KR101466666B1

KR101466666B1 - 열 안정성 dna 중합효소의 제조방법 및 이에 의해 제조된 dna 중합효소

Info

Publication number: KR101466666B1
Application number: KR20130129854A
Authority: KR
Inventors: 장욱진; 최희백; 유미경
Original assignee: (주)진스랩; 가천대학교 산학협력단
Priority date: 2013-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2014-12-01

Abstract

본 발명은 앞부분에 포스포로티오에이트 처리가 되어있고 G와 C의 상보적인 결합으로 이루어진 짧은 단편에 의해 열 안정성 DNA 중합효소가 낮은 온도에서는 스스로 증폭이 방해되지만 온도가 높아지면 단편에서 해리되어 나옴으로써 활성이 회복되어 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시키는 방법에 관한 것이다.

Description

열 안정성 DNA 중합효소의 제조방법 및 이에 의해 제조된 DNA 중합효소{Method for DNA Polymerase Having Improved andDNAPolymerasethereby}

본 발명은 열 안정성이 향상된 DNA 중합효소의 제조방법 및 이에 따라 제조된 DNA 중합효소 및 이를 이용하여 PCR을 수행하는 방법에 관한 것이다.

1983년 K.Mullis에 의해 개발된 PCR(Polymerase chain reaction)은 원하는 DNA 부분을 복제 및 증폭 시키는 분자생물학적인 기술이다(Saiki, Scharf et al. 1985; Mullis and Faloona 1987). 이 기술은 열화학적 중합효소의 발명과 함께 급속하게 발전되어 왔으며 현재에는 질병의 진단, DNA 지문분석을 이용한 과학수사, 친자 확인의 방법 등 다양한 분야에서 활용되고 있다.

PCR에 사용되는 Taq DNA 중합효소의 주 요소는 충실도(Fidelity)와 내열성이다. Taq DNA 중합효소의 충실도가 낮은 경우에는 오류율(error rate)이 높아 원하는 DNA 가닥이 정확하게 증폭이 되지 않는다는 문제가 있다. Taq DNA 중합효소의 내열성이 낮은 경우에는 PCR이 수행 중에 중합효소의 활성이 제대로 유지되지 않으며 제 기능을 하지 못하게 된다. 따라서 Taq DNA 중합효소에 있어서 충실도와 내열성은 그 무엇도 놓칠 수 없는 요소이다. PCR 관련 기술들은 끊임없이 발전하고 있으며 예로 긴 길이(Long size)를 증폭하는 방법(Cheng, Fockler et al. 1994), (Barnes 1994), 역 전사 후 증폭하는 RT-PCR, 정량적 PCR (Real time PCR), Hot start PCR 등이 있다. 그 중 Hot start PCR의 개발 배경은 다음과 같다. Taq DNA 중합효소는 70 ℃ 이하에서 활성을 가지고 있다. 그로 인해 초기 변성(Denaturation) 과정에서 주형 DNA가 변성되기도 전에 시발체가 붙어서 DNA 합성이 일어나는 경우가 있다. 이처럼 낮은 온도에서 PCR 반응이 일어나게 되면 시발체가 잘못 붙을 확률이 높아지게 되고 결과적으로 비특이적인 PCR 증폭 산물이 만들어진다. 따라서 이러한 비특이적 반응을 줄이기 위해서 사용되는 것이 Hot start PCR이다.

현재 Hot start PCR의 방법으로는 몇 가지가 있다. 가장 초기에는 PCR에 필요한 성분 중의 하나를 온도가 올라간 상태에서 첨가해 주는 방법이다. 그러나 이 방법은 다량, 다수의 PCR을 수행하는 경우 번거롭다는 단점이 있다. 이후 개발된 방법으로 미네랄 오일 방법이 있다 (Chou, Russell et al. 1992). 주형 DNA와 나머지 구성성분을 일정온도가 될 때까지 미네랄 오일로 분리시키고 적정 온도가 되면 이들이 섞이는 방법이다. 이는 PCR 증폭 산물을 얻을 때 오일의 방해가 있을 가능성이 존재하며 전체 반응액의 양이 증가된다는 단점이 있다.

그 외에 DNA 중합효소의 항체를 이용한 방법이 있다(Kainz, Schmiedlechner et al. 2000). 적정 온도에 도달하기 전까지는 Taq DNA 중합효소가 항체와 결합하고 있어 활성이 억제된다. 하지만 온도에 오르면 항체가 떨어져 나가면서 Taq DNA 중합효소가 활성화 되어 PCR 반응이 이루어진다. 이로서 비 특이적인 반응이 일어날 가능성을 최소한으로 낮춰줄 수 있다. 하지만 이 방법은 항체의 양이 많이 필요하며 가격이 높다는 단점을 갖고 있다(Kellogg, Rybalkin et al. 1994). 최근에는 Taq DNA 중합효소의 화학적인 변형을 통하여 Hot Start 기능을 부여하는 방법(Birch 1996)이 널리 사용되고 있다. 변형을 통해 Taq DNA 중합효소의 활성이 억제 되어 있다가 후에 활성이 살아나 DNA를 증폭하는 방법이다. 그러나 PCR 반응 초기에는 효소의 30%만이 재활성되고, 고온에 의한 재활성화로 인하여 주형 DNA에 탈 퓨린화가 발생되어 원하는 DNA의 길이가 길 불가능하다는 단점을 지니고 있다.

또 다른 방법으로써 시발체의 독특한 디자인을 통하여 Taq DNA 중합효소의 효율을 증가시키는 방법이 있다. 하지만 이는 시발체 제작에 있어 많은 비용이 소모된다는 단점이 있다.

본 발명자들은 열 안정성 DNA 중합효소의 성능을 높이고자 노력한 결과, 염기 G (Guanine)와 염기 C (Cytocin)의 경우 삼중결합을 통해 강한 결합력을 지닌다는 특성을 이용하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 DNA 중합효소와 결합할 수 있는 DNA를 첨가 하여 DNA 중합효소의 구조적 변형을 통한 열 안정성 DNA 중합효소 및 이에 의해 제조된 DNA 중합 효소를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 열 안정성이 향상된 DNA 중합효소를 이용한 PCR 수행방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되었으며 그 인용은 괄호 내에 출처를 표기되어 있다.

본 발명은 Taq DNA 중합효소에 구아닌(G) 또는 시토신(C) 중 어느 하나 또는 둘을 합한 염기서열의 비율이 전체 염기서열의 40 % 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 보다 더 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 70% 이상으로 변형된 블록 시발체(Block Promoter)를 혼합하는 단계를 포함하는 내열성이 향상된 Taq DNA 중합효소의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "블록 시발체"는 중합효소와 결합하는 DNA 단편을 의미한다. 즉, 본 발명의 열 안정성을 향상시키기 위하여 Taq DNA 중합효소에 단일가닥의 DNA 단편을 추가해 주는 방법을 이용하였다. DNA 단편은 중합효소와 서로 상보적으로 만들어져 있기 때문에 스플라이싱이 일어나게 된다. 상기 DNA 단편은 일정 온도 이하에서는 중합효소에 결합하여 활성을 억제하지만 일정 온도 이상이 되면, 중합효소의 억제자로서의 기능을 잃게 된다.

상기 블록 시발체의 염기서열의 어느 하나 이상은 포스포로티오에이트 변형(phosphorothioate modification)이 된 것을 사용하는 것이 바람직하며, 상세하게는 블록 시발체의 염기서열의 첫 번째부터 열 번째 염기서열 중 어느 하나 이상은 포스포로티오에이트 변형(phosphorothioate modification)된 것이다. 이는 이전의 방식에 따라 제작된 Taq 중합효소와 비교하였을 때 포스포로티오에이트 변형으로 Taq 중합효소가 단일가닥 DNA 를 절단하지 못하게 하는 효과를 갖게 하여 단일가닥 DNA가 낮은 온도에서 Taq 중합효소의 작용을 억제 할 수 있는 효과를 갖게 한다.

블록 시발체는 Taq DNA 중합효소 대비 0.01 내지 10 부피%로 첨가되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.1 내지 3 부피%, 보다 더 바람직하게는 0.5 내지 1 부피% 일 수 있다. 또한 본 발명은 상기 방법을 통해 제조된 Taq DNA 중합효소에 관한 것이다. 본 발명의 Taq DNA 중합효소를 이용하여, DNA를 중합반응을 수행할 수 있고, 상세하게는 중합반응은 DNA 중합 방법은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)일 수 있으며, 보다 상세하게는 Hot start PCR에 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 구조적 변형 대상이 되는 효소는 열 안정성 (내열성)이 향상 됨으로써 고온의 최적 온도를 갖게 되어 효율이 증가된 중합효소이다. 상기 향상된 열 안정성 중합효소는 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터 분리된 Taq DNA 중합효소이다.

이하, 실시의 예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시의 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위함이며, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 실시의 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 계통에서 통상의 지식을 가진 이에 의해 자명될 것이다.

본 발명은 구조적 변형을 통한 열안정성 DNA 중합효소, GC가 높을 경우의 DNA 중합효소 반응 전 혼합물, 그리고 상기 DNA 중합효소를 이용하는 증폭 방법에 대해 제공한다. 본 발명의 Edit block 시발체를 첨가하여 만든 Hot start Taq DNA 중합효소는 hot start PCR에 적합하며 개선된 민감도 및 충실도로 증폭 효율을 높일 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 지닌 자에게 위의 구체적 기술은 바람직한 구현의 예일 뿐이며 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실직적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 Edit block 프라이머의 2차 구조 형태를 보여주는 모형이다.
도 2는 애기장대의 유전자 HSP 중 일부를 증폭하여 기존의 DNA 중합효소보다 개선되었음을 보여주는 사진이다.
도 3은 람다 (Lambda) DNA를 주형으로 사용하여 1 fg/ul만으로도 증폭이 가능함을 보여주는 사진이다.
도 4는 애기장대의 유전자 중 GC ratio 47%를 갖는 HSP 일부를 증폭하여 타사의 DNA 중합효소와 비교한 사진이다.
도 5는 GC ratio 75%로 이루어진 인간의 유전자 SIM2를 증폭하여 타사의 DNA 중합효소와 비교한 사진이다.
도 6은 GC ratio 71%로 이루어진 인간의 유전자 DIP2A를 증폭하여 타사의 DNA 중합효소와 비교한 사진이다.

내열성이 향상된 Taq DNA 중합효소의 제조

하기의 표 1은 본 발명자가 실험을 사용한 위해 디자인한 블록 시발체의염기서열(변형 후)과 기존에 사용되던 블록 시발체(변형 전)의 염기서열을 보여준다. 붉은 색이 변형된 부분이며, * 부분은 포스포로티오에이트 변형(phosphorothioate modification)된 서열을 나타낸다. 상기 DNA 단편은 앞부분으로부터 12번째 염기부터 뒷부분의 끝까지 서로 상보적으로 만들어져 있기 때문에 스플라이싱(splicing)된다. 이로서 40℃ 이하의 온도에서는 Taq DNA 중합효소의 활성을 억제 하지만 40℃ 이상의 온도가 되면 억제자로서의 기능을 잃게 된다. 따라서 Taq DNA 중합효소가 활성을 띄게 되는 것이다(Dang and Jayasena 1996; Lin and Jayasena 1997).

변형 전	5'-TGG*GATATCCCTTTTCTTTCATTCTTACATATGTAAGAATGAAAGAAAA-3'
변형 후	5'-TGG*GATATCCCGGGGCTTGCGGGCGGGCGTACGCCCGCCCGCAAGCCCC-3'

변형된 블록시발체를 이용하여 향상된 Taq DNA 중합효소를 만들기 위해 필요한 Taq DNA 중합효소를 적정 농도로 맞추기 위한 제조 작업을 수행한다. 희석용액 (40 mM Tris Hcl pH 8.0, 200 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 % Tween-20, 50 % Glycerol)과 함께 Taq DNA 중합효소를 이진법으로 희석시킨 후 증폭에 사용한다. 이 때 증폭 대상은 1Kb의 람다 (Lambda)DNA이며 Taq DNA 중합효소의 농도 2^-8까지 증폭이 가능한 적정 농도의 Taq DNA 중합효소를 얻는다. 후에 Taq 중합효소 50 ul, edit block 시발체 0.5 ul의 비율로 섞어줌으로써 제작하였다.

본 발명의 향상된 열 안정성 DNA 중합효소는 Hot start PCR에 매우 적합하며 이전의 어떠한 열 안정성 중합효소보다 우수한 내열성과 충실성 (fidelity), 그리고 민감성 (sensitivity)을 나타낸다. 이와 같은 내용은 하기 실시예의 실험결과에 각각 설명되어 있으며 도 2~6을 통해 확인할 수 있다.

실험 재료 및 실험 방법

실험 재료

애기장대 지놈 DNA는 MS 배지에서 2주간 키운 seedling 상태의 조직에서 추출하였으며 인간 지놈 DNA는 혈액에서 추출하여 사용하였다. 람다 (Lambda) DNA는 TAKARA사의 제품을 사용하였다. Taq DNA 중합효소의 대조군으로서 BIOsystem사의 제품, Biolab사의 제품, NEB사의 제품, GenetBio사의 제품, TNT사의 제품을 사용하였다. Edit block 시발체의 합성은 Bioneer사에서 하였다. 사용한 PCR 기계는 Eppendorf사의 mastercycler gradient와 ASTEC의 PC320을 사용하였다.

실험 방법

Ⅰ. DNA 중합효소의 연쇄반응 및 민감도 테스트

Ⅰ-1 : 애기장대지놈 DNA를 주형으로 이용한 PCR

DNA 중합효소의 PCR 반응을 확인하기 위해, 애기장대의 지놈 DNA와 ArabiGC47 센스 (forward) 시발체와 안티센스 (reverse) 시발체를 이용하여 1,179bp의 PCR 반응 생성물을 보다 효율적으로 얻을 수 있음을 확인하였다 (도2 참조).

PCR 반응은 10x 반응 용액 (500 mM Tris-HCl pH9.5, 200 mM (NH₄)₂SO_4,20mMMgCl₂,1mg/mlBSA)2ul,dNTP혼합액의 최종 농도는 0.1mM이 되도록 넣어 준다. 또한 애기장대 지놈 DNA 100 ng/ul을 1ul, 10 pmole/ul ArabiGC47 시발체들 2ul를 넣어 준 후 여기에 기존의 Taq DNA 중합효소와 edit block 시발체를 통해 향상된 edit Taq DNA 중합효소를 첨가하였다. 최종 부피는 20ul가 되게 증류수를 넣어 준 후 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응은 94도에서 10분 진행한 후 95도에서 20초, 65도에서 20초, 72도에서 1분을 30회 반복한다. 마지막으로 72도에서 5분간 반응을 더 진행한 후 10도로 낮추었다. 반응 생성물은 적정량의 로딩 다이를 넣은 후 1% 아가로즈 젤 전기영동을 실시하여 결과를 확인하였다.

올리고 뉴클레오타이드	서열(5'-> 3')
ArabiGC47-F	GCGGACTTTAGGAGGAAACA	HSP7OB(일부 사용 1179bp)GC47%
ArabiGC47-R	TGGGACCTCCAGCAGCACCT	HSP7OB(일부 사용 1179bp)GC47%

상기 표 2는 애기장대 ArabiGC47을 증폭하기 위한 프라이머의 서열 및 특징을 나타낸다. 올리고 뉴클레오타이드에서 F는 정방향(forward), R은 역방향(reverse)을 나타내며, 방향성은 5'에서 3'이다.

Ⅰ-2 : 람다(Lambda) DNA를 주형으로 한 낮은 카피수의 증폭

Edit block 시발체를 첨가하여 만든 Hot start Taq DNA 중합효소를 이용하여 증폭을 하였을 때 필요한 최소한의 카피 수를 보기 위해 실험을 수행하였다. 10x 반응 용액과 dNTP 혼합액은 실험에서의 조건과 동일하게 사용하였다. 람다 (Lambda) DNA와 람다 센스 (forward) 시발체와 안티센스 (reverse) 시발체를 이용하여 1Kb의 PCR 반응을 하였다. 단, 람다 (Lambda) DNA는 증류수와의 희석을 통하여 1 ng/ul, 100 pg/ul, 10 pg/ul, 1 pg/ul, 100 fg/ul, 10 fg/ul, 1 fg/ul까지 사용하였다. PCR의 구체적인 조건은 아래의 표 3과 같고, PCR 반응 생성물의 확인은 1% 아가로즈 젤 전기영동을 통하여 수행하였다.

올리고 뉴클레오타이드	서열(5'-> 3')
Iambda-F1	GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG	5.5Kb w/Iambda-F1
Iambda-5.5R	TTGCCTGCTTAAGCAGAATTTCTGT	5.5Kb w/Iambda-F1

상기 표 3은 람다 (Lambda)를 증폭하기 위한 프라이머의 서열 및 특징을 나타낸다. 5'에서 3' 방향이다.

사이클(Cycle)	Lambda DNA (1Kb)
1	95℃ for 2min
30	95℃ for 20sec
	65℃ for 20sec
	72℃ for 1min
1	72℃ for 5min

상기 표 4는 람다 (Lambda)를 증폭하기 조건을 나타낸다.

Ⅱ. DNA 중합효소의 증폭 효율 비교

Ⅱ-1 : 애기장대 HSP 일부의 증폭 비교

Edit block 시발체를 첨가하여 만든 Hot start Taq DNA 중합효소의 증폭 효율을 알아보기 위하여 타사의 DNA 중합효소와 비교실험을 수행하였다. 식물과 사람의 유전자를 증폭하는데 있어 약간의 차이가 존재하기 때문에 식물 중 애기장대의 HSP 유전자 일부 (ArabiGC47), 인간의 유전자 중 SIM2, DIP2A를 각각 실험에 사용하였다.

DNA 중합효소를 이용하여 증폭할 때 초기의 증폭효율을 비교하기 위하여 증폭 사이클 수를 줄여 수행하였다. Edit block 시발체를 첨가하여 만든 Hot start Taq과 비교하기 위하여 Biolab사의 제품, NEB사의 제품, Genetbio사의 제품, TNT사의 제품을 이용하여 동일하게 증폭하였다. 증폭에 사용한 주형과 시발체는 Ⅰ-1에서 언급한 것과 동일하며 ArabiGC47 PCR 증폭 조건은 하기의 표 5와 같다.

사이클(Cycle)	ArabiGC47 (1Kb)
1	94℃ for 10min
24	95℃ for 20sec
	65℃ for 20sec
	72℃ for 1min
1	72℃ for 5min

Ⅱ-2 : 인간두유전자의증폭비교

인간 유전자 중 SIM2는 GC ratio가 75%로 구성되어 있는 GC rich 유전자이다. GC가 많은 경우 DNA 두 가닥이 쉽게 벌어지지 않기 때문에 증폭이 까다롭다. 인간 유전자 DIP2A도 마찬가지이다. 따라서 PCR이 보다 쉽게 이루어지도록 돕는 PCR enhancer로서 3.6M betaine을 첨가하여 증폭조건을 잡았다. 그 후 Edit block 시발체를 첨가하여 만든 Hot start Taq DNA 중합효소와 타사의 DNA 중합효소를 이용하여 증폭을 통해 비교하였다. 타사의 제품을 이용하여 증폭을 할 때는 그 회사에서 만들어진 GC enhancer 제품을 함께 구매하여 사용하였다. 각 인간 유전자의 증폭에 사용한 시발체는 하기의 표 6와 같으며 PCR 조건은 하기의 표 7에 표기하였다.

올리고 뉴클레오타이드	서열 (5'-> 3')
SIM2-F	CCGTTTTCACGTGTGTGTGT	GC 75%, 1200bp
SIM2-R	TTCCTTCTCCCTCCTGGTCT	GC 75%, 1200bp
DIP2A-F	AGGGGAAGGAAGCAGGACT	GC 71%, 1185bp
DIP2A-R	CAGCTCAGCCAGGCTCTC	GC 71%, 1185bp

사이클(Cycle)	SIM2: GC75% (1.2Kb)	DIP2A: GC71% (1.2Kb)
1	95℃ for 5min	95℃ for 5min
30	95℃ for 20sec	95℃ for 20sec
	55℃ for 20sec	55℃ for 20sec
	72℃ for 1min 30sec	72℃ for 1min 30sec
1	72℃ for 5min	72℃ for 5min

실험결과

Ⅰ. DNA 중합효소의 연쇄반응 및 민감도 테스트

Ⅰ-1 : 애기장대지놈 DNA를 주형으로 이용한 PCR

Edit block 시발체를 첨가하여 만든 Hot start Taq DNA 중합효소의 효율을 기존의 hot start Taq 중합효소와 비교하기 위하여 동일한 조건하에서 PCR을 수행하였다. 도 2는 그 결과를 나타낸 것이며, M은 1Kb DNA ladder 레인을 나타내며, 1은 Edit block 시발체를 첨가하여 만든 Hot start Taq DNA 중합효소를 이용한 증폭 결과, 2는 기존의 Taq DNA 중합효소를 이용한 증폭 결과이다. 상기 실험 결과를 통해 Edit block 시발체를 첨가하여 만든 Hot start Taq DNA 중합효소를 이용할 경우 최종 생성물의 양이 증가함을 확인 할 수 있었다.

Ⅰ-2 : 람다(Lambda) DNA를 주형으로 한 낮은 카피수의 증폭

주형으로 사용된 DNA의 카피수가 어느 정도까지 감지되어 증폭할 수 있는지 알아보기 위하여 람다(Lambda) DNA를 이용하여 증폭을 하였다. 결과를 도 3을 통해 확인할 수 있다. M은 1Kb DNA ladder 레인을 나타내며, 레인 1부터 7까지는 각각 람다(Lambda) DNA 1ng/ul, 100pg/ul, 10pg/ul, 1pg/ul, 100fg/ul, 10fg/ul, 1fg/ul 농도 별 결과이다. 1fg까지도 감지가 가능하다는 결과를 확인함으로써 적은 양의 DNA에도 민감하게 작용할 수 있다는 판단을 할 수 있다.

Ⅱ. DNA 중합효소의 증폭 효율 비교

Ⅱ-1 : 애기장대 HSP 일부의 증폭 비교

일반적으로 증폭하려는 대상을 이루고 있는 염기 G와 C의 비율이 높으면 상대적으로 증폭에 어려움이 있다. 이 경우 Edit block 시발체를 첨가하여 만든 Hot start Taq DNA 중합효소를 사용하였을 때 개선되는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 증폭 대상은 식물 애기장대 유전자 중 HSP 일부(ArabiGC47)를 타깃으로 하였으며 GC ratio는 47%이다. 실험 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에서 보여지는 M은 1Kb DNA ladder 레인을 나타내며, N은 네가티브 컨트롤을 나타낸다. 레인 1은 기존의 Hot Start Taq DNA 중합효소, 레인 2는 Edit block 시발체를 첨가하여 만든 Hot start Taq DNA 중합효소, 레인 3은 Gold Taq 중합효소, 레인 4는 OneTaq 중합효소, 레인 5는 HS Taq 중합효소, 레인 6은 TNT 중합효소를 사용하여 증폭한 결과를 나타낸다. 타사의 제품과 함께 비교한 결과 중합효소의 효율이 상대적으로 우월함을 확인할 수 있다.

Ⅱ-2 : 인간두유전자의증폭비교

Edit block 시발체를 첨가하여 만든 Hot start Taq DNA 중합효소의 증폭 효율을 인간 유전자에서도 확인하기 위하여 추가 실험을 수행하였다. 증폭 대상은 인간 유전자 중 GC rate이 75%로 이루어진 SIM2 유전자와 71%로 이루어진 DIP2A 유전자로 택하였으며 GC 비율이 높은 두 가닥의 DNA 증폭이 보다 수월하게 이루어지도록 PCR enhancer를 개발하여 첨가해 주었다. 위의 애기장대 실험과 동일하게 타사의 제품과 함께 각각 증폭을 확인하였으며 그 결과는 도 5와 도 6과 같다. 각 도면의 레인이 의미하는 바도 위의 애기장대 경우와 동일하다. 두 경우를 종합적으로 타사와 비교하면, Edit block primer를 첨가하여 만든 Hot start Taq DNA 중합효소의 결과는 밴드가 끌리는 경향도 전무하며 원하는 밴드의 두께도 상대적으로 뛰어나 높은 증폭 효율을 갖고 있음을 확인할 수 있다.

참고문헌

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Lin, Y. and S. D. Jayasena (1997). "Inhibition of multiple thermostable DNA polymerases by a heterodimeric aptamer." J Mol Biol 271(1): 100-111.

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Saiki, R. K., S. Scharf, et al. (1985). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia." Science 230(4732): 1350-1354.

Claims

염기서열의 5'말단 기준으로 두 번째부터 네 번째 염기서열 중 어느 하나 이상은 포스포로티오에이트 변형(phosphorothioate modification)된 하기의 서열번호 1의 염기서열을 갖는 블록 시발체와
Taq DNA 중합효소를 혼합하는 단계를 포함하는,
Taq DNA 중합효소의 제조방법:
<서열번호 1>
5'-TGGGATATCCCGGGGCTTGCGGGCGGGCGTACGCCCGCCCGCAAGCCCC-3'.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 블록 시발체는 Taq DNA 중합효소 대비 0.01 내지 10 v/v%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 Taq DNA 중합효소의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 블록 시발체는 Taq DNA 중합효소 대비 0.1 내지 3 v/v%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 Taq DNA 중합효소의 제조방법.
삭제
삭제
삭제
제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 Taq DNA 중합효소를 증폭하고자 하는 DNA에 첨가하는 단계를 포함하는, 핫 스타트(Hot start) 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 방법.