CN104389026A - 单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用。该构建方法包括以下步骤：对单细胞中的RNA进行反转录得到cDNA；用扩增引物对cDNA进行预扩增，得到扩增cDNA；对扩增cDNA进行片段化文库构建，得到单细胞的转录组测序文库；其中，扩增引物中的dTTP替换为dUTP。本发明的上述构建方法，通过将预扩增引物中的dTTP替换为dUTP，使得在接头连接之后的酶消化步骤能将带接头片段中含有预扩增引物的片段打断，并在后续高温预变性及变性步骤中去除，进而减少了带预扩增引物的片段的扩增，使得产出的测序数据中带有预扩增引物污染的数据比例也大大下降，从而大大提高了产出数据的有效数据量。

Description

单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及高通量测序领域，具体而言，涉及一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用。

背景技术

对于单细胞转录组测序来说，转录组测序文库的构建是主要的难点，因为单细胞中mRNA含量低至10pg，无法通过常规的RNA转录组文库的构建方法来构建。因此，目前市场上能够利用如此少量的mRNA进行单细胞转录组测序文库构建的产品一般在获得预扩增cDNA后采用Illumina公司的DNA文库构建试剂盒(illumina Nextera XT DNA sample preparation kit)。

Illumina公司的该试剂盒是采用化学方法对样品进行片段化，即用转座酶对cDNA进行打断的方式建库。单细胞经裂解后，mRNA经反转录得到cDNA，然后对cDNA进行预扩增后，采用转座酶打断的方式对cDNA进行片段化处理。于此同时，转座酶在打断的同时会在破碎片段的两端加上接头，然后再经PCR对片段进行富集，该步骤中PCR的引物会在破碎片段的两端带上标签序列(index)，加标签序列的目的是给不同的样品带上不同的标签，以便从得到的混合测序数据中分离出各样品所对应的测序数据。Illumina公司的上述DNA文库构建试剂盒具有能从低至1ng的样品起始量进行文库构建的巨大优势，但采用上述试剂盒所构建的测序文库存在插入峰很宽的问题，大约在300bp～1000bp之间。文库峰宽的宽窄会对上机定量的准确性产生影响，进而影响上机量和产出。文库峰宽越宽，定量的偏差就越大。因而存在文库上机定量的不准，数据量产出不稳定的问题。因为如果是数据产出过量，浪费成本；如果产量不足，还需要后期额外加测，耽误项目周期。

为了克服上述缺陷，现有技术中采用物理破碎的方式对反转得到的cDNA进行打断，使破碎片段较小且相对均匀，进而使得所构建的单细胞转录组测序文库的峰宽较为集中；且片段化后的样品不经纯化步骤减少了样品损失不仅能够实现微量样品的单细胞转录组测序文库的构建，而且还能增加数据量产出的稳定性，从而提高了大规模单细胞转录组文库高通量测序的可靠性。

但在打断之前都需要经过预扩增的步骤，以使cDNA的量能够满足建库所需，然而这种物理破碎的方式对cDNA进行打断，会使得所构建的文库中含有预扩增的引物污染，约占数据总量的20％，造成数据的浪费。

因此，仍需要对现有的单细胞转录组测序文库的构建方法进行改进，以减少所构建的文库中的预扩增引物污染。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用，用以减少所构建的文库中的预扩增引物污染片段。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种单细胞转录组测序文库的构建方法，该构建方法包括以下步骤：直接对单细胞的RNA进行反转录得到cDNA；用扩增引物对cDNA进行预扩增，得到扩增cDNA；对扩增cDNA进行片段化文库构建，得到单细胞的转录组测序文库；其中，扩增引物中的dTTP替换为dUTP。

进一步地，对cDNA进行片段化文库构建的步骤包括：步骤S1，对cDNA采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品；步骤S2，对片段化不经过纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品；步骤S3，对修复后样品进行接头连接，得到带接头样品；步骤S4，对带接头样品进行扩增，得到单细胞的转录组测序文库。

进一步地，在得到带接头样品之后，以及对带接头样品进行扩增之前，还包括对带接头样品进行消化的步骤，消化步骤中用ESUR酶进行消化。

进一步地，物理破碎的方式为采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA进行片段化；优选自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA进行片段化时的参数设置为：循环数8％～12％，峰值入射功率170～180瓦；循环数/爆发200～220个；时间300～360s；温度4～8℃。

进一步地，自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA进行片段化后得到的片段化样品的长度为150～200bp。

进一步地，在得到片段化样品之后，以及对片段化样品进行末端修复的步骤之前，还包括对片段化样品进行浓缩的步骤；优选采用Thermo Scientific公司的Thermo Scientific DNASpeed111V离心浓缩系统。

进一步地，在步骤S2中采用NEB公司的末端修复酶试剂组合对片段化样品不经纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，末端修复酶试剂组合包括10×的NEBNext末端修复反应缓冲液和NEBNext末端制备酶混合物；在步骤S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端连接酶混合物和NEBNext接头对修复后样品进行接头连接；在步骤S4中采用KAPA BIO公司的2×的KaPA HiFi反应混合物对接头样品进行扩增。

进一步地，当片段化样品的量低至3ng时，在步骤S3中，对接头进行稀释后再进行接头连接；优选将接头稀释至1.0～2.0μM；更优选稀释至1.5μM。

进一步地，在步骤S4中，扩增的循环次数为10～15次，优选13次。

根据本发明的另一方面，提供了上述任一种构建方法在研究细胞异质性方面的应用。

应用本发明的技术方案，在常规的单细胞转录组文库构建的基础上，通过将预扩增引物中的dTTP替换为dUTP，使得本发明的在接头连接之后进行的酶消化步骤，不仅能够将U型接头打断使双链分别带上接头序列，而且能将带接头片段中含有预扩增引物的片段打断，并在后续文库扩增步骤的高温预变性及变性步骤中去除，进而减少了带预扩增引物的片段的扩增，使得产出的测序数据中带有预扩增引物污染的数据比例也大大下降，从而大大提高了产出数据的有效数据量。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了本发明的单细胞转录组测序文库构建流程的示意图；

图2示出了本发明的实施例中反转录得到的片段的大小；

图3示出了按照本发明的方法所构建的文库的大小；

图4示出了本发明所构建的文库中GC分离度和GC含量图；以及

图5示出了对本发明的文库中的插入片段的评估结果。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

在本发明中的术语“单细胞”是指单一类型细胞的单个细胞；“微量样品”是指起始量在3～20ng的cDNA样品。

正如背景技术部分提到的，为了减少所构建的单细胞转录组测序文库的产出数据中的引物污染数据，在本发明一种典型的实施方式中，如图1所示，提供了一种单细胞转录组测序文库的构建方法，该构建方法包括以下步骤：对单细胞中的RNA进行反转录得到cDNA；用扩增引物对cDNA进行预扩增，得到扩增cDNA；对扩增cDNA进行片段化文库构建，得到单细胞的转录组测序文库；其中，扩增引物中的dTTP替换为dUTP。

本发明的上述构建方法，在常规的单细胞转录组文库构建的基础上，通过将预扩增引物中的dTTP替换为dUTP，使得本发明的在接头连接之后进行的酶消化步骤，不仅能够将U型接头打断使双链分别带上接头序列，而且能将带接头片段中含有预扩增引物的片段打断，并在后续文库扩增步骤的高温预变性及变性步骤中去除，进而减少了带预扩增引物的片段的扩增，使得产出的测序数据中带有预扩增引物污染的数据比例也大大下降，从而大大提高了产出数据的有效数据量。

在本发明的上述文库构建方法中，在单细胞样品裂解后，直接将细胞中的mRNA反转录成双链cDNA。反转录的步骤通常包括：由细胞样品进行反转录，得到第一链cDNA；对第一链cDNA进行扩增，得到双链的cDNA。

对上述得到的第一链cDNA和双链cDNA最好都经过纯化的步骤，纯化的步骤能够使得样品的纯度更高，提高后续构建所得到文库的质量。该步骤中可以采用市售的纯化试剂盒进行相应的纯化步骤，在本发明中，优选使用Clontech公司的APRI Ampure XP磁珠进行纯化，该纯化方法纯化效率高，纯化速度快，且操作更方便。

在本发明的一种优选的实施例中，对cDNA进行片段化文库构建的步骤包括：步骤S1，cDNA采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品；步骤S2，对片段化样品不经过纯化直接进行末端修复和添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品；步骤S3，对修复后样品进行接头连接，得到带接头样品；步骤S4，对带接头样品进行扩增，得到单细胞转录组的测序文库。

在上述实施例中，采用物理破碎的方式进行片段化，相比化学破碎的方式(转座酶随机打断的方式)，物理破碎的方式对单细胞样品进行片段化具有使破碎得到的片段大小的较小，且能使破碎片段大小较为集中，片段大小相对均匀，使得后续对文库定量检测的准确度大大提高，进而使得上机扩增成簇步骤中各插入片段的扩增效率相对均等，减少了偏差扩增现象，使数据量产出更稳定，进而避免因为数据量产出不足需要额外加测而耽误项目周期或者数据量产出过多浪费成本。且对上述片段化样品不经过纯化直接进行后续步骤，能减少样品损失，使本发明的上述构建方法能够适用于单细胞转录组的文库构建。

在本发明又一种优选的实施例中，在上述接头连接得到带接头样品步骤后，进行USER酶消化的步骤。在现有的单细胞转录组测序文库构建方法中，该步骤也存在，但现有技术中，预扩增阶段所使用的引物中是带有dTTP的碱基序列，因此USER酶消化的目的仅是为了将所加的U型接头打断，以使双链都带上接头序列。而在本发明中，在步骤中进行USER酶消化的目的不仅为了将U型接头打开，另一个更主要的作用是：是为了将目的片段文库带有dUTP的扩增引物片段进行消化，从而降低预扩增引物的污染，提到扩增后文库中目的片段的相对含量，进而提到产出数据的有效量。

在文库构建方法中，对样品进行物理破碎的方式通常采用超声破碎，适用于本发明的超声破碎仪包括DNA切割超声破碎仪Q800R或自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220。物理破碎方式具有重复性好，得到的片段较小，使所构建的文库的峰宽较窄的优点。在本发明一种优选的实施例中，采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对样品进行片段化。更优选自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对样品进行片段化时的参数设置为：循环数8～12％，峰值入射功率170～180瓦；循环数/爆发200～220个；时间300～360s；温度4～8℃。

在上述自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对cDNA样品进行片段化的步骤中，得到的片段化样品的长度为150～200bp。发明人通过大量的实验发现，当设置Covaris S220的参数在上述范围内时，通常可得到长度为150～200bp的片段化样品，这使得所构建的转录组测序文库的峰宽集中在270～320bp，提高文库定量的准确性，从而提高了产出数据量的稳定性。

在上述采用物理破碎方式得到片段化样品后，通常还需要经过磁珠纯化或过吸附柱纯化的方法对片段化的样品进行纯化浓缩。但在本发明中，当片段化样品的体积大于末端修复酶反应体系所要求的最小体积时，在进行末端修复的步骤之前，还包括对片段化样品进行浓缩的步骤。此处的浓缩不是用磁珠纯化或者过柱子的浓缩方法，而是采用浓缩仪浓缩的方法，能够更大程度地既避免片段化的样品损失。在本发明一种优选的实施例中，采用Thermo Scientific公司的Thermo Scientific DNA Speed111V离心浓缩系统。通过浓缩步骤使片段化样品的浓度得到相对提高，并且符合文库构建试剂盒的体系要求。当片段化样品的体积小于反应体系所需的最小体积时，可通过加高纯水稀释至所需的最小体积。

在上述所说的文库构建中，在上述步骤S2中采用NEB公司的末端修复酶试剂组合，其末端修复酶试剂组合包括10×的NEBNext末端修复反应缓冲液(10×NEBNext End RepairReaction Buffer)和NEBNext末端制备酶混合物(NEBNext End Prep Enzyme Mix)；经发明人的大量实验验证，上述末端修复酶试剂组合在一步反应中完成修复与加A的步骤，方便快捷，减少出错几率。在上述步骤S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端连接酶混合物(Blunt/TA Ligase Master Mix)和NEBNext接头进行接头连接的步骤，该连接酶混合物对接头的连接效率较高，利于增加最终的文库产量。在步骤S4中采用2×KAPA.BIO公司的KaPAHiFi反应混合物进行扩增，采用这种聚合酶扩增稳定性好，保真性更高，且对于高GC含量模板的扩增一样有效。上述各步骤中所用到的试剂并不仅限于上述几种，只要能够达与上述几种效果相当或更好的市售试剂或自配制试剂同样适用于本发明。

在上述转录组测序文库构建的过程中，根据所得到片段化样品的总量适当调整接头的用量。根据发明人大量实验所得的经验，当片段化样品的量在低至3ng时，在进行接头连接的步骤中，先对接头进行稀释至1.0～2.0μM；优选稀释至1.5μM后再进行接头连接。将上述接头浓度稀释至上述浓度范围时，既能与建库起始量低相匹配，又能减少接头使用量，还可以避免接头污染。这样，本发明的这种方法也能够由相对较低的起始量实现单细胞转录组测序文库的构建。

由于Illumina公司的DNA文库构建试剂盒采用双标签序列(index)，当有多个样品需要上机时，无法与其他样品混合在一个通道(lane)中进行测序，而需要单独占用一个通道来进行测序，这样造成测序仪器空间的浪费和测序成本的增高。而本发明通过使用单端带有标签序列的引物进行扩增，使得所构建的文库能够与其他具有单端标签序列的样品的文库进行混合测序，从而减少资源浪费，降低成本。

在本发明的上述扩增步骤中，一般扩增循环次数为10次，在此基础上，在不同的样品测序文库的实际构建过程中，可根据片段化样品的起始量的多少对循环次数进行调整。在本发明中优选上述扩增循环次数为10～15次，更优选13次。将扩增次数控制在上述范围内，既能实现对片段化样品的有效扩增，使其满足上机测序浓度的要求；又不至于造成片段化样品的过度扩增，造成非特异性扩增从而减少测序数据的实际有效量。

由于本发明的上述构建方法能够有效提高单细胞转录组测序文库的测序质量，提高所测数据的有效量，这为单细胞生物学的研究提供了一种新的研究手段。因此，本发明的上述单细胞转录组测序文库的构建方法能够应用于细胞异质性的研究。

下面将结合实施例来进一步说明本发明的有益效果。

下列实施例是参照附图1，以猪卵细胞样品进行详细说明本发明的构建方法。下列实施例中所涉及的方法如无特别说明均为常规方法，前期反转和预扩增所用的试剂来自Clontech公司；2×KaPA HiFi反应混合物(Master Mix)购自美国KAPA.BIO公司；其他试剂如无特别说明均为NEB公司的产品；所有水为超纯水。

实验一、第一链cDNA的合成(在洁净工作室)

1)配制细胞裂解液：裂解液(Triton-X-100溶液)    19μL

                  RNA酶抑制剂                 1μL

                  总体积                      20μL。

2)单细胞样品制备：取1μL含单个猪卵细胞的培养基转移至含有2.5μL细胞裂解液的无RNA酶的200μL PCR管中，然后立即置于干冰上。

3)将单细胞样品放置在经–20℃预冷的PCR管架上，向其中加入3’SMART CDS引物IIA(12μM)1μl。混匀各组份，然后瞬时离心，将反应管放在PCR仪中，72℃，孵育3min。然后将反应管放回预冷的PCR架中。

与此同时，在室温中混匀以下试剂：

4)待孵育完成后，立即分别向PCR管中加入5.5μl反应混合液。用移液器轻柔地吸打混匀，然后瞬时离心将混合物收集到管底部。42℃，孵育90min。70℃，加热10min，终止反应。

实验二、使用SPRI Ampure XP beads纯化第一链cDNA(在洁净工作室)

1)用200μl的移液管分别吸取25μl的SPRI Ampure XP beads加入到样品中，总体积35μL。用移液器吹打10次(尽量轻慢)，然后在室温下静置8min。

2)瞬时离心，然后将样品管放在磁力架上，反应5min或者更长时间，直到上清夜澄清后，弃上清。然后将样品管取出，置于离心机中瞬时离心，将粘在管壁上的液体收集到管底部。

3)样品管放回磁力架上再放置2min或者更长时间使磁珠完全和液体分离开。然后，用10μL的移液器将管中剩余的液体吸掉，确保管中不再有剩余的上清液。

实验三、长距离PCR(LD PCR)扩增双链cDNA(操作中的步骤1和2在PCR洁净工作室进行)

1)准备PCR扩增反应的预混液。将以下试剂按照下列顺序分别加入2个反应管中，旋涡混匀后在微型离心机中瞬时离心。

其中，第一个管中加入IS PCR引物中为含有T碱基的序列，具体序列如SEQ ID NO.1所示，第二管中加入含有U碱基的IS PCR引物序列，具体序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，SEQ ID NO.1为：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT-3'；

SEQ ID NO.2：5’-AAGCAGUGGUAUCAACGCAGAGUACU-3'

2)向样品中加入上述50μl PCR预混液，混匀后瞬时离心。需要说明的是，从该步骤起，下面所有的操作最好在一般操作实验室中进行，以防DNA扩增的步骤对洁净工作室造成污染。

3)将反应管放在提前预热的PCR仪中，按照下面参数设置PCR扩增程序：

第一步：95℃预变性2min；

第二步：95℃变性15sec；

第三步：65℃退火30sec；

第四步：68℃延伸6min；

第五步：循环第二步至第四步，共循环18次；

第六步：72℃延伸10min后，结束。

实验四、扩增后的cDNA的纯化与鉴定

1)将扩增后的双链cDNA产物用1.8倍XP磁珠纯化1次，纯化步骤严格按照使用说明书进行。

2)从步骤1)纯化后的cDNA中取出1μl，做Qubit2.0检测，总量为3ng，表明扩增成功。

3)取1μL做安捷伦2100高灵敏芯片检测样品浓度和纯度，检测结果如下表1和图2所示，从中可以看出，反转录的全长cDNA片段纯度较高，且其大小主要集中在1.5kb-2kb之间，大于2kb的cDNA的浓度就下降了很多，且量也很少。

表1：

样品峰	大小/bp	质量浓度/pg/μl	摩尔浓度/pmol/μl
				峰2	1,850	14.90	12.1

实验五、Covaris剪切

1)在1.5ml EP管中，补水将cDNA稀释到130μL。用Covaris S220设备进行物理破碎，根据大量实验总结的经验，将Covaris S220的参数设置为循环数8％～12％，峰值入射功率170～180瓦；循环数/爆发200～220；处理时间300～360s；温度4～8℃范围内时，均能破碎得到的片段大小主要在150～200bp之间，该实验中按照下表2中的数据进行设置。

表2：

2)用移液器小心地将破碎后的DNA样本吸到一个新的1.5ml EP管中，为了减少损失，在该步骤后不进行纯化和片段检测的步骤，而是直接进行末端修复等后续步骤。

实验六、浓缩、末端修复和加腺苷酸A

1)采用Thermo Scientific公司的DNA Speed111V离心浓缩系统，在45゜C的温度条件下，2000rpm的转速离心27～30min，若浓缩后体积小于55.5μL，再用水补至55.5μL。

2)将上步浓缩后的片段化产物进行末端修复和加腺苷酸A的步骤，按如下体系配置末端修复和加腺苷酸A的反应体系：

反应条件：20℃孵育30min后65℃失活30min。

3)反应结束后立刻放于冰上，立即进入下一步接头连接反应。

实验七、接头的连接

1)向实验六中的产物中加入接头，反应体系如下：

反应条件：20℃孵育15min。

2)在步骤1)的产物中加入3μL USER酶，充分混匀后，置于PCR仪中37℃反应15min。

实验八、片段大小选择

1)涡旋混匀AMPure XP磁珠。

2)准备干净的1.5ml离心管，对照样品写好相应编号，向管中加入13.5μL无RNA酶的水以使与上步反应产物混合后的终体积为100μL，再加入57μL(0.57×)重悬的AMPure XPbeads。

3)将实验七中连上接头的DNA产物(86.5μL)加入上步准备好的离心管中，与重悬的AMPure XP beads混匀，室温孵育5min。

4)瞬时离心，然后置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用移液器小心吸取含有大片段的上清液到另一个干净的1.5ml离心管中，为了去除上清中可能含有的磁珠，防止文库中含有大片段，将上述盛有上清液的离心管在12,000rpm的转速下离心3min后置于磁力架上。准备干净的离心管并将对应的编号写好。将上清液转入对应的离心管中。

5)加入25μL(0.25×)重悬好的AMPure XP beads，并用移液器混匀。室温孵育5min。

6)置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用移液器小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠，此步上清含偏小的片段如接头等，而磁珠上吸附DNA的为目标片段DNA)。

7)加入200μL 80％乙醇漂洗2次，最后使用10μL移液器吸取离心管底部残留的液体。

9)室温干燥8min让乙醇尽量挥发干净。

10)加入51μL无RNA酶的水，涡旋混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。

11)准备干净的离心管，写好对应编号，加入86.5ul涡旋混匀好的AMPure XP beads。吸取上步50μL上清至对应AMPure XP beads管内，移液器混匀，静置5min。置于磁力架上，静置5min。于磁力架上小心吸取上清液后丢弃(注意尽量不要吸到磁珠)。

12)加入200μL 80％乙醇漂洗2次，最后使用10μL移液器吸取离心管底部残留的液体。

13)室温干燥8min让乙醇尽量挥发干净。

14)加入24μL无RNA酶的水，涡旋混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用10μL移液器小心吸取23μL上清至干净的PCR管内。

实验九、PCR扩增富集

1)PCR扩增反应体系如下：

带有标签序列的PCR引物1的序列为SEQ ID NO.3：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，其中标签序列为上述引物中的第25位碱基至第30位碱基，即CGTGAT。

不带标签序列的PCR引物2的序列为SEQ ID NO.4：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。

反应条件为：

第一步：98℃预变性2min；

第二步：98℃变性10sec；

第三步：65℃退火30sec；

第四步：72℃延伸30sec；

第五步：循环第二步至第四步，共循环13次；

第六步：72℃延伸5min后，结束。

2)纯化PCR产物

向上一步扩增后的PCR产物中加入等体积AMPure XP Beads纯化两次，纯化过程严格按照使用说明书进行。

3)从纯化后的产物中取出1μL进行Qubit定量，测定文库的总量为280ng。

实验十、文库库检

1)将实验九中所得的纯化产物稀释到1ng/ul，取出1μL用于Agilent2100(美国Agilent公司)检测，检测结果如图3所示，构建的文库总长度在270～320bp之间。另外，再取1μL用于实时荧光定量PCR(qPCR)(BioRed公司)检测，根据检测结果来决定上机浓度。

2)根据步骤1)所得的浓度，将文库稀释到上机要求后(2nM)，在Illumina公司的Hiseq2000测序平台进行测序。

实验十一、上机结果质控

1)对所建文库进行GC分离度和GC含量进行评估，如图4所示，结果显示无GC或者AT分离，含量无偏离。

2)对所建文库的插入片段大小进行评估，测的是双端100bp(PE100)，要减去100*2，RNA插入大小指两个读长之间的碱基个数。结果如图5所示，预期的插入片段大小在200左右有明显的主峰，且无杂峰。

对上述两管样品同时构建得到的文库，进行上机测序后，对得到的数据进行统计具体见下表3。

表3：

文库	第一管	第二管
			总下机数据(clean reads)	9837810	7486444
目的片段数据(reads)	7637646	6770739
			引物污染比例	22％	9.56％

从上述表3所示的两种文库构建方法所得到文库的下机数据的比较结果可以看出，在第一管中，总下机数据为9837810条合格的序列(clean reads)，其中，目的片段数据为7637646条，预扩增引物污染数据为22％。在第二管中，总下机数据为7486444条合格的序列(cleanreads)，其中目的片段数据为6770739条，预扩增引物污染数据为9.56％。可见，采用本发明的方法能够使预扩增引物污染由22％下降至9.56％，大大提高了产出数据的有效量。

从以上的描述中，可以看出上述实施例通过利用本发明的构建方法，不仅能够将有效插入片段控制在150～200bp，从而控制下游数据量产出的稳定性；而且更重要的是能够大大降低预扩增引物污染，显著提高了产出数据的有效量。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种单细胞转录组测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

对单细胞中的RNA进行反转录得到cDNA；

用扩增引物对所述cDNA进行预扩增，得到扩增cDNA；

对扩增cDNA进行片段化文库构建，得到单细胞的转录组测序文库；其中，将扩增引物中的dTTP替换为dUTP。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，对所述cDNA进行片段化文库构建的步骤包括：

步骤S1，对所述cDNA采用物理破碎的方式进行片段化，得到片段化样品；

步骤S2，对所述片段化不经过纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，得到修复后样品；

步骤S3，对所述修复后样品进行接头连接，得到带接头样品；

步骤S4，对所述带接头样品进行扩增，得到所述单细胞的转录组测序文库。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在得到所述带接头样品之后，以及对所述带接头样品进行扩增之前，还包括对所述带接头样品进行消化的步骤，所述消化步骤中用USER酶进行消化。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述物理破碎的方式为采用自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA进行片段化；优选所述自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA进行片段化时的参数设置为：循环数8％～12％，峰值入射功率170～180瓦；循环数/爆发200～220个；时间300～360s；温度4～8℃。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述自动聚焦声波样本处理仪Covaris S220对所述cDNA进行片段化后得到的所述片段化样品的长度为150～200bp。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在得到所述片段化样品之后，以及对所述片段化样品进行所述末端修复的步骤之前，还包括对所述片段化样品进行浓缩的步骤；优选采用Thermo Scientific公司的Thermo Scientific DNA Speed111V离心浓缩系统。

7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，

在所述步骤S2中采用NEB公司的末端修复酶试剂组合对所述片段化样品不经纯化直接进行末端修复，同时添加腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，所述末端修复酶试剂组合包括10×的NEBNext末端修复反应缓冲液和NEBNext末端制备酶混合物；

在所述步骤S3中采用NEB公司的平末端/粘性TA末端连接酶混合物和NEBNext接头对所述修复后样品进行接头连接；

在所述步骤S4中采用KAPA BIO公司的2×的KaPA HiFi反应混合物对所述接头样品进行扩增。

8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，当所述片段化样品的量低至3ng时，在所述步骤S3中，对所述接头进行稀释后再进行接头连接；优选将所述接头稀释至1.0～2.0μM；更优选稀释至1.5μM。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S4中，所述扩增的循环次数为10～15次，优选13次。

10.权利要求1至9中任一项所述的构建方法在研究细胞异质性方面的应用。