JP4793842B2

JP4793842B2 - ランダムｒｎａプライマーを用いたｄｎａの増幅方法

Info

Publication number: JP4793842B2
Application number: JP2004339524A
Authority: JP
Inventors: 公子山本; 宏和高橋
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Priority date: 2004-11-24
Filing date: 2004-11-24
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2024-11-24
Also published as: JP2006141357A

Description

本発明は、DNAの増幅方法に関する。より詳しくは、本発明は、ランダムRNAプライマーを用いて鋳型DNAから目的のDNAを増幅する方法に関する。

医療や研究の現場において、あるいは産業における現場において、得られる染色体由来のDNA量が限られる場合（例えば、臨床の生体採取材料、絶滅危惧種、あるいは培養が難しい菌体等の場合）が頻繁に生じうる。しかしながら、上記の場合に得られるDNA量は、遺伝子解析に必要とされるDNA量に比してかなり少ない場合が多い。そのため得られたDNA全体をまんべんなく増幅することが必須である。この目的のため、これまでに以下に述べるような数多くの手法が開発されてきたが、極微量のDNAを全長にわたって偏りなく増幅することはほとんど不可能であった。

DNAの増幅方法としては、polymerase chain reaction (PCR)法が有名である。しかしながら、この方法はある特定領域を増幅するのには非常に適しているものの、一般的にPCR法では増幅できる長さは50 Kbpが最高（普通は10Kbp程度）であり、染色体全部のDNA（3〜300 Mbp）を増幅することは不可能であるばかりか、配列がある程度既知の領域でなければ増幅は不可能であった。そこで目的DNAを制限酵素で切断後、既知配列を付加し、その既知配列で増幅を試みるlinker-adaptor PCR（非特許文献１および２）、非特異的なプライマーを使用しランダムに増幅を試みるdegenerated oligonucleotide-primed PCR（非特許文献３および４）やprimer extension pre-amplification（非特許文献５）などPCR法を基盤とした方法が考え出され使用されてきた。

しかし、これらの方法により増幅されたDNAは、(1) 増幅されたDNAの長さが比較的短い、(2) DNAの網羅率に偏りが出る、(3) 繰り返し配列が増幅され易い、(4) 鋳型となったDNA以外の非特異産物が増幅される等、増幅以降の解析方法や使用方法に制限や解析結果に偏りがでることが問題となっていた。

最近、これらの問題を克服する手法として鎖置換型DNA合成酵素とランダムプライマーを用いた増幅方法(Malti-strand displacement amplification; MDA)（非特許文献６および７）が報告された。この方法により、上記の(1)〜(3)の問題点はほぼ解決したが、鋳型DNAが少量の場合、プライマーダイマーと思われる非特異産物の増幅が過剰になり（非特許文献８）、目的産物が最終生成物のわずか1万分の1程度しか含まれていないことが明らかとなった。この問題を避けるためには、最低でも1000コピー以上の鋳型DNAが必要とされている。

上記の方法のように、非特異産物が大量に増幅されて、目的産物に比べて過剰になると、増幅後のDNAの組成がオリジナルなDNAと異なった組成となってしまう。そのため、増幅後の解析、特に配列決定時に非特異産物の影響により間違った結果が出てしまうなど、これら副産物が結果に及ぼす影響が予想できない。従って、上記の方法は、再入手が困難な生体サンプル、およびフィールドサンプルなどの増幅に用いるには、リスクが大きい。

また、この方法によって得た増幅産物は、これを鋳型とするPCRをベースとした解析方法にしか使用できない。なぜなら増幅した産物に含まれるほとんどのDNAが非特異産物であるため、直接的な解析方法、例えばクローニング、シークエンス等には使用できないからである。そのため、既知の配列のプライマーを使用してPCRによる増幅で正しい産物が得られているかどうかの確認が必要である。したがって、既知の配列以外は実際には解析が不可能となる。

なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
Kao, F. T. & Yu, J. W. Chromosome microdissection and cloning in human genome and genetic disease analysis. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 1844-8 (1991). Ponelies, N., Stein, N. & Weber, G. Microamplification of specific chromosome sequences; an improved method for genome analysis. Nucleic Acids Res 25, 3555-7 (1997). Telenius, H. et al. Cytogenetic analysis by chromosome painting using DOP-PCR amplified flow-sorted chromosomes. Genes Chromosomes Cancer 4, 257-63 (1992). Kittler, R., Stoneking, M. & Kayser, M. A whole genome amplification method to generate long fragments from low quantities of genomic DNA. Anal Biochem 300, 237-44 (2002). van Eijk, M. J., Russ, I. & Lewin, H. A. Order of bovine DRB3, DYA, and PRL determined by sperm typing. Mamm Genome 4, 113-8 (1993). Dean, F. B., Nelson, J. R., Giesler, T. L. & Lasken, R. S. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification. Genome Res 11, 1095-9 (2001). Dean, F. B. et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 5261-6 (2002). Lage, J. M. et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res 13, 294-307 (2003).

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、微量の鋳型DNAを用いた場合でも、非特異的なDNAの生成を抑えつつ、目的のDNAを増幅しうる方法を提供することにある。

核酸増幅法としてRNAをプライマーとして使用した例はない。その理由として、(1) 1本鎖RNAはDNAに比べ不安定であること、(2) 自己会合により容易に立体構造を作りやすい為、プライマー自身の熱融解温度が高いこと、(3) DNAに比べRNAの人工合成は不安定で単価的にも割高になること、などが挙げられる。

このため核酸増幅法においては、これまでDNAプライマーが用いられてきた。しかしながら、本発明者は、この技術常識に反して、プライマーとしてオリゴDNAプライマーに代えてオリゴRNAプライマーを使用したところ、驚くべきことに、極微量の鋳型DNAからの増幅時においても、非特異的なDNAの生成を抑えつつ、目的DNAを増幅させることに成功した。

この結果は、使用した鎖置換型DNA合成酵素が、RNAを鋳型としてDNAを合成することができず、このためプライマー由来の非特異的産物の伸長反応が生じなかったことに基づくものと考えられる(図１)。

すなわち本発明は、RNAをプライマーとする核酸増幅法に基づくものであり、より詳しくは、以下の〔１〕〜〔４〕を提供するものである。
〔１〕 DNAの伸長反応において、ランダムRNAプライマーを用いて鋳型DNAから目的のDNAを伸長させることを特徴とする、DNAを増幅する方法。
〔２〕鎖置換型DNA合成酵素を用いて低温でDNAの伸長反応を行なう、〔１〕に記載の方法。
〔３〕微量の鋳型DNAを用いる、〔１〕に記載の方法。
〔４〕ランダムRNAプライマーが短鎖である、〔１〕に記載の方法。

本発明の方法の利点は、まず、RNA自身が鋳型とはならないため、RNAプライマー同士によるDNA合成が起こらないことにある。これにより目的産物以外のDNA合成が起こらず、結果的に目的産物だけを増幅することが可能になる。また、オリゴDNAプライマー使用時には必要であった核酸のチオリン酸化が不要であることも本発明の方法の利点である。これはDNAポリメラーゼの機能として存在する3’-5’エキソヌクレアーゼ活性に対してもRNAは基質とならないため、耐性を持たせるための修飾（非特許文献６）が不要になるからである。このことは結果的にオリゴプライマーの単価を下げることにつながる。さらに、PCR法では問題となっていたプライマー自身の自己会合が、使用するプライマーの鎖長が短いため問題とならないことや、不要なオリゴRNAプライマーを酵素によって容易に取り除くことが出来るため、精製が簡便であることも、本発明の利点である。

本発明の方法は、染色体由来DNAばかりではなく、一般に多く使用されるプラスミド等ベクターを増やすのにも有効である。特にオリゴDNAプライマーでは非特異産物が多く生成されるため難しかったCosmid、Bacteria artificial chromosome (BAC)、Yeast artificial chromosome (YAC)等、生体内でのコピー数の少ないベクターを増幅するためにも有効であり、この点も本発明のさらなる利点である。

本発明は、DNAの伸長反応において、ランダムRNAプライマーを用いて鋳型DNAから目的のDNAを伸長させることを特徴とする、DNAを増幅する方法に関する。

本発明の方法に使用されるランダムRNAプライマーは、RNAがランダムに整列した塩基配列を含有するプライマーのことをいう。RNA（リボヌクレオチド）とは、糖部分がD-リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、ウラシル（U）を有するものが挙げられる。ランダムRNAプライマーの3’末端以外のRNAには、2-O-methyl RNAなどを使用することもできる。このようにメチル化RNAを用いることにより、RNAプライマー自身がRNaseによって分解されるのを防ぐことが可能となる。

本発明に使用されるランダムRNAプライマーの長さとしては、特に限定はないが、短鎖であることが好ましい。短鎖とは、一般的には6ヌクレオチド〜10ヌクレオチドの長さ、好ましくは、6ヌクレオチドまたは7ヌクレオチドの長さである。ランダムRNAプライマーの長さは、低温で鋳型へ会合し、かつ、プライマーそれ自身が2次構造を取らないように設定される。ランダムRNAプライマーには、ランダムな配列に加えて、必要に応じて特定の配列を付加していてもよい。ランダムRNAプライマーは、核酸合成機を使って合成することができる。

反応系に添加するランダムRNAプライマーの量（濃度）は、鋳型量、鋳型の鎖長に応じて適宜調節するが、例えば、好ましくは約5〜100μM、より好ましくは約50μMである。

本発明のDNAの伸長反応においては、微量の鋳型DNAを鋳型として用いることが好ましい。「微量」とは、鋳型の鎖長および反応系のサイズに依存し変化するが、通常、コピー数が約1000コピー以下であることを意味する。従来法では、鋳型量が少なくなるにともないプライマー同士が会合する機会が増加し、プライマーダイマーが目的産物以上に増加するが、本発明の方法では、使用する鎖置換型DNA合成酵素がRNAを鋳型としてDNAを合成することができないため、従来法より非特異的増幅産物量が減少する。

鋳型DNAは、直鎖DNA及び環状DNAのいずれであってもよい。直鎖DNAは、長鎖であることが好ましく、このような長鎖DNAとしては主にゲノムDNA（ゲノム全体もしくは一部（染色体1本、あるいはさらにその一部）等）である。環状DNAとしては葉緑体DNA及びミトコンドリアDNA、BACクローン、PACクローンなどが挙げられる。長鎖DNAの長さとしては、直鎖上のDNAの場合、増幅効率の観点から、10kb以上であることが好ましい。

また、該鋳型DNAは、一本鎖、二本鎖のいずれもが好適に使用できる。二本鎖DNAを鋳型とする場合は、二本鎖DNAを一本鎖に変性する前処理工程の後に本発明を実施すればよい。二本鎖DNAを変性させるには、例えば、約95℃で保持する方法やアルカリ処理による方法等、当業者に公知の方法を用いることができる。

本発明の方法において鋳型となるDNAは、当該DNAを含むあらゆる試料から調製または単離したものでもよい。このようなDNAを含む試料には特に制限はなく、ウイルス、原核生物、真核生物の個体そのものあるいはその一部が使用できる。例えば脊椎動物（人を含む）では、糞便、尿、もしくは汗のような排泄物、血液、精液、唾液、胃液、もしくは胆汁のような体液等が挙げられる。あるいは、外科的に生体から取り出した組織、または体毛のように生体から脱落した組織であっても良い。またこれら以外にも、細菌、カビ、酵母、植物、昆虫のような生物がDNA含有試料として挙げられる。また、前記試料を更に分画してその一部を取り出したものから調製したDNA含有調製物であってもよい。

本発明に使用されるDNA合成酵素は、DNAの鎖置換活性(strand displacement)を有する鎖置換型DNA合成酵素である。「鎖置換活性」とはDNAを複製していく過程で伸長方向に既に二本鎖のDNAが形成されていた場合、相補鎖を引き剥がして一本鎖にしながら合成していく活性のことをいう。

本発明に使用される鎖置換型DNA合成酵素は特に制限はなく、例えば、Phi29 DNA polymerase（ニューイングランドバイオラブス社）、Klenow fragment (各社)、Bst DNA polymerase (ニューイングランドバイオラブス社)、BcaBEST DNA polymerase (宝酒造)等が挙げられる。さらに、本発明においては、3’-5’ exonuclease活性を有する鎖置換型DNA合成酵素が好ましく、そのような酵素としては、Phi29 DNA polymeraseが挙げられる。また、鋳型DNAが長鎖DNAでない場合は、Klenow fragment等も好適に使用できる。

本発明のDNAの伸長反応において使用される鎖置換型DNA合成酵素の量（濃度）は、使用する酵素の種類によって至適化することが好ましい、例えば、Phi29 DNA polymeraseの場合、好ましくは終濃度約0.025〜20unit/μl、より好ましくは終濃度約0.5unit/μlで使用する。

本発明のDNAの伸長反応は、好ましくは、一定の低温化で実施される。本発明における「低温」とは、30℃〜55℃を意味する。反応温度は酵素の至適温度とプライマー鎖長に基づく変性温度（プライマーが鋳型DNAに結合／解離する温度帯）に基づいて適宜設定される。例えば、鎖置換型DNA合成酵素としてPhi29 DNA polymeraseを使用する場合は、30℃〜42℃が好ましい。一方、伸長反応を低温ではなく、耐熱性酵素を使用して行う場合は、好ましい反応温度は55℃〜65℃である。耐熱性酵素を使用する場合は、プライマー鎖長は約9オリゴヌクレオチドであることが好ましい。

本発明のDNAの伸長反応に使用される反応液には、上記成分以外に、緩衝成分、マグネシウム塩、dNTPを含有するものが使用できる。緩衝成分は、特に限定はないが、例えば、トリス塩酸、トリス酢酸が好適に使用できる。マグネシウム塩としては、特に限定はないが、例えば、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムまたは酢酸マグネシウムが好適に使用でき、その濃度は、好ましくは約5〜20 mM、より好ましくは約10 mMである。DNA伸長反応の基質となるdNTP混合物（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）の濃度は、好ましくは約0.5〜5 mM、より好ましくは約1 mMである。この他、反応液中には伸長反応の安定化を目的とした添加物を添加してもよい。例えば、DTT（好ましくは約0.5〜2mM、より好ましくは約1mM）、BSA（好ましくは約0〜0.02%、より好ましくは約0.01%）、Tween 20（好ましくは約0〜2%、より好ましくは約1%）、Triton X100（好ましくは約0〜0.1%、より好ましくは約0.1%）等が挙げられる。さらには、長時間反応に際し、副産物として生成される、DNA合成反応の阻害剤であるピロリン酸を除去する為にPyrophosphotaseを加えることによって合成効率を上げることもできる。Phyrophosphotaseは約0.02U/反応、添加することが好ましい。

本発明の方法によって増幅されたDNAは、電気泳動により検出できる。また、増幅したDNA領域の配列が既知の場合、定量PCR等を用いて、増幅産物が目的の物であるか否かを検出し、増幅効率を求めることができる。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例になんら制限されるものではない。

[実施例１]ランダムRNAプライマーを用いた低温での微量DNAの増幅
実験に用いたランダムRNAプライマーは日本テクノサービス社に合成を依頼した。合成されたランダムRNAプライマーは、200μMになるようにジエチルピロカーボネート処理した超純水（マキシムバイオテック社）に溶解した。
ランダムRNAプライマー配列：rNrNrNrNrNrN（rNはRNA塩基A,G,U,Cのどれかを意味する）
また、ランダムDNAプライマーはインビトロジェン社に合成を依頼した。合成されたランダムDNAプライマーは200μMになるように超純水（インビトロジェン社）に溶解した。
ランダムDNAプライマー配列：NNNNsNsNN（NはDNA塩基のA, G, T, Cにいずれか、sNは5’-チオリン酸化されたDNA塩基のA, G, T, Cにいずれかを意味する）

鋳型DNAであるLamda phage DNA(49.5 kbp)は東洋紡績から入手した。Lamda phage DNAは分子量を計算した後、10⁴, 10³, 10², 10, 1コピー/μlになるように超純水（インビトロジェン社）で希釈した。

DNAの増幅は以下のように行った。
DNA溶液に上記プライマー溶液を最終濃度50μMになるように加え、その後95℃5分間熱変成を行い氷冷水で急冷した。この溶液に、鋳型DNAおよびプライマーが終濃度50μMになるように、最終濃度50 mM トリス塩酸、10 mM 塩化マグネシウム、10 mM 硫酸マグネシウム、4 mM DTT、1 mM dNTPs、5U/20μl Phi29 DNA 合成酵素（ニューイングランドバイオラブス社）を加え、20μlの反応系で30〜37℃で4時間から16時間反応させた。反応終了後、アガロース電気泳動によりDNA合成が起こっているか否かを確認した。

従来通りにオリゴDNAプライマーを使用した場合と、オリゴRNAプライマーを使用した条件で鋳型量による増幅産物の違いを確認した結果を図２に示す。オリゴDNAプライマーを使用した場合、プライマーどうしによるDNA合成が起こった結果、鋳型の有無に関係無くスメア状のDNAが増幅され（レーン3，4）、両者の電気泳動像には差が少なかった。従って、目的産物以外のDNAの合成がかなり生じていたと考えられる。
一方、オリゴRNAプライマーを使用した本発明の方法では、鋳型を入れていないレーン（レーン2）は、オリゴDNAプライマーを使用した場合における鋳型を入れていないレーン（レーン4）と比較して、明らかに合成されたDNA量が少なかった。このことから、オリゴRNAプライマー使用時にはプライマーどうしによるDNA合成が起こらずに、非特異的産物の生成を抑えられていることが判明した。

なお、鋳型DNAを加えていないものにも増幅されたDNAが見られるが、これは反応に用いている酵素に混在している大腸菌由来の染色体DNAを鋳型として増幅しているものと考えられる。

オリゴDNAプライマーおよびオリゴRNAプライマー使用時における、プライマー由来の非特異的産物の伸長反応の有無を示す図である。オリゴDNAプライマー使用時とオリゴRNAプライマー使用時における増幅産物の違いを示す電気泳動写真である。

Claims

DNAの伸長反応において、ランダムRNAプライマーを用いて鋳型DNAからDNAを伸長させることを特徴とする、DNAを増幅する方法であって、ここで
(i) 該鋳型DNAが1000コピー以下のDNAであり、
(ii) 該ランダムRNAプライマーが６〜１０ヌクレオチドの鎖長であり、かつ、
(iii) 鎖置換型DNA合成酵素（ただし、RNAを鋳型としてDNAを合成する酵素を除く）を用いてDNAの伸長反応を行なう
方法。
鎖置換型DNA合成酵素（ただし、RNAを鋳型としてDNAを合成する酵素を除く）を用いた、1000コピー以下のDNAの増幅反応におけるプライマー同士による非特異的DNA合成を抑制する方法であって、プライマーとして６〜１０ヌクレオチドの鎖長のランダムRNAプライマーを用いることを特徴とする方法。