所述缓冲液优选包含缓冲剂以将pH保持于几乎恒定的值。所述缓冲剂可以包括磷酸盐、硼酸盐、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、甘氨酸和/或[三(羟甲基)甲氨基]丙磺酸(TAPS)。聚合酶的优选反应pH为6-10，优选7-9，如7.2、7.5、7.8、8.0、8.1、8.5、8.6或8.8。
优选的缓冲剂是或包含Tris，优选10-100mM Tris。优选通过添加酸如乙酸盐和/或氯化氢将所述Tris设置于所需的pH值。
复制反应的合适缓冲液还包含二价金属离子，如Mg2+或Mn2+。二价金属离子可以以其盐的形式提供，如氯化镁、硫酸镁和/或乙酸镁。所述浓度优选为0.5-20mM，如1-10mM，优选约5-10mM。
所述缓冲液的其他组分可以包括钾离子如氯化钾，其他盐如硫酸铵，和/或甜菜碱、乙二醇、1,2-丙二醇和/或亚精胺，正如本领域已知增强某些DNA模板，如2％-10％DMSO或2％-10％甘油(Cheng et al.,1994.Proc Natl Acad Sci 91:5695-5699)。
优选地，反应缓冲液中包含额外的成分以稳定酶活性，包括明胶、白蛋白、还原剂如β-巯基乙醇、二硫代苏糖醇(DTT)和/或三(2-羧乙基)膦(TCEP)，以及温和去污剂如，例如，TWEEN 20或Triton-X 100。
在一个实施方式中，优选的缓冲液包含Tris-乙酸盐、乙酸镁和乙酸钾，更优选33mM Tris-乙酸盐，37℃下pH 7.9，10mM乙酸镁，66mM乙酸钾，0.1％(w/w)吐温20和1mMDTT。
在一个实施方式中，优选的缓冲液包含Tris-氯化物、氯化镁和硫酸铵，更优选50mM Tris-HCl(25℃下pH 7.5)、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4和4mM DTT。
本发明的方法还可以包括提供至少一种外源寡核苷酸作为引物，该寡核苷酸与模板DNA分子上的一段核苷酸、随机寡核苷酸的混合物或其组合互补。所述寡核苷酸或寡核苷酸的混合物优选是或包含一种或多种单链核酸分子，优选DNA分子、RNA分子，或其混合物或类似物。所述单链核酸分子优选包含6-100个碱基长度，如9-30个碱基。所述单链核酸分子可以作为模板DNA分子复制和扩增的额外起点。
通过本发明的方法产生的扩增产物可以通过例如凝胶电泳检测和可视化。凝胶电泳是基于其尺寸分离DNA分子的技术，因为所有DNA分子基本上都具有相同的电荷。电泳涉及使电流通过含有所关注分子的凝胶。基于其尺寸，分子将以不同的速度穿过凝胶，从而使它们彼此分离。
所述凝胶通常是琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯酰胺凝胶通常用于长达500-1000个碱基对(bp)的DNA小片段。琼脂糖凝胶可以用于100-20kbp的DNA片段，但采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)可以实现超过6Mb的分辨率。
作为替代，或另外，通过本发明的方法产生的扩增产物可以通过DNA结合剂或DNA嵌入剂或染料如溴化乙锭、结晶紫、Hoechst染色剂或DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、花青染料如SYBR绿或Eva绿进行检测和可视化。可替换地，通过本发明的方法产生的扩增产物可以通过使用缀合或荧光探针，例如通过生物素或荧光团连接的互补寡核苷酸或荧光标记的分子信标，和/或通过在修饰或连接的dNTP存在下扩增来检测。
合适的荧光团的实例包括，但不限于，Atto425(ATTO-TEC GmbH,Siegen,Germany)、Atto 647N(ATTO-TEC GmbH,Siegen,Germany)、YakimaYellow(EpochBiosciences Inc,Bothell,WA,USA)、Cal610(BioSearch Technologies,Petaluma,CA,USA)、Cal635(BioSearch Technologies,Petaluma,CA,USA)、FAM(Thermo FisherScientific Inc.,Waltham,MA USA)、TET(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MAUSA)、HEX(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA)、花青染料(如Cy5、Cy5.5、Cy3、Cy3.5、Cy7(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA))、Alexa染料(ThermoFisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA)、Tamra(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA)、ROX(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA)、JOE(ThermoFisher Scientific Inc.,Waltham,MA MA USA)、异硫氰酸荧光素(FITC,Thermo FisherScientific Inc.,Waltham,MA USA)和四甲基罗丹明(TRITC,Thermo Fisher ScientificInc.,Waltham,MA USA)。
如本领域中技术人员已知的，使用本领域已知的任何合适的方法可以检测所述荧光团。例如，通过用适当波长的光激发荧光团并检测发射的荧光可以检测荧光团。
根据本发明的方法用于扩增的模板DNA分子可以是任何线性或环状DNA分子，包括来自噬菌体、病毒、细菌(包括古细菌)、原生动物(如变形虫、蝶形动物和古虫界(Excavata))、藻物界(Chromista)(包括藻类)、硅藻、植物、真菌、动物(包括人类)的线粒体DNA和基因组DNA。所述基因组模板，优选全基因组模板的扩增可以用于生物医学和法医应用。基因组分析，如比较基因组杂交、多态位点基因分型和疾病基因突变检测，在基因组医学和法医学中是重要的。
许多生物医学和法医DNA分析技术需要纳克到微克量的基因组DNA。在进行基因组分析之前，通常必须对DNA样本进行扩增。本发明的方法可以用于基因组模板DNA分子的这种全基因组扩增。
作为替代，或另外，本发明的方法可以用于扩增环状模板DNA分子。所述环状DNA模板是例如重组DNA质粒、天然存在质粒、线粒体基因组或某些噬菌体和病毒的环状基因组。所述环状DNA模板也可以例如通过挂锁探针，通过基因合成，或通过重组DNA方法，包括酶促连接，例如酶连接，通过T4 DNA连接酶，或使用特殊DNA连接酶的无模板连接，如可以独立于模板的单链DNA序列分子内连接以生成单链DNA环的连接酶，如环连接酶(CircLigase)(Lucigen Corp.,Middleton,WI)人工产生。本领域技术人员应该理解，线性DNA模板产物也可以使用例如DNA重组酶、原端粒酶、分解酶或整合酶，通过自身连接或通过末端发夹环的连接而转化为环状模板。
扩增方法，本发明的扩增方法，理想地适用于产生用于RNA合成或体外转录的DNA模板，包括线性模板。例如，在根据本发明的DNA聚合酶和RNA聚合酶(不论是否匹配启动子位点)存在下可以扩增包含RNA聚合酶的启动子，例如，SP6、T3或T7启动子的环状DNA构建体。在消化扩增的产物的扩增反应期间可能存在限制性内切酶，从而产生适用于体外或体内转录的离散的线性化扩增产物。所述限制酶优选对扩增的产物具有选择性，但不限制模板DNA分子。例如，这种选择性由甲基化敏感性限制酶提供。例如，在Dam+(识别序列GATC中的甲基化A)大肠杆菌菌株中产生的模板DNA分子不能被MboI限制，而扩增的产物未被甲基化并可以被该酶限制。如本领域公知的，也可以使用与某些核酸内切酶(例如，XbaI、ClaI)的识别位点重叠的甲基化位点，对于更多的实例参见international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/dam-and-dcm-methylases-of-e-coli，或限制酶数据库REBASE(rebase.neb.com/rebase/rebms.html)。类似地，在Dcm+(CCAGG和CCTGG中的甲基化物C)大肠杆菌菌株中产生的模板DNA分子不能在甲基化位点被某些限制酶如StyD4I、ApaI或FseI限制，而扩增产物未甲基化，并可以被这些酶限制。
此外，扩增方法，本发明的扩增方法非常适合于产生线性病毒模板。例如，在DNA聚合酶和RNA聚合酶，例如T7聚合酶、核苷酸和核糖核苷酸存在下，可以扩增包含病毒基因组DNA拷贝的环状构建体。所述环状构建体在末端重复序列之间包含限制酶识别序列，优选Dam、Dcm或EcoKI甲基化酶敏感性限制酶识别序列。在扩增反应期间所述限制酶的存在将限制所述扩增产物，导致病毒基因组的线性扩增基因组DNA拷贝在两端都存在末端重复序列。
4.3本发明的用途
如上所述，RNA聚合酶如T7 RNA聚合酶可以介导模板DNA上的引发，用于随后由DNA依赖性DNA聚合酶进行的延伸反应。出乎意料的是，即使DNA模板不包含共有的T7启动子序列，也会发生这种现象。还发现其他DNA依赖性RNA聚合酶如SP6和T3RNA聚合酶，分别在没有共有SP6或T3启动子序列的情况下启动DNA模板的复制。
因此，本发明提供了RNA聚合酶用于在DNA模板上提供引物的用途。根据本发明的所述用途优选还包括在脱氧核糖核苷酸存在下，优选在所有四种脱氧核糖核苷酸存在下，通过链置换DNA依赖性DNA聚合酶从引物扩增所述DNA模板。
如上文所述，所述链置换DNA依赖性DNA聚合酶优选是Phi29、Bst和/或VentDNA聚合酶。
所述DNA模板可以是任何线性或环状DNA分子，包括质粒DNA、合成DNA、线粒体DNA和来自噬菌体、病毒、原核生物和真核生物包括人的基因组DNA。
所述DNA模板的扩增可以用于生物医学、诊断、法医或治疗目的或应用。基因组分析，如比较基因组杂交、多态位点基因分型、疾病基因突变检测和DNA测序，在生物医学研究、基因组医学、诊断学和法医学中是重要的。诊断用途还包括在DNA测序或通过合适的方法检测扩增产物之前，根据本发明的方法扩增来自病毒、细菌和其他微生物制剂的DNA模板。
可替换地，或另外，在根据本发明的RNA聚合酶用于DNA模板上提供引物的随时用途用于DNA测序中，包括确定所述模板DNA中核苷酸的精确排序的任何方法、技术或过程。
DNA的治疗应用，如基因疗法或DNA疫苗，依赖于基于DNA的疗法，包括表达载体、用于反义或外显子跳跃应用的寡核苷酸、DNA诱饵、DNA适配子和DNA酶。所述基于DNA的疗法的临床应用需要质量受控的高纯度DNA制剂。虽然相对较短的寡核苷酸可以化学合成至高纯度，但较长的DNA分子通常作为质粒从细菌发酵培养物中分离。所述质粒必须通过多个不同的加工步骤分离，包括广泛的纯化步骤以消除任何微量的细菌基因组DNA、RNA、蛋白质和内毒素。根据本发明的方法合成的无细胞DNA扩增为基于DNA的治疗剂的生产提供了简单、可扩展且便宜的替代方案。此外，本发明的方法可以是易于采用的，以允许将修饰的核苷酸引入基于DNA的疗法中，这可以增强它们的治疗效果。
可替换地，根据本发明的所述用途是用于液相免疫分析测试和/或免疫组织化学。由DNA依赖性RNA聚合酶引发和由链置换DNA依赖性RNA聚合酶进行的随后扩增可以在游离溶液中和在固定的靶标上进行(固相扩增)。免疫组织化学是可以为形态学观察和可溶性测定提供诊断和预后信息的方法。信号放大，利用DNA模板与杂交反应中的组分的缀合，然后用DNA依赖性RNA聚合酶引发，并随后用链置换DNA依赖性RNA聚合酶进行扩增，可以用于提高杂交反应的灵敏度和特异性。
靶模板与固体载体的连接可能是有利的，并且可以通过用于将所述靶模板连接到固体载体的聚合物而实现。适用于所述方法的此类固态底物可以包括核苷酸可以连接的任何固体材料。这包括如丙烯酰胺、纤维素、硝化纤维、玻璃、聚苯乙烯、聚乙烯醋酸乙烯酯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚环氧乙烷、玻璃、聚硅酸酯、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、碳氟、尼龙、硅酮橡胶、聚酐、聚乙醇酸、聚乳酸、聚原酸酯、聚富马酸丙酯、胶原蛋白、糖胺聚糖和聚氨基酸的材料。固态基材可以具有任何有用的形状，包括薄膜或膜、珠、瓶、盘、纤维、织造纤维、成型聚合物、颗粒和微粒。固态基材的优选形式是载玻片或微量滴定板，如标准96孔板。优选实施方式利用玻璃或塑料作为载体。
所述DNA模板优选是环状DNA模板，允许滚环扩增以提高免疫分析测试和/或免疫组织化学的灵敏度和特异性。由此产生的高信噪比使其适用于检测、量化和可视化临床样品中的低丰度蛋白质标记、病毒和细菌DNA，并且作为核酸杂交的芯片信号放大方法，例如，DNA和RNA微阵列分析。
此外，本文介绍的扩增技术可以应用于DNA纳米结构和DNA水凝胶的构建。
4.4部件试剂盒
本发明还提供了一种部件试剂盒，包括固定DNA依赖性RNA聚合酶的部件、固定链置换DNA依赖性DNA聚合酶的部件，或将所述酶组合成单一即用型溶液。每种聚合酶可以用本领域已知的以基本相同方式发挥功能的类似蛋白质取代。
所述部件试剂盒还可以包含合适的反应缓冲液、脱氧核苷酸和/或核糖核苷酸，其中至少一种是嘌呤核糖核苷酸。所述核糖核苷酸优选包含ATP、GTP或ATP和GTP两者。
所述试剂盒可选地还包括提供包含至少一种与模板DNA分子上的一段核苷酸互补的寡核苷酸、随机寡核苷酸的混合物或其组合的引物。
所述试剂盒优选还包括使用DNA依赖性RNA聚合酶和链置换DNA依赖性DNA聚合酶引发和随后扩增DNA模板的说明书。
本发明还提供了根据本发明的部件试剂盒用于扩增DNA模板的用途。所述DNA模板可以是任何线性或环状DNA分子，包括来自噬菌体、病毒、细菌(包括古细菌)、原生动物(如变形虫、蝶形动物和古虫界(Excavata))、藻物界(Chromista)(包括藻类和硅藻)、植物、真菌和动物(包括人类)的质粒DNA、线粒体DNA和基因组DNA。所述基因组模板，优选全基因组模板的扩增可以用于生物医学和法医应用，包括诊断应用。
参考以下实施例进一步描述本发明，这些实施例在此仅用于举例说明，不应该以任何方式解释为限制本发明。
5.实施例
实施例1
通用材料和方法。
试剂供应商：New England Biolabs(NEB；Ipswich,MA,USA)的T7 RNA聚合酶(M0251)、T3 RNA聚合酶(M0378)、SP6 RNA聚合酶(M0207)、Phi 29DNA聚合酶(M0269)、核糖核苷酸(N0450))、dNTP混合物(N0447)、XbaI(R0145，20U/μL)、BsaI-HFv2(R3733，20U/μL)、PvuI-HF(R3150，20U/μL)；Biolab Innovative Research Technologies(BLIRT；Gdańsk，Poland)的Phi29 DNA聚合酶(EN-20)；Thermo Fisher Scientific(TF，Bleiswijk，theNetherlands)的T7 RNA聚合酶(EP0111)、T3 RNA聚合酶(EP0101)、SP6 RNA聚合酶(EP0131)和Phi29 DNA聚合酶(EP0091)；与酶一起提供并在一些实施例中使用的市售原液缓冲液如下所示。包含两个3'硫代磷酸酯键的随机六聚体购自Integrated DNA Technologies(IDT，Coralville，OH，USA)。
DNA模板：使用Nucleobond或NucleoSpin柱(Macherey-Nagel，Düren，Germany)由大肠杆菌培养物纯化双链环状DNA质粒。质粒p3是5千碱基的CMV-GFP表达构建体，包含单个T7启动子共有序列(5'TAATACGACTCACTATAG 3')；pGEM-7Zf+(Promega Corporation，Madison，WI，USA，以下简称pGEM)是空的3kb标准克隆载体，含有反向的T7启动子共有序列和SP6启动子共有序列(5'ATTTAGGTGACACTATAG 3')；pBlueScript II SK+(Stratagene，LaJolla,CA,USA，以下简称pBSK)是广泛使用的3kb噬菌粒克隆载体，容纳反向的T7启动子和T3启动子共有序列(5'AATTAACCCTCACTAAAG 3')。质粒p53是3.7kb CMV-GFP哺乳动物表达载体，不含任何T7、T3或SP6启动子位点。通过在CMV-GFP表达盒的任一侧反向插入BsaI限制性位点和T7启动子共有序列，从p53构建质粒B327(3.8kb)。所有质粒包含用于线性化的单个独特的XbaI识别序列。HeLa基因组DNA(本文中称为gDNA)和来自M13mp18的单链环状DNA购自NEB(分别为目录N40065和N4040S)。
标准扩增条件：除非另有说明，标准扩增条件在含有20μL反应体积的0.5mL或0.2mL PCR管中进行，如下所示。在含有33mM Tris-乙酸盐(pH 7.9，37℃)、66mM乙酸钾、10mM乙酸镁、0.1％Tween-20和1mM DTT的1×Phi29缓冲液B或含有50mM Tris-HCl(pH 7.5，25℃)、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4和4mM DTT的1×Phi29缓冲液N中准备反应。反应混合物补充有1mM dNTPs(NEB，N0447)和0.25U/μL Phi29 DNA聚合酶(Biolab InnovativeResearch Technologies，EN-20)。在所有实验中，使用包含所有常见组分的预混物以最小化样品之间的差异。如所示的，在适当的情况下，将模板DNA、六聚体、核糖核苷酸和/或RNA聚合酶添加到预混物或单独的反应中。所有移液步骤在冰上进行。将反应混合物在30℃下培养16小时或指定的时间，然后在配备有用于0.5mL管的两个30孔α单位或用于0.2mL管的96孔T100热循环仪(Bio-Rad)的PTC-200Peltier Thermal Cycler DNA Engine(MJResearch)中在65℃下加热灭活10分钟。
DNA扩增产物的分析：在指定时间培养和热灭活后，将反应混合物在5mM EDTA(pH8.0)中稀释五倍，并在65℃温育30分钟以溶解焦磷酸镁和高分子量DNA，这由于过度的核苷酸转化和DNA扩增而经常形成凝胶状沉淀物。然后将溶解的反应产物在水中稀释一次，以达到2mM EDTA的最终浓度，并储存于-20℃下以用于进一步分析。
限制分析：为了验证扩增产物，用5个单位的XbaI或BsaI在CutSmart缓冲液(NewEngland Biolabs，50mM醋酸钾，20mM Tris-醋酸盐，10mM醋酸镁，100μg/mL BSA，pH 7.9，25℃)中消化3-5μL稀释的反应混合物。在37℃下培养1小时后，加入4μL 6×上样缓冲液(NEB；Ipswitch，MA，USA)并在琼脂糖凝胶上分析消化产物。
凝胶电泳：将样品加载于含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上，并在1×TAE缓冲液(40mM Tris、20mM乙酸、1mM EDTA)中进行电泳分析。对于DNA片段的参比和尺寸估计，使用1kb DNA阶梯(NEB，N3232)。扩增和/或限制性消化产物使用UV透射仪进行可视化，并在ProXima 10Phi成像平台上捕获。
实施例2
为了研究RNA聚合酶是否可以通过与其同源启动子序列结合而启动DNA扩增的特异性引发，在标准扩增反应中测试了表1所示的不同的质粒DNA模板，其内含0个、一个或两个不同RNA聚合酶的共有启动子序列。
标准扩增反应设置于1×Phi29缓冲液B中，其中包含0.25U/μL Phi29、1mM dNTP、0.5mM核糖核苷酸GTP/ATP、10ng模板DNA或水以及50μM六聚体(图1A左上部分)、0.5U/μL T7RNA聚合酶(右上部分)、0.5U/μL T3 RNA聚合酶(左下部分)或0.5U/μL SP6 RNA聚合酶(图1A的右下部分)中任意之一。在30℃下培养16小时后，在凝胶电泳分析之前，通过XbaI限制性内切酶消化将反应产物稀释和线性化。
出乎意料的是，尽管广泛描述了T7 RNA聚合酶对其同源启动子序列的高度特异性，但发现T7 RNA聚合酶可以有效引发DNA模板的DNA扩增，而没有这样的启动子序列(质粒p53，泳道2)。含有单个T7启动子序列(p3，泳道3)或含有两个反向T7启动子序列(pB327，泳道4)的质粒在T7 RNA聚合酶存在的情况下同等地良好扩增，表明引发不依赖T7启动子序列发生。还出乎意料的是T3-和SP6 RNA聚合酶(也已知对其各自的启动子序列具有严格特异性)可以有效引发所有使用的质粒DNA模板，而与其同源启动子序列的存在无关。
除了下面描述的其他实施例之外，该实验因此表明RNA聚合酶可以实现DNA的无引物扩增。鉴于该方法的简单性以及所用酶和反应组分的广泛可用性，本发明的DNA扩增方法可以证明是各种应用如用于研究、诊断和治疗目的的有价值工具。
表1.DNA模板
| 泳道号 | 质粒 | 尺寸(kb) | T7启动子 | T3启动子 | SP6启动子 |
| 1 | - | ||||
| 2 | P53 | 3.7 | - | - | - |
| 3 | P3 | 5 | 1 | ||
| 4 | pB327 | 3.8 | 2 | ||
| 5 | pBSK | 3 | 1 | 1 | |
| 6 | pGEM | 3 | 1 | 1 |
为了进一步分析和确证RNA聚合酶引发的启动是否与其启动子序列无关，质粒pB327(含有两个T7启动子)在随机六聚体、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶中任一种存在下，在不存在或存在嘌呤核糖核苷酸下，在标准扩增条件下扩增。每个反应包含以下组分：在1×Phi29反应缓冲液B中，1mM dNTP(NEB，N0447)和0.25U/μL Phi29(Blirt，EN20)。反应2和3(对应于图1B中的泳道编号)补充50μM随机六聚体，反应4和反应7分别添加0.5U/μL T7 RNA聚合酶，而反应5和6分别添加0.5U/μL T3 RNA聚合酶或0.5U/μL SP6 RNA聚合酶。反应2-5还补充核糖核苷酸GTP和ATP(各0.5mM)，并且最后，所有反应均提供10ngpB327模板DNA。反应在30℃下培养16小时，然后进行BsaI限制性分析和凝胶电泳。对于参照，将200ng非扩增模板DNA pB327包含于限制分析中，以验证获得的限制模式(图1B中的泳道8)。
如所示，六聚体和RNA聚合酶两者都能引发模板DNA扩增，尽管六聚体在引发天然质粒DNA方面似乎非常有效。尽管使用的模板DNA pB327仅包含T7 RNA聚合酶的两个启动子共有序列，但还发现T3和SP6RNA聚合酶可以有效引发pB327的DNA扩增。如果预计T7 RNA聚合酶会结合其同源启动子序列并从启动子位点引发DNA扩增，在T7启动子位点反向取向的情况下，预计出现指数扩增。然而明显的是T7 RNA聚合酶引发反应中扩增产物的强度不超过T3或SP6 RNA聚合酶反应中的强度(比较泳道4、5和6)，再次表明RNA聚合酶的引发不依赖其同源启动子序列发生。有趣的是，在无核糖核苷酸下，在与T7 RNA聚合酶的反应混合物中没有观察到扩增产物(比较泳道4和7)，这促使我们进一步研究对核糖核苷酸的依赖性。
实施例3
为了研究观察到的RNA聚合酶对DNA扩增的启动是否取决于特异性的核糖核苷酸或其浓度，建立了标准扩增反应，其中仅变化RNA聚合酶的类型或核糖核苷酸的类型(图2A)。每个反应在1×Phi29反应缓冲液B中含有1mM dNTP、10ng p53模板DNA和0.25U/μLPhi29(BLIRT EN20)。将T7-、T3-或SP6-RNA聚合酶以0.5U/mL添加到反应混合物中。如图2A所示，将核糖核苷酸添加到各个反应中。为了分析各结果，将0.5μL的每种反应产物在琼脂糖凝胶上运行。从图2A中可以看出，除非不存在核糖核苷酸，否则所有三种RNA聚合酶都能引发DNA扩增。感兴趣的是，UTP似乎对通过RNA聚合酶的引发是非常低效的，而使用GTP和/或ATP会产生最高产量。因此优选在本发明的方法中包括至少一种嘌呤核糖核苷酸。
通过将GTP和ATP的混合物从1mM滴定到4μM，确定用于通过RNA聚合酶的DNA扩增引发的嘌呤核糖核苷酸的最佳浓度(图2B)。每个反应包含在1×Phi29反应缓冲液B中的1mMdNTP、10ng pB327模板DNA、0.25U/μL Phi29(BLIRT、EN20)和0.5U/μL的T7-、T3-或SP6-RNA聚合酶中的一种。作为阴性对照，加入水代替核糖核苷酸。在GTP/ATP浓度低至15微摩尔的情况下，仍容易观察到DNA扩增，这表明核糖核苷酸是必不可少的，但与脱氧核苷酸相比，可以以非常低的浓度用于本发明的方法中。
通常，寡核苷酸或随机六聚体引物与双链DNA的结合需要额外的变性步骤，其中模板DNA通过加热或碱处理变性，以允许引物退火。这些步骤需要额外的设备和/或缓冲液，但更重要的是，这些附加的步骤会增加外源DNA污染的风险，并可能严重影响模板DNA的质量。为了确定RNA聚合酶的引发是否也需要模板DNA的变性，将pB327质粒与过量的随机六聚体混合并保留其天然双链形式，或在95℃下变性5分钟并缓慢冷却至允许六聚体引物向模板DNA退火。为了最小化由于模板DNA中的切口导致的可能自引发的混淆效应，pB327质粒首先用T5核酸外切酶处理。为此，将3μg pB327与30单位的T5核酸外切酶(NEB，M0363)在CutSmart缓冲液中37℃下培养2小时，并通过NucleoSpin柱(Macherey-Nagel，Düren，Germany)纯化。反应在标准条件下建立，每个反应中的最终浓度为0.5ng/μL模板DNA、50μM随机六聚体和0.5mM GTP/ATP。如图3中每个泳道上方所示，加入RNA聚合酶至0.5U/μL。将完全反应混合物的单独等分试样在30℃下培养，并在10分钟的指定时间点停止扩增反应。在65℃下加热灭活并在-20℃下储存直至进一步分析。在凝胶电泳分析之前，用XbaI消化反应产物。消化的反应产物以线性化pB327(3.8kb)的预期尺寸迁移，并且色带的强度随时间增加。根据图3可以推断，随机六聚体的有效扩增需要模板DNA的变性(比较泳道1和5)，而添加RNA聚合酶允许引发和扩增天然和变性的模板DNA。这表明在DNA扩增中使用RNA聚合酶避免了变性步骤的需要，从而使该过程真正等温。
实施例4
DNA依赖性RNA聚合酶(如T7-、T3和SP6 RNA聚合酶)的转录活性对其各自的启动子序列具有高度特异性，并且该结合区被识别为双链双链体(Golomb et al.，1977.J Virol21:743-752；Stump and Hall,1993.Nucleic Acids Res 21:5480–5484；Maslak andMartin,1993.Biochemistry 32:4281-4285；Li et al.,1996.Biochemistry 35:3722-3727)。本发明显示RNA聚合酶也可以起到引发DNA扩增的作用，并且这出乎意料地发生在不存在启动子序列的情况下。为了确立RNA聚合酶的引发是否也发生于单链DNA模板上，使用单链M13mp18噬菌体DNA作为模板以建立标准扩增反应。M13mp18(NEB，N4040)是7.2千碱基的环状单链DNA分子，包含单个独特的XbaI识别位点，其允许M13mp18在复制于双链分子后线性化。M13mp18序列(基因库登录号X02513)缺少任何T7-、T3或SP6-启动子序列。为了测试DNA扩增，使用1ng/μL单链M13mp18模板DNA和0.5mM GTP/ATP在1×Phi29缓冲液(NewEngland Biolabs)中建立标准反应条件。反应产物用XbaI消化并通过凝胶电泳分析。如图4所示，消化的反应产物以线性化M13mp18(7.2kb)的预期尺寸迁移，表明单链M13mp18模板被忠实复制并通过六聚体和RNA聚合酶引发都扩增成双链DNA。图4中上部的带对应于琼脂糖凝胶的孔，最有可能代表M13mp18模板的单链高分子量多联体(concatemer)。这个实施例说明了RNA聚合酶除了独立于其启动子序列发挥作用外还可以有效地引发单链DNA模板的复制和扩增。
实施例5
全基因组扩增(WGA)是扩增少量基因组DNA用于进一步处理、分析或测序的强大技术。大多数市售试剂盒采用基于PCR的方法(例如，
TakaraBio USA，Mountain View，CA；
WGA试剂盒，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)或使用多重置换扩增(MDA)，如GenomiPhiTM(GE Healthcare，Chicago，IL)和REPLI-g(Qiagen，Hilden，Germany)。这些试剂盒的共同特点是它们依赖于随机引物或半简并寡核苷酸的使用。这些方法的缺点之一是基因组DNA模板需要变性以使引物退火和引发扩增。在只有微量或古代DNA可用的情况下(例如在法医或考古学的情况下)，有价值的DNA样本的变性可能不利于下游分析。使用随机或半随机引物的另一个缺点是模板DNA的偏向扩增。这可能会导致信息丢失，由于错误引发所致的测序错误，或随机寡核苷酸自引发的非特异性扩增(参见，例如，Hansen et al.，2010.Nucleic Acids Res 38:e131；van Gurp et al.，2013.PLoSONE 8：e85583；Sabina and Leamon，2015.Methods Mol Biol 1347：15-41)。最近报道了一种使用从嗜热栖热菌HB27中分离的引物酶聚合酶(PrimPol)进行基因组扩增的新方法(Picher et al.，2016.Nature Comm 7:13296)，其具有内在引物酶活性，而无需外源添加寡核苷酸引物。然而，这种方法在扩增前仍需要对模板DNA进行变性，而且使用的酶并不是广泛可获得的。为了分析RNA聚合酶引发天然非变性基因组DNA扩增的能力，使用天然HeLa基因组DNA作为模板。在标准扩增条件下，在含有0.5mM GTP/ATP以及50μM随机六聚体、0.5U/μL所示的RNA聚合酶或50μM随机六聚体和0.5U/μL RNA聚合酶(图5A和5B)的组合的1×Phi29缓冲液(New England Biolabs)中扩增。1ng/μL天然HeLa基因组DNA(NEB，N4006)用作扩增模板，并使用和不使用模板建立相同反应(图5A和5B)。扩增后，在0.7％琼脂糖凝胶上分析1μL未消化的扩增产物。如图5A所示，除了泳道1中的无引物对照外，所有反应都导致扩增产物的主要DNA带迁移约50-70kb，这被视为Phi29介导的DNA聚合的最大产物长度。含有随机六聚体(泳道2、6-8)的样品显示出更高的强度，并且似乎含有更多的扩增DNA。然而，根据图5B中的无模板对照可以推断，在随机六聚体存在下扩增的大多数产物似乎是人工产物，最有可能是由随机六聚体的自引发和扩展造成。相反，在仅存在RNA聚合酶之下扩增的模板对照反应缺乏任何非特异性扩增产物(泳道3-5)。这强烈表明RNA聚合酶引发会导致天然基因组DNA的特异性扩增，使其成为现有WGA方法的优越替代方案。
实施例6
还研究了RNA聚合酶是否会改变随机六聚体引物DNA扩增的动力学，或是否可以提高产物产量。为此，在含有50μM六聚体、0.5mM GTP/ATP和10ng pB327质粒的1×Phi29缓冲液(Biolab Innovative Research Technologies)中进行标准扩增反应。反应预混物分成四部分，并补充有水(仅六聚体，左上图)或0.5U/μL所示的RNA聚合酶(图6A)。在所示的时间点停止反应，通过XbaI消化和凝胶电泳分析等量的扩增产物。为了量化动力学，使用ImageJ软件(Schneider et al.,2012.Nature Methods9:671-675)确定带强度，并在MicrosoftExcel中进行图形分析(图6B)。显然，加入RNA聚合酶显著提高了扩增反应的总产量，并且比单独使用六聚体更快地达到最大产量。最大产量取决于反应混合物中dNTP消耗或dNTP聚合期间形成的焦磷酸盐的抑制效应，并且对于T7和T3 RNA聚合酶，这种状态似乎在8-16小时内达到，而对于SP6 RNA聚合酶，则稍微早些。
市售等温DNA扩增试剂盒通常使用浓度非常高(50或甚至100μM)的随机六聚体引物，这代表了扩增产物的巨量摩尔过量。为了研究在RNA聚合酶存在下是否可以降低该浓度而不损失产量，在标准扩增反应中测试了固定量的T7 RNA聚合酶和可变量的随机六聚体。为了允许随机六聚体退火模板DNA，在本实验中使用了热变性p53质粒DNA作为模板。此外，该模板不包含任何T7 RNA聚合酶的共有启动子序列。在30℃下培养16小时后，在凝胶上分析反应产物。除非存在T7 RNA聚合酶，否则在没有随机六聚体时观察不到DNA扩增(图6C；该系列的第一泳道)。此外，在T7 RNA聚合酶存在下，最大产量似乎在20μM六聚体浓度下达到，而在没有RNA聚合酶之下，即使含有100μM的反应也没有达到最大扩增产量。这表明RNA聚合酶和核糖核苷酸的添加会强烈增强引物依赖性DNA扩增。
实施例7
为了证实本发明的方法也适用于来自其他供应商的类似酶并测试本发明方法的稳健性，使用了10ng的p53质粒DNA作为模板和来自三个不同供应商的Phi29DNA聚合酶建立标准反应条件。此外，还包括来自两个不同供应商的RNA聚合酶，并测试了所有可能的组合(图7A)。插图a中的反应包含来自Blirt的0.25U/μL Phi29聚合酶；插图b中的反应包含来自New England Biolabs的0.25U/μL Phi29聚合酶；而插图c中的反应包含来自ThermoFisher的0.25U/μL Phi29聚合酶。所有三种DNA聚合酶都与来自相应供应商的反应缓冲液组合使用。反应产物用XbaI消化并通过凝胶电泳分析。如图7A所示，所有六种测试的RNA聚合酶都能有效启动DNA扩增，与随机六聚体启动相当(比较每个插图中的泳道2和泳道3-8)。此外，来自三个不同供应商的Phi29 DNA聚合酶有效扩增了模板DNA(比较插图a-c)，表明本发明的方法适用于来自不同供应商的多种聚合酶。泳道之间扩增产物的不同强度表明来自相同或不同供应商的RNA聚合酶和DNA聚合酶的某些组合可能比其他组合效果更好。为了进一步测试该方法的稳健性，在组成显著不同的两种缓冲液中进行RNA聚合酶引发的DNA扩增；Phi29缓冲液N含有50mM Tris-HCl(pH 7.5，25℃)、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4和4mMDTT(在图7B中表示为“Tris-HCl缓冲液”)或Phi29缓冲液B含有33mM Tris-醋酸盐(pH 7.9，37℃)、66mM醋酸钾、10mM醋酸镁、0.1％Tween-20和1mM DTT(在图7B中表示为“Tris-醋酸盐缓冲液”)。所有其他反应组分保持相同：1mM dNTP、0.5ng/μL p53质粒DNA、0.25U/μL Phi29聚合酶(Blirt，EN20)、0.5mM GTP/ATP。通过添加50μM随机六聚体(泳道1和5)，或来自Thermo Fisher的0.5U/μL T7 RNA聚合酶(泳道2和6)，或来自Thermo Fisher的0.5U/μL T3RNA聚合酶(泳道3和7)，或来自Thermo Fisher的0.5U/μL SP6 RNA聚合酶(泳道4和8)引发反应，并在30℃下培养16小时以允许进行DNA扩增。反应产物用XbaI消化并通过凝胶电泳分析。如图7B所示，不同缓冲液系列之间的产量没有观察到显著差异。因此，所展示的实施例被认为是稳健的扩增方法，不依赖于任何特定的酶供应商或缓冲液组合物。
实施例8
DNA的治疗应用，如基因疗法或DNA疫苗，需要高纯度且经过序列验证的无污染物DNA制剂。因此，根据本发明的方法合成的无细胞DNA扩增可以为基于DNA的治疗剂的扩增和生产提供了简单且负担得起的替代方案。可替换地，优选当存在有限量的模板DNA时，本发明的方法可以用于DNA测序过程。通过在各种条件下扩增GFP表达载体并将消化的扩增产物转染到细胞中用于表达分析而测试功能性DNA的生产。扩增产物的DNA序列通过Sanger测序验证。
材料和方法
扩增：用于转染研究的DNA在标准反应条件下使用10ng p53作为模板DNA产生。通过添加50μM随机六聚体(含或不含0.5mM GTP/ATP(以排除核糖核苷酸在表达研究中的可能影响)或通过0.5mM GTP/ATP和0.5U/μL T7 RNA聚合酶、0.5U/μL T3 RNA聚合酶或0.5U/μLSP6 RNA聚合酶引发扩增。p53质粒的扩增产物在37℃下用PvuI(NEB，R3150)消化2小时。质粒p53在载体骨架中包含单个独特的PvuI识别位点，使得PvuI消化会产生包含驱动GFP表达的完整表达盒的线性化全长质粒。消化后，使用NucleoSpin Gel和PCR Clean-up(Macherey-Nagel，Düren，Germany)纯化线性DNA片段，在10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA中洗脱，并在NanoDrop分光光度计(ThermoFisher)上测量DNA浓度。
细胞培养和转染：人胚胎肾细胞(HEK293、ATCC CRL-1573)和小鼠黑色素瘤细胞(B16F10、ATCC CRL-6475)在标准组织培养条件下保持于补充5％热灭活胎牛血清(FBS，Sigma-Aldrich，F0804)和1％青霉素-链霉素混合物(Lonza，17-602E)的IMDM培养基(ThermoFisher-Gibco，21980-032)中。转染前一天，将每孔100μL IMDM培养基中的20*10E3HEK293或4*10E3 B16-F10细胞接种于96孔平底组织培养板中。第二天，根据制造商的说明书，使用Saint-DNA转染试剂(SD-2001-01，Synvolux Products，Leiden，Netherlands)进行三倍体转染。简而言之，将Saint-DNA校准到室温并涡旋30秒。对于每个孔，将50ngPvuI消化和纯化的RCA产物与1μL Saint-DNA在磷酸盐缓冲盐水(PBS，Lonza，17-516F)中室温下络合5分钟，总体积为10μL。将络合物(10μL)添加到每个孔中，并将细胞置于CO2培养箱中。48小时后，细胞用PBS冲洗一次，通过胰蛋白酶处理(ThermoFisher-Gibco)收集并用包含PBS和0.5％牛血清白蛋白(BSA，Biowest，P6154)的FACS缓冲液洗涤两次。在GuavaEasyCyte5HT(Merck-Millipore,Burlington,MA,USA)上分析GFP表达。使用GuavaSoft 3.3(Merck)进行数据分析。
DNA测序：为了验证扩增期间核苷酸引入的身份和保真度，使用Sanger测序对RCA产物进行测序。为此，在随机六聚体或RNA聚合酶存在下，在标准扩增条件下扩增质粒pB327。每个反应包含1×Phi29反应缓冲液N中的以下组分：1mM dNTP、0.5mM GTP/ATP、0.25U/μL Phi29(Blirt，EN20)和10ng pB327质粒DNA模板。引发由以下表2中所示的50μM随机六聚体、0.5U/μL T7 RNA聚合酶、0.5U/μL T3 RNA聚合酶或0.5U/μL SP6 RNA聚合酶中的任一种开启。反应在30℃下培养16小时，然后使用NucleoSpin Gel和PCR Clean-up柱(Macherey-Nagel，Düren，Germany)进行XbaI消化和纯化。DNA测序由Baseclear B.V.(Leiden，the Netherlands)在ABI 3730遗传分析仪((Fisher Scientific,Landsmeer,theNetherlands)上进行。
结果
为了比较转染效率和反应产物的表达，在随机六聚体或RNA聚合酶存在下，在标准条件下扩增p53模板DNA。p53质粒包含带有CMV启动子、绿色荧光蛋白(GFP)和β-珠蛋白poly-A信号的表达盒，允许通过流式细胞术监测单个细胞表达。
如图8左图所示，所有扩增产物在HEK293细胞(至多达90％)和B16F10细胞(至多达70％)中均被有效转染，而转染细胞数量没有明显差异。如通过每个细胞的GFP荧光水平评价的表达水平在转染的DNA产物之间也没有显示出任何显著差异。这表明：(1)在扩增反应中包含核糖核苷酸(如果有的话)不影响扩增产物的转录，和(2)根据本发明的方法通过RNA聚合酶引发DNA扩增会提供适于细胞中表达的纯的且功能性的DNA及其可能的治疗目的。
表2.DNA扩增的保真度
| 引发引物 | 序列文件名 | 同一性<sup>a</sup> | Phred计分Q15/Q20<sup>b</sup> |
| 六聚体 | V190491058 | 100％ | 525/522 |
| T7RNAP | V190491059 | 100％ | 522/519 |
| T3RNAP | V190491060 | 100％ | 530/528 |
| SP6RNAP | V190491061 | 100％ | 528/525 |
a同一性是指与原始模板DNA pB327相比的碱基序列相似性。bQ15值代表正确调用的碱基数，确定性为96.8％或更高。对于Q20值，可靠性为99％或更高。
测序结果(见表2)表明，RNA聚合酶的引发可以忠实复制和扩增模板DNA，其中扩增产物与原始模板DNA在DNA序列上具有100％同一性。这表明本发明的方法也可以用于DNA测序目的。
实施例9
对于基因治疗目的，持续表达和可重复性是成功的重要因素。为了研究和比较合成线性DNA的体内基因表达，在第0天和第41天向小鼠皮内注射等摩尔量的编码萤火虫荧光素酶的质粒DNA(pDNA，10微克)或线性DNA(lnDNA，5.4微克)，或作为对照的磷酸盐缓冲盐水(每组n＝4)。在指定的时间点用IVIS Spectrum体内成像系统(Perkin Elmer)测量荧光素酶活性。在注射了质粒DNA或线性DNA的小鼠中，荧光素酶活性是相当的，两者的起始速度为约2.0*107光子/秒(p/s)，并且一个月后下降至约1.0*106p/s(图9)。DNA的第二次注射导致质粒DNA和线性DNA的荧光素酶活性的相似水平和动力学，表明通过本发明的方法产生的合成线性DNA在体内具有活性，并且与质粒DNA相当。
实施例10
材料和方法
小鼠和肿瘤细胞系：C57BL/6(Jico)小鼠和B6 Albino小鼠(B6/Rj-Tyrc/c株)分别购自Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA)和Janvier Labs(Le Genest-Saint-Isle,France)。小鼠安置于符合FELASA的条件下，所有动物实验均由荷兰动物伦理委员会(DutchAnimal Ethical Committee)批准并根据其指导方针进行。B16-OVA是用卵清蛋白稳定转染的B16-F10黑色素瘤细胞系的衍生物，在加湿的CO2培养箱(37℃，5％CO2)中，在L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素(均来自ThermoFisher-Gibco)的存在下将其维持于由补充8％胎牛血清(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，the Netherlands)的IMDM(ThermoFisher-Gibco，Waltham，MA，USA)组成的培养基中。
用于体内研究的线性DNA生产。通过本发明的方法体外扩增了编码萤火虫萤光素酶的环状质粒DNA或侧接BsaI限制酶位点的B16-OVA表位。缺乏质粒骨架序列的表达盒通过用BsaI(NEB,Ipswich,MA,USA)消化从多联体扩增产物中获得，并在37℃的1小时和16℃的1小时的8个循环期间扎接到核酸酶抗性发夹寡核苷酸(IDT,Coralville,OH,USA)，以获得具有封闭末端的线性DNA(lnDNA)。然后在37℃下加入T5核酸外切酶(NEB,Ipswich,MA,USA)长达16小时以去除载体骨架和未扎接的产物。大肠杆菌细菌培养物产生的质粒DNA和线性DNA用Nucleobond Xtra maxi EF柱(Macherey-Nagel，Düren，Germany)纯化两次，并再悬浮于10％Tris-EDTA缓冲液中。
体内生物发光成像：在第0天和第41天，在B6白化小鼠的尾基部皮内注射等摩尔剂量的编码质粒DNA或线性DNA的荧光素酶。对照组接受相同体积的PBS。对于体内生物发光成像，小鼠皮下注射150mg/kg D-荧光素(Synchem；Cat.Nr.bc219)。15分钟后，小鼠通过吸入异氟醚麻醉，并使用IVIS Spectrum小动物成像仪(PerkinElmer)进行成像。在整个实验中使用固定大小的所关注区域在小鼠的尾基处量化使用开放式过滤器和自动采集时间的光信号。使用LivingImage软件(PerkinElmer)进行图像分析和发光定量。
小鼠疫苗接种、免疫反应和肿瘤攻击：在第0天，向雄性C57BL/6小鼠(3组，每组8只小鼠)皮内注射含有等摩尔量(4.3pmol)DNA分子的30μL 0.9％NaCl溶液。第一组接种10μg编码多种抗原并包括OVA特异性表位的环状质粒DNA(3.6kB)。第二组用5.4μg线性DNA(1.9kb)接种，从第一组中使用的相同但缺乏细菌骨架序列的质粒载体进行扩增，而第三组(对照组)不做任何处理。接种疫苗两周后，从所有小鼠中抽取血液，用红细胞裂解缓冲液处理并用在荷兰莱顿(Leiden,the Netherlands)的LUMC四聚体设施生产的PE-缀合H2-Kb/SIINFEKL四聚体染色，以检测OVA特异性CD8 T细胞。样品在BD LSRII(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)和FlowJo软件(FlowJo LLC)上通过流式细胞术进行分析。分析的数据在GraphPad Prism软件(San Diego,CA,USA)中绘制成图。接种疫苗后第21天，小鼠皮下注射50,000个B16-OVA细胞。每3-4天监测肿瘤生长，并将肿瘤尺寸计算为(长×宽×宽)/2。携带超过1000mm3的肿瘤或溃疡出血的小鼠通过CO2窒息实施安乐死。
结果
本发明的方法特别适用于纯DNA的快速而廉价的生产，例如，用于生产个性化癌症疫苗。为了研究合成线性DNA是否会诱导T细胞活化和肿瘤保护，6-8周龄的幼C57BL/6小鼠接受了含有等摩尔量的质粒DNA(pDNA，10微克)或编码OVA表位的线性DNA(lnDNA，5.4微克)的单次皮内接种。对照组的小鼠未经治疗(每组n＝8)。在接种疫苗后第14天对外周血进行四聚体染色和流式细胞术以检测OVA特异性T细胞的诱导作用。如图10A所示，用质粒DNA或线性DNA接种导致了对疫苗内编码的OVA表位特异性的显著和相当的T细胞诱导。接着，在接种疫苗后21天用B16-OVA肿瘤细胞(50.000个细胞/小鼠)挑战相同小鼠，并跟踪肿瘤生长。图10B表明所有未经治疗的小鼠(只有一只例外)在1个月内因肿瘤生长而死亡。相反，用质粒DNA(10μg)或线性DNA(5.4μg)接种疫苗几乎可以完全防止肿瘤生长。存活的小鼠在实验的剩余时间内保持无肿瘤(超过100天)。
Claims (15)
1.一种用于扩增模板DNA分子的方法，包括
a)提供模板DNA分子；
b)提供RNA聚合酶、DNA聚合酶以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合；
c)将所述材料在合适的缓冲液中培养合适的时间以允许所述模板DNA分子的复制和扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RNA聚合酶是单亚基RNA聚合酶，优选选自T7RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或它们的变体的组。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中，所述DNA聚合酶是具有链置换活性的DNA依赖性DNA聚合酶，优选选自Phi29、Bst、Vent DNA聚合酶或它们的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述核糖核苷酸包括至少一种具有嘌呤核碱基，如腺嘌呤或鸟嘌呤或它们的组合的核糖核苷酸。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，复制和扩增还包括提供至少一种与所述模板DNA分子互补的寡核苷酸、随机寡核苷酸的混合物或它们的组合。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，核苷酸或核糖核苷酸中的至少一种是修饰或标记的，优选使用可检测标记。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，通过荧光和/或通过化学手段，例如通过生物素标记的探针或荧光团标记的探针，和/或通过在荧光团缀合的dNTP存在下的扩增检测扩增产物。
8.根据RNA聚合酶用于在DNA模板上提供引物和可选地在脱氧核糖核苷酸存在下通过链置换DNA聚合酶由所述引物扩增所述DNA模板的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述引物的提供优选包括提供至少一种具有嘌呤核碱基的核糖核苷酸，更优选2或3种选自GTP、ATP和CTP的核糖核苷酸。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的用途，用于扩增线性或环状形式的单链或双链DNA分子，包括基因组DNA。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的用途，用于出于治疗目的扩增DNA，包括但不限于基因治疗和疫苗。
12.根据权利要求8-10中任一项所述的用途，用于法医或诊断目的，例如基因分型、DNA测序、病毒或细菌DNA检测或核酸突变检测。
13.部件试剂盒，包括RNA聚合酶、链置换DNA聚合酶或它们的混合物，并且可选地包括容纳合适的缓冲液的部件。
14.根据权利要求13所述的部件试剂盒，还包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和/或它们的混合物。
15.根据权利要求13或权利要求14的部件试剂盒用于扩增模板DNA分子的用途。
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