JP2022530476A - 等温ｄｎａ増幅のための方法及び組成物 - Google Patents
等温ｄｎａ増幅のための方法及び組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022530476A JP2022530476A JP2021563380A JP2021563380A JP2022530476A JP 2022530476 A JP2022530476 A JP 2022530476A JP 2021563380 A JP2021563380 A JP 2021563380A JP 2021563380 A JP2021563380 A JP 2021563380A JP 2022530476 A JP2022530476 A JP 2022530476A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- rna polymerase
- amplification
- template
- polymerase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 90
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 18
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 title description 38
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims abstract description 128
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims abstract description 127
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 124
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 124
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 66
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims abstract description 66
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 64
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 286
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 50
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 41
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 35
- 108010065868 RNA polymerase SP6 Proteins 0.000 claims description 31
- 108010028263 bacteriophage T3 RNA polymerase Proteins 0.000 claims description 31
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 28
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- -1 purine nucleic acid Chemical class 0.000 claims description 11
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims description 9
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 8
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 7
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 4
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims description 4
- 125000004219 purine nucleobase group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 68
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 63
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 50
- 239000000047 product Substances 0.000 description 43
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 42
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 10
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 10
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 10
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 7
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 7
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 7
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101100078869 Arabidopsis thaliana MUTE gene Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108010092681 DNA Primase Proteins 0.000 description 4
- 102000016559 DNA Primase Human genes 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 4
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 4
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 230000001696 purinergic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000274177 Juniperus sabina Species 0.000 description 3
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 101100273253 Rhizopus niveus RNAP gene Proteins 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 3
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011718 B6 albino mouse Methods 0.000 description 2
- 241000206761 Bacillariophyta Species 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 2
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 2
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 2
- 235000008001 rakum palm Nutrition 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-4-amino-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s,3s)-2-[[(2s)-2-azaniumyl-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-carboxylatobutanoyl]amino]-6-azaniumy Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JVJGCCBAOOWGEO-RUTPOYCXSA-N 0.000 description 1
- XAEIGPYNMXSHAA-UHFFFAOYSA-N 1-[[1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl]amino]propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCC(S(O)(=O)=O)NC(CO)(CO)CO XAEIGPYNMXSHAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QHQZEEGNGSZBOL-UHFFFAOYSA-N 2-(aminomethyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(CO)(CO)CO QHQZEEGNGSZBOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KLLLJCACIRKBDT-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1H-indole Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C=C1C1=CC=CC=C1 KLLLJCACIRKBDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YCTVGBGOFTUCNT-UHFFFAOYSA-N 6-(methoxyamino)-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CONC1=CC=NC(=O)N1 YCTVGBGOFTUCNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNDDWSAHNYBXKY-UHFFFAOYSA-N ATTO 425-2 Chemical compound CC1CC(C)(C)N(CCCC(O)=O)C2=C1C=C1C=C(C(=O)OCC)C(=O)OC1=C2 WNDDWSAHNYBXKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 101100377299 Arabidopsis thaliana ZHD13 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010003497 Asphyxia Diseases 0.000 description 1
- 241000322342 Bacillus phage M2 Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 108091028732 Concatemer Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 108091027757 Deoxyribozyme Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 101000658547 Escherichia coli (strain K12) Type I restriction enzyme EcoKI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 1
- 102100036263 Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 101001001786 Homo sapiens Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit C, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N L-xanthosine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000735235 Ligustrum vulgare Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101500006448 Mycobacterium bovis (strain ATCC BAA-935 / AF2122/97) Endonuclease PI-MboI Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920002845 Poly(methacrylic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical class CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000508269 Psidium Species 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000701518 Salmonella virus PRD1 Species 0.000 description 1
- 241001479493 Sousa Species 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 101150111242 TPT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150070010 Tctp gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 241000193447 Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus Species 0.000 description 1
- 241000205180 Thermococcus litoralis Species 0.000 description 1
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000034953 Twin anemia-polycythemia sequence Diseases 0.000 description 1
- 206010061577 Ulcer haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N Xanthosine Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J dimagnesium;phosphonato phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N fluoromethane Chemical compound FC NBVXSUQYWXRMNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011503 in vivo imaging Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 108091064355 mitochondrial RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 150000004712 monophosphates Chemical class 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000002745 poly(ortho ester) Substances 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001299 polypropylene fumarate Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001414 potassium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000007921 solubility assay Methods 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N xanthosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07006—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/101—Temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本発明は、DNA鋳型を増幅するための方法であって、リボヌクレオチドの存在下でDNA鋳型をDNA依存性RNAポリメラーゼとインキュベートする工程、及び鎖置換DNAポリメラーゼによりDNA鋳型を増幅する工程を含む方法に関する。本発明は、DNA鋳型上でリボヌクレオチドプライマーを生成し、続いて鎖置換DNAポリメラーゼによりDNA鋳型を増幅するためのRNAポリメラーゼの使用、RNAポリメラーゼ及び鎖置換DNA依存性DNAポリメラーゼを含むパーツのキット、並びにDNA鋳型の増幅のためのパーツのキットの使用に更に関する。
Description
分野:
本発明は、等温条件下で天然又は変性DNA鋳型を複製する又は増幅するための方法、組成物、及びキットを提供する。より具体的には、本発明は、還元型の外部添加されるオリゴヌクレオチドプライマーなしで又はこれを用いてDNA鋳型を増幅するための方法におけるRNAポリメラーゼの使用に向けられている。
本発明は、等温条件下で天然又は変性DNA鋳型を複製する又は増幅するための方法、組成物、及びキットを提供する。より具体的には、本発明は、還元型の外部添加されるオリゴヌクレオチドプライマーなしで又はこれを用いてDNA鋳型を増幅するための方法におけるRNAポリメラーゼの使用に向けられている。
1 序論
DNA分子の増幅にはいくつかの技法が存在する。これらの技法には、異なる温度での反復回の反応を含むポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、及びほとんど全てが鎖置換DNAポリメラーゼを含む等温反応が含まれる。等温反応の例には、ローリングサークル増幅(RCA)、多置換増幅(MDA)、疑似環状DNA分子を生成する特異的プライマーを含むループ介在等温増幅(LAMP)、ヘリカーゼ依存増幅(HDA)、及び複製をプライミングするのに使用されるDNA分子中のニックの生成を含むニッキング酵素増幅反応(NEAR)が含まれる。
DNA分子の増幅にはいくつかの技法が存在する。これらの技法には、異なる温度での反復回の反応を含むポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、及びほとんど全てが鎖置換DNAポリメラーゼを含む等温反応が含まれる。等温反応の例には、ローリングサークル増幅(RCA)、多置換増幅(MDA)、疑似環状DNA分子を生成する特異的プライマーを含むループ介在等温増幅(LAMP)、ヘリカーゼ依存増幅(HDA)、及び複製をプライミングするのに使用されるDNA分子中のニックの生成を含むニッキング酵素増幅反応(NEAR)が含まれる。
DNA分子の複製は、DNAポリメラーゼによるデオキシリボヌクレオチドの付加のための開始点としての役目を果たす遊離のヒドロキシル基を必要とする。典型的には、鋳型DNA分子に相補的である短い一本鎖オリゴヌクレオチド又はプライマーは、DNAポリメラーゼによるDNA分子の複製をプライミングするために外部添加される。前記一本鎖プライマーは、特定のDNA鋳型を増幅するために特定のヌクレオチド配列を含む、又はDNA鋳型を半ランダムに増幅するために1つ又は複数の一般的及び/又は縮重ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。前記一般的ヌクレオチド配列は、例えば、ランダムオリゴリボヌクレオチドであるランダムヘキサマー及びランダムノナマーのDNAプライマーを含む。
代替的に、DNA複製は、タンパク質に共有結合しているデオキシリボヌクレオシド一リン酸によって開始されうる。前記タンパク質は、自然の中では宿主細胞においてゲノム複製のためにある特定の細菌ウイルス又は動物ウイルスにより使用される(Salas、1991. Annu. Rev. Biochem. 60: 39～71頁)が、現在他の用途への広範な適用に欠ける。更に、プライマーゼポリメラーゼ(PrimPol)と呼ばれる別クラスの酵素は、DNAポリメラーゼ活性とDNAプライマーゼ活性の両方を含み、プライマー合成にもDNA分子の複製にも使用しうる。前記PrimPolは、従来のプライマーゼと違って、DNAプライマーを生成する(Lippsら、2003. EMBO J 22: 2516～2525頁)。サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophiles)から単離されたPrimPolは、ランダムプライミングと比べた場合、単細胞からの全ゲノムの増幅において良好な結果をもたらすことが最近見出された(Picherら、2016. Nature Comm 7: 13296頁)。
最近の最先端では、DNA鋳型、特に全ゲノム等の大きなDNA分子のインビトロ複製は大部分が多置換増幅(MDA)に基づいている。MDAは、オリゴヌクレオチドプライマー及びPhi29 DNAポリメラーゼ等の鎖置換DNAポリメラーゼを用いて鋳型DNA分子を指数関数的に増幅させる等温増幅法である(Deanら、2001. Genome Res. 11(6): 1095～1099頁; Deanら、2002. Proc. Nath Acad. Sci. 99(8): 5261～5266頁)。Phi29 DNAポリメラーゼは、高度な処理能力、鎖置換活性、及び3'→5'プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を組み合わせて、非常に低いエラー率で>70kbのDNA断片を合成する(Blancoら、1989. J Biol Chem 264: 8935～8940頁; Garmendiaら、1992. J Biol Chem 267: 2594～2599頁; Estebanら、1993. J Biol Chem 268: 2719～26頁)。
天然のDNAは一般に二重ヘリックス構造体として存在するが、ヘキサマープライマー等の特定の又は縮重ランダムオリゴヌクレオチドの使用は、効率的なプライミングのためには変性又は一本鎖DNAを必要とする。熱又は化学的方法によるDNAの変性は、最初の鋳型DNAへの鎖切断及び他の有害な損傷をもたらすことがあり、これは非常に好ましくなく、ことによると下流分析にとって有害である。更に、ランダムプライマーの使用は、鋳型DNAの偏った増幅を、ミスプライミングによるシーケンシングエラーを、及び/又はランダムオリゴヌクレオチドの自己プライミングによる非特異的増幅をもたらすことが多い(例えば、Hansenら、2010. Nucleic Acids Res 38: el31; van Gurpら、2013. PLoS ONE 8(12): e85583; Sabina及びLeamon 2015. Methods Mol Biol. 1347:15～41頁を参照)。これらの問題の一部はサーマス・サーモフィルスから単離したPrimPolの使用により一部解決され(Picherら、2016. Nature Comm 7: 13296頁)、PrimPolは、外部添加されるオリゴヌクレオチドを必要とせずとも内在性のプライマーゼ活性を有する。しかし、ランダムオリゴヌクレオチドもPrimPolも、効率的なプライミングのためには一本鎖又は変性DNAを鋳型として必要とする又は好む。変性は、温度を上げることにより又は高アルカリ性溶液を添加し、続いて複製に先立って溶液を中和することにより達成できる。前記追加の変性工程は、鋳型DNAの損傷又は切断等の人為的な結果になり汚染のリスクを増やす傾向がある。したがって、追加の変性工程は、特にハイスループットDNA複製法では及び繊細な又は稀なDNA鋳型の場合には、避けるのが好ましい。それゆえ、オリゴヌクレオチドプライマー及び/又はDNA鋳型分子を変性する追加の工程を必要としないDNA複製法の必要性が存在する。
Salas、1991. Annu. Rev. Biochem. 60: 39～71頁
Lippsら、2003. EMBO J 22: 2516～2525頁
Picherら、2016. Nature Comm 7: 13296頁
Deanら、2001. Genome Res. 11(6): 1095～1099頁
Deanら、2002. Proc. Nath Acad. Sci. 99(8): 5261～5266頁
Blancoら、1989. J Biol Chem 264: 8935～8940頁
Garmendiaら、1992. J Biol Chem 267: 2594～2599頁
Estebanら、1993. J Biol Chem 268: 2719～26頁
Hansenら、2010. Nucleic Acids Res 38: el31
van Gurpら、2013. PLoS ONE 8(12): e85583
Sabina及びLeamon 2015. Methods Mol Biol. 1347:15～41頁
McAllister及びRaskin、1993. Mol Microbiol. 10: 1～6頁
Kostyukら、1995. FEBS Lett. 369: 165～168頁
Sousaら、1995. EMBO J. 14(18): 4609～4621頁
Gudimaら、1998. FEBS Lett. 439: 302～306頁
Padillaら、2002. Nucl. Acids Res. 30(24): el38
Boulainら、2013. Protein Eng Des Sel. 26(11): 725～734頁
Ikedaら、1993. Biochemistry 32(35):9115～9124頁
Fujimura及びRoop、1976. J Biol Chem 251: 2168～2174頁
Kaboord及びBenkovic、1995. Curr Biol 5:149～157頁
Matsumotoら、1989. Gene 84: 247頁
Jungら、1987. Proc Natl Aced Sci USA 84: 8287頁
Zhu及びIto、1994. Biochim Biophys Acta 1219: 267～276頁
de Vegaら、2010. PNAS 107: 16506～16511頁
Suzukiら、2005. Nucleic Acids Symp Series 49: 97～98頁
Golombら、1977. J Virol 21: 743～752頁
Stump及びHall、1993. Nucleic Acids Res 21: 5480～5484頁
Maslak及びMartin、1993. Biochemistry 32: 4281～4285頁
Liら、1996. Biochemistry 35: 3722～3727頁
Revyakinら、2006. Science 314: 1139～1143頁
Chengら、1994. Proc Natl Acad Sci 91: 5695～5699頁
Schneiderら、2012. Nature Methods 9: 671～675頁
2 本発明の簡単な説明
オリゴヌクレオチドプライマーの非存在下又は減少量での鋳型又は標的DNAの増幅のための方法、組成物、及びキットが本明細書で提供される。標的DNAは、プラスミド、コスミド、又は環状化DNAパドロックプローブ等の環状分子、或いはゲノム、1つ若しくは複数のゲノム断片、又は合成的に若しくは酵素的に生成される核酸断片等の直鎖状分子でもよい。鋳型DNA分子は、一本鎖型又は二本鎖型でもよい。
オリゴヌクレオチドプライマーの非存在下又は減少量での鋳型又は標的DNAの増幅のための方法、組成物、及びキットが本明細書で提供される。標的DNAは、プラスミド、コスミド、又は環状化DNAパドロックプローブ等の環状分子、或いはゲノム、1つ若しくは複数のゲノム断片、又は合成的に若しくは酵素的に生成される核酸断片等の直鎖状分子でもよい。鋳型DNA分子は、一本鎖型又は二本鎖型でもよい。
本発明は、鋳型DNA分子を増幅するための方法であって、a)鋳型DNA分子を用意する工程、b)RNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ及びリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組合せを用意する工程、c)前記材料を適切な緩衝液中で適切な時間インキュベートして、前記鋳型DNA分子の複製及び増幅を可能にする工程を含む方法を提供する。
前記鋳型DNA分子、RNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ、及びヌクレオチドは、好ましくは前記適切な緩衝液中、3℃、6℃、又は12℃の範囲内の一定温度で、適切な時間インキュベートされる。
前記RNAポリメラーゼは、好ましくは単一サブユニットRNAポリメラーゼのファミリーのメンバーである。好ましいRNAポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、又はその変異体の群から選択される。
前記DNAポリメラーゼは、好ましくは鎖置換活性のあるDNA依存性DNAポリメラーゼである。好ましいDNAポリメラーゼは、Phi29、Bst、ベントDNAポリメラーゼ、又はその組合せ若しくは変異体から選択される。
本発明の好ましい方法では、前記リボヌクレオチドは、好ましくはプリン核酸塩基を有する少なくとも1つのリボヌクレオチドを含む。
本発明の方法による鋳型DNA分子の複製及び増幅は、鋳型DNA分子に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマー、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーの混合物、又はその組合せの存在下で更に実施してもよい。
本発明の方法では、ヌクレオチド又はリボヌクレオチドの1つ、好ましくはヌクレオチド又はリボヌクレオチドの少なくとも1種は、好ましくは検出可能な標識で修飾される又は標識化される。
本発明の方法により複製され増幅される増幅産物は、DNA結合剤若しくはDNA挿入剤により等の当技術分野で公知である種々の方法により、又は、例えば、鋳型DNA分子に相補的であるオリゴヌクレオチド若しくは分子ビーコン等のビオチン標識化プローブ若しくはフルオロフォア標識化プローブにより直接的に又は間接的に検出しうる。
本発明は、DNA鋳型上にプライマーを付与するため、及び、任意選択的に、デオキシリボヌクレオチドの存在下で鎖置換DNAポリメラーゼによりプライマーからDNA鋳型を増幅するためのRNAポリメラーゼの使用を更に提供する。プライマーの前記付与は、好ましくはプリン核酸塩基をもつ少なくとも1つのリボヌクレオチド、更に好ましくは、GTP、ATP、及びCTPから選択される2つ又は3つのリボヌクレオチドを供することを含む。
本発明による前記RNAポリメラーゼは、ゲノムDNAを含む一本鎖又は二本鎖鋳型DNA分子を直鎖状又は環状型で増幅するために使用しうる。本発明によるRNAポリメラーゼの使用は、生物医学的目的で、遺伝子治療及びワクチンを含むがこれらに限定されない治療目的で、或いは法医学又は診断目的で、例えば、遺伝子型判定、DNAシーケンシング、ウイルス若しくは細菌DNAの検出、又は核酸突然変異の検出を含む、微生物学的診断若しくは遺伝子診断、液相免疫アッセイ及び/若しくは免疫組織化学で用いうる。
本発明は、RNAポリメラーゼ、鎖置換DNAポリメラーゼ、又はその混合物、及び、任意選択的に、適切な緩衝液を保有するパーツを含む、パーツのキットを更に提供する。
パーツの前記キットは、更に、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び/又はその混合物を更に含みうる。
本発明は、鋳型DNA分子の増幅のための本発明によるパーツのキットの使用を更に提供する。
3. 図面の説明
4 本発明の詳細な説明
4.1 定義
用語「鋳型DNA分子」、又は「DNA鋳型」とは、本明細書で使用される場合、複製されることになるDNA分子のことである。前記DNA鋳型は、一本鎖又は二本鎖DNA分子、直鎖状又は環状DNA分子、及び10キロ塩基未満の直鎖状又は環状プラスミド分子からゲノムDNA分子又はBACプラスミド等の大きなDNA分子までに及ぶ小さな又は大きなDNA分子を含む、いかなるDNA分子でも可能である。
4.1 定義
用語「鋳型DNA分子」、又は「DNA鋳型」とは、本明細書で使用される場合、複製されることになるDNA分子のことである。前記DNA鋳型は、一本鎖又は二本鎖DNA分子、直鎖状又は環状DNA分子、及び10キロ塩基未満の直鎖状又は環状プラスミド分子からゲノムDNA分子又はBACプラスミド等の大きなDNA分子までに及ぶ小さな又は大きなDNA分子を含む、いかなるDNA分子でも可能である。
用語「適切な緩衝液」とは、本明細書で使用される場合、そのpHがほぼ一定値である水性緩衝液のことである。複製反応に適した緩衝液は、二価金属塩、好ましくは塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム及び/又は酢酸マグネシウム等のマグネシウム塩を含む。
用語「RNAポリメラーゼ」とは、本明細書で使用される場合、DNA鋳型RNA転写物を生成するDNA依存性RNAポリメラーゼ酵素のことである。前記RNAポリメラーゼは、好ましくは多くのファージRNAポリメラーゼ(T7、T3、K11、SP6、N4等)並びにミトコンドリアRNAポリメラーゼを含む単一サブユニットRNAポリメラーゼのファミリーのメンバーである(McAllister及びRaskin、1993. Mol Microbiol. 10: 1～6頁)。好ましいRNAポリメラーゼは、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、又はその変異体の群から選択される。そのような変異体には、例えば、基質として標準及び非標準リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの両方を利用することができる変異T7 RNAポリメラーゼ(Kostyukら、1995. FEBS Lett. 369: 165～168頁; Sousaら、1995. EMBO J. 14(18): 4609～4621頁; Gudimaら、1998. FEBS Lett. 439: 302～306頁; Padillaら、2002. Nucl. Acids Res. 30(24): el38)、更に高い熱安定性を示すRNAポリメラーゼ変異体(New England Biolabs社製のHi-T7(商標) RNA Polymerase; Boulainら、2013. Protein Eng Des Sel. 26(11): 725～734頁)、又はプロモーター特異性が減少している変異RNAポリメラーゼ(Ikedaら、1993. Biochemistry 32(35):9115～9124頁)が含まれる。
用語「DNAポリメラーゼ」とは、本明細書で使用される場合、DNA鋳型DNA分子を生成するDNA依存性DNAポリメラーゼ酵素のことである。前記DNAポリメラーゼはデオキシリボヌクレオチドをDNA鎖の3'末端に付加する。
用語「鎖置換DNAポリメラーゼ」とは、本明細書で使用される場合、下流DNA鎖を置換することができるDNAポリメラーゼのことである。したがって、前記酵素は、前記分子の複製中二本鎖DNA分子を巻き戻すことができる。前記ポリメラーゼは、好ましくは5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を欠く。適切な鎖置換DNA依存性DNAポリメラーゼには、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片、Bstポリメラーゼと名付けられるバチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)DNAポリメラーゼのクレノウ断片(New England Biolabs社、Ipswich、MA)、Bsm DNAポリメラーゼ、大きな断片(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA)、BcaBEST DNAポリメラーゼ(Takara Bio社、Kusatsu、Japan)、サーモアナエロバクター・サーモヒドロスルフリカス(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)(Tts)DNAポリメラーゼ(US 5,744,312)、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)、サーマス・フラバス(Thermus flavus)又はサーマス・サーモフィルス(Thermus thermophiles)由来のDNAポリメラーゼ、SEQUENASE(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA)と名付けられたT7 DNA依存性DNAポリメラーゼの変異体、T5 DNA依存性DNAポリメラーゼ(Fujimura及びRoop、1976. J Biol Chem 251: 2168～2174頁)、T4 DNAポリメラーゼホロ酵素(Kaboord及びBenkovic、1995. Curr Biol 5:149～157頁)、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)由来のDNA依存性DNAポリメラーゼ、ベントポリメラーゼと名付けられる(New England Biolabs社、Ipswich、MA)、ファージM2 DNAポリメラーゼ(Matsumotoら、1989. Gene 84: 247頁)、ファージPRD1 DNAポリメラーゼ(Jungら、1987. Proc Natl Aced Sci USA 84: 8287頁; Zhu及びIto、1994. Biochim Biophys Acta 1219: 267～276頁)、Phi29 DNAポリメラーゼ、及び、例えば、DNA結合タンパク質とポリメラーゼの融合体を含むその任意の鎖置換DNA依存性DNAポリメラーゼ変異体(de Vegaら、2010. PNAS 107: 16506～16511頁)が含まれる。
用語「リボヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、リボース糖基、核酸塩基及び少なくとも1つのリン酸基を含む分子のことである。前記核酸塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、及びその任意の修飾物が含まれる。核酸塩基のアデニン及びグアニンは集合的にプリンと名付けられ、シトシン及びウラシルは集合的にピリミジンと名付けられている。用語リボヌクレオチドは、蛍光分子、例えば、1,3-ジアザ-2-オキソフェノチアジン-リボース-5'-三リン酸(tCTP)等のリボヌクレオチドの類似体、並びに/又はイノシン、キサントシン、N4-ヒドロキシシトシン、N4-メトキシシトシン及び6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,2]オキサジン-7-オン(Suzukiら、2005. Nucleic Acids Symp Series 49: 97～98頁)等の他の類似体への言及を含む。
用語「デオキシリボヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、デオキシリボース糖基、核酸塩基及び少なくとも1つのリン酸基を含む分子のことである。前記核酸塩基には、天然の存在するアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、及びその任意の修飾物が含まれる。核酸塩基のアデニン及びグアニンは集合的にプリンと名付けられ、シトシン及びチミジンは集合的にピリミジンと名付けられている。用語デオキシリボヌクレオチドは、デオキシウリジン、デオキシイノシン、及び/又はデオキシキサントシン等のデオキシリボヌクレオチドの類似体への言及を含む。
用語「ヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はその任意の変異体若しくは修飾物のことである。当業者に公知である多くの有用な目的にかなう多種多様なヌクレオチド修飾物が生成され記載されてきたことは認識される。本明細書で用いられる用語ヌクレオチドは、そのような化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態のヌクレオチドを包含する。
用語「プライマー」とは、本明細書で使用される場合、鋳型DNAにアニールし、DNAポリメラーゼによる前記鋳型DNAの複製をプライミングするのに効果的であるオリゴヌクレオチドのことである。前記オリゴヌクレオチドは、鋳型DNAに外部添加されてもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はその組合せ若しくは変異体を含みうる。代替的に、プライマーはRNAポリメラーゼによりDNA鋳型から生成してもよい。前記プライマーは、1つ又は複数のヌクレオチドの存在下でRNAポリメラーゼ又はその変異体により生成することができる。前記ヌクレオチドは、好ましくはリボヌクレオチド、好ましくはGTP、ATP、及びCTPから選択される1～3種を含み、更に好ましくは、アデニン若しくはグアニン等の少なくとも1つのプリン核酸塩基、又はアデニン核酸塩基とグアニン核酸塩基の両方を含む。前記変異体は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート2アルキル化及びホスホロアミド酸類似体等の合成オリゴヌクレオチド類似体、2'-フルオロ、O-メチル、若しくはメトキシエチル等のヌクレオシド糖環の2'位に修飾のある類似体、ペプチド核酸、架橋型核酸並びに/又はロックド核酸分子を含む。
用語「パドロックプローブ」とは、本明細書で使用される場合、その末端が標的鋳型RNA又はDNA分子上の隣接する配列に相補的であるオリゴヌクレオチドのことである。パドロックプローブのその標的へのハイブリダイゼーションはライゲーションによる環状化を可能にする。環状化パドロックプローブは、その後増幅のための鋳型DNAとしての役目を果たしうる。
4.2 本発明の方法
本発明は、T7 RNAポリメラーゼ等のRNAポリメラーゼが、コンセンサスT7プロモーター配列及び外部添加されるオリゴヌクレオチドプライマーの非存在下で、DNAポリメラーゼによる後続の増幅のために天然と変性DNA鋳型の両方のプライミングを効率的に媒介することができるという思いがけない所見に基づいている。続いて、SP6及びT3 RNAポリメラーゼ等の他のRNAポリメラーゼも、それぞれコンセンサスSP6又はT3プロモーター配列の非存在下でDNA増幅を開始することができることが見出された。更に、前記RNAポリメラーゼは一本鎖DNA鋳型上でプライミングを開始することが明らかにされている。この知見の意外性は、T7、T3、及びSP6 RNAポリメラーゼのようなDNA依存性RNAポリメラーゼの転写活性は、そのそれぞれのプロモーター配列に高度に特異的であると広く記載されており、前記RNAポリメラーゼの結合は二本鎖DNAプロモーター配列上でのみ起こるという事実にある(Golombら、1977. J Virol 21: 743～752頁; Stump及びHall、1993. Nucleic Acids Res 21: 5480～5484頁; Maslak及びMartin、1993. Biochemistry 32: 4281～4285頁; Liら、1996. Biochemistry 35: 3722～3727頁)。
本発明は、T7 RNAポリメラーゼ等のRNAポリメラーゼが、コンセンサスT7プロモーター配列及び外部添加されるオリゴヌクレオチドプライマーの非存在下で、DNAポリメラーゼによる後続の増幅のために天然と変性DNA鋳型の両方のプライミングを効率的に媒介することができるという思いがけない所見に基づいている。続いて、SP6及びT3 RNAポリメラーゼ等の他のRNAポリメラーゼも、それぞれコンセンサスSP6又はT3プロモーター配列の非存在下でDNA増幅を開始することができることが見出された。更に、前記RNAポリメラーゼは一本鎖DNA鋳型上でプライミングを開始することが明らかにされている。この知見の意外性は、T7、T3、及びSP6 RNAポリメラーゼのようなDNA依存性RNAポリメラーゼの転写活性は、そのそれぞれのプロモーター配列に高度に特異的であると広く記載されており、前記RNAポリメラーゼの結合は二本鎖DNAプロモーター配列上でのみ起こるという事実にある(Golombら、1977. J Virol 21: 743～752頁; Stump及びHall、1993. Nucleic Acids Res 21: 5480～5484頁; Maslak及びMartin、1993. Biochemistry 32: 4281～4285頁; Liら、1996. Biochemistry 35: 3722～3727頁)。
本発明の方法による、前記RNAポリメラーゼによるプライミングは、少なくとも1つのリボヌクレオチドの存在に依存している。RNA転写物の長い重合を防ぐためには、反応は好ましくは3つ以下のリボヌクレオチドの存在下で実施される。前記3つ以下のリボヌクレオチドは、好ましくはATP若しくはGTP、又はその組合せ等の少なくとも1つのプリンリボヌクレオチドを含む。CTP及び/又はUTPのいずれかは反応混合物から除外されているのが好ましい。
したがって、本発明は、鋳型DNA分子を増幅するための方法であって、a)鋳型DNA分子を用意する工程、b)RNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ及びリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組合せを用意する工程、並びにc)前記材料を適切な緩衝液中で適切な時間インキュベートして、前記鋳型DNA分子の複製及び増幅を可能にする工程、並びに、任意選択的に、d)増幅された産物を検出する工程を含む方法を提供する。
前記RNAポリメラーゼは、DNAポリメラーゼによるその後の伸長反応に対するプライミングを媒介する任意のRNAポリメラーゼが可能である。理論に束縛されることなく、前記RNAポリメラーゼは鋳型DNAに結合し、DNA依存性DNAポリメラーゼによる伸長のためのプライマーとしての役目を果たしうる単一RNAヌクレオチドを結合させる。代替的に、又は付加的に、前記RNAポリメラーゼは、不完全転写(abortive transcription)と名付けられた方法により短い一続きのRNAを生成し、そこでRNAポリメラーゼはDNA分子に結合して短いmRNA転写物の合成を開始する。前記不完全転写は、DNAスクランチング(scrunching)を含みうる(Revyakinら、2006. Science 314: 1139～1143頁)。短い不完全mRNA転写物はリボヌクレオチドプライマーとして使用することができ、DNA依存性DNAポリメラーゼにより伸長される。
好ましいRNAポリメラーゼは、T3 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ及びT7 RNAポリメラーゼである。極めて好ましいRNAポリメラーゼはT7 RNAポリメラーゼである。
前記鎖置換DNA依存性DNAポリメラーゼは好ましくはPhi29、Bst、及び/又はベントDNAポリメラーゼである。Phi29ポリメラーゼの最適温度は約30℃である。Bstポリメラーゼの最適温度は60～65℃であり、ベントポリメラーゼの最適温度は約72℃である。大半の天然のRNAポリメラーゼは30～37℃で活性があるので、T3 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ又はT7 RNAポリメラーゼと組み合わせるための一般に好まれる酵素はPhi29ポリメラーゼである。しかし、もっと耐熱性のDNA依存性RNAポリメラーゼなら、もっと高いインキュベーション温度でBstポリメラーゼ又はベントポリメラーゼと組み合わせうることは当業者には明らかである。
Phi29 DNAポリメラーゼは、Bst及び/又はベントDNAポリメラーゼと比べた場合、より高度な処理能力及び鎖置換能力を有する。更に、Phi29 DNAポリメラーゼはプルーフリーディング活性を有し、高度に正確な複製をもたらす(Garmendiaら、1992. J. Biol. Chem. 267, 2594～2599頁)。したがって、極めて好ましい鎖置換DNA依存性DNAポリメラーゼはPhi29ポリメラーゼである。しかし、知られている又は将来知られる他の鎖置換DNA依存性DNAポリメラーゼも本発明の方法での使用に適している可能性がある。
本発明の方法は、DNA鋳型を増幅するのに適した時間実施される。前記時間は好ましくは0.5～48時間、更に好ましくは1～24時間、更に好ましくは2～20時間、例えば、少なくとも5時間、少なくとも8時間、少なくとも12時間、又は少なくとも16時間である。
本発明の方法は適切な緩衝液で実施される。前記緩衝液は、好ましくはpHをほぼ一定値に保つ緩衝剤を含む。前記緩衝剤は、リン酸塩、ホウ酸塩、N-シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸(CHES)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノエタン(Tris)、2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)、グリシン、及び/又は[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパンスルホン酸(TAPS)を含みうる。ポリメラーゼに好ましい反応pHは、6と10の間、好ましくは、7と9の間、例えば、7.2、7.5、7.8、8.0、8.1、8.5、8.6、又は8.8である。
好ましい緩衝剤は、トリス、好ましくは10～100mMのトリスである、又はこれを含む。前記トリスは、好ましくは酢酸及び/又は塩酸等の酸の添加により所望のpHに設定される。
複製反応に適した緩衝液は、Mg2+又はMn2+等の二価の金属イオンを更に含む。二価の金属イオンは、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム及び/又は酢酸マグネシウム等のその塩として供してもよい。前記濃度は、好ましくは0.5と20mMの間、例えば、1と10mMの間、好ましくは約5～10mMである。
前記緩衝液の追加の成分は、ある特定のDNA鋳型の複製を増強することが当技術分野で知られている、塩化カリウム等のカリウムイオン、硫酸アンモニウム等の他の塩、並びに/又はベタイン、エチレングリコール、1,2-プロパンジオール及び/若しくはスペルミジン、例えば、2～10%のDMSO又は2～10%のグリセロールを含みうる(Chengら、1994. Proc Natl Acad Sci 91: 5695～5699頁)。
好ましくは、ゼラチン、アルブミン、ベータメルカプトエタノール、ジチオスレイトール(DTT)、及び/又はトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)等の還元剤、並びに、例えば、TWEEN20又はTriton-X100等の中性洗剤を含む、酵素活性を安定化する追加の成分が反応緩衝液に含まれる。
実施形態では、好ましい緩衝液は、トリス酢酸塩、酢酸マグネシウム、及び酢酸カリウム、更に好ましくは、33mMの酢酸トリス、37℃でpH7.9、10mMの酢酸マグネシウム、66mMの酢酸カリウム、0.1%(w/w)のTween20、及び1mMのDTTを含む。
実施形態では、好ましい緩衝液は、トリス塩化物、塩化マグネシウム及び硫酸アンモニウム、更に好ましくは、50mMのトリス-HCl(25℃でpH7.5)、10mMのMgCl2、10mMの(NH4)2SO4、及び4mMのDTTを含む。
本発明の方法は、プライマーとして少なくとも1つの外因性オリゴヌクレオチドであって、鋳型DNA分子上のヌクレオチドの一続きに相補的であるオリゴヌクレオチド、ランダムオリゴヌクレオチドの混合物、又はその組合せの供給を更に含みうる。前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの混合物は、好ましくは1つ若しくは複数の一本鎖核酸分子、好ましくはDNA分子、RNA分子、又はその混合物若しくは類似体である又はこれを含む。前記一本鎖核酸分子は、好ましくは6～100塩基長、例えば、9～30塩基を含む。前記一本鎖核酸分子は、鋳型DNA分子の複製及び増幅のための追加の開始点としての役目を果たしうる。
本発明の方法により生成される増幅産物は、例えば、ゲル電気泳動により検出し可視化しうる。ゲル電気泳動は、DNA分子が全て本質的に同じ電荷をもつので、DNA分子をそのサイズに基づいて分離するために使用される技法である。電気泳動は、目的の分子を含有するゲル中に電流を流すことを含む。分子は、そのサイズに基づいて、ゲル中を異なる速度で進み、分子を互いに分離させる。
前記ゲルは典型的にはアガロース又はポリアクリルアミドゲルである。ポリアクリルアミドゲルは、通常500～1000塩基対(bp)までのDNAの小DNA断片に使用される。アガロースゲルは100～20kbpのDNA断片に使用することができるが、パルスフィールドゲル電気泳動(PFGE)を用いれば6Mbを超える分解能を達成することができる。
代替的に、又は付加的に、本発明の方法により生成される増幅産物は、DNA結合剤若しくはDNA挿入剤又は臭化エチジウム、クリスタルバイオレット、ヘイスト染色若しくはDAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)等の染料、SYBRグリーン、若しくはEvaグリーン等のシアニン染料により検出し可視化しうる。代替的に、本発明の方法により生成される増幅産物は、例えば、ビオチン-若しくはフルオロフォア繋留相補的オリゴヌクレオチド又は蛍光標識分子ビーコンにより、及び/或いは修飾された又はコンジュゲートされたdNTPの存在下での増幅により等のコンジュゲートされた又は蛍光プローブを使用することにより検出しうる。
適切なフルオロフォアの例は、Atto425(ATTO-TEC GmbH社、Siegen、Germany)、Atto 647N(ATTO-TEC GmbH社、Siegen、Germany)、ヤキマイエロー(Epoch Biosciences社、Bothell、WA、USA)、Cal610(BioSearch Technologies社、Petaluma、CA、USA)、Cal635 (BioSearch Technologies社、Petaluma、CA、USA)、FAM(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA USA)、TET(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA USA)、HEX (Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA USA)、Cy5、Cy5.5、Cy3、Cy3.5、Cy7等のシアニン染料(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA USA)、アレクサ染料(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA USA)、Tamra (Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA USA)、ROX(Thermo Fisher Scientific社、Waltham, MA USA)、JOE(Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA USA)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC、Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA USA)、及びテトラメチルローダミン(TRITC、Thermo Fisher Scientific社、Waltham、MA USA)を含むがこれらに限定されない。
当業者に知られているように、前記フルオロフォアは当技術分野で公知であるいかなる適切な方法を使用しても検出することができる。例えば、フルオロフォアは、フルオロフォアを光の適切な波長で励起し、放出された蛍光を検出することにより検出することができる。
本発明の方法による増幅用の鋳型DNA分子は、ミトコンドリアDNA並びにバクテリオファージ、ウイルス、古細菌を含む細菌、アメーボゾア、コアノゾア、及びエクスカバータ等の原生生物、藻類、及び珪藻類を含むクロミスタ、植物、菌類、ヒトを含む動物由来のゲノムDNAを含む、任意の直鎖状又は環状DNA分子でありうる。前記ゲノム鋳型、好ましくは全ゲノム鋳型の増幅は、生物医学及び法医学応用に使用しうる。比較ゲノムハイブリダイゼーション、多型遺伝子座の遺伝子型判定及び疾患遺伝子突然変異の検出等のゲノム分析は、遺伝子医学及び法医学科学において重要である。
多くの生物医学及び法医学DNA分析技法は、ナノグラムからマイクログラム量のゲノムDNAを必要とする。DNA試料は、ゲノム分析を実施可能になる前に増幅しなければならないことが多い。本発明の方法は、ゲノム鋳型DNA分子のそのような全ゲノム増幅に使用しうる。
代替的に、又は付加的に、本発明の方法は、環状鋳型DNA分子を増幅するのに用いうる。前記環状DNA鋳型は、例えば、組換えDNAプラスミド、天然に存在するプラスミド、ミトコンドリアゲノム、又は一部のバクテリオファージ及びウイルスの環状ゲノムである。前記環状DNA鋳型は、例えば、パドロックプローブの使用により、遺伝子合成により、又は、例えば、T4 DNAリガーゼによる酵素的ライゲーション、若しくは鋳型非依存性が可能であるリガーゼ等の特殊なDNAリガーゼを使用する鋳型なしライゲーション、一本鎖DNAサークルを生み出す一本鎖DNA配列の分子内ライゲーション、例えば、CircLigase(Lucigen社、Middleton、WI)を含む組換えDNA法により、人工的に生成しうる。当業者であれば認識するように、直鎖状DNA鋳型産物は、自己ライゲーションにより又は末端ヘアピンループのライゲーションにより、例えば、DNAリコンビナーゼ、プロテロメアーゼ、リゾルバーゼ又はインテグラーゼを使用して、環状鋳型に変換することもできる。
本発明の増幅法等の増幅法は、理想的には直鎖状鋳型を含む、RNA合成又はインビトロ転写のためのDNA鋳型を生成するのに適している。例えば、RNAポリメラーゼ用のプロモーター、例えば、SP6、T3又はT7プロモーター、及び、任意選択的に、ポリ(A)配列を含む環状DNA構築物は、本発明に従って、DNAポリメラーゼ及びRNAポリメラーゼ(プロモーター部位に適合する又は適合しないのいずれか)の存在下で増幅させうる。増幅産物を消化して、インビトロ又はインビボ転写に適している個別の直鎖化した増幅産物を生じる制限酵素が増幅反応中に存在していてもよい。前記制限酵素は、好ましくは増幅産物に対して選択的であるが、鋳型DNA分子を制限しない。そのような選択性は、例えば、メチル化感受性制限酵素によりもたらされる。例えば、Dam+(認識配列GATCにおいてAをメチル化する)大腸菌(E.coli)株において生成される鋳型DNA分子は、MboIでは制限することができず、一方、増幅産物はメチル化されずこの酵素が制限することができる。当技術分野で周知であるように、ある特定のエンドヌクレアーゼ(例えば、XbaI、ClaI)に認識部位に重なるメチル化部位も使用しうる。もっと多くの例は、international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/dam-and-dcm-methylases-of-e-coli、又は制限酵素データベースREBASE (at rebase.neb.com/rebase/rebms.html)を参照されたい。同様に、Dcm+(CCAGG及びCCTGGにおいてCをメチル化する)大腸菌株において生成される鋳型DNA分子は、StyD4I、ApaI、又はFseI等のある特定の制限酵素によりメチル化部位では制限することができず、一方、増幅産物はメチル化されずこれらの酵素によって制限することができる。
更に、本発明の増幅法等の増幅法は、理想的には直鎖状ウイルス鋳型を生成するのに適している。例えば、ウイルスゲノムのDNAコピーを含む環状構築物は、DNAポリメラーゼ及びRNAポリメラーゼ、例えば、T7ポリメラーゼ、ヌクレオチド並びにリボヌクレオチドの存在下で増幅しうる。前記環状構築物は、末端反復配列の中間に制限酵素認識配列、好ましくはDam、Dcm、又はEcoKIメチラーゼ感受性制限酵素認識配列を含む。増幅反応中の前記制限酵素の存在は、増幅産物を制限し、末端反復配列が両末端に存在するウイルスゲノムの直鎖化した増幅ゲノムDNAコピーを生じる。
4.3 本発明の使用
本明細書の上に示されるように、T7 RNAポリメラーゼ等のRNAポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼによるその後の伸長反応のための鋳型DNA上でのプライミングを媒介することができる。驚くべきことに、この現象は、たとえDNA鋳型がコンセンサスT7プロモーター配列を含まなくても起きた。SP6及びT3 RNAポリメラーゼ等の他のDNA依存性RNAポリメラーゼも、それぞれコンセンサスSP6又はT3プロモーター配列の非存在下でDNA鋳型の複製を開始することが見出された。
本明細書の上に示されるように、T7 RNAポリメラーゼ等のRNAポリメラーゼは、DNA依存性DNAポリメラーゼによるその後の伸長反応のための鋳型DNA上でのプライミングを媒介することができる。驚くべきことに、この現象は、たとえDNA鋳型がコンセンサスT7プロモーター配列を含まなくても起きた。SP6及びT3 RNAポリメラーゼ等の他のDNA依存性RNAポリメラーゼも、それぞれコンセンサスSP6又はT3プロモーター配列の非存在下でDNA鋳型の複製を開始することが見出された。
したがって、本発明は、DNA鋳型上にプライマーを付与するためのRNAポリメラーゼの使用を提供する。本発明による前記使用は、好ましくはデオキシリボヌクレオチドの存在下で、好ましくは4種全てのデオキシリボヌクレオチドの存在下で、鎖置換DNA依存性DNAポリメラーゼによりプライマーから前記DNA鋳型を増幅する工程を更に含む。
本明細書の上に示されるように、前記鎖置換DNA依存性DNAポリメラーゼは、好ましくはPhi29、Bst、及び/又はベントDNAポリメラーゼである。
前記DNA鋳型は、プラスミドDNA、合成DNA、ミトコンドリアDNA並びにバクテリオファージ、ウイルス、原核生物及びヒトを含む真核生物由来のゲノムDNAを含む、任意の直鎖状又は環状DNA分子でもよい。
前記DNA鋳型の増幅は、生物医学、診断、法医学、又は治療目的若しくは治療応用に使用しうる。比較ゲノムハイブリダイゼーション、多型遺伝子座の遺伝子型判定、疾患遺伝子突然変異の検出、及びDNAシーケンシング等のゲノム分析は、生物医学研究、ゲノム医学、診断法及び法医学科学において重要である。診断用途は、DNAシーケンシング又は適切な方法による増幅産物の検出に先立って、本発明の方法による、ウイルス、細菌、及び他の微生物病原体由来のDNA鋳型の増幅も含む。
代替的に、又は付加的に、本発明による、DNA鋳型上へプライマーを付与するためのRNAポリメラーゼの前記使用は、前記鋳型DNAでのヌクレオチドの正確な順番付けを決定する任意の方法、技術、又は処理を含む、DNAシーケンシングにおいてである。
遺伝子治療又はDNAワクチン等のDNAの治療応用は、発現ベクター、アンチセンス又はエキソンスキッピング適用のためのオリゴヌクレオチド、DNAデコイ、DNAアプタマー、及びDNAザイムを含むDNAベースの治療薬に頼っている。前記DNAベースの治療薬の臨床用途は、品質管理された高純度のDNA製剤が必要である。比較的短いオリゴヌクレオチドは高純度まで化学的に合成しうるが、もっと長いDNA分子は、典型的には細菌発酵培養物からプラスミドとして単離される。前記プラスミドは、いかなる微量の細菌ゲノムDNA、RNA、タンパク質、及び内毒素でも取り除くための広範な精製工程を含む、複数の異なる処理工程を通じて単離しなければならない。本発明の方法による合成的無細胞DNA増幅は、DNAベースの治療薬の生産のための単純でスケーラブルで手ごろな別法を提供する。更に、本発明の方法は、その治療効果を増強しうるDNAベースの治療薬に修飾ヌクレオチドを取り込ませるため容易に採用することができると考えられる。
代替的に、本発明による前記使用は、液相免疫アッセイ及び/又は免疫組織化学にある。DNA依存性RNAポリメラーゼによるプライミング及び鎖置換DNA依存性RNAポリメラーゼによるその後の増幅は、自由溶液中で及び固定化された標的の上で(固相増幅)実施することができる。免疫組織化学は、形態学的観察及び可溶性アッセイに診断及び予後情報を供することができる方法である。シグナル増幅は、ハイブリダイゼーション反応でのDNA鋳型の成分へのコンジュゲーション、続いてDNA依存性RNAポリメラーゼによるプライミング及び鎖置換DNA依存性RNAポリメラーゼによるその後の増幅を用いるが、ハイブリダイゼーション反応の感受性及び特異性を増加するために適用しうる。
固体支持体への標的鋳型の付着は好都合でありえ、固体支持体へ前記標的鋳型を付着させるのに役立つポリマーという手段を通じて達成することができる。記載される方法で有用であるそのような固体状態基材は、ヌクレオチドを結合させることができる任意の固体材料を含むことができる。これには、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ガラス、多ケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート(polypropylfumerate)、コラーゲン、グリコサミノグリカン、及びポリアミノ酸等の材料が含まれる。固体状態基材は、薄フィルム又は膜、ビーズ、瓶、皿、繊維、織物、成形ポリマー、粒子及び微粒子を含む任意の有用な形態をもつことができる。固体状態基材の好ましい形態は、ガラススライド又は標準96ウェルプレート等のマイクロタイタープレートである。好ましい実施形態は、支持体としてガラス又はプラスチックを利用する。
前記DNA鋳型は、好ましくはローリングサークル増幅が免疫アッセイの及び/又は免疫組織化学における感受性及び特異性を増強することを可能にする、環状DNA鋳型である。こうして得られる高シグナルノイズ比のおかげで、環状DNA鋳型は、臨床試料中の低含量タンパク質性マーカー、ウイルス及び細菌DNAを検出し、定量化し、可視化するために、並びに、例えば、DNA及びRNAマイクロアレイアッセイにおいて核酸ハイブリダイゼーションのためのオンチップシグナル増幅法として適している。
更に、本明細書で提示される増幅技法は、DNAナノ構造及びDNAハイドロゲルの構築に適用することができる。
4.4 パーツのキット
本発明は、DNA依存性RNAポリメラーゼを保有するパーツ、鎖置換DNA依存性DNAポリメラーゼを保有するパーツ、又は前記酵素を単一のすぐに使える溶液にした組合せを含む、パーツのキットを更に提供する。ポリメラーゼのそれぞれは、当技術分野で公知の実質的に同じように機能する類似のタンパク質で置き換えることができる。
本発明は、DNA依存性RNAポリメラーゼを保有するパーツ、鎖置換DNA依存性DNAポリメラーゼを保有するパーツ、又は前記酵素を単一のすぐに使える溶液にした組合せを含む、パーツのキットを更に提供する。ポリメラーゼのそれぞれは、当技術分野で公知の実質的に同じように機能する類似のタンパク質で置き換えることができる。
前記パーツのキットは、適切な反応緩衝液、デオキシヌクレオチド及び/又は少なくとも1つがプリンリボヌクレオチドである、リボヌクレオチドを更に含みうる。前記リボヌクレオチドは、好ましくはATP、GTP、又はATPとGTPの両方を含む。
前記キットは、任意選択的に、鋳型DNA分子上の一続きのヌクレオチドに相補的である少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、ランダムオリゴヌクレオチドの混合物、又はその組合せを含むプライマーの提供を更に含む。
前記キットは、好ましくはDNA鋳型のプライミング及びその後の増幅のためのDNA依存性RNAポリメラーゼ及び鎖置換DNA依存性DNAポリメラーゼの使用説明書を更に含む。
本発明は、DNA鋳型の増幅のための本発明によるパーツのキットの使用を更に提供する。前記DNA鋳型は、プラスミドDNA、ミトコンドリアDNA並びにバクテリオファージ、ウイルス、古細菌を含む細菌、アメーボゾア、コアノゾア、及びエクスカバータ等の原生生物、藻類、及び珪藻類を含むクロミスタ、植物、菌類、及びヒトを含む動物由来のゲノムDNAを含む、任意の直鎖状又は環状DNA分子でありうる。前記ゲノム鋳型、好ましくは全ゲノム鋳型の増幅は、診断応用を含む、生物医学及び法医学応用に使用しうる。
本発明は、以下の実施例を参照することにより更に説明され、これらの実施例は例示のためだけに本明細書に提示されるものであり、いかなる点でも本発明を限定すると解釈するべきではない。
5. 実施例
(実施例1)
一般的材料及び方法
試薬供給業者:T7 RNAポリメラーゼ(M0251)、T3 RNAポリメラーゼ(M0378)、SP6 RNAポリメラーゼ(M0207)、Phi 29 DNAポリメラーゼ(M0269)、リボヌクレオチド(N0450)、dNTP ミックス(N0447)、XbaI(R0145、20U/μl)、BsaI-HFv2(R3733、20U/μl)、PvuI-HF(R3150、20U/μl)はNew England Biolabs社(NEB; Ipswich、MA、USA); phi29 DNAポリメラーゼ (EN-20)はBiolab Innovative Research Technologies社(BLIRT; Gdansk、Poland);T7 RNAポリメラーゼ(EP0111)、T3 RNAポリメラーゼ(EP0101)、SP6 RNAポリメラーゼ(EP0131)、及びPhi 29 DNAポリメラーゼ(EP0091)はThermo Fisher Scientific社(TF、Bleiswijk、the Netherlands);酵素を補給され実施例の一部で使用される市販のストック緩衝液は下に示されている。2つの3'ホスホロチオエート連鎖を含有するランダムヘキサマーは、Integrated DNA Technologies社(IDT、Coralville、OH、USA)から購入した。
(実施例1)
一般的材料及び方法
試薬供給業者:T7 RNAポリメラーゼ(M0251)、T3 RNAポリメラーゼ(M0378)、SP6 RNAポリメラーゼ(M0207)、Phi 29 DNAポリメラーゼ(M0269)、リボヌクレオチド(N0450)、dNTP ミックス(N0447)、XbaI(R0145、20U/μl)、BsaI-HFv2(R3733、20U/μl)、PvuI-HF(R3150、20U/μl)はNew England Biolabs社(NEB; Ipswich、MA、USA); phi29 DNAポリメラーゼ (EN-20)はBiolab Innovative Research Technologies社(BLIRT; Gdansk、Poland);T7 RNAポリメラーゼ(EP0111)、T3 RNAポリメラーゼ(EP0101)、SP6 RNAポリメラーゼ(EP0131)、及びPhi 29 DNAポリメラーゼ(EP0091)はThermo Fisher Scientific社(TF、Bleiswijk、the Netherlands);酵素を補給され実施例の一部で使用される市販のストック緩衝液は下に示されている。2つの3'ホスホロチオエート連鎖を含有するランダムヘキサマーは、Integrated DNA Technologies社(IDT、Coralville、OH、USA)から購入した。
DNA鋳型:二本鎖環状DNAプラスミドは、Nucleobond又はNucleoSpinカラム(Macherey-Nagel社、Duren、Germany)を使用して、大腸菌培養物から精製した。プラスミドp3は、単一T7プロモーターコンセンサス配列(5' TAATACGACTCACTATAG 3')を含有する5キロ塩基CMV-GFP発現構築物であり、pGEM-7Zf+(Promega Corporation社、Madison、WI、USA、以後pGEMと呼ぶ)は、T7プロモーターコンセンサス配列及びSP6プロモーターコンセンサス配列(5' ATTTAGGTGACACTATAG 3')を逆方向に含有する空の3キロ塩基標準クローニングベクターであり、pBlueScript II SK+(Stratagene社、La Jolla、CA、USA、以後pBSKと呼ぶ)は、T7プロモーター及びT3プロモーターコンセンサス配列(5' AATTAACCCTCACTAAAG 3')を逆方向に宿す広く使用される3kbのファージミドクローニングベクターである。プラスミドp53はいずれのT7、T3、又はSP6プロモーター部位も欠く3.7キロ塩基のCMV-GFP哺乳動物発現ベクターである。プラスミドB327(3.8キロ塩基)は、CMV-GFP発現カセットのどちらかの側にBsaI制限部位及びT7プロモーターコンセンサス配列を逆方向に挿入することによりp53から構築した。全てのプラスミドは、直鎖化用に単一の独特なXbaI認識配列を含有する。HeLaゲノムDNA(本明細書ではgDNAと呼ぶ)及びM13mp18由来の一本鎖環状DNAは、NEB社から購入した(カタログ番号それぞれN40065及びN4040S)。
標準増幅条件:別段明記されなければ、標準増幅条件は、以下の通りに20μlの反応容積を含有する0.5ml又は0.2mlのPCRチューブで実施した。反応は、33mMの酢酸トリス(37℃でpH 7.9)、66mMの酢酸カリウム、10mMの酢酸マグネシウム、0.1%のTween-20及び1mMのDTTを含有するl×Phi29緩衝液Bで、又は50mMのトリス-HCl(25℃でpH 7.5)、10mMのMgCl2、10mMの(NH4)2SO4、及び4mMのDTTを含有する1×Phi29緩衝液Nで準備した。反応混合物は、1mMのdNTP(NEB社、N0447)、及び0.25U/μlのPhi29 DNAポリメラーゼ(Biolab Innovative Research Technologies社、EN-20)を補充した。全ての実験において、試料間の変動を最小限に抑えるため全ての共通成分を含有する予備混合物を使用した。必要に応じて、鋳型DNA、ヘキサマー、リボヌクレオチド、及び/又はRNAポリメラーゼを予備混合物に又は指示通りに個々の反応に追加した。ピペット操作工程は全て氷上で実施した。反応混合物は、16時間又は指示した時間、30℃でインキュベートし、続いて0.5mLのチューブ用に2つの30ウェルアルファユニット又は0.2mlチューブ用に96ウェルT100サーモサイクラー(Bio-Rad社)を備えたPTC-200 PeltierサーマルサイクラーDNA Engine (MJ Research社)において65℃で10分間熱不活化させた。
DNA増幅産物の分析:指示した時間でのインキュベーション及び熱不活化に続いて、反応混合物は5mMのEDTA(pH 8.0)で5倍に希釈し、65℃で30分間インキュベートして、過剰なヌクレオチド変換及びDNA増幅のせいでゲル様沈殿物を形成することが多いピロリン酸マグネシウム及び高分子量DNAを可溶化した。次に、可溶化反応産物を2mMのEDTAの最終濃度に達するまで水で1度希釈し、さらなる分析のため-20℃で保存した。
制限分析:増幅産物を検証するため、3～5μlの希釈反応混合物をCutSmart緩衝液(New England Biolabs社、50mMの酢酸カリウム、20mMの酢酸トリス、10mMの酢酸マグネシウム、100μg/mlのBSA、25℃でpH 7.9)中5ユニットのXbaI又はBsaIで消化した。37℃で1時間のインキュベーションに続いて、4μlの6×添加液(NEB社; Ipswitch、MA、USA)を添加し、消化産物はアガロースゲル上で分析した。
ゲル電気泳動:試料を臭化エチジウムを含有する1%アガロースゲル上に充填し、1×のTAE緩衝液(40mMのトリス、20mMの酢酸、1mMのEDTA)で電気泳動分析にかけた。参照及びDNA断片のサイズ評価のため、1kbのDNAラダー(NEB社、N3232)を使用した。増幅及び/又は制限消化産物は、UVトランスイルミネーターを使用して可視化し、ProXima 10 Phi撮像プラットホーム上でとらえた。
(実施例2)
RNAポリメラーゼが、その同族プロモーター配列に結合することによりDNA増幅の特異的プライミングを開始できるかどうか調べるため、Table 1(表1)に示される異なるRNAポリメラーゼに対するゼロ、1つ、又は2つのコンセンサスプロモーター配列を宿す異なるプラスミドDNA鋳型を標準増幅反応において試験した。
RNAポリメラーゼが、その同族プロモーター配列に結合することによりDNA増幅の特異的プライミングを開始できるかどうか調べるため、Table 1(表1)に示される異なるRNAポリメラーゼに対するゼロ、1つ、又は2つのコンセンサスプロモーター配列を宿す異なるプラスミドDNA鋳型を標準増幅反応において試験した。
標準増幅反応は、0.25U/μlのPhi29、1mMのdNTP、0.5mMのリボヌクレオチドGTP/ATP、10ngの鋳型DNA又は水、及び50μMのヘキサマー(図1Aの上左部分)、0.5U/μlのT7 RNAポリメラーゼ(上右部分)、0.5U/μlのT3 RNAポリメラーゼ(下左部分)、又は0.5U/μlのSP6 RNAポリメラーゼ(図1Aの下右部分)を含有する1×Phi29緩衝液Bにおいて設定した。30℃で16時間のインキュベーションに続いて、反応産物は希釈し、ゲル電気泳動による分析に先立って、XbaI制限酵素消化により直鎖化した。
思いがけないことに、その同族プロモーター配列に対するT7 RNAポリメラーゼの広く記載された高度な特異性にもかかわらず、T7 RNAポリメラーゼは、そのようなプロモーター配列なしでDNA鋳型に対するDNA増幅のプライミングを効率的に可能にすることが見出された(プラスミドp53、レーン2)。単一のT7プロモーター配列を含有するプラスミド(p3、レーン3)又は2つのT7プロモーター配列を逆方向に含有するプラスミド(pB327、レーン4)は、T7 RNAポリメラーゼの存在下で等しくよく増幅され、プライミングがT7プロモーター配列とは無関係に起こることを示唆している。驚くべきことに、T3-及びSP6 RNAポリメラーゼも、そのそれぞれのプロモーター配列に厳密に特異的であるであることも知られているが、その同族プロモーター配列の存在とは無関係に、使用される全てのプラスミドDNA鋳型のプライミングを効率的に可能にすることが見出された。
したがって、この実験は、下に記載される他の実施例に加えて、RNAポリメラーゼがDNAのプライマーレス増幅を可能にすることを示している。方法の単純さ並びに使用される酵素及び反応成分の広い入手可能性を考慮に入れると、本発明のDNA増幅法は、研究、診断、及び治療目的のため等の種々の応用において価値あるツールであることが判明しうる。
そのプロモーター配列とは無関係に実際にRNAポリメラーゼによるプライミングが起こるのかどうかを更に分析し確認するために、プラスミドpB327(2つのT7プロモーターを含有する)を、標準増幅条件下、ランダムヘキサマー、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、又はSP6 RNAポリメラーゼの存在下で、プリン作動性リボヌクレオチドの非存在下で又はこれの存在下で増幅させた。それぞれの反応は、以下の成分:1×Phi29反応緩衝液B中1mMのdNTP(NEB社、N0447)及び0.25U/μlのPhi29(Blirt社、EN20)を含有した。反応2及び3(図1Bのレーン番号付けに対応する)は50μMのランダムヘキサマーを補充し、反応4及び7は0.5U/μlのT7 RNAポリメラーゼを補充し、反応5及び6はそれぞれ0.5U/μlのT3 RNAポリメラーゼ又は0.5U/μlのSP6 RNAポリメラーゼを補充した。反応2から5は、リボヌクレオチドGTP及びATP(それぞれ0.5mM)を更に補充し、最後に、全ての反応は10ngのpB327鋳型DNAを供給した。反応は、30℃で16時間インキュベートし、続いてBsaI制限分析及びゲル電気泳動を行った。参考に、200ngの非増幅鋳型DNA pB327を制限分析に含め、得られた制限パターンを検証した(図1Bでのレーン8)。
記載されているように、ヘキサマーとRNAポリメラーゼの両方が、鋳型DNA増幅のプライミングを可能にするが、ヘキサマーは、天然のプラスミドDNAをプライミングするのに非常に効果的であると確かに思われる。使用された鋳型DNA pB327はT7 RNAポリメラーゼに対して2つのプロモーターコンセンサス配列のみを含有するが、T3及びSP6 RNAポリメラーゼもpB327のDNA増幅を効率的にプライミングすることが見出された。T7 RNAポリメラーゼがその同族プロモーター配列に結合してプロモーター部位からDNA増幅をプライミングすると予想される場合、逆方向のT7プロモーター部位が与えられると、指数関数的な増幅が予想されると考えられた。しかし、明らかに、T7 RNAポリメラーゼプライミング反応での増幅産物の強度は、T3-又はSP6 RNAポリメラーゼ反応での増幅産物の強度を超えず(レーン4、5、及び6を比較されたい)、RNAポリメラーゼによるプライミングはその同族プロモーター配列とは無関係に起こることが再び示されている。興味深いことに、リボヌクレオチドがなければ、T7 RNAポリメラーゼとの反応混合物では増幅産物は観察されず(レーン4と7を比較されたい)、そのためリボヌクレオチドへの依存性を更に調べることになった。
(実施例3)
RNAポリメラーゼによるDNA増幅の観察されるプライミングが特定のリボヌクレオチド又はその濃度に依存しているのかどうかを調べるため、RNAポリメラーゼの種類又はリボヌクレオチドの種類だけが変えられる標準増幅反応を設定した(図2A)。それぞれの反応は、1×Phi29反応緩衝液B中1mMのdNTP、10ngのp53鋳型DNA、及び0.25U/μlのPhi29(BLIRT社 EN20)を含有した。T7-、T3-、又はSP6-RNAポリメラーゼを0.5U/μlで反応混合物に添加した。リボヌクレオチドは、図2Aに示される通りに個々の反応に添加した。結果を解析するため、0.5μlのそれぞれの反応産物をアガロースゲル上に流した。図2Aに見ることができるように、3つのRNAポリメラーゼは全て、リボヌクレオチドが欠如していなければ、DNA増幅のプライミングを可能にする。興味深いことに、UTPはRNAポリメラーゼによるプライミングに非常に無効であると思われ、一方GTP及び/又はATPの使用により最高の収量が得られる。したがって、本発明の方法には少なくとも1つのプリン作動性リボヌクレオチドを含むことが好ましい。
RNAポリメラーゼによるDNA増幅の観察されるプライミングが特定のリボヌクレオチド又はその濃度に依存しているのかどうかを調べるため、RNAポリメラーゼの種類又はリボヌクレオチドの種類だけが変えられる標準増幅反応を設定した(図2A)。それぞれの反応は、1×Phi29反応緩衝液B中1mMのdNTP、10ngのp53鋳型DNA、及び0.25U/μlのPhi29(BLIRT社 EN20)を含有した。T7-、T3-、又はSP6-RNAポリメラーゼを0.5U/μlで反応混合物に添加した。リボヌクレオチドは、図2Aに示される通りに個々の反応に添加した。結果を解析するため、0.5μlのそれぞれの反応産物をアガロースゲル上に流した。図2Aに見ることができるように、3つのRNAポリメラーゼは全て、リボヌクレオチドが欠如していなければ、DNA増幅のプライミングを可能にする。興味深いことに、UTPはRNAポリメラーゼによるプライミングに非常に無効であると思われ、一方GTP及び/又はATPの使用により最高の収量が得られる。したがって、本発明の方法には少なくとも1つのプリン作動性リボヌクレオチドを含むことが好ましい。
RNAポリメラーゼによるDNA増幅のプライミング用のプリン作動性リボヌクレオチドの最適濃度は、GTPとATPの混合物をそれぞれ1mMから4μMまで滴定することにより確立した(図2B)。それぞれの反応は、1×Phi29反応緩衝液B中1mMのdNTP、10ngのpB327鋳型DNA、0.25U/μlのPhi29(BLIRT社 EN20)及びT7-、T3-、又はSP6-RNAポリメラーゼを0.5U/μl含有した。負の対照として、リボヌクレオチドの代わりに水を添加した。わずか15マイクロモルのGTP/ATP濃度で、それでもDNA増幅が容易に観察され、リボヌクレオチドは不可欠であるが、本発明の方法ではデオキシリボヌクレオチドと比べて非常に低濃度で使用しうることが示された。
典型的には、二本鎖DNAへのオリゴヌクレオチド又はランダムヘキサマープライマーの結合には、鋳型DNAを熱又はアルカリ処理により変性させてプライマーをアニーリングさせる追加の変性工程が必要である。そのような工程は、追加の設備及び/又は緩衝液を必要とするが、更に重要なのは、これらの追加された工程は外来性DNAによる汚染のリスクを増やし、鋳型DNAの品質に深刻な影響を与えうる。RNAポリメラーゼによるプライミングも鋳型DNAの変性を必要とするかどうかを明確にするため、pB327プラスミドを過剰なランダムヘキサマーと混合させ、その天然の二本鎖型にしておく、又は95℃で5分間変性させ、ゆっくり冷却して、鋳型DNAにヘキサマープライマーをアニーリングした。鋳型DNA中のニックに起因する考えられる自己プライミングの交絡効果(confounding effects)を最小限に抑えるため、pB327プラスミドは先ずT5エキソヌクレアーゼで処理した。この目的のため、3μgのpB327を37℃で2時間CutSmart緩衝液中30ユニットのT5エキソヌクレアーゼ(NEB社、M0363)と一緒にインキュベートし、NucleoSpinカラム(Macherey-Nagel社、Duren、Germany)で精製した。それぞれの反応において最終濃度が0.5ng/μlの鋳型DNA、50μMのランダムヘキサマー、及び0.5mMのGTP/ATPである標準条件下で反応を設定した。図3のそれぞれのレーン上に示したように、RNAポリメラーゼを0.5U/μlまで添加した。完全反応混合物の別々の各一定分量を30℃でインキュベートし、増幅反応は、65℃で10分間の熱不活化により指示した時点で停止させ、さらなる分析まで-20℃で保存した。ゲル電気泳動による分析に先立って反応産物をXbaIで消化した。消化された反応産物は直鎖化pB327の予想されるサイズ(3.8kb)で移動し、バンドの強度は経時的に増加する。図3から結論できるように、ランダムヘキサマーによる効率的な増幅は、鋳型DNAの変性を必要とし(レーン1と5を比較されたい)、RNAポリメラーゼを添加すれば、天然と変性鋳型DNAの両方のプライミング及び増幅が可能になる。これは、DNA増幅においてRNAポリメラーゼを使用すれば変性工程の必要がなくなり、これによってこの工程は真に等温性になることを暗示している。
(実施例4)
T7-、T3-、及びSP6 RNAポリメラーゼのようなDNA依存性RNAポリメラーゼの転写活性は、そのそれぞれのプロモーター配列に高度に特異的であり、この結合領域は二本鎖のデュプレックスとして認識される(Golombら、1977. J Virol 21: 743～752頁; Stump及びHall、1993. Nucleic Acids Res 21: 5480～5484頁; Maslak及びMartin、1993. Biochemistry 32: 4281～4285頁; Liら、1996. Biochemistry 35: 3722～3727頁)。本発明は、RNAポリメラーゼがDNA増幅をプライミングするように機能することもできること、及びこれが思いがけなくプロモーター配列の非存在下で起こることを例示する。RNAポリメラーゼによるプライミングが一本鎖DNA鋳型上でも起こるのかどうかを明確にするために、一本鎖M13mp18ファージDNAを鋳型として使用する標準増幅反応を設定した。M13mp18(NEB社、N4040)は、単一の独特なXbaI認識部位を含み、二本鎖分子に複製後、M13mp18の直鎖化を可能にする7.2キロ塩基の環状一本鎖DNA分子である。M13mp18配列(Genbank受託番号X02513)は、いかなるT7-、T3、又はSP6-プロモーター配列も欠く。DNA増幅を試験するため、1×Phi29緩衝液(New England Biolabs社)中1ng/μlの一本鎖M13mp18鋳型DNA及び0.5mMのGTP/ATPを使用する標準反応条件を設定した。反応産物はXbaIで消化し、ゲル電気泳動で分析した。図4に示されるように、消化された反応産物は直鎖化されたM13mp18(7.2kb)の予想されるサイズで移動し、一本鎖M13mp18鋳型がヘキサマーとRNAポリメラーゼプライミングの両方により忠実に複製され二本鎖DNAに増幅されることを示している。図4の上のバンドはアガロースゲルの穴に対応し、ほぼ間違いなくM13mp18鋳型の一本鎖高分子量コンカテマーを表している。本実施例は、RNAポリメラーゼが、そのプロモーター配列とは無関係に機能していることは別として、一本鎖DNA鋳型の複製及び増幅を効率的にプライミングできることも例示している。
T7-、T3-、及びSP6 RNAポリメラーゼのようなDNA依存性RNAポリメラーゼの転写活性は、そのそれぞれのプロモーター配列に高度に特異的であり、この結合領域は二本鎖のデュプレックスとして認識される(Golombら、1977. J Virol 21: 743～752頁; Stump及びHall、1993. Nucleic Acids Res 21: 5480～5484頁; Maslak及びMartin、1993. Biochemistry 32: 4281～4285頁; Liら、1996. Biochemistry 35: 3722～3727頁)。本発明は、RNAポリメラーゼがDNA増幅をプライミングするように機能することもできること、及びこれが思いがけなくプロモーター配列の非存在下で起こることを例示する。RNAポリメラーゼによるプライミングが一本鎖DNA鋳型上でも起こるのかどうかを明確にするために、一本鎖M13mp18ファージDNAを鋳型として使用する標準増幅反応を設定した。M13mp18(NEB社、N4040)は、単一の独特なXbaI認識部位を含み、二本鎖分子に複製後、M13mp18の直鎖化を可能にする7.2キロ塩基の環状一本鎖DNA分子である。M13mp18配列(Genbank受託番号X02513)は、いかなるT7-、T3、又はSP6-プロモーター配列も欠く。DNA増幅を試験するため、1×Phi29緩衝液(New England Biolabs社)中1ng/μlの一本鎖M13mp18鋳型DNA及び0.5mMのGTP/ATPを使用する標準反応条件を設定した。反応産物はXbaIで消化し、ゲル電気泳動で分析した。図4に示されるように、消化された反応産物は直鎖化されたM13mp18(7.2kb)の予想されるサイズで移動し、一本鎖M13mp18鋳型がヘキサマーとRNAポリメラーゼプライミングの両方により忠実に複製され二本鎖DNAに増幅されることを示している。図4の上のバンドはアガロースゲルの穴に対応し、ほぼ間違いなくM13mp18鋳型の一本鎖高分子量コンカテマーを表している。本実施例は、RNAポリメラーゼが、そのプロモーター配列とは無関係に機能していることは別として、一本鎖DNA鋳型の複製及び増幅を効率的にプライミングできることも例示している。
(実施例5)
全ゲノム増幅(WGA)は、さらなる処理、分析、又はシーケンシングのために少量のゲノムDNAを増幅する強力な技法である。市販のキットの大半が、PCRベースの方法(例えば、SMARTer(登録商標)PicoPLEX(登録商標)、Takara Bio USA社、Mountain View、CA; GenomePlex(登録商標)WGA kits、Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO)を用いる又はGenomiPhi(商標)(GE Healthcare社、Chicago、IL)及びREPLI-g(Qiagen社、Hilden、Germany)等の多置換増幅(MDA)を使用する。これらのキットの共通の特徴は、これらのキットがランダムプライマー又は半変性オリゴヌクレオチドの使用に頼っていることである。これらの方法の不都合の1つは、プライマーがアニールし増幅をプライミングするためにはゲノムDNA鋳型が変性される必要があることである。微量の又は非常に古いDNAのみが入手可能である場合には(例えば、法医学又は考古学でのような)、貴重なDNA試料の変性は下流の分析にとって有害になる場合がある。ランダム又はセミランダムプライマーを使用する別の不都合は、鋳型DNAの偏った増幅である。これにより、情報の損失が、ミスプライミングに起因するシーケンシングエラーが、又はランダムオリゴヌクレオチドの自己プライミングによる非特異的増幅が生じる場合がある(例えば、Hansenら、2010. Nucleic Acids Res 38: el31; van Gurpら、2013. PLoS ONE 8: e85583; Sabina及びLeamon、2015. Methods Mol Biol 1347: 15～41頁を参照)。サーマス・サーモフィラスHB27から単離されたプライマーゼ-ポリメラーゼ(PrimPol)を使用するゲノム増幅のための新しい方法が最近報告されており(Picherら、2016. Nature Comm 7: 13296頁)、これは、外部添加されるオリゴヌクレオチドプライマーの必要なく内因性のプライマーゼ活性を有する。しかし、この方法は、それでも増幅に先立つ鋳型DNAの変性が必要であり、使用される酵素は広く入手可能ではない。天然の非変性ゲノムDNAの増幅をプライミングするRNAポリメラーゼの能力を分析するため、天然HeLaゲノムDNAを鋳型として使用した。増幅は、0.5mMのGTP/ATP並びに50μMのランダムヘキサマー、指示した0.5U/μlのRNAポリメラーゼ、又は50μMのランダムヘキサマー及び0.5U/μlのRNAポリメラーゼの組合せを含有する1×Phi29緩衝液(New England Biolabs社)において、標準増幅条件下で実施した(図5A及び5B)。増幅用の鋳型として1ng/μlの天然HeLaゲノムDNA(NEB社、N4006)を使用し、鋳型のある及び鋳型なしの同一反応を設定した(図5A及び5B)。増幅に続いて、1μlの未消化増幅産物を0.7%のアガロースゲル上で分析した。図5Aに示すように、レーン1でのプライミング対照なしを除いて全ての反応が増幅産物を生じ、主なDNAバンドは約50～70kb移動しており、これはPhi29媒介DNA重合では最大の産物長と見なされる。ランダムヘキサマーを含有する試料(レーン2、6～8)はより高い強度を示し、より多くの増幅DNAを含有するように思われる。しかし、図5Bでの鋳型対照なしから結論されるように、ランダムヘキサマーの存在下で増幅された産物の大半がアーチファクトだと思われ、ほぼ間違いなくランダムヘキサマーによる自己プライミング及び伸長から生じている。これとは対照的に、RNAポリメラーゼのみの存在下で増幅された鋳型対照なしの反応はいかなる非特異的増幅産物も欠く(レーン3～5)。これにより、RNAポリメラーゼによるプライミングが天然のゲノムDNAの特定の増幅をもたらし、この方法が既存のWGA法の優れた代替法になることが強く示唆される。
全ゲノム増幅(WGA)は、さらなる処理、分析、又はシーケンシングのために少量のゲノムDNAを増幅する強力な技法である。市販のキットの大半が、PCRベースの方法(例えば、SMARTer(登録商標)PicoPLEX(登録商標)、Takara Bio USA社、Mountain View、CA; GenomePlex(登録商標)WGA kits、Sigma-Aldrich社、St. Louis、MO)を用いる又はGenomiPhi(商標)(GE Healthcare社、Chicago、IL)及びREPLI-g(Qiagen社、Hilden、Germany)等の多置換増幅(MDA)を使用する。これらのキットの共通の特徴は、これらのキットがランダムプライマー又は半変性オリゴヌクレオチドの使用に頼っていることである。これらの方法の不都合の1つは、プライマーがアニールし増幅をプライミングするためにはゲノムDNA鋳型が変性される必要があることである。微量の又は非常に古いDNAのみが入手可能である場合には(例えば、法医学又は考古学でのような)、貴重なDNA試料の変性は下流の分析にとって有害になる場合がある。ランダム又はセミランダムプライマーを使用する別の不都合は、鋳型DNAの偏った増幅である。これにより、情報の損失が、ミスプライミングに起因するシーケンシングエラーが、又はランダムオリゴヌクレオチドの自己プライミングによる非特異的増幅が生じる場合がある(例えば、Hansenら、2010. Nucleic Acids Res 38: el31; van Gurpら、2013. PLoS ONE 8: e85583; Sabina及びLeamon、2015. Methods Mol Biol 1347: 15～41頁を参照)。サーマス・サーモフィラスHB27から単離されたプライマーゼ-ポリメラーゼ(PrimPol)を使用するゲノム増幅のための新しい方法が最近報告されており(Picherら、2016. Nature Comm 7: 13296頁)、これは、外部添加されるオリゴヌクレオチドプライマーの必要なく内因性のプライマーゼ活性を有する。しかし、この方法は、それでも増幅に先立つ鋳型DNAの変性が必要であり、使用される酵素は広く入手可能ではない。天然の非変性ゲノムDNAの増幅をプライミングするRNAポリメラーゼの能力を分析するため、天然HeLaゲノムDNAを鋳型として使用した。増幅は、0.5mMのGTP/ATP並びに50μMのランダムヘキサマー、指示した0.5U/μlのRNAポリメラーゼ、又は50μMのランダムヘキサマー及び0.5U/μlのRNAポリメラーゼの組合せを含有する1×Phi29緩衝液(New England Biolabs社)において、標準増幅条件下で実施した(図5A及び5B)。増幅用の鋳型として1ng/μlの天然HeLaゲノムDNA(NEB社、N4006)を使用し、鋳型のある及び鋳型なしの同一反応を設定した(図5A及び5B)。増幅に続いて、1μlの未消化増幅産物を0.7%のアガロースゲル上で分析した。図5Aに示すように、レーン1でのプライミング対照なしを除いて全ての反応が増幅産物を生じ、主なDNAバンドは約50～70kb移動しており、これはPhi29媒介DNA重合では最大の産物長と見なされる。ランダムヘキサマーを含有する試料(レーン2、6～8)はより高い強度を示し、より多くの増幅DNAを含有するように思われる。しかし、図5Bでの鋳型対照なしから結論されるように、ランダムヘキサマーの存在下で増幅された産物の大半がアーチファクトだと思われ、ほぼ間違いなくランダムヘキサマーによる自己プライミング及び伸長から生じている。これとは対照的に、RNAポリメラーゼのみの存在下で増幅された鋳型対照なしの反応はいかなる非特異的増幅産物も欠く(レーン3～5)。これにより、RNAポリメラーゼによるプライミングが天然のゲノムDNAの特定の増幅をもたらし、この方法が既存のWGA法の優れた代替法になることが強く示唆される。
(実施例6)
RNAポリメラーゼがランダムヘキサマープライミングDNA増幅の動態を変化させるのかどうか、又は産物収量を増強することができるのかどうかも調べた。この目的のため、反応当たり50μMのヘキサマー、0.5mMのGTP/ATP、及び10ngのpB327プラスミドを含有する1×Phi29緩衝液(Biolab Innovative Research Technologies社)において標準増幅反応を実施した。反応予備混合は4部分に分け、水(ヘキサマーのみ、上左パネル)を、又は0.5U/μlの指示したRNAポリメラーゼを補充した(図6A)。指示した時点で、反応を停止させ、等量の増幅産物をXbaI消化及びゲル電気泳動により分析した。動態を定量化するため、バンド強度をImageJソフトウェア(Schneiderら、2012. Nature Methods 9: 671～675頁)を使用して決定し、マイクロソフトエクセルで図表を用いて分析した(図6B)。明らかに、RNAポリメラーゼの添加により増幅反応の総収量は劇的に増加し、ヘキサマー単独よりもはるかに速く最大収量に達する。最大収量は反応混合物中のdNTPの枯渇により又はdNTPの重合中に形成されるピロリン酸の阻害効果により決定し、この状態は、T7-及びT3 RNAポリメラーゼでは8～16時間の間、SP6 RNAポリメラーゼではそれよりもいくぶん早く到達すると思われる。
RNAポリメラーゼがランダムヘキサマープライミングDNA増幅の動態を変化させるのかどうか、又は産物収量を増強することができるのかどうかも調べた。この目的のため、反応当たり50μMのヘキサマー、0.5mMのGTP/ATP、及び10ngのpB327プラスミドを含有する1×Phi29緩衝液(Biolab Innovative Research Technologies社)において標準増幅反応を実施した。反応予備混合は4部分に分け、水(ヘキサマーのみ、上左パネル)を、又は0.5U/μlの指示したRNAポリメラーゼを補充した(図6A)。指示した時点で、反応を停止させ、等量の増幅産物をXbaI消化及びゲル電気泳動により分析した。動態を定量化するため、バンド強度をImageJソフトウェア(Schneiderら、2012. Nature Methods 9: 671～675頁)を使用して決定し、マイクロソフトエクセルで図表を用いて分析した(図6B)。明らかに、RNAポリメラーゼの添加により増幅反応の総収量は劇的に増加し、ヘキサマー単独よりもはるかに速く最大収量に達する。最大収量は反応混合物中のdNTPの枯渇により又はdNTPの重合中に形成されるピロリン酸の阻害効果により決定し、この状態は、T7-及びT3 RNAポリメラーゼでは8～16時間の間、SP6 RNAポリメラーゼではそれよりもいくぶん早く到達すると思われる。
市販の等温DNA増幅キットは典型的には、ランダムヘキサマープライマーを非常に高い(50又は100μMでさえ)濃度で使用し、この濃度は増幅産物よりも莫大なモル過剰を表す。この濃度を収量を損失せずにRNAポリメラーゼの存在下で下げることができるかどうかを調べるため、固定量のT7 RNAポリメラーゼと可変量のランダムヘキサマーを標準増幅反応で試験した。ランダムヘキサマーを鋳型DNAにアニールさせるため、熱変性p53プラスミドDNAをこの実験では鋳型として使用した。更に、この鋳型はT7 RNAポリメラーゼに対するいかなるコンセンサスプロモーター配列も含まない。30℃での16時間のインキュベーションに続いて、反応産物はゲル上で分析した。T7 RNAポリメラーゼが存在しなければ、ランダムヘキサマーなしではDNA増幅は観察されなかった(図6C;一連のうちの最初のレーン)。その上、T7 RNAポリメラーゼの存在下での最大収量は20μMのヘキサマー濃度で到達するように思われるが、RNAポリメラーゼの非存在下では、100μMも含有する反応でも最大増幅収量に到達しなかった。これは、RNAポリメラーゼ及びリボヌクレオチドの添加によりプライマー依存性DNA増幅が強く増強されることを示している。
(実施例7)
本発明の方法が他の供給業者の類似する酵素を用いても機能することを確かめるため及び発明された方法の頑健性を試験するため、鋳型として10ngのp53プラスミドDNA及び3つの異なる供給業者製のPhi29 DNAポリメラーゼを使用する標準反応条件を設定した。更に、2つの異なる供給業者製のRNAポリメラーゼが含まれ、全ての可能な組合せを試験した(図7A)。パネルaの反応はBlirt社製の0.25U/μlのPhi29ポリメラーゼを含み、パネルbの反応はNew England Biolabs社製の0.25U/μlのPhi29ポリメラーゼを含み、パネルcの反応はThermo Fisher社製の0.25U/μlのPhi29ポリメラーゼを含む。3つのDNAポリメラーゼは全て対応する供給業者製の反応緩衝液と組み合わせて使用した。反応産物はXbaIで消化し、ゲル電気泳動により分析した。図7Aに図示されるように、6つの試験したRNAポリメラーゼ全てがDNA増幅の効率的なプライミングを可能にし、ランダムヘキサマーによるプライミングに匹敵していた(それぞれのパネルでレーン2とレーン3～8を比較されたい)。更に、3つの異なる供給業者製のPhi29 DNAポリメラーゼは鋳型DNAを効率的に増幅し(パネルa～cを比較されたい)、本発明の方法は異なる供給業者製の種々のポリメラーゼを用いて機能することを示している。レーン間の増幅産物の異なる強度は、同じ又は異なる供給業者製のRNAポリメラーゼとDNAポリメラーゼのある特定の組合せによって機能に善し悪しがありうることを示唆している。この方法の頑健性を更に試験するため、RNAポリメラーゼプライミングDNA増幅は、著しく異なる組成物をもつ2つの緩衝液;50mMのトリス-HCl(25℃でpH 7.5)、10mMのMgCl2、10mMの(NH4)2SO4、及び4mMのDTTを含有するPhi29緩衝液N(図7Bでは「トリス-HCl緩衝液」と表示される)又は33mMの酢酸トリス(37℃でpH 7.9)、66mMの酢酸カリウム、10mMの酢酸マグネシウム、0.1%のTween-20及び1mMのDTTを含有するPhi29緩衝液B(図7Bでは「酢酸トリス緩衝液」と表示される)において実施した。他の反応成分は全て同一に保った: 1mMのdNTP、0.5ng/μlのp53プラスミドDNA、0.25U/μlのPhi29ポリメラーゼ(Blirt社、EN20)、0.5mMのGTP/ATP。反応は、50μMのランダムヘキサマー(レーン1及び5)、又はThermo Fisher社製の0.5U/μlのT7 RNAポリメラーゼ(レーン2及び6)、又はThermo Fisher社製の0.5U/μlのT3 RNAポリメラーゼ(レーン3及び7)、又はThermo Fisher社製の0.5U/μlのSP6 RNAポリメラーゼ(レーン4及び8)を添加することによりプライミングを与え、30℃で16時間インキュベートしてDNA増幅を可能にした。反応産物は、XbaIで消化しゲル電気泳動により分析した。図7Bに描かれているように、異なる緩衝液シリーズ間では収量に有意差は観察されなかった。したがって、提示されている例は、いかなる特定の酵素供給業者又は緩衝液組成物にも依存しない頑健な増幅法を支持する。
本発明の方法が他の供給業者の類似する酵素を用いても機能することを確かめるため及び発明された方法の頑健性を試験するため、鋳型として10ngのp53プラスミドDNA及び3つの異なる供給業者製のPhi29 DNAポリメラーゼを使用する標準反応条件を設定した。更に、2つの異なる供給業者製のRNAポリメラーゼが含まれ、全ての可能な組合せを試験した(図7A)。パネルaの反応はBlirt社製の0.25U/μlのPhi29ポリメラーゼを含み、パネルbの反応はNew England Biolabs社製の0.25U/μlのPhi29ポリメラーゼを含み、パネルcの反応はThermo Fisher社製の0.25U/μlのPhi29ポリメラーゼを含む。3つのDNAポリメラーゼは全て対応する供給業者製の反応緩衝液と組み合わせて使用した。反応産物はXbaIで消化し、ゲル電気泳動により分析した。図7Aに図示されるように、6つの試験したRNAポリメラーゼ全てがDNA増幅の効率的なプライミングを可能にし、ランダムヘキサマーによるプライミングに匹敵していた(それぞれのパネルでレーン2とレーン3～8を比較されたい)。更に、3つの異なる供給業者製のPhi29 DNAポリメラーゼは鋳型DNAを効率的に増幅し(パネルa～cを比較されたい)、本発明の方法は異なる供給業者製の種々のポリメラーゼを用いて機能することを示している。レーン間の増幅産物の異なる強度は、同じ又は異なる供給業者製のRNAポリメラーゼとDNAポリメラーゼのある特定の組合せによって機能に善し悪しがありうることを示唆している。この方法の頑健性を更に試験するため、RNAポリメラーゼプライミングDNA増幅は、著しく異なる組成物をもつ2つの緩衝液;50mMのトリス-HCl(25℃でpH 7.5)、10mMのMgCl2、10mMの(NH4)2SO4、及び4mMのDTTを含有するPhi29緩衝液N(図7Bでは「トリス-HCl緩衝液」と表示される)又は33mMの酢酸トリス(37℃でpH 7.9)、66mMの酢酸カリウム、10mMの酢酸マグネシウム、0.1%のTween-20及び1mMのDTTを含有するPhi29緩衝液B(図7Bでは「酢酸トリス緩衝液」と表示される)において実施した。他の反応成分は全て同一に保った: 1mMのdNTP、0.5ng/μlのp53プラスミドDNA、0.25U/μlのPhi29ポリメラーゼ(Blirt社、EN20)、0.5mMのGTP/ATP。反応は、50μMのランダムヘキサマー(レーン1及び5)、又はThermo Fisher社製の0.5U/μlのT7 RNAポリメラーゼ(レーン2及び6)、又はThermo Fisher社製の0.5U/μlのT3 RNAポリメラーゼ(レーン3及び7)、又はThermo Fisher社製の0.5U/μlのSP6 RNAポリメラーゼ(レーン4及び8)を添加することによりプライミングを与え、30℃で16時間インキュベートしてDNA増幅を可能にした。反応産物は、XbaIで消化しゲル電気泳動により分析した。図7Bに描かれているように、異なる緩衝液シリーズ間では収量に有意差は観察されなかった。したがって、提示されている例は、いかなる特定の酵素供給業者又は緩衝液組成物にも依存しない頑健な増幅法を支持する。
(実施例8)
遺伝子治療又はDNAワクチン等のDNAの治療応用は、汚染物質のない高純度の配列確認されたDNA製剤が必要である。したがって、本発明による合成的無細胞DNA増幅は、DNAベースの治療薬の増幅及び生産の簡単で手ごろな値段の別法を提供する。代替的に、本発明の方法は、好ましくは存在する鋳型DNAの量が限られている場合には、DNAシーケンシングの過程で使用しうる。機能的DNAの生産は、種々の条件下でGFP発現ベクターを増幅させ、消化された増幅産物を発現分析のために細胞中にトランスフェクトすることにより試験した。増幅産物のDNA配列は、サンガーシーケンシングにより検証した。
遺伝子治療又はDNAワクチン等のDNAの治療応用は、汚染物質のない高純度の配列確認されたDNA製剤が必要である。したがって、本発明による合成的無細胞DNA増幅は、DNAベースの治療薬の増幅及び生産の簡単で手ごろな値段の別法を提供する。代替的に、本発明の方法は、好ましくは存在する鋳型DNAの量が限られている場合には、DNAシーケンシングの過程で使用しうる。機能的DNAの生産は、種々の条件下でGFP発現ベクターを増幅させ、消化された増幅産物を発現分析のために細胞中にトランスフェクトすることにより試験した。増幅産物のDNA配列は、サンガーシーケンシングにより検証した。
材料及び方法
増幅:トランスフェクション研究用のDNAは、10ngのp53を鋳型DNAとして使用して標準反応条件下で生成した。増幅は、0.5mMのGTP/ATPを用いて若しくはなしで(発現研究におけるリボヌクレオチドの考えられる影響を排除するため)50μMのランダムヘキサマーを添加することにより、又は0.5mMのGTP/ATP及び0.5U/μlのT7 RNAポリメラーゼ、0.5U/μlのT3 RNAポリメラーゼ若しくは0.5U/μlのSP6 RNAポリメラーゼにより開始した。P53プラスミドの増幅産物は37℃で2時間PvuI(NEB社、R3150)を用いて消化した。プラスミドp53は、ベクター骨格に単一で独特なPvuI認識部位を含有することにより、PvuIでの消化により、GFP発現を駆動する無傷の発現カセットを含む直鎖化完全長プラスミドが生じる。消化に続いて、直鎖状DNA断片はNucleoSpin Gel及びPCR Clean-up (Macherey-Nagel社、Diiren、Germany)を使用して精製し、10mMのトリス-HCl、0.1mMのEDTAに希釈し、DNA濃度はNanoDrop分光光度計(ThermoFisher社)上で測定した。
増幅:トランスフェクション研究用のDNAは、10ngのp53を鋳型DNAとして使用して標準反応条件下で生成した。増幅は、0.5mMのGTP/ATPを用いて若しくはなしで(発現研究におけるリボヌクレオチドの考えられる影響を排除するため)50μMのランダムヘキサマーを添加することにより、又は0.5mMのGTP/ATP及び0.5U/μlのT7 RNAポリメラーゼ、0.5U/μlのT3 RNAポリメラーゼ若しくは0.5U/μlのSP6 RNAポリメラーゼにより開始した。P53プラスミドの増幅産物は37℃で2時間PvuI(NEB社、R3150)を用いて消化した。プラスミドp53は、ベクター骨格に単一で独特なPvuI認識部位を含有することにより、PvuIでの消化により、GFP発現を駆動する無傷の発現カセットを含む直鎖化完全長プラスミドが生じる。消化に続いて、直鎖状DNA断片はNucleoSpin Gel及びPCR Clean-up (Macherey-Nagel社、Diiren、Germany)を使用して精製し、10mMのトリス-HCl、0.1mMのEDTAに希釈し、DNA濃度はNanoDrop分光光度計(ThermoFisher社)上で測定した。
細胞培養及びトランスフェクション:ヒト胎児性腎臓細胞(HEK293、ATCC CRL-1573)及びマウスメラノーマ細胞(B16F10、ATCC CRL-6475)は、5%の熱不活化ウシ胎仔血清(FBS、Sigma-Aldrich社、F0804)及び1%のペニシリン-ストレプトマイシン混合物(Lonza社、17-602E)を補充したIMDM培地(ThermoFisher-Gibco社、21980-032)において、標準組織培養条件下で維持した。トランスフェクション1日前、ウェル当たり100μlのIMDM培地中20×10E3 HEK293又は4×10E3 B16-F10細胞を96ウェル平底組織培養プレートに播種した。その次の日、トランスフェクションは、Saint-DNAトランスフェクション試薬(SD-2001-01、Synvolux Products社、Leiden、the Netherlands)を使用して製造業者の説明書に従って、三重に(in triplo)実行した。手短に言えば、Saint-DNAを室温に較正し、30秒間ボルテックスした。それぞれのウェルについて、50ngのPvuI消化及び精製RCA産物を、室温で5分間、総容積10μlでリン酸緩衝食塩水(PBS、Lonza社、17-516F)中1μlのSaint-DNAと組み合わせた。複合体(10μl)はそれぞれのウェルに添加し、細胞はCO2インキュベーターに置いた。48時間後、細胞はPBSで1回すすぎ、トリプシン処理(ThermoFisher-Gibco社)により収穫し、PBS及び0.5%のウシ血清アルブミン(BSA、Biowest社、P6154)を含むFACS緩衝液を用いて2回洗浄した。GFP発現はGuava EasyCyte 5HT(Merck-Millipore社、Burlington、MA、USA)上で分析した。データはGuavaSoft 3.3(Merck社)で分析した。
DNAシーケンシング:増幅中のヌクレオチド取り込みの同一性及び忠実度を検証するため、RCA産物のシーケンシングをサンガーシーケンシングを使用して実施した。この目的のため、プラスミドpB327をランダムヘキサマー、又はRNAポリメラーゼの存在下、標準増幅条件下で増幅させた。それぞれの反応は以下の成分、1×Phi29反応緩衝液N中に1mMのdNTP、0.5mMのGTP/ATP、0.25U/μlのPhi29 (Blirt社、EN20)及び10ngのpB327プラスミドDNA鋳型を含有した。プライミングは、下のTable 2(表2)に指示するように、50μMのランダムヘキサマー、0.5U/μlのT7 RNAポリメラーゼ、0.5U/μlのT3 RNAポリメラーゼ又は0.5U/μlのSP6 RNAポリメラーゼにより開始した。反応物は30℃で16時間インキュベートし、続いてXbaI消化し、NucleoSpin Gel及びPCR Clean-up(Macherey-Nagel社、Duren、Germany)を使用して精製した。DNAシーケンシングは、ABI 3730遺伝子解析装置(Fisher Scientific社、Landsmeer、the Netherlands)上で、pB327特異的フォワードシーケンシングプライマー及びBigDye(登録商標)Terminator v3.1サイクルシーケンシング(Fisher Scientific社、Landsmeer、the Netherlands)を使用してBaseclear B.V.(Leiden社、the Netherlands)により実施した。
結果
反応産物のトランスフェクション効率と発現を比較するため、p53鋳型DNAを、ランダムヘキサマー又はRNAポリメラーゼの存在下、標準条件下で増幅させた。p53プラスミドは、CMVプロモーター、緑色蛍光タンパク質(GFP)、及びベータグロビンポリAシグナルを有する発現カセットを含み、フローサイトメトリーによる単細胞発現モニタリングを可能にする。
反応産物のトランスフェクション効率と発現を比較するため、p53鋳型DNAを、ランダムヘキサマー又はRNAポリメラーゼの存在下、標準条件下で増幅させた。p53プラスミドは、CMVプロモーター、緑色蛍光タンパク質(GFP)、及びベータグロビンポリAシグナルを有する発現カセットを含み、フローサイトメトリーによる単細胞発現モニタリングを可能にする。
図8、左パネルに図解されているように、増幅産物は全て、HEK293細胞においても(最大90%)B16F10細胞においても(最大70%)効率的にトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞の数に明らかな差はなかった。発現レベルは、細胞当たりのGFP蛍光のレベルにより評価された場合も、トランスフェクトされたDNA産物間にいかなる有意差も示さなかった。これは、(1)増幅反応にリボヌクレオチドが含まれても、増幅産物の転写に影響を与えない、(2)本発明の方法による、RNAポリメラーゼによるDNA増幅のプライミングは、細胞での発現及び考えられる治療目的に適した純粋で機能的なDNAを送達することを示している。
シーケンシング結果(Table 2(表2)参照)によれば、RNAポリメラーゼによるプライミングは鋳型DNAを忠実に複製し増幅させることができ、増幅産物ははじめの鋳型DNAにDNA配列が100%同一であることが明らかになった。これは、本発明の方法がDNAシーケンシング目的でも使用しうることを論じている。
(実施例9)
遺伝子治療目的では、維持された発現及び再現性が成功には重要な要因である。合成直鎖状DNAのインビボ遺伝子発現を調べ比較するため、ホタルルシフェラーゼをコードする等モル量のプラスミドDNA(pDNA、10ug)若しくは直鎖状DNA(InDNA、5.4ug)を、又は対照としてリン酸緩衝食塩水を0日目及び41日目、マウスに皮内注射した(1群当たりn=4匹)。ルシフェラーゼ活性は、指示した時点でIVIS Spectrumインビボ撮像システム(Perkin Elmer社)で測定した。ルシフェラーゼ活性は、プラスミドDNA又は直鎖状DNAを注射され、両方ともおおよそ2.0×107光子/秒(p/s)で開始し、1ヶ月後おおよそ1.0×106p/sまで減衰したマウスに匹敵していた(図9)。DNAの2度目の注射では、プラスミドDNAと直鎖状DNAの両方でルシフェラーゼ活性の類似するレベル及び動態が得られ、本発明の方法により生成された合成直鎖状DNAがインビボで活性であり、プラスミドDNAに匹敵することが示されている。
遺伝子治療目的では、維持された発現及び再現性が成功には重要な要因である。合成直鎖状DNAのインビボ遺伝子発現を調べ比較するため、ホタルルシフェラーゼをコードする等モル量のプラスミドDNA(pDNA、10ug)若しくは直鎖状DNA(InDNA、5.4ug)を、又は対照としてリン酸緩衝食塩水を0日目及び41日目、マウスに皮内注射した(1群当たりn=4匹)。ルシフェラーゼ活性は、指示した時点でIVIS Spectrumインビボ撮像システム(Perkin Elmer社)で測定した。ルシフェラーゼ活性は、プラスミドDNA又は直鎖状DNAを注射され、両方ともおおよそ2.0×107光子/秒(p/s)で開始し、1ヶ月後おおよそ1.0×106p/sまで減衰したマウスに匹敵していた(図9)。DNAの2度目の注射では、プラスミドDNAと直鎖状DNAの両方でルシフェラーゼ活性の類似するレベル及び動態が得られ、本発明の方法により生成された合成直鎖状DNAがインビボで活性であり、プラスミドDNAに匹敵することが示されている。
(実施例10)
材料及び方法
マウス及び腫瘍細胞株: C57BL/6(Jico)マウス及びB6アルビノマウス(strain B6/Rj-Tyrc/c)はそれぞれJackson laboratory社(Bar Harbor、ME、USA)及びJanvier Labs社(Le Genest-Saint-Isle、France)から購入した。マウスはFELASA対応条件下で収容し、全ての動物実験はオランダ動物倫理委員会によりそのガイドラインに従って承認された。卵白アルブミンを安定的にトランスフェクトされたB16-F10メラノーマ細胞株の誘導体であるB16-OVAを、加湿CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)においてL-グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン(全てThermoFisher-Gibco社製)の存在下、8%のウシ胎仔血清(Sigma-Aldrich社、Zwijndrecht、the Netherlands)を補充したIMDM (ThermoFisher-Gibco社、Waltham、MA、USA)からなる培養培地で維持した。
材料及び方法
マウス及び腫瘍細胞株: C57BL/6(Jico)マウス及びB6アルビノマウス(strain B6/Rj-Tyrc/c)はそれぞれJackson laboratory社(Bar Harbor、ME、USA)及びJanvier Labs社(Le Genest-Saint-Isle、France)から購入した。マウスはFELASA対応条件下で収容し、全ての動物実験はオランダ動物倫理委員会によりそのガイドラインに従って承認された。卵白アルブミンを安定的にトランスフェクトされたB16-F10メラノーマ細胞株の誘導体であるB16-OVAを、加湿CO2インキュベーター(37℃、5%CO2)においてL-グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン(全てThermoFisher-Gibco社製)の存在下、8%のウシ胎仔血清(Sigma-Aldrich社、Zwijndrecht、the Netherlands)を補充したIMDM (ThermoFisher-Gibco社、Waltham、MA、USA)からなる培養培地で維持した。
インビボ研究のための直鎖状DNA生成:BsaI制限酵素部位に隣接するホタルルシフェラーゼ又はB16-OVAエピトープをコードする環状プラスミドDNAを本発明の方法によりインビトロで増幅させた。プラスミド骨格配列を欠く発現カセットは、BsaI(NEB社、Ipswich、MA、USA)での消化により鎖状体増幅産物から入手し、37℃で1時間及び16℃で1時間の8サイクル中ヌクレアーゼ耐性ヘアピンオリゴ(IDT社、Coralville、OH、USA)にライゲートして、閉鎖末端をもつ直鎖状DNA(InDNA)を得た。次に、T5エキソヌクレアーゼ(NEB社、Ipswich、MA、USA)を37℃で16時間添加してベクター骨格及び未ライゲート産物を取り除いた。大腸菌細菌培養により生成されたプラスミドDNA及び直鎖状DNAは、Nucleobond Xtra maxi EFカラム(Macherey-Nagel社、Duren、Germany)を用いて2度精製し、10%のトリス-EDTA緩衝液に再懸濁した。
インビボ生物発光撮像:0日目及び41日目に、B6アルビノマウスの尾部付け根に、等モル用量のルシフェラーゼコードプラスミドDNA又は直鎖状DNAを皮内注射した。対照群は同じ容積のPBSを受けた。インビボ生物発光撮像では、マウスに150mg/kgのD-ルシフェリン(Synchem社;カタログ番号bc219)を皮下注射した。15分後、マウスにはイソフルラン吸入により麻酔をかけ、撮像はIVIS Spectrum小動物撮像装置(PerkinElmer社)を使用して実施した。オープンフィルター及び自動捕捉時間(acquisition time)を使用する光シグナルは、全実験中ずっと目的の固定サイズの領域を使用してマウスの尾部付け根で定量化した。画像分析及び発光定量化はLivinglmageソフトウェア(PerkinElmer社)を使用して実施した。
マウスワクチン接種、免疫応答及び腫瘍負荷:0日目、雄C57BL/6マウス(3群それぞれマウス8匹)に、等モル量(4.3pmol)のDNA分子を含有する30μlの0.9%NaCl溶液を皮内注射した。第1の群には、OVA特異的エピトープを含む複数の抗原をコードする10μgの環状プラスミドDNA(3.6kB)をワクチン接種した。第2の群は5.4ugの直鎖状DNA(1.9kb)をワクチン接種し、第1の群で使用したのと同じであるが細菌骨格配列を欠くプラスミドベクターから増幅させ、第3の(対照)群は非処置のままにした。ワクチン接種の2週間後、全てのマウスから採血し、赤血球溶解緩衝液で処置し、LUMCテトラマー設備、Leiden、the Netherlandsで生産されたPEコンジュゲートH2-Kb/SIINFEKLテトラマーで染色して、OVA特異的CD8 T細胞を検出した。試料はBD LSRII(Becton Dickinson社、San Jose、CA、USA)及びFlowJoソフトウェア(FlowJo LLC社)上でフローサイトメトリーにより分析した。分析されたデータはGraphPad Prismソフトウェア(San Diego、CA、USA)にプロットした。ワクチン接種後の21日目に、マウスには50,000のB16-OVA細胞を皮下注射した。腫瘍成長は3～4日ごとにモニターし、腫瘍サイズは、(長さ×幅×幅)/2として計算した。1000mm3を超える腫瘍を保有する又は出血性潰瘍を抱えたマウスはCO2窒息により殺処分した。
結果
本発明の方法は、純粋なDNAの迅速で安価な生産に、例えば、個別化されたがんワクチンの生産に特に適している。合成直鎖状DNAがT細胞活性化及び腫瘍防御を誘導するかどうかを調べるため、ナイーブな6～8週齢C57BL/6マウスは、OVAエピトープをコードする等モル量のプラスミドDNA(pDNA、10ug)又は直鎖状DNA(InDNA、5.4ug)の1回皮内ワクチン接種を受けた。対照群のマウスは非処置のままにした(n=群当たり8)。テトラマー染色及びフローサイトメトリーはワクチン接種後14日目に末梢血で実施して、OVA特異的T細胞の誘導を検出した。図10Aに示されるように、プラスミドDNA又は直鎖状DNAを用いたワクチン接種により、ワクチン内にコードされているOVAエピトープに特異的であるT細胞の有意で比較可能な誘導が生じた。次に、同じマウスにワクチン接種21日後にB16-OVA腫瘍細胞(50,000細胞/マウス)を負荷し、腫瘍成長を追跡した。図10Bは、非処置マウスは全て(1例外あり)腫瘍成長のために1月以内に死亡したことを示している。これとは対照的に、プラスミドDNA(10ug)又は直鎖状DNA(5.4ug)を用いたワクチン接種では腫瘍成長に対してほぼ完全に防御された。生存マウスは、実験の残りの期間(優に100日を超える)腫瘍なしのままでいた。
本発明の方法は、純粋なDNAの迅速で安価な生産に、例えば、個別化されたがんワクチンの生産に特に適している。合成直鎖状DNAがT細胞活性化及び腫瘍防御を誘導するかどうかを調べるため、ナイーブな6～8週齢C57BL/6マウスは、OVAエピトープをコードする等モル量のプラスミドDNA(pDNA、10ug)又は直鎖状DNA(InDNA、5.4ug)の1回皮内ワクチン接種を受けた。対照群のマウスは非処置のままにした(n=群当たり8)。テトラマー染色及びフローサイトメトリーはワクチン接種後14日目に末梢血で実施して、OVA特異的T細胞の誘導を検出した。図10Aに示されるように、プラスミドDNA又は直鎖状DNAを用いたワクチン接種により、ワクチン内にコードされているOVAエピトープに特異的であるT細胞の有意で比較可能な誘導が生じた。次に、同じマウスにワクチン接種21日後にB16-OVA腫瘍細胞(50,000細胞/マウス)を負荷し、腫瘍成長を追跡した。図10Bは、非処置マウスは全て(1例外あり)腫瘍成長のために1月以内に死亡したことを示している。これとは対照的に、プラスミドDNA(10ug)又は直鎖状DNA(5.4ug)を用いたワクチン接種では腫瘍成長に対してほぼ完全に防御された。生存マウスは、実験の残りの期間(優に100日を超える)腫瘍なしのままでいた。
Claims (15)
- 鋳型DNA分子を増幅するための方法であって、
a)鋳型DNA分子を用意する工程、
b)RNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ、並びにリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの組合せを用意する工程、
c)前記材料を、適切な緩衝液中で適切な時間インキュベートして、前記鋳型DNA分子の複製及び増幅を可能にする工程
を含む、方法。 - 前記RNAポリメラーゼが、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼ、SP6 RNAポリメラーゼ、又はその変異体の群から好ましくは選択される、単一サブユニットRNAポリメラーゼである、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、Phi29、Bst、ベントDNAポリメラーゼ、又はその組合せから好ましくは選択される、鎖置換活性を有するDNA依存性DNAポリメラーゼである、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記リボヌクレオチドが、アデニン又はグアニン又はその組合せ等の、プリン核酸塩基を有する少なくとも1つのリボヌクレオチドを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 複製及び増幅が、前記鋳型DNA分子に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチド、ランダムオリゴヌクレオチドの混合物、又はその組合せを用意する工程を更に含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- ヌクレオチド又はリボヌクレオチドの少なくとも1種が、好ましくは検出可能な標識で、修飾又は標識化される、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 増幅産物が、蛍光により及び/又は化学的手段により、例えばビオチン若しくはフルオロフォア標識化プローブにより、及び/又はフルオロフォアコンジュゲートdNTPの存在下での増幅により検出される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- DNA鋳型上にプライマーを付与するための、及び、任意選択的に、デオキシリボヌクレオチドの存在下で鎖置換DNAポリメラーゼにより前記プライマーから前記DNA鋳型を増幅するためのRNAポリメラーゼの使用。
- プライマーの付与が、プリン核酸塩基を有する少なくとも1つのリボヌクレオチド、より好ましくは、GTP、ATP、及びCTPから選択される2つ又は3つのリボヌクレオチドを供することを好ましくは含む、請求項8に記載の使用。
- ゲノムDNAを含む、直鎖状又は環状の一本鎖又は二本鎖DNA分子を増幅するための、請求項8又は請求項9に記載の使用。
- 遺伝子療法及びワクチンを含むがこれらに限定されない治療目的でDNAを増幅するための、請求項8から10のいずれか一項に記載の使用。
- 法医学又は診断目的のための、例えば、遺伝子型判定、DNAシーケンシングにおける、ウイルス若しくは細菌DNAの検出における、又は核酸突然変異の検出における、請求項8から10のいずれか一項に記載の使用。
- RNAポリメラーゼ、鎖置換DNAポリメラーゼ、又はその混合物、及び、任意選択的に、適切な緩衝液を保有するパーツを含む、パーツのキット。
- リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び/又はその混合物を更に含む、請求項13に記載のパーツのキット。
- 鋳型DNA分子の増幅のための、請求項13又は請求項14に記載のパーツのキットの使用。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL2022993 | 2019-04-23 | ||
| NL2022993A NL2022993B1 (en) | 2019-04-23 | 2019-04-23 | Methods and compositions for isothermal DNA amplification |
| PCT/NL2020/050261 WO2020218924A1 (en) | 2019-04-23 | 2020-04-23 | Methods and compositions for isothermal dna amplification |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2022530476A true JP2022530476A (ja) | 2022-06-29 |
Family
ID=66641433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021563380A Pending JP2022530476A (ja) | 2019-04-23 | 2020-04-23 | 等温ｄｎａ増幅のための方法及び組成物 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20220213538A1 (ja) |
| EP (1) | EP3959335A1 (ja) |
| JP (1) | JP2022530476A (ja) |
| KR (1) | KR20220025709A (ja) |
| CN (1) | CN114072521A (ja) |
| AU (1) | AU2020262824A1 (ja) |
| CA (1) | CA3133932A1 (ja) |
| NL (1) | NL2022993B1 (ja) |
| WO (1) | WO2020218924A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023096494A1 (en) | 2021-11-26 | 2023-06-01 | Synvolux Ip B.V. | Conserved coronavirus t cell epitopes |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2240334C (en) | 1995-12-15 | 2008-07-22 | Amersham Life Science, Inc. | Thermostable dna polymerase from thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus and mutant enzymes thereof with exonuclease activity removed |
| JP2003526328A (ja) * | 1999-01-11 | 2003-09-09 | プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ | Ｄｎａの等温増幅 |
| AU2005203180A1 (en) * | 1999-01-11 | 2005-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Isothermal Amplification of DNA |
| WO2010065629A2 (en) * | 2008-12-02 | 2010-06-10 | Kapabiosystems | Nucleic acid amplification |
| JP5616584B2 (ja) * | 2009-01-09 | 2014-10-29 | 富士フイルム株式会社 | 核酸配列の複製方法 |
| DK2971080T3 (en) * | 2013-03-15 | 2018-02-12 | Expedeon S L | METHODS FOR AMPLIFICATION AND SEQUENCE USING THERMOSTABLE TTHPRIMPOL |
| US20190032109A1 (en) * | 2016-01-27 | 2019-01-31 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Single molecule timers and clocks |
-
2019
- 2019-04-23 NL NL2022993A patent/NL2022993B1/en active
-
2020
- 2020-04-23 CA CA3133932A patent/CA3133932A1/en active Pending
- 2020-04-23 US US17/605,097 patent/US20220213538A1/en active Pending
- 2020-04-23 EP EP20721838.9A patent/EP3959335A1/en active Pending
- 2020-04-23 WO PCT/NL2020/050261 patent/WO2020218924A1/en unknown
- 2020-04-23 CN CN202080045635.7A patent/CN114072521A/zh active Pending
- 2020-04-23 KR KR1020217038080A patent/KR20220025709A/ko unknown
- 2020-04-23 JP JP2021563380A patent/JP2022530476A/ja active Pending
- 2020-04-23 AU AU2020262824A patent/AU2020262824A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2020218924A1 (en) | 2020-10-29 |
| AU2020262824A1 (en) | 2021-11-18 |
| KR20220025709A (ko) | 2022-03-03 |
| NL2022993B1 (en) | 2020-11-02 |
| US20220213538A1 (en) | 2022-07-07 |
| CA3133932A1 (en) | 2020-10-29 |
| EP3959335A1 (en) | 2022-03-02 |
| CN114072521A (zh) | 2022-02-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220127667A1 (en) | Method of dna synthesis | |
| KR101926662B1 (ko) | 닫힌 선형 ｄｎａ의 제조 | |
| EP2601312B1 (en) | Production of closed linear dna using a palindromic sequence | |
| US20110195457A1 (en) | Isothermal amplification of nucleic acid using primers comprising a randomized sequence and specific primers and uses thereof | |
| ES2954507T3 (es) | Método de producción de ADN y kit de unión de fragmentos de ADN | |
| JP2015091236A (ja) | Ｄｎａミニサークルおよびその使用 | |
| JP6764193B2 (ja) | 環状ｄｎａの増幅方法 | |
| JP2022530476A (ja) | 等温ｄｎａ増幅のための方法及び組成物 | |
| JP5652843B2 (ja) | Ｄｎａ増幅法 | |
| JP4942160B2 (ja) | ＲｅｃＡタンパク質を利用した核酸の等温増幅法 | |
| EA004630B1 (ru) | Способ образования комплекса | |
| JP2011010591A (ja) | Ｄｎａの増幅方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230421 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20240322 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20240408 |