JP2007520236A - 抗凍結タンパク質により高められた核酸増幅 - Google Patents
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Abstract
方法及び組成物は、標準核酸増幅緩衝液、リアルタイムＰＣＲ緩衝液、又はその両方のシグナル強度の増加及び貯蔵安定性を与える。本発明に記載される緩衝液は、抗凍結タンパク質(ＡＦＰ)を、場合によりＢＳＡなどのキャリアタンパク質と共に含む。
Description
本発明は、核酸増幅反応における増幅収量を増加するための、シグナル強度を高めて核酸検出及び定量方法、例えばリアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応(リアルタイムＰＣＲ)、におけるシグナル対ノイズ比を改善するための、並びに度重なる凍結/融解サイクルにわたりかかる反応において使用する増幅酵素溶液の安定性を増加するための方法及び組成物に関する。
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、２００４年２月４日に出願された「METHODS AND COMPOSITIONS TO ENHANCE AMPLIFICATION EFFICIENCY AND SIGNAL」と題する米国仮特許出願第60/541,999号に基づく優先権を主張する。
本出願は、２００４年２月４日に出願された「METHODS AND COMPOSITIONS TO ENHANCE AMPLIFICATION EFFICIENCY AND SIGNAL」と題する米国仮特許出願第60/541,999号に基づく優先権を主張する。
多量の核酸分子を調製する能力は、分子生物学の多くのプロトコルに必須であり、そしてバイオテクノロジー及び臨床研究における多くの下流用途における基本的な要件である。例えば、増幅された核酸分子は、しばしば、クローニング実験、ＤＮＡシーケンス反応、制限酵素切断反応、及びそれに続くライゲーション反応に使用され、そしてこうした使用は全て、又はある程度は、開始ＤＮＡ物質の品質及び量に左右される。そのようなものとして、品質の高い多量の配列特異的核酸分子を調製する信頼の置ける方法に対する必要性がこれまで存在し、そして継続して存在する。
さらに、混合された標的物質から標的核酸分子を検出及び/又は定量する能力は、多くの臨床、工業、及び基礎研究適用に有用である。例えば、患者サンプル中でウイルス核酸配列を感度高くそして正確に検出及び定量することは、正確な診断及びそれに続く患者の治療についての臨床セットに有用である。かかる検出及び治療方法は、一般的に開始物質に存在する１以上の標的核酸分子の増幅を必要とする。そのようなものとして、開始物質由来の標的核酸分子の検出及び治療を容易にすることについて必要性が存在し、そして継続して存在し、これは、品質の高い多量の配列特異的核酸分子を調製する信頼できる方法をまた必要とする。
核酸を増幅する有力なアプローチは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を介する。ＰＣＲは、テンプレートの核酸を指数関数的に増幅するのに有用で便利なｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法である。ＰＣＲの特定の応用は、標的遺伝子発現を検出及び/又は定量すること、並びにアレイ技術を用いて検出される標的遺伝子発現の差を確認することを含む。一般的にＰＣＲ技術の最適化は、増幅された産物(単位複製配列)の正確性(つまり、配列特異性)及びトータル・レベル若しくは量の両方を向上させ、そしてリアルタイム-ＰＣＲ技術の最適化は、当該方法の間、感度を高め、そして非特異的増幅を抑制しうる。それぞれのリアルタイムアッセイは、ＰＣＲ産物の生成の際の検出可能なシグナルの放出に依存しており、そして非特異的増幅は、開始物質が少量である場合特に問題となる。さらに、反応の間、及び反応混合液と合わせる前の反応に関与する構成要素の貯蔵の間の両方において、ＰＣＲ反応に関与する構成要素である酵素のより優れた安定性に対して必要性が存在する。
従来、ＰＣＲ最適化は、標準ＰＣＲ緩衝液を改変すること、プライマー・アニーリング温度を改変すること、より効率のよい熱安定性のポリメラーゼ酵素を提供すること、及びより有効なプライマー分子を設計することに注目してきた。リアルタイムＰＣＲにおける産物の定量化に関して、最適化は、２個の比較的新しいアッセイ：インターカレット型の色素及びバイナリ・ハイブリダイゼーション・プローブを使用するリアルタイムＰＣＲのＴａｑＭａｎ（登録商標）法(Leeら、1993 Nucleic Acids Res., 21 (16:3761.6)) の開発に焦点を当てた。いずれの場合でも、非特異的増幅のさらなる減少、シグナル強度の増幅、及び酵素安定性の向上は、より感度の高く、正確で、そしてしっかりとした結果を提供するために決定的に必要とされている。
この背景に対して、本発明が開発された。
この背景に対して、本発明が開発された。
関連文献の要約
抗凍結タンパク質(ＡＦＰ)は、氷結温度又は氷点下で生存する生物において広く見られる氷に結合するタンパク質のクラスである。最初に発見されたＡＦＰは、南極地方の魚のある種の血液から発見された(DeVries(1969)Science 163, 1073-1075)。これらの最初の発見以来、当該タンパク質を発現する多くの生物(例えば、魚、昆虫、植物、及び微生物)が同定された(Jiaら、(2002) TRENDS in Biochem. Sciences, 27:2、101-106)。ＡＦＰは、タンパク質配列及び構造特徴に基づいて分類され、その多くはかなり異なる構造を有する。多くのＡＦＰに基づく異なる構造は、これらの分析において同定され、へリックス・バンドル・タンパク質、タンパク質の一の側に並んだＴｈｒ残基を有するらせん状のタンパク質、Ａｌａ-Ａｌａ-Ｔｈｒの繰り返しを有するらせん状タンパク質、及び球形タンパク質を含む。
抗凍結タンパク質(ＡＦＰ)は、氷結温度又は氷点下で生存する生物において広く見られる氷に結合するタンパク質のクラスである。最初に発見されたＡＦＰは、南極地方の魚のある種の血液から発見された(DeVries(1969)Science 163, 1073-1075)。これらの最初の発見以来、当該タンパク質を発現する多くの生物(例えば、魚、昆虫、植物、及び微生物)が同定された(Jiaら、(2002) TRENDS in Biochem. Sciences, 27:2、101-106)。ＡＦＰは、タンパク質配列及び構造特徴に基づいて分類され、その多くはかなり異なる構造を有する。多くのＡＦＰに基づく異なる構造は、これらの分析において同定され、へリックス・バンドル・タンパク質、タンパク質の一の側に並んだＴｈｒ残基を有するらせん状のタンパク質、Ａｌａ-Ａｌａ-Ｔｈｒの繰り返しを有するらせん状タンパク質、及び球形タンパク質を含む。
近年、ＡＦＰタンパク質及び特にＩ型ＡＦＰタンパク質（AFP type I protein)は、一般的な商品の安定性のため、化粧品用途において使用されてきた。さらに、ＡＦＰは、凍結条件下で、冷凍食品の保護を助けるために、食品添加剤として限られた設定で使用され、哺乳動物細胞の凍結保護用に使用され、そして細胞手術の間の腫瘍細胞の破壊を高めるために使用されてきた(Fletcherら(1999)CHEMTECH 30(6)：17-28)。
本発明は、核酸増幅反応の性能を改善するための組成物及び方法を提供する。ここで、当該反応は、通常、少なくとも１回の変性ステップ、アニーリング・ステップ、及び伸張ステップを含む。本発明の組成物は、何回もの凍結/融解のコースに渡って酵素安定性を改善する有利な効果を提供し、そしてさらに驚くべきことに、増幅反応の性能を有意に高め、そしてシグナル強度を劇的に増加させ、そして関連する検出及び定量方法においてシグナル対ノイズ比を改善する。本発明は、抗凍結タンパク質(ＡＦＰ)、例えばＢＳＡなどのキャリアタンパク質と混合されたＡＦＰ、ポリオールと混合されたＡＦＰ、及びキャリアタンパク質及びポリオールと混合されたＡＦＰを含む増幅反応混合組成物を提供する。
本発明の一の態様では、増幅酵素溶液中において酵素の安定性を改善するための方法及び組成物が提供され、ここで、当該酵素溶液は、次の増幅反応において使用する前に、少なくとも１回の凍結融解サイクルに付される。一の実施態様では、酵素溶液は、ＡＦＰを含み、そして場合によりさらにキャリアタンパク質及び/又はポリオールを含む。好ましい実施態様では、ＡＦＰは、凍結融解サイクルの前に、又は同時に酵素溶液に加えられる。
本発明の別の態様では、一般的な核酸増幅反応、及び特に関連する検出及び定量方法の性能を改善するための方法及び組成物であって、両性イオン緩衝液中のキャリアタンパク質と場合により組合せた少なくとも１の抗凍結タンパク質を、増幅反応混合液中に含めることを含む。本明細書中に記載されるように、これらの新たな増幅反応混合液は、単位複製配列の収量及びシグナル強度を改善し、シグナル対ノイズ比を増加させ、そして反応の全体の感受性を高める。
特別な実施態様では、反応のシグナル対ノイズ比を改善するために反応混合液が少なくとも１の抗凍結タンパク質を含む核酸増幅反応を含む、改善された核酸検出及び定量方法が提供される。好ましい抗凍結タンパク質は、シグナル及び感度を高めるための１以上のアラニン-リッチ・モチーフを有する。特に好ましい実施態様では、キャリアタンパク質、例えばＢＳＡ又は他のタンパク質は、反応混合液中に、抗凍結タンパク質と組み合わせて含められて、シグナル対ノイズ比を最大にする。驚くべきことに、ＡＦＰとキャリアタンパク質の組合せは、ＡＦＰ単独又はキャリアタンパク質単独を超えるシグナル対ノイズ比の相乗的改善を提供する。
好ましい実施態様では、ポリオールは、一定の第二構造を有するテンプレート核酸を含む増幅反応混合液中に含められる。特に好ましい実施態様では、ポリオールは、ソルビトール、マルチトール、アドニトール、アラビトール、及びマンニトールからなる群から選ばれる。付属的な物質(例えば非限定的に、一本鎖結合タンパク質、ｎ-プロピル・スルホキシドなどを含む)は、増幅反応をさらに促進するために、当該反応混合液に含めることができる。
本発明のさらなる実施態様は、５’-３’ヌクレオチド分解性の切断の際に蛍光シグナルの放出が予期されるリアルタイムＰＣＲの間、シグナル増幅を最大化する組成物を含む。本発明の好ましい組成物及び方法は、好ましくは１以上のアラニン・リッチ・モチーフを有する少なくとも１の抗凍結タンパク質(例えばＩ型ＡＦＰにより発現される）を、単独で、又はキャリアタンパク質と組み合わせて含む反応混合液を使用する。特に好ましい実施態様では、反応混合液は、約７.９〜約８.１のｐＨを有する両性緩衝液で調製される。別の好ましい実施態様では、核酸定量方法は、リアルタイムＰＣＲであり、そして抗凍結タンパク質、及びキャリアタンパク質の添加が、相乗的なシグナル増幅を与える。
本発明のこれらの及び様々な他の特徴及び利点は、以下の詳細な記載を読み、そして添付の特許請求の範囲を読むことから明らかであろう。
以下の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語の理解を促すために提供され、そして本開示の範囲を制限することを意味しない。
本明細書中に使用されるとき「増幅反応」又は「核酸増幅反応」は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、所望の核酸配列のコピーの数を増加するin vitro方法のいずれかを指す。核酸増幅反応は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)(米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号に記載される。両特許は、本明細書中に援用される)、核酸配列に基づく増幅(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）(ＮＡＳＢＡ)(米国特許第5,409,818号に記載される。当該特許は本明細書中に援用される)、及び鎖置換増幅(Strand Displacement Amplification)(ＳＤＡ)(米国特許5,455,166号に記載される。当該特許は、本明細書中に援用される)を含む。当該技術分野に周知であるが、かかる反応は、サンプル中の１以上の標的核酸配列の存在を測定する多くの核酸検出方法において、並びに当該反応により産生された単位複製配列の量を定量する多様な核酸定量方法において有利な用途を見つける。
本明細書中で使用されるとき「アンチセンス」は、標的「センス」ポリヌクレオチド配列に相補的であるポリヌクレオチド配列を指す。
本明細書中に使用されるとき、「キャリアタンパク質」は、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、プリオネックス(Prionex)、冷水魚ゼラチン、ゼラチン、Ｇｒｏ Ｌ、Ｇｒｏ Ｓ、ＤＮＡＫ、熱ショックタンパク質７０(ＨＳＰ７０)、アポリポタンパク質、並びに血清アルブミン様の他の物質を指す。
本明細書中で使用されるとき「Ｃｔシフト」又は「閾値サイクル」は、増幅産物が検出できるサイクルを指し、１.５〜３サイクルのＣｔシフトは、５〜１０倍量のＤＮＡに相当する。
本明細書中で使用されるとき、「核酸」又は「ＮＡ」は、デオキシリボ核酸(ＤＮＡ)及びリボ核酸(ＲＮＡ)の両方、並びにそれらの改変及び/又は官能基化されたバージョンを指す。同様に、本明細書中で使用される「ヌクレオチド」は、リボ核酸及びデオキシリボ核酸の個々のユニットの両方、並びにヌクレオシド及びヌクレオチドアナログ、及び改変されたヌクレオチド、例えば標識ヌクレオチドを含む。さらに、「ヌクレオチド」は、非天然型のアナログ構造、例えば、糖、ホスフェート、及び/又は塩基ユニットが失われているか、又は他の化学構造により置換されている構造を含む。こうして、「ヌクレオチド」という用語は、個々のペプチド核酸(ＰＮＡ)(Nielsenら、Bioconjug. Chem.1994;5(1):3-7)及びロックされた核酸(locked nucleic acid)(ＬＮＡ)(Braasch及びCorey, Chem. Biol. 2001； 8(1); 1-7)を含む。
本明細書中で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」又は同等の文法的同等物は、互いに共有結合された少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。当業者により認められるように、糖-ホスフェート骨格の様々な改変は、生理環境における係る分子の安定性を増加するために行われ、例えば、化学改変、例えば、ホスホロチオエート、又はメチルホスホネートを含む。係る分子は、例えば、標識の付加を促進する目的で、明らかな特徴的性質を有する１以上の分子とカップリングすることにより官能基化されてもよい。
本明細書中に使用されるとき、「核酸配列」は、核酸の鎖に沿ったヌクレオチドの順番又は配列を指す。幾つかの場合、これらのヌクレオチドの順番は、対応するポリペプチド鎖に添ったアミノ酸の順番を決定するであろう。核酸配列は、こうしてアミノ酸配列をコードする。核酸配列は、定められる場合、一本鎖又は二本鎖であってもよく、又は二本鎖及び一本鎖配列の両方の一部を含んでもよい。核酸配列は、ＤＮＡ、ゲノム及びｃＤＮＡ、ＲＮＡ、又はハイブリッドから構成されてもよく、ここで当該配列は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組合せ、及び塩基（例えばウラシル(Ｕ)、アデニン(Ａ)、チミン(Ｔ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなど）の任意の組合せを含む。
本明細書中で使用されるとき「相補」又は「相補性」は、第二ポリヌクレオチド分子中の別のヌクレオチドと塩基対を形成するポリヌクレオチド分子中のヌクレオチドの能力を指す。例えば、５’-Ａ-Ｃ-Ｔ-３’配列は、３’-Ｔ-Ｇ-Ａ-５’配列に相補する。相補性は部分的(その場合ヌクレオチドの幾つかのみが、塩基対に従って適合する)であってもよいし、又は完全(その場合、全てのヌクレオチドが塩基対に従って適合する)であってもよい。本発明の目的では、「実質的に相補的」は、標的塩基対領域の長さにわたり、９５％以上の同一性を指す。
本明細書中で使用されるとき、「発現」は、宿主細胞内で起こる転写及び翻訳を指す。宿主細胞におけるＤＮＡ分子の発現レベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量、又は宿主細胞により産生されるＤＮＡ分子がコードするタンパク質の量のいずれかに基づいて決定されてもよい。本発明の文脈内において、「発現」という用語についてのさらなる詳細は、Sambrookら、1989, Molecular Cloning； A Laboratory Manual; 18.1-18.88の総説を介して得ることができる。
本明細書中で使用されるとき、「凍結/融解」条件は、典型的には０℃未満、及び好ましくは約-３０℃〜約-４０℃以下ではない温度で標的物質を凍結することにより特徴付けられる。融解条件は、典型的には室温を超えることはない。典型的なゆっくりの凍結/融解サイクルは、物質を約０℃〜約-４０℃で凍結し、その温度で一定の時間貯蔵し、そして約１℃から約２７℃で融解するサイクルであり、必要とされる最終用途に左右される。
本明細書中に使用されるとき、「宿主細胞」又は「宿主細胞(複数)」は、異種のポリヌクレオチド分子、例えばプラスミド・ベクターを発現しているか、又は発現することができる細胞を指す。本発明の宿主細胞は、バイオテクノロジー、分子生物学、及び臨床セットを含む多くの用途において有用であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する。本発明における適切な宿主細胞の例は、非限定的に細菌、酵母、昆虫、及び哺乳動物細胞を含む。かかる細胞の具体例は、イー.コリ(Ｅ.ｃｏｌｉ)ＤＨ５α細胞、並びに種々の他の細菌細胞源、例えばイー.コリ株：ＤＨ１０ｂ細胞、ＸＬ１Ｂｌｕｅ細胞、ＸＬ２Ｂｌｕｅ細胞、Ｔｏｐ１０細胞、ＨＢ１０１細胞、及びＤＨ１２Ｓ細胞、並びにサッカロマイシス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia)、及びクルヴェロマイシス(Kluveromyces)を含む属由来の酵母宿主細胞を含む。
本明細書中に使用されるとき、本発明の目的のための「単離された」及び「精製された」は、互換性を有し、そしてポリヌクレオチド、例えば標的核酸配列であって、細胞破片から分離されたもの、例えば高分子量ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質を指す。これは、ＤＮＡを含む細胞破片から分離される単離ＲＮＡサンプルを含む。
本明細書中に使用されるとき、「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」は、交換して使用することができ、アミノ酸ポリマー又は２以上の相互作用若しくは結合するアミノ酸ポリマーのセットを指す。
本明細書中に使用されるとき、「リアルタイムＰＣＲ」は、蛍光プローブ、ビーコン、及び/又はインターカレット型色素を、当該方法の全てのサイクルの間用いる定量的ＰＣＲ技術を指す。
本明細書中に使用されるとき、「厳格度」は、条件、つまり、温度、イオン強度、溶媒などであって、その条件下でポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションが生じる条件を指す。ハイブリダイゼーションは、増幅方法のアニーリングステップの間、プライマーとテンプレートＤＮＡとの間で生じるプロセスである。
本発明の実施態様は、核酸増幅反応の全体としての性能を高め、そして関連する検出及び定量方法を改善するための方法及び組成物を提供する。特に、本発明の実施態様は、一般的な核酸増幅反応のシグナル強度を向上させ、シグナル増幅を高め及び/又は核酸検出法及び増幅法においてシグナル対ノイズ比を改善し、そしてかかる反応及び方法において使用する前に１回又は数回の凍結融解サイクルをとおした酵素溶液の安定性を増加することに関する。
好ましくは、本発明の具体的な実施態様は、以下の：
リアルタイムＰＣＲの間において、シグナル増幅(ＲＦＵ)及び感度(閾値サイクル)を高めるために抗凍結タンパク質(ＡＦＰ)を含めること；凍結/融解条件の間、貯蔵安定性を高めるために酵素溶液内にＡＦＰを含めること；シグナルの大きさ及び感度、並びに貯蔵安定性についてさらなる相乗効果を提供するために、ＡＦＰとともにキャリアタンパク質、例えばＢＳＡを含めること；凍結/融解サイクルの間、生成物収量を高め、そして安定性をさらに改良するために、混合物中にＡＦＰとともにソルビトール又は他の同様のポリオール物質を含めること；及び高性能核酸増幅緩衝液、例えばＰＣＲ緩衝液(感度、特異性、シグナル強度、及び貯蔵安定性を増加させる)を提供するために、両イオン性緩衝液製剤、つまりＫＣｌを伴うＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ又はＫＣｌを伴うＴＡＰＳ-ＫＯＨに基づく緩衝液(特にここでｐＨは約７.９〜約８.１である)中に、ｄＵＴＰ、ポリオール、及びＡＦＰを含めることを含む。
リアルタイムＰＣＲの間において、シグナル増幅(ＲＦＵ)及び感度(閾値サイクル)を高めるために抗凍結タンパク質(ＡＦＰ)を含めること；凍結/融解条件の間、貯蔵安定性を高めるために酵素溶液内にＡＦＰを含めること；シグナルの大きさ及び感度、並びに貯蔵安定性についてさらなる相乗効果を提供するために、ＡＦＰとともにキャリアタンパク質、例えばＢＳＡを含めること；凍結/融解サイクルの間、生成物収量を高め、そして安定性をさらに改良するために、混合物中にＡＦＰとともにソルビトール又は他の同様のポリオール物質を含めること；及び高性能核酸増幅緩衝液、例えばＰＣＲ緩衝液(感度、特異性、シグナル強度、及び貯蔵安定性を増加させる)を提供するために、両イオン性緩衝液製剤、つまりＫＣｌを伴うＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ又はＫＣｌを伴うＴＡＰＳ-ＫＯＨに基づく緩衝液(特にここでｐＨは約７.９〜約８.１である)中に、ｄＵＴＰ、ポリオール、及びＡＦＰを含めることを含む。
抗凍結タンパク質(ＡＦＰ)
抗凍結タンパク質(ＡＦＰ)は、凍結条件下で生育する多くの種に凍結抵抗性及び凍結寛容性を与えるタンパク質のファミリーを表す。一般的に、生物内のＡＦＰ分子は、種氷結晶の表面に結合して、結晶の成長を制御する。Jiaら、(2002) TRENDS in Biochem. Sciences, 27(2) 101-106を参照のこと。数種の魚及び数種の昆虫を含む多くの異なる生物がＡＦＰを発現することが、発見されてきた。魚のＡＦＰは、主に一次構造及び二次構造分析に基づいて、５個の群に分類される(表１を参照のこと)。昆虫のＡＦＰに関して、Ｔｍ又はＤｃ(カブトムシ)及びＣｆ(蛾)を含む数種の昆虫は、２のグループに分類されてきた。ＡＦＰは、数種の植物種から同様に単離されてきた(Aticiら、(2003)Phytochemistry, 64(7)187-96)。
抗凍結タンパク質(ＡＦＰ)は、凍結条件下で生育する多くの種に凍結抵抗性及び凍結寛容性を与えるタンパク質のファミリーを表す。一般的に、生物内のＡＦＰ分子は、種氷結晶の表面に結合して、結晶の成長を制御する。Jiaら、(2002) TRENDS in Biochem. Sciences, 27(2) 101-106を参照のこと。数種の魚及び数種の昆虫を含む多くの異なる生物がＡＦＰを発現することが、発見されてきた。魚のＡＦＰは、主に一次構造及び二次構造分析に基づいて、５個の群に分類される(表１を参照のこと)。昆虫のＡＦＰに関して、Ｔｍ又はＤｃ(カブトムシ)及びＣｆ(蛾)を含む数種の昆虫は、２のグループに分類されてきた。ＡＦＰは、数種の植物種から同様に単離されてきた(Aticiら、(2003)Phytochemistry, 64(7)187-96)。
重要なことに、ＡＦＰファミリー内において幾つかの異なって同定されるモチーフ及びモチーフの繰り返しは、氷の成長を阻害するように同様に機能することが示されてきた。これらには、１１個のアミノ酸(ａａ)を有するアラニンリッチへリックス(へリックスの３個のターン)(Ｉ型ＡＦＰ)又はＡｌａ-Ａｌａ-Ｘ(二糖の側鎖)の３個のａａの繰り返しモチーフ(ここで、Ｘはセリン、アルギニン、リジン、アスパラギン、グルタミン、又はスレオニンである)(ＡＦＧＰ)が含まれる。さらなる構造情報は、Jiaらから得ることができ、そして表１に示される（米国特許第6,017,574号を参照のこと。当該特許は、本明細書中に援用される）。
本発明は、核酸検出及び定量方法、例えばリアルタイムＰＣＲにおいて、シグナル増幅を高めるための、並びに核酸増幅反応において使用される酵素溶液の安定性を増加させるための組成物及び方法を提供する。
一の実施態様では、本明細書中に提供される改良された増幅反応混合物は、一般的にプライマー、テンプレートＤＮＡ、ｄＮＴＰ、及び適切な増幅酵素、例えばＴａｑＤＮＡポリメラーゼを提供し、そして特異的に少なくとも１のＡＦＰを含む。好ましい実施態様では、ＡＦＰは、アラニン-リッチへリックス又は-Ａｌａ-Ａｌａ-Ｘ-(二糖)の繰り返しを有する群から選ばれ、それぞれＩ型ＡＦＰ又はＡＦＧＰに由来する。さらに、Ｉ型ＡＦＰに由来するアラニンリッチへリックスモチーフを有するＡＦＰ断片(例えば米国特許第5,925,540号を参照のこと、この開示は、本明細書中に明らかに援用される)、又はＡＦＧＰに由来する-Ａｌａ-Ａｌａ-Ｔｈｒ-(二糖)の繰り返し、及びそれらのバリアント、誘導体、アイソタイプ、及びその融合タンパク質(これら全ての例は、本発明の目的のために、一般的にＡＦＰと呼ばれる)は、これらの点で有用である。好ましい実施態様では、増幅酵素溶液及び/又は反応混合液は、ＡＦＰに基づく結果を高めるために、さらにキャリアタンパク質、例えばＢＳＡ又はゼラチンを含む。本明細書中に示されるように、ＡＦＰとともに反応混合液中にキャリアタンパク質を含めることは、ＡＦＰ単独又はキャリアタンパク質単独を超える相乗効果をもたらす。
本発明に記載される実施態様は、典型的に、約１０〜２００μｇ/ｍｌ、及び好ましくは約２５〜１００μｇ/ｍｌ、そして最も好ましくは約４０〜６０μｇ/ｍｌのＡＦＰの酵素溶液を含む。ＡＦＰにキャリアタンパク質を含めることは、典型的に、約１００μｇ/ｍｌ〜約３００μｇ/ｍｌ、及び好ましくは約１５０〜約２５０μｇ／ｍｌ、そして最も好ましくは約２００μｇ／ｍｌの濃度にて行われる。平均的なＲＦＵ、及び閾値サイクルで計測された検出のサイクルにより計測されるとき、ＡＦＰとキャリアタンパク質を、標準リアルタイムＰＣＲ緩衝液中に含めることにより、シグナル増幅の有意な改善が提供される。以下の実施例に記載されるように、ＡＦＰとキャリアタンパク質の組合せは、かかるアッセイのシグナル強度又は輝度、及び感度の相乗的な改善を提供する。
本発明において使用するためのＡＦＰは、AFP Proteins, Inc., Waltham MA.から購入できる。さらに、本発明に記載されるＡＦＰ、並びにＡＦＰの断片、誘導体、及び融合タンパク質は、昆虫細胞、酵母細胞、原核細胞、及び真核細胞において発現することができる。発現に使用される適切な原核宿主は、非限定的にエスケリキア、バチルス、及びサルモネラ属の細菌を含む。組換えタンパク質の発現を設計するためのＡＦＰ配列は、Jiaらの総説から得ることができ、その全てを本明細書中に援用される(米国特許第5,925,540号を参照のこと、当該特許もその全てを援用される)。
本発明において有用なＡＦＰ分子のアミノ酸配列の改変は、多くの既知の配列により達成することができる。例えば、突然変異は、オリゴヌクレオチド-ダイレクト突然変異誘導により、特定の位置で誘導されうる(Walderら、1986, Gene, 42:133; Bauerら, 1985, Gene 37: 73, Craik, 1985, Biotechniques, 12-19; Smithら、1981, Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press; 米国特許第4,737,462号)。本明細書中に記載され、そして実施例において示されるように、改変は、ＡＦＰ活性を高めるのに有用でありうる。
本発明のＡＦＰポリペプチドは、好ましくは、単離又は部分的に単離された形態で使用される。ポリペプチドは、例えば、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ・クロマトグラフィー、及びレクチン・クロマトグラフィーを含む既知の方法により、組換え細胞の培養物から回収及び精製されうる。
ＡＦＰポリペプチドを、精製を促進するために異種のポリペプチドと融合することができる。多くの利用できる異種のペプチドは、融合タンパク質の結合パートナーへの選択的結合を可能にする。ペプチドタグの非限定的な例は、６-Ｈｉｓ、チオレドキシン、ヘマググルチニン、ＧＳＴ、及びＯｍｐＡシグナル配列タグを含む。異種ペプチドを認識し、当該ペプチドに結合する結合パートナーは、金属イオン、抗体、抗体断片、或いは異種ペプチドに優先的に結合して、融合タンパク質の精製を許容する任意のタンパク質又はペプチドを含む任意の分子又は化合物でありうる。
本発明は、何回もの凍結／融解サイクル、及び４℃〜-８０℃の長期の貯蔵後において使用するための高い安定性を有する増幅酵素溶液及び増幅緩衝液、例えばリアルタイムＰＣＲ緩衝液を提供する(以下の実施例を参照のこと)。上記のように、標準増幅緩衝液成分は、任意の２回のゆっくりした凍結／融解サイクルの間酵素分解を最小にするために、上記濃度を使用してＡＦＰと、又はＡＦＰ及びキャリアタンパク質と混合される。ＡＦＰが、ゆっくりした凍結事象、例えば酵素溶液の０℃〜-４０℃での凍結に対する安定化に特に有効であるということに留意すべきである。
そのようなものとして、そして理論に束縛されることなく、ＡＦＰ又はキャリアタンパク質と組み合わせたＡＦＰを含めることは、繰り返しの凍結／融解サイクルの間増幅酵素の安定化に二重の利得をもたらし、そして驚くべきことに、後の核酸増幅反応の感度及びシグナル強度をさらに高めるということが信じられている。典型的に、０℃〜-４０℃の凍結条件に対して、安定性が提供される。適切な量のＡＦＰを含む増幅緩衝液、例えばリアルタイムＰＣＲ緩衝液を有するキットは、アッセイの安定性を最大化し、ゆっくりした凍結条件下で緩衝液の貯蔵を安定化するようにパッケージされうる。加えて、ＡＦＰ又はＡＦＰとキャリアタンパク質は、ＰＣＲ又は他の同様の増幅反応混合液に加えるために、所望のポリメラーゼとパッケージされうる。
ＰＣＲ緩衝液中のＡＦＰを含めることにより、ポリメラーゼに基づく増幅反応及び当該反応を使用する検出及び定量方法が高められることが示されるが、他の所望の活性を有する酵素の貯蔵において有用であることも想像されるということに留意すべきである。例えば、ＡＦＰは、酵素活性の維持を必要とするゆっくりした凍結条件を受ける任意の酵素溶液(つまり、ここで酵素が、凍結／融解により損傷を受けうる)における用途を見出すであろう。１の他の実施態様では、キャリアタンパク質の存在下又は非存在下において、ＡＦＰは、ＡＭＶと混合されて、数回のゆっくりした凍結／融解サイクルの間にわたり、酵素の逆転写活性を保護する。
ＡＦＰに基づく反応混合液を使用する核酸増幅
１の態様では、本発明は、核酸テンプレートを増幅するための方法であって、増幅反応混合液中において核酸テンプレートを増幅反応に付すことを含む方法を提供する。増幅反応混合液は、好ましくは、ＡＦＰ１及びさらに好ましくはＡＦＰ１とキャリアタンパク質、例えばＢＳＡを含む。
１の態様では、本発明は、核酸テンプレートを増幅するための方法であって、増幅反応混合液中において核酸テンプレートを増幅反応に付すことを含む方法を提供する。増幅反応混合液は、好ましくは、ＡＦＰ１及びさらに好ましくはＡＦＰ１とキャリアタンパク質、例えばＢＳＡを含む。
核酸分子は、文献に記載される手動又は自動化増幅方法のいずれかに従って増幅されてもよい。核酸増幅は、ヌクレオチドを、ＤＮＡ分子又はプライマー中に取り込むことをもたらし、それにより、核酸テンプレートに相補する新たなＤＮＡ分子を形成する。形成されたＤＮＡ分子及びそのテンプレートは、さらなるＤＮＡ分子を合成するためにテンプレートとして使用することができる。本明細書中に使用されるとき、１の増幅反応は、ＤＮＡ複製の多くのサイクル又はラウンドからなりうる。ＤＮＡ増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を含む。１のＰＣＲ反応は、１０〜１００サイクルのＤＮＡ分子の変性と合成からなりうる。かかる方法は、非限定的にＰＣＲ(米国特許第4,683,195号及び第4,683,202号に記載され、これらの特許は、本明細書中に援用される)、鎖置換増幅(ＳＤＡ)(米国特許第5,455,166号に記載され、当該特許は本明細書中に援用される)、及び核酸配列に基づく増幅(ＮＡＳＢＡ(米国特許第5,409,818号に記載され、当該特許は本明細書に援用される)を含む。例えば、増幅は、熱を用いずにＤＮＡ融解の効力を高めるためにヘリカーゼをさらに使用するローリング・サークル複製システム(rolling circle replication systemu)により達成されてもよい(Yuzhakouら、"Replisome Assembly Reveals the Basis for Asymmetric Function in Leading and Lagging Strand Replication" Cell 86: 877-886(1996)及びMokら、"The Escherichia coli Preprimosome and DnaB Helicase Can Form Replication Forks That Move at the Same Rate," J. Biol. Chem. 262: 16558-16565(1987)を参照のこと。これらの文献は、本明細書に援用される)。最も好ましくは、核酸分子は、ＰＣＲに基づく増幅技術を使用して本発明の方法により増幅される。
好ましい実施態様では、増幅反応は、高温の変性ステップを含む。高温の変性ステップについての好ましい温度は、約９０℃〜約９８℃の範囲であり、９３℃〜９４℃の温度は特に好ましい。かかる好ましい増幅反応は、温度サイクル増幅反応、例えば約１０〜１００サイクル、より好ましくは約２５〜５０サイクル、そして約９３℃〜約９４℃のピーク温度のポリメラーゼ連鎖反応を含む。
好ましい実施態様では、(ａ)必要とする配列の末端が、十分詳細に知られており、それらにハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドを合成でき、そして(ｂ)少量の配列が、連鎖反応を開始するために利用できるならば、ＰＣＲ反応が所望のポリメラーゼを使用して行われて、関与する反応ステップの数に比例する指数関数量で、少なくとも１の特異的な核酸配列を産生する。連鎖反応の産物は、使用された特異的プライマーの各末端に対応する末端を有する別個の核酸二本鎖であろう。
精製又は未精製の形態における核酸の任意の源は、所望の特異的核酸を含むかぎり、開始核酸として利用できる。こうして、当該方法は、例えばＤＮＡ又はメッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡ(ここでＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖又は二本鎖であってもよい)を利用しうる。さらに、それぞれの一の鎖を含むＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッドが、利用されてもよい。これらの核酸の任意の混合物が使用されてもよいか、或いは同じ又は異なるプライマーを使用して前に行った増幅反応から産生される核酸が利用されてもよい。増幅された核酸は、好ましくはＤＮＡである。増幅される特異的核酸配列は、巨大分子のほんの一部であってもよいし、又は特異的配列は核酸全体を構成するように個別の分子として最初から存在することもある。増幅される配列が、はじめに純粋な形態である必要はなく、複合混合物の数少ない部分であってもよい。例えば、全ヒトＤＮＡ中に含まれるβ-グロビン遺伝子の部分、或いは特定の生物サンプルの分画中かなり少数の部分を構成する特定の微生物に起因する核酸配列部分などである。開始核酸は、同じであるか又は異なりうる１超の所望の特異的核酸配列を含んでもよい。その結果、当該方法は、１の特異的核酸配列の多くの量を産生するためだけでなく、同じ又は異なる核酸分子上に配置する１超の異なる特異的核酸を同時に産生するためにも有用である。
核酸は、任意の源から得てもよく、そしてプラスミド及びクローン化されたＤＮＡ又はＲＮＡ、並びに、例えば細菌、酵母、ウイルス、及び植物又は動物などの高等動物を含む任意の源由来のＤＮＡ又はＲＮＡを含んでもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡは、Maniatisら、Molecular Cloning: A Labolatory Manual, (New York: Cold Spring Harbor Laboratory) pp 280-281(1982)により記載される種々の技術により、血液、絨毛膜絨毛、又は羊膜から抽出されうる。
任意の特異的核酸は、本方法により製造されうる。所望の配列の異なる鎖に、そして配列に沿った相対位置にハイブリッド形成する２個のオリゴヌクレオチド・プライマーが調製されるように、配列の両末端にて十分な数の塩基が十分詳細に知られることのみが必要とされる。その結果、１のプライマーから合成される伸張産物が、そのテンプレート(相補体)から分離されたとき、他のプライマーが規定の長さの核酸へと伸張するためのテンプレートとして役に立つ。配列の両末端での塩基についての知識が多ければ多いほど、標的核酸配列についてのプライマーの特異性が大きくなり、そうして当該方法の効率がよくなる。以後用いられるプライマーという用語は、特に増幅される断片の末端配列に関する組成についていくらかの不明確性が存在する場合、１超のプライマーを指しうることが理解されよう。例えば、核酸配列が、タンパク質配列情報から与えられる場合、遺伝コードの縮重に基づいて起こりうるコドンの多様性を示す配列を含むプライマーの集合がそれぞれの鎖について使用されうる。当該集合からの１のプライマーが、増幅される所望の配列の末端と同一であろう。
幾つかの変わりの実施態様において、ランダムプライマー、好ましくはヘキサマーが、核酸分子テンプレートを増幅するために使用される。いくつかの実施態様では、増幅された的確な配列は、予め決められていない。
オリゴヌクレオチド・プライマーは、任意の適切な方法、例えばホスホトリエステル及びホスホジエステル法、又はこれらの自動化された実施態様を用いて調製されてもよい。かかる自動化された実施態様の一つでは、ジエチルホスホロアミダイト(diethylohoshoramidite)が開始物質として使用され、そしてBeaucageら、Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862(1981)により記載されるように合成されてもよい。当該文献は、本明細書中に援用される。改変された固体支持体上でのオリゴヌクレオチドの合成方法は、米国特許第4,458,006号において記載されている。当該文献は本明細書中に援用される。生物学的ソースから単離されたプライマーを使用することも可能である(例えば制限的エンドヌクレアーゼ切断)。
特異的核酸は、その配列をテンプレートとして含む核酸を使用することにより生成される。核酸が２個の鎖を含む場合、別のステップで又はプライマー伸張産物の合成と同時に、テンプレートとして使用される前に核酸の鎖を分離することが必要である。当該鎖の分離は、物理的、化学的、又は酵素的方法を含む任意の適切な変性方法により達成することができる。核酸の鎖を分離する１の物理的方法は、核酸を完全に(９９％)変性するまで熱することを含む。典型的な熱変性は、１〜１０分間、約８０℃〜１０５℃の範囲の温度を含む。標準的な分離は、ヘリカーゼとして知られている酵素のクラス由来の酵素、つまりＲｅｃＡ酵素により誘導されうる。当該酵素は、ヘリカーゼ活性を有し、そしてＤＮＡを変性することが知られている。核酸の鎖をヘリカーゼで分離するために適した反応条件は、Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol. XLIII "DNA:Replication and Recombination"(New York：Cold Spring Harbor Laboratory, 1978)に記載されており、そしてＲｅｃＡを使用する方法は、C. Radding, Ann, Rev. Genetics, 16:405-37(1982)において総説されており、当該文献は本明細書中に援用される。
増幅される配列を含む元の核酸が一本鎖である場合、その相補体は、１又は２個のオリゴヌクレオチドプライマーを元の核酸に加えることにより合成される。適切な１のプライマーを加える場合、プライマー伸張産物は、当該プライマー、ポリマー化薬剤、及び以下に記載される４個のヌクレオチドの存在下で合成される。生成物は、部分的に一本鎖核酸に相補し、そして核酸鎖とハイブリッド形成して、不均等の長さの二本鎖を形成し、当該鎖は上記のように一本鎖に分離されて、一本に分離された２個の相補鎖を提供する。或いは、２個の適切なプライマーが、一本鎖核酸に加えられ、そして反応が行われうる。
元の核酸が、増幅される配列を構成する場合、生成されたプライマー伸張産物は、元の核酸の鎖に完全に相補し、そしてそれらとハイブリッド形成して、一本鎖分子へと分離される同じ長さの鎖の二本鎖を形成する。
核酸がもともと二本鎖であろうと又は一本鎖であろうと、核酸(単数又は複数)の相補鎖が分離されるとき、鎖は、さらなる核酸鎖の合成のためのテンプレートとして使用される準備ができている。この合成は、任意の適切な方法を用いて行われうる。好ましくは、過剰量のモル数(クローン化された核酸では、通常約１０００：１のプライマー：テンプレート、ゲノム核酸については、通常約１０6：１のプライマー対テンプレート)の２個のオリゴヌクレオチド・プライマーを分離されたテンプレートの鎖を含む緩衝液に加える。しかしながら、本明細書中の方法が診断適用に用いられる場合、相補鎖の量は知られていないので、その結果相補鎖の量に対するプライマーの量が、確信をもって決定できないということが理解される。しかしながら、実際の問題として、増幅される配列が、長鎖の核酸鎖の複合混合物中に含まれるとき、加えられるプライマーの量は、一般的に相補鎖(テンプレート)の量を超えるモル過剰量である。大幅なモル過剰量は、当該方法の効率を改善するために好ましい。
ヌクレオチド三リン酸、好ましくはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰはまた、適切な量で合成混合物中に加えられ、そして得られた溶液は、好ましくは約９０℃〜９５℃で約１〜１０分間、好ましくは１５秒〜２分間熱せられる。この加熱時間の後に、溶液を約６０℃に冷却する。この温度は、プライマー・ハイブリダイゼーションに好ましい。次に、ポリメラーゼは、室温を超える温度、好ましくは約６０〜７５℃で核酸合成を行う。
新たに合成された鎖及びその相補的な核酸鎖は、本方法の次のステップにおいて使用される二本鎖を形成する。次のステップにおいて、二本鎖分子の鎖を上記方法のいずれかを使用して分離して一本鎖分子を提供する。
新たな核酸を一本鎖分子に基づいて合成する。さらなるポリメラーゼ、ヌクレオチド、及びプライマーを、必要に応じて、上記条件下で反応を行うために加えてもよい。さらに、合成がオリゴヌクレオチド・プライマーの一の末端にて開始され、そしてテンプレートの一本鎖に沿って進行して、さらなる核酸を提供するであろう。
鎖分離及び伸張産物合成のステップは、特異的な核酸配列の所望の量を与えるために必要とされるだけ、繰り返すことができる。産生される特異的核酸の量は、指数関数的に増加するであろう。
第一核酸又は核酸の混合物から１超の特異的核酸配列を産生することが所望される場合、適切な数の異なるオリゴヌクレオチド・プライマーが利用される。例えば、２個の異なる特異的核酸配列が産生されるならば、４個のプライマーが利用される。２個のプライマーは、特異的核酸配列のうちの一つに特異的であり、そして残りの２個のプライマーは、第二の核酸配列に特異的である。この様式では、２個の異なる特異的配列は、本方法により指数関数的に産生されうる。もちろん、核酸配列が同じである場合、プライマー配列は、同じであろう。
さらに上記のとおり、他の実施態様では、ランダムプライマーが核酸分子テンプレートを増幅するために使用される。
本発明は、段階的に(各段階の後に、新たな試薬が加えられる)、同時に(全ての試薬が最初のステップに加えられる)、又は部分的に段階的でそして部分的に同時に(ある数のステップの後に新たな試薬を加える。例えば、ＡＦＰ及び場合によりキャリアタンパク質を含む新たな酵素溶液を加える)行われうる。適切な時間が過ぎて、所望量の核酸配列が産生された後に、既知の方法のいずれかで酵素を不活性化することにより、又は反応の内容物を分離することにより、反応を止めてもよい。
本発明に従って核酸分子を増幅する際に、好ましくはＡＦＰ、及び好ましくはＡＦＰ１を有し、そして最も好ましくはＡＦＰとキャリアタンパク質を有する適切な緩衝液中において、核酸分子はポリメラーゼを含む組成物と接触される。
一回以上の凍結/融解後の増幅反応を高める方法
本発明は、溶液中の酵素、好ましくはＰＣＲ又はリアルタイム-ＰＣＲ緩衝液中のポリメラーゼの機能的溶液を維持するための方法を提供するが、逆転写ポリメラーゼＩＩＩなどの他の酵素も、本発明の範囲内である。最初に、ポリオール、ＡＦＰ又はキャリアタンパク質を伴うＡＦＰを、所望の増幅酵素と混合する。組合せは、本発明のより具体的な実施態様に一致する標準増幅緩衝液(単数又は複数)中で生じうる。混合された酵素-ポリオール、酵素-ＡＦＰ、又は酵素-ＡＦＰ-キャリアタンパク質を、増幅反応のための反応混合物中で使用する。凍結させた際、残存物質は、凍結融解効果のいくらか、又は全てから保護される。こうして得られた酵素溶液は、必要とされる酵素活性を維持し、そして何回もの凍結融解、好ましくは最大５又は１０回の凍結融解、より好ましくは最大１５回の凍結融解にわたって使用することができる。好ましい実施態様では、増幅反応は、リアルタイムＰＣＲ反応である。別の実施態様では、当該方法は、少なくとも以下の：ポリオール、ＡＦＰ、及びキャリアタンパク質うちの２つが混合され、そして最も好ましくはこれら三つの全てが含まれる酵素を含む。さらなる実施態様では、一般的ではないヌクレオチドは、dUTP BASED COMPOSITIONS FOR REDUCING PRIMER-DIMER FORMATION DURING NUCLEIC ACID AMPLIFICATIONという題名の2005年2月4日に出願される同時係属特許協力条約出願第 号に記載されるように、プライマー-ダイマーの形成を低減することにより、反応効率を増大するために増幅反応ミックス中に含められる。当該特許は本明細書中に援用される。
本発明は、溶液中の酵素、好ましくはＰＣＲ又はリアルタイム-ＰＣＲ緩衝液中のポリメラーゼの機能的溶液を維持するための方法を提供するが、逆転写ポリメラーゼＩＩＩなどの他の酵素も、本発明の範囲内である。最初に、ポリオール、ＡＦＰ又はキャリアタンパク質を伴うＡＦＰを、所望の増幅酵素と混合する。組合せは、本発明のより具体的な実施態様に一致する標準増幅緩衝液(単数又は複数)中で生じうる。混合された酵素-ポリオール、酵素-ＡＦＰ、又は酵素-ＡＦＰ-キャリアタンパク質を、増幅反応のための反応混合物中で使用する。凍結させた際、残存物質は、凍結融解効果のいくらか、又は全てから保護される。こうして得られた酵素溶液は、必要とされる酵素活性を維持し、そして何回もの凍結融解、好ましくは最大５又は１０回の凍結融解、より好ましくは最大１５回の凍結融解にわたって使用することができる。好ましい実施態様では、増幅反応は、リアルタイムＰＣＲ反応である。別の実施態様では、当該方法は、少なくとも以下の：ポリオール、ＡＦＰ、及びキャリアタンパク質うちの２つが混合され、そして最も好ましくはこれら三つの全てが含まれる酵素を含む。さらなる実施態様では、一般的ではないヌクレオチドは、dUTP BASED COMPOSITIONS FOR REDUCING PRIMER-DIMER FORMATION DURING NUCLEIC ACID AMPLIFICATIONという題名の2005年2月4日に出願される同時係属特許協力条約出願第 号に記載されるように、プライマー-ダイマーの形成を低減することにより、反応効率を増大するために増幅反応ミックス中に含められる。当該特許は本明細書中に援用される。
本発明の別の実施態様において、１以上のポリオールを増幅酵素溶液又は緩衝液中に含めることにより、さらに凍結融解条件下で安定性が増加する。好ましい実施態様では、増幅緩衝液は、標準的ＰＣＲ緩衝液である。１の実施態様では、ソルビトール又は他の同様のポリオールは、約５０ｍM〜約５００ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、そして最も好ましくは約１００ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で、ＰＣＲ緩衝液中に含められる。上記のように、他の破壊的薬剤、つまりＤＭＳＯ、ＳＳＢＰなどを、ポリオールに含めることは、全体としてのプラスの影響を高めることが予期される。
高性能リアルタイムＰＣＲ緩衝液の組成物
本発明はさらに、増幅反応、好ましくは標準ＰＣＲ反応及びリアルタイムＰＣＲ反応において使用するための高性能増幅緩衝液をさらに提供する。本発明に記載される緩衝液は、抗凍結タンパク質(好ましくはＡＦＰ１、ＡＦＧＰ、ＡＦＰ１とＡＦＧＰの混合物)、キャリアタンパク質、ｄＮＴＰミックス、ポリオール、核酸ポリメラーゼ、好ましくは好熱性又は超好熱性ポリメラーゼを含むことができ、そして両性イオン製剤を利用する緩衝系を通して得られる改変されたｐＨを有する。代表的な両性イオン製剤は、ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ、ＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ-Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ、ＴＡＰＳ-ＫＯＨ、又はＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓを含む。本発明の好ましい実施態様は、ＴＡＰＳ-ＫＯＨ及び/又はＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ、及び最も好ましくはＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ０を含む緩衝系を利用する。これらの緩衝液についての好ましいｐＨ範囲は、最終的な使用に左右される。例えば、リアルタイムＰＣＲにおいて使用する緩衝液は、約７.９〜約８.７、そして好ましくは約８.２〜約８.７のｐＨを有するように緩衝化される。標準ＰＣＲにおいて使用するための緩衝液は、約７.９〜８.９のｐＨを有するように改変される。好ましい実施態様では、カリウム塩濃度は、１０ｍＭ〜約８０ｍＭである。好ましい実施態様では、緩衝系のｄＮＴＰミックスは、約１０％〜約５０％ｄＵＴＰを含み(ｄＮＴＰミックス中のｄＴＴＰを置換する)、そしてより好ましくは約１０％〜４０％ｄＵＴＰ(ｄＮＴＰミックス中のｄＴＴＰを置換する)を含む。さらに、幾つかの実施態様では、ｎ-プロピル・スルホキシド、及び/又はトレハロースは、高性能緩衝液中に含めることができる。
本発明はさらに、増幅反応、好ましくは標準ＰＣＲ反応及びリアルタイムＰＣＲ反応において使用するための高性能増幅緩衝液をさらに提供する。本発明に記載される緩衝液は、抗凍結タンパク質(好ましくはＡＦＰ１、ＡＦＧＰ、ＡＦＰ１とＡＦＧＰの混合物)、キャリアタンパク質、ｄＮＴＰミックス、ポリオール、核酸ポリメラーゼ、好ましくは好熱性又は超好熱性ポリメラーゼを含むことができ、そして両性イオン製剤を利用する緩衝系を通して得られる改変されたｐＨを有する。代表的な両性イオン製剤は、ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ、ＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ-Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ、ＴＡＰＳ-ＫＯＨ、又はＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓを含む。本発明の好ましい実施態様は、ＴＡＰＳ-ＫＯＨ及び/又はＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ、及び最も好ましくはＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ０を含む緩衝系を利用する。これらの緩衝液についての好ましいｐＨ範囲は、最終的な使用に左右される。例えば、リアルタイムＰＣＲにおいて使用する緩衝液は、約７.９〜約８.７、そして好ましくは約８.２〜約８.７のｐＨを有するように緩衝化される。標準ＰＣＲにおいて使用するための緩衝液は、約７.９〜８.９のｐＨを有するように改変される。好ましい実施態様では、カリウム塩濃度は、１０ｍＭ〜約８０ｍＭである。好ましい実施態様では、緩衝系のｄＮＴＰミックスは、約１０％〜約５０％ｄＵＴＰを含み(ｄＮＴＰミックス中のｄＴＴＰを置換する)、そしてより好ましくは約１０％〜４０％ｄＵＴＰ(ｄＮＴＰミックス中のｄＴＴＰを置換する)を含む。さらに、幾つかの実施態様では、ｎ-プロピル・スルホキシド、及び/又はトレハロースは、高性能緩衝液中に含めることができる。
高性能緩衝液の実施態様における有用な成分濃度は、表２に示されるとおりである。ＴＡＰＳ-ＫＯＨの好ましい濃度は、１５０ｍＭ・ＫＣｌであり、そしてＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓの好ましい濃度は、５００ｍＭ・ＫＣｌであることに留意すべきである。その両方とも約８の最終緩衝液ｐＨを有する。
本発明はさらに、約３０ｍＭ〜約８０ｍＭ、そして好ましくは約４０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度の範囲の一価カリウム塩を有する上記ＡＦＰ両性緩衝液組成物を提供する。さらに、本発明の緩衝液中のマグネシウムイオンは、約２.５ｍＭ〜約１０ｍＭであり、そして好ましくは約５ｍＭ〜約８ｍＭでありうる。
前記実施態様に従ったプライマー-ダイマー形成を制限するために改変ｄＮＴＰ混合物を使用する実施態様は、本発明の高性能ＰＣＲ緩衝液の実施態様に含められうるということが、予測される。2005年2月4日に出願され、そしてdUTP BASED COMPOSITIONS FOR REDUCING PRIMER-DIMER FORMATION DURING NUCLEIC ACID AMPLIFICATIONという題名の同時係属特許協力条約出願第 号を参照のこと。当該特許出願は、本明細書中に援用される。そのようなものとして、両性イオン緩衝液製剤を使用する実施態様は、１以上のＡＦＰ、キャリアタンパク質、ソルビトール、マンニトール、ＤＭＳＯ、ＳＳＢＰ、及びｄＮＴＰミックス（ｄＴＴＰ又はｄＮＴＰの他の成分のある割合がｄＵＴＰなどの一般的でないヌクレオチドに置換される）のうちの１以上を有しうる(例えば、米国特許第6,783,940号、本明細書中に援用される)。典型的に、当該組成物は、最適効果について約７.９〜８.２のｐＨを有する。他のｐＨは、限定された結果で使用されうる。
ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ緩衝液キット
本発明はさらに、本発明の実施態様の組成物を含むキットを提供する。キットは、本発明のＰＣＲ緩衝液、例えば本発明の高性能ＰＣＲ緩衝液の実施態様、或いは、予め決められた独立量のＡＦＰ、ソルビトール、マンニトール、又は他の本発明の組成物を含むことができ、これらは、ＰＣＲ緩衝液に加えられるか、又は標的用途に適した増幅酵素と混合され、本発明と混合される。さらに、キット組成物は、同じ又は異なるチューブ中におけるＡＦＰと、異なるポリメラーゼ酵素との組合せを含みうる。
本発明はさらに、本発明の実施態様の組成物を含むキットを提供する。キットは、本発明のＰＣＲ緩衝液、例えば本発明の高性能ＰＣＲ緩衝液の実施態様、或いは、予め決められた独立量のＡＦＰ、ソルビトール、マンニトール、又は他の本発明の組成物を含むことができ、これらは、ＰＣＲ緩衝液に加えられるか、又は標的用途に適した増幅酵素と混合され、本発明と混合される。さらに、キット組成物は、同じ又は異なるチューブ中におけるＡＦＰと、異なるポリメラーゼ酵素との組合せを含みうる。
本発明を一般的に記載してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明をより容易に理解されるであろう。当該実施例は、例示の方法により提供され、そして制限するものとして意図されない。
実施例１：抗凍結タンパク質(ＡＦＰ)は、-２０℃での長期間の貯蔵の間、リアルタイム-ＰＣＲマスター・ミックスの安定性を高める。
リアルタイムＰＣＲ緩衝液の凍結/融解安定性についてのＡＦＰ１の効果が調査された。まず最初に、ＡＦＰ１は、ＡＦＰ１のどの濃度までが単位複製配列の収量に悪影響を及ぼさないかを決定するために、リアルタイム-ＰＣＲ反応で滴定された。リアルタイムＰＣＲを、Eppendorf RealMasterMix Probe +/- ROX(カタログ番号00320900.525)に記載されるとおりに行い、そして産物をエチジウム・ブロミド染色１％アガロースゲル上で可視化した。図１に示されるように、産物収量は、約１００μg／ｍｌのＡＦＰ１が反応ミックスに含まれるまでは、悪影響を及ぼさなかった。逆に、５０μｇ／ｍｌのＡＦＰ１をリアルタイムＰＣＲに加えることは、反応収量にほとんど影響を及ぼさないか、まったく影響を及ぼさなかった(０ＡＦＰ１を有するレーンと、５０μｇ／ｍｌのＡＦＰ１を有するレーンとの比較)。
リアルタイムＰＣＲ緩衝液の凍結/融解安定性についてのＡＦＰ１の効果が調査された。まず最初に、ＡＦＰ１は、ＡＦＰ１のどの濃度までが単位複製配列の収量に悪影響を及ぼさないかを決定するために、リアルタイム-ＰＣＲ反応で滴定された。リアルタイムＰＣＲを、Eppendorf RealMasterMix Probe +/- ROX(カタログ番号00320900.525)に記載されるとおりに行い、そして産物をエチジウム・ブロミド染色１％アガロースゲル上で可視化した。図１に示されるように、産物収量は、約１００μg／ｍｌのＡＦＰ１が反応ミックスに含まれるまでは、悪影響を及ぼさなかった。逆に、５０μｇ／ｍｌのＡＦＰ１をリアルタイムＰＣＲに加えることは、反応収量にほとんど影響を及ぼさないか、まったく影響を及ぼさなかった(０ＡＦＰ１を有するレーンと、５０μｇ／ｍｌのＡＦＰ１を有するレーンとの比較)。
ＡＦＰ１の存在下及び非存在下においてリアルタイムＰＣＲ緩衝液の凍結／融解の許容度を決定する前に、ＡＦＰ１が凍結前のリアルタイムＰＣＲサンプルを高める能力を試験した。リアルタイムＰＣＲは、上記の通り行われ、そしてサンプルは、２００μｇ／ｍｌのＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌのＡＦＰ１、又は２００μｇ／ｍｌのＢＳＡと混合された５０μｇ／ｍｌのＡＦＰ１とインキュベーションされた。図２Ａ及び図２Ｂは、ＡＦＰ１のみが、実際は本実験において平均ＲＦＵ(Ａ)と閾値サイクル(Ｂ)に若干のマイナスの影響を与えることをグラフで示す。ＢＳＡのみは、リアルタイムＰＣＲにほとんど影響を与えないか、まったく影響を与えない。しかしながら、ＢＳＡとＡＦＰ１の組合せは、シグナル増幅(Ａ)と閾値サイクル(Ｂ)の両方に目立った改善を提供した。そうして、ＡＦＰ１とＢＳＡなどのキャリアタンパク質の組合せは、単位複製配列の最大収量を維持する一方で、リアルタイムＰＣＲの際の相乗効果を提供する。
ＡＦＰ１：ＢＳＡを含有するリアルタイムＰＣＲサンプルを、次に-２０℃での０、１週、２週、及び３週間に渡る凍結融解状態の安定性について試験した(図３Ａ及び図３Ｂを参照のこと)。リアルタイムＰＣＲ条件は、異なる量のキャリアタンパク質及びＡＦＰ１を含めることを除いて、上記のとおりであった。図３Ａ及び３Ｂに示されるように、リアルタイムＰＣＲの間得られた高いシグナルが、ＡＦＰ１及びＢＳＡを反応ミックスに加えた際に維持され(Ａ)、そしてＢＳＡのみ、ＡＦＰ１のみ、又は添加なしにおいて記録される変化に比べて閾値サイクルが維持された(Ｂ)。
ＡＦＰ１の効果がＡＦＰ１に限定されるか、又はＡＦＰ１の効果が他のＡＦＰファミリーのメンバー、特に同様の一次及び二次構造を有するＡＦＰファミリーメンバーに拡張可能であるかを決定するために、同様のリアルタイムＰＣＲ試験を、ＡＦＧＰをキャリアタンパク質の存在下及び非存在下で使用することにより行った。ＡＦＧＰは、ＡＦＰ１に類似する一次及び二次タンパク質構造を含み、特にαへリックス両親媒性二次構造を有するＡＦＰ１のアラニン・リッチ・モチーフと、ＡＦＧＰのアラニン-アラニン-スレオニン二糖の繰り返しとの間に強い類似性が存在する。ＡＦＰ１と同様に、ＢＳＡと組み合わせたＡＦＧＰは、対照サンプルに比較して閾値サイクルを維持又は低減する重要な影響を有した。実験パラメーターを以下の表３に示す。
図７に示されるように、ＡＦＧＰは、新たなサンプル及び１、２、又は３週間凍結融解されたサンプル(-２０℃)についての閾値サイクルにおいて同様の結果を示した。Ｉ型ＡＦＰ、ＡＦＧＰ、及びＢＳＡの組合せは、対照のみならず、Ｉ型ＡＦＰのみ、ＡＦＧＰのみ、Ｉ型ＡＦＰとＢＳＡ、及びＡＦＧＰとＢＳＡに比べて、リアルタイムＰＣＲ安定性試験において最良の総合性能を提供したということに留意すべきである。
当該実施例における結果により、リアルタイムＰＣＲ反応においてキャリアタンパク質の存在下においてＡＦＰ１及びＡＦＧＰを含めることが、-２０℃における複数回の凍結／融解の間緩衝液の安定性を助けるという有用性が示される。当該実施例はまた、少なくとも２個の抗凍結タンパク質ファミリーのメンバー、Ｉ型ＡＦＰ及びＡＦＧＰが、リアルタイムＰＣＲ緩衝液の長期の安定性を支持するということを提供する。当該データーは、類似する抗凍結タンパク質様機能性質を示すタンパク質が、当該タンパク質と同様の様式で有効であり、そしてＩ型ＡＦＰ及びＡＦＧＰの機能モチーフ(上記表１を参照のこと)は、同様の様式で有効であるという強い証拠を提供する。
実施例２：ｐＨの改変及び緩衝液のタイプは、ソルビトール、ＡＦＰ１を含むリアルタイムＰＣＲ緩衝液に有意な影響を与える。
幾つかのリアルタイムＰＣＲ緩衝液の組合せを、ソルビトール及びＡＦＰ１／ＢＳＡの両方の標準量の存在下におけるシグナル増幅及び閾値サイクルについて試験した。異なるイオン濃度及びｐＨを提供するために、緩衝組成物及び塩の両方を変更した。特に、１５ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ・ｐＨ８.０；１５ｍＭ・Ｋ ＧＬＵＴを伴う２５ｍＭ・ＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.０；５０ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＨＥＰＥＳ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.０；１５ｍＭ・Ｋ ＧＬＵＴを伴う２５ｍＭ・Ｂｉｃｉｎｅ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.０；１５ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ、ｐＨ８．０；５０ｍＭ・Ｋ ＧＬＵＴを伴う２５ｍＭ・Ｂｉｃｉｎｅ−Ｔｒｉｓ・ｐＨ８．０；１５ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＴＡＰＳ-ＫＯＨ・ｐＨ８.０；１５ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・Ｂｉｃｉｎｅ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.０；５０ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.０；及び５０ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・Ｂｉｃｉｎｅ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.４を、高度に正確なリアルタイムＰＣＲ(それぞれの緩衝液はまた、５０μｇ/ｍｌ ＡＦＰ１、２００μｇ・ｍｌＢＳＡ、及び１００ｍＭソルビトールを含む)をサポートする能力について比較した。
幾つかのリアルタイムＰＣＲ緩衝液の組合せを、ソルビトール及びＡＦＰ１／ＢＳＡの両方の標準量の存在下におけるシグナル増幅及び閾値サイクルについて試験した。異なるイオン濃度及びｐＨを提供するために、緩衝組成物及び塩の両方を変更した。特に、１５ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ・ｐＨ８.０；１５ｍＭ・Ｋ ＧＬＵＴを伴う２５ｍＭ・ＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.０；５０ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＨＥＰＥＳ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.０；１５ｍＭ・Ｋ ＧＬＵＴを伴う２５ｍＭ・Ｂｉｃｉｎｅ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.０；１５ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＨＥＰＥＳ-ＫＯＨ、ｐＨ８．０；５０ｍＭ・Ｋ ＧＬＵＴを伴う２５ｍＭ・Ｂｉｃｉｎｅ−Ｔｒｉｓ・ｐＨ８．０；１５ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＴＡＰＳ-ＫＯＨ・ｐＨ８.０；１５ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・Ｂｉｃｉｎｅ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.０；５０ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.０；及び５０ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・Ｂｉｃｉｎｅ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.４を、高度に正確なリアルタイムＰＣＲ(それぞれの緩衝液はまた、５０μｇ/ｍｌ ＡＦＰ１、２００μｇ・ｍｌＢＳＡ、及び１００ｍＭソルビトールを含む)をサポートする能力について比較した。
図４Ａ及び４Ｂにおいてグラフに示されるように(及び表４)、ＴＡＰＳ-ＫＯＨ１５０ｍＭ・ＫＣｌ、ｐＨ８.０及びＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ５００ｍＭ・ＫＣｌ、ｐＨ８.０から構成される緩衝液は、リアルタイムＰＣＲにおいて最も低い閾値サイクル及び最も高いシグナル増幅を提供した。
１５ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＴＡＰＳ-ＫＯＨ・ｐＨ８.０、５０ｍＭ・ＫＣＬを伴う２５ｍＭ・ＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.０、及び５０ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・Ｂｉｃｉｎｅ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.４がリアルタイムＰＣＲをサポートする能力について比較することにより、緩衝液組成物について、さらに特徴決定を行った。図５に示される結果は、各緩衝液条件についてＲＦＵ及び閾値についてグラフで示し、５０ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.０が、１５ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＴＡＰＳ-ＫＯＨ・ｐＨ８.０、及び５０ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・Ｂｉｃｉｎｅ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.４の両方の性能をしのぐということを示す。最終的に、図６に示される結果は、５０ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓが、５０ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・Ｂｉｃｉｎｅ-Ｔｒｉｓ・ｐＨ８.４及びインビトロゲン・プラチナｑＰＣＲスーパーミックス-ＵＤＧ(Invitrogen Platinum qPCR Supermix-UDG)(Invitrogen、製品番号：11730-017)の両方の性能をしのぐことを示す。インビトロゲン・プラチナｑＰＣＲスーパーミックス-ＵＤＧ用のリアルタイムＰＣＲ条件が、製品の推奨条件を使用して行われた。
本データーにより、５０ｍＭ・ＫＣｌを伴う２５ｍＭ・ＴＡＰＳ-Ｔｒｉｓ、ｐＨ約８から構成され、そしてソルビトール、ＡＦＰ１、及びＢＳＡを含むリアルタイムＰＣＲ緩衝液が、インビトロゲンの製品に対して、シグナルサイズ及び閾値サイクルを有意に改善するということが示される。これらの同じ緩衝液は、試験者が有する長期間貯蔵に対する要望について、-２０℃で貯蔵された緩衝液を安定化するのに役に立つ。
実施例３：ＡＦＰを含有するＰＣＲマスターミックスは、競合するＰＣＲミックスより性能が優れている。
本発明に従って調製されるＰＣＲマスター・ミックスの実施態様は、リアルタイム-ＰＣＲ内での長期間の安定性をサポートするその能力について、プラチナｑＰＣＲスーパーミックス-ＵＤＧと機能的に比較される。サイクルのパラメーターは：９５℃で１分、そして９５℃で２０秒、５６℃で１０秒、そして６８℃で３０秒を４０サイクルを含んだ。
本発明に従って調製されるＰＣＲマスター・ミックスの実施態様は、リアルタイム-ＰＣＲ内での長期間の安定性をサポートするその能力について、プラチナｑＰＣＲスーパーミックス-ＵＤＧと機能的に比較される。サイクルのパラメーターは：９５℃で１分、そして９５℃で２０秒、５６℃で１０秒、そして６８℃で３０秒を４０サイクルを含んだ。
図８Ａ及び８Ｂに示されるように、本発明のＡＦＰを含有するリアルタイムＰＣＲ緩衝液は、インビトロゲン・プラチナｑＰＣＲスーパーミックスＵＤＧと比較して、６週間の実験コースにわたり、４℃、-２０℃、及び-８０℃で強いシグナル増幅(ＲＦＵ)(８Ａ)及び早いＣｔ(８Ｂ)をサポートした。このデーターにより、本発明の緩衝液が、当該技術水準として売られている緩衝液に比べて、本発明の緩衝液は、長期間の安定性について比較されるほどの又はよりよい結果を提供することが示される。そのようなものとして、本発明の実施態様は、リアルタイムＰＣＲにおいて有用である緩衝液の長期間の安定性を提供する有用性を有する。インビトロゲン製品を購入し、そして製品推奨に従って用いた。
実施例４：ソルビトールは、-２０℃での長期間の貯蔵の間、リアルタイムＰＣＲマスター・ミックスの安定性を高める。
リアルタイム-ＰＣＲマスターミックス緩衝液の貯蔵安定性について、ソルビトールの効果を決定するために、ソルビトールをリアルタイムＰＣＲマスターミックス中に含めた。マスター・ミックスサンプルを、１００ｍＭソルビトールあり及びなしで調製し、４、-２０、又は-８０℃で、１、２、又は３週間貯蔵し、そしてリアルタイムＰＣＲにおいて全体の性能について試験した。
リアルタイム-ＰＣＲマスターミックス緩衝液の貯蔵安定性について、ソルビトールの効果を決定するために、ソルビトールをリアルタイムＰＣＲマスターミックス中に含めた。マスター・ミックスサンプルを、１００ｍＭソルビトールあり及びなしで調製し、４、-２０、又は-８０℃で、１、２、又は３週間貯蔵し、そしてリアルタイムＰＣＲにおいて全体の性能について試験した。
図９Ａ及び図９Ｂにおいて示されるように、１００ｍＭのソルビトールによって、-２０℃で１週間、２週間、又は３週間凍結されたマスターミックスで行われる反応では、少ないＣｔが与えられる。対応するＲＦＵ値はまた、この温度においてソルビトール含有マスターミックス中で維持された。４℃又は-８０℃のいずれかで貯蔵されるサンプルは、ソルビトール含有又は非含有サンプルの間で少しの変化を示すか、又はまったく変化を示さなかった。ソルビトールは、当該温度範囲においてゆっくり凍結する性質のため、-２０℃で貯蔵されるマスターミックスを安定するのに最も有効であることが信じられる。比較として、マスターミックスを４℃又は-８０℃のいずれかで貯蔵することにより、同じ保護が提供されることは予期されなかった。なぜなら、４℃は、サンプルを凍結させないし、そして-８０℃はかなりの急速凍結であるので、損傷を与える氷結晶の形成に関与しないようであるが、以下に示されるようにいくらかの利得が得られる。
図１０Ａ及び１０Ｂは、１週間及び３週間の貯蔵後の収量についての比較を提供し、ＲＴ-ＰＣＲにおいて-２０℃でマスターミックスを安定化する際のソルビトールの有用性がここでも示される。-２０℃で貯蔵されたマスターミックス中にソルビトールが含まれない場合、収量が有意に減少することに留意すべきである(１０Ａのレーン８、及び１０Ｂのレーン５)。しかしながら、対応するサンプルの劇的な増加は、１００ｍＭのソルビトールがマスターミックス緩衝液中に含められるときに生じる。
実施例５：ＡＦＰ１は、多くの凍結/融解のコースにわたる、有意な安定性保護を提供する。
ＤＮＡポリに基づくｇＤＮＡ増幅（DNApoly based gDNA amplification)についてのＡＦＰ１の効果は、１５回の凍結融解サイクルにわたり試験された。反応ミックスは、ＲＯＸ(５-カルボキシ-ローダミン；トリエチルアンモニウム塩)を伴うか又は伴わない２.５×リアルマスターミックス(RealMasterMix)を含んだ。リアルマスターミックスは、１０×リアルマスタープローブ緩衝液(０.５ｍｇ/ｍｌ・ＡＦＰ１、２５０ｍｍ・Ｔａｐｓ、１０３ｍｍ・Ｔｒｉｓ、５００ｍｍ・ＫＣｌ、５０ｍｍ・ＭｇＡｃ及び２ｍｇ/ｍｌＢＳＡ)、１０ｍｍ・ｄＮＴＰミックス(エッペンドルフ(Eppendorf)製品番号W40460)、及び１００ＵμｌのＨｏｔＭａｓｔｅｒ Ｔａｑ ＤＷＡポリメラーゼから構成される。それゆえ、それぞれの反応は、およそ２００μｇ/ｍｌのＢＳＡ及び５０μｇ/ｍｌのＡＦＰ１を含む。反応は、ＡＢ１ ７０００サーマルサイクラー又はＢｉｏ-ＲａｄのｉＣｙｃｌｅｒを使用して、表６、７、及び８に示されるように設定した。各反応ミックスは温和にボルテックスしたことに留意すべきである。
ＤＮＡポリに基づくｇＤＮＡ増幅（DNApoly based gDNA amplification)についてのＡＦＰ１の効果は、１５回の凍結融解サイクルにわたり試験された。反応ミックスは、ＲＯＸ(５-カルボキシ-ローダミン；トリエチルアンモニウム塩)を伴うか又は伴わない２.５×リアルマスターミックス(RealMasterMix)を含んだ。リアルマスターミックスは、１０×リアルマスタープローブ緩衝液(０.５ｍｇ/ｍｌ・ＡＦＰ１、２５０ｍｍ・Ｔａｐｓ、１０３ｍｍ・Ｔｒｉｓ、５００ｍｍ・ＫＣｌ、５０ｍｍ・ＭｇＡｃ及び２ｍｇ/ｍｌＢＳＡ)、１０ｍｍ・ｄＮＴＰミックス(エッペンドルフ(Eppendorf)製品番号W40460)、及び１００ＵμｌのＨｏｔＭａｓｔｅｒ Ｔａｑ ＤＷＡポリメラーゼから構成される。それゆえ、それぞれの反応は、およそ２００μｇ/ｍｌのＢＳＡ及び５０μｇ/ｍｌのＡＦＰ１を含む。反応は、ＡＢ１ ７０００サーマルサイクラー又はＢｉｏ-ＲａｄのｉＣｙｃｌｅｒを使用して、表６、７、及び８に示されるように設定した。各反応ミックスは温和にボルテックスしたことに留意すべきである。
図１１に示されるように、ＢＳＡと混合されたＡＦＰ１は、１５回の凍結/融解のコースに渡り、ＤＮＡポリメラーゼ活性の保護を提供した。各凍結/融解サイクルは、-２０℃へゆっくり凍結し、そして室温へ融解することを含んだ。
試験された各組成は、２種の他のＰＣＲ法のもとで、１５回の凍結/融解サイクルの各回の後で、性能が一致することが認められた。このデーターにより、ＢＳＡと混合されたＡＦＰ１が、何回もの凍結/融解のコースにわたり、ＤＮＡポリメラーゼ活性を維持するように機能することが示される。この保護は、他の酵素系に拡張可能であり、そして凍結温度で長期間、酵素保護に使用するように拡張可能であることが予測される。
本発明は、具体的な実施例を参照することで記載された。これらの実施例は、本発明をどのようにも制限することを意味しない。本開示の目的で、種々の変更及び改変が本発明になされ、それらの変更及び改変が本発明の範囲内であることが理解される。多くの他の変更がなされてもよく、それらは当業者に容易に示唆されるものであり、そして本明細書中に開示される本発明の本質に包含され、そして添付の特許請求の範囲において定義される。
本明細書は、特許、特許出願、及び公開を多く引用を含むが、それらは全ての目的のため、本明細書中に援用される。
Claims (20)
- 抗凍結タンパク質及び酵素を含む酵素溶液であって、当該酵素が、少なくとも１回の凍結／融解の後に酵素活性を保持する、前記溶液。
- 前記酵素が、１０回を超える凍結／融解の後に活性を保持する、請求項１に記載の酵素溶液。
- さらに緩衝液を含む、請求項１又は２に記載の酵素溶液。
- 前記緩衝液が、両性イオン性である、請求項３に記載の酵素溶液。
- さらにキャリアタンパク質を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素溶液。
- 前記キャリアタンパク質が、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)である、請求項５に記載の酵素溶液。
- 前記抗凍結タンパク質が、アラニン-リッチ・モチーフを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素溶液。
- 前記抗凍結タンパク質が、Ｉ型ＡＦＰタンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素溶液。
- 組成物のｐＨが、約７.９〜８.９である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素溶液。
- さらにポリオールを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の酵素溶液。
- 前記ポリオールが、ソルビトール、トレハロース、又はそれらの混合物である、請求項１０に記載の酵素溶液。
- 前記抗凍結タンパク質が、約１０μｇ〜約２００μｇ/ｍｌの濃度を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の酵素溶液。
- 前記酵素がＤＮＡポリメラーゼであり、そして当該酵素溶液を増幅反応混合液に添加することは、核酸増幅反応の感度及び収量を改善する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵素溶液。
- ｄＮＴＰ及び請求項１３に記載される酵素溶液を含む、核酸増幅反応において使用するための反応混合液。
- ２回以上の凍結/融解にわたり、酵素の安定性を高める方法であって、抗凍結タンパク質を、当該凍結融解の前に当該酵素を含む酵素溶液に加えることを含む、前記方法。
- 標的核酸配列を、請求項１４に記載される反応混合液中の少なくとも１のプライマーと混合し、そして当該標的核酸配列を増幅することを含む、核酸増幅反応の感度及び収量を増加する方法であって、前記抗凍結タンパク質を含めることが、単位複製配列の収量及び感度を増加する、前記方法。
- サンプルを、請求項１４に記載の反応混合液中の少なくとも１のプライマーと混合し、そして当該標的核酸配列を増幅することを含む、サンプル中の標的核酸配列を検出する改良方法であって、前記抗凍結タンパク質を含めることが、シグナル強度を増加させ、当該シグナル対ノイズ比を改善する、前記方法。
- サンプルを、請求項１４に記載の反応混合液中の少なくとも１のプライマーと混合し、そして前記標的核酸配列を増幅することを含む、サンプル中の標的核酸配列を定量する改良方法であって、前記抗凍結タンパク質を含めることが、シグナル強度を改善し、そしてシグナル対ノイズ比を改善する、前記方法。
- 抗凍結タンパク質及び酵素を含む溶液を含むキット。
- 前記溶液がさらにキャリアタンパク質を含む、請求項１９に記載のキット。
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