CN115873922A - 一种单细胞全长转录本建库测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了单细胞全长转录本建库测序方法。本发明提供了一种单细胞全长转录本建库测序方法,包括如下步骤:A)对单细胞的mRNA进行单细胞标记和U组合标记;B)将所述双标记cDNA进行预扩增、打断、文库构建,得到单细胞全长转录本文库;C)测序所述单细胞全长转录本文库,实现单细胞全长转录本建库测序。本发明使用胞嘧啶与甲基化胞嘧啶或羟甲基化胞嘧啶可以在重亚硫酸盐或脱氨酶的作用发生转化而发生碱基改变(变成T)基础上,使用甲基化胞嘧啶或羟甲基化胞嘧啶在逆转录时加入到cDNA上的位置组合来对原始的RNA分子进行标记,利用标记来确定测序序列是否来自同一RNA分子,从而组装成全长转录本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,尤其涉及一种单细胞全长转录本建库测序方法。
背景技术
单细胞转录组测序是对单个细胞的转录组进行测序,是目前高通量测序技术中被用的最广泛的技术之一,可以对组织或细胞在特定时间或功能状态下转录的RNA进行高通量测序。单细胞转录组测序让对细胞的异质性、细胞发育、肿瘤微环境等研究从混合细胞到了单细胞的水平,可以进一步揭示了生物体的细胞水平的变化规律,为精准医疗带来巨大的进步。单细胞转录组技术可以将细胞分为不同的类型,同时可以将同种类型的细胞区分为不同亚型。而且已经可以利用微孔芯片或油包水液滴等技术或产品,实现一次对成千上万的单细胞进行转录组建库测序,例如10xgenomics的单细胞RNA测序产品或者BD公司的相应产品。高通量单细胞转录组测序技术的出现,使得研究人员可以对更多不同物种的不同组织的细胞进行大规模的转录组分析,构建细胞图谱,研究细胞类群与细胞个体的差异,更好的理解不同组织细胞的功能与变化。但是目前常用的高通量单细胞转录组测序方案都只能获得mRNA 3’端的信息,只能对基因的表达量进行分析,而无法获得全长转录本的信息,丢失了大量信息,造成无法对基因的可变剪切以及其Isoform进行深入研究。高通量单细胞全长转录组测序技术可以同时对大量单细胞进行全长转录组测序,获得每个细胞中mRNA的完整信息,除基因表达量以外,还可以分析同一个基因在不同细胞中的表达形式,对以往由不同基因的表达量的差异而区分出来的细胞类群进行进一步的分析。拥有转录本的完整RNA序列可以揭示RNA是如何被处理的(例如,通过编码部分的选择性剪接),以及RNA是由母亲还是父亲的基因复制(等位基因)产生的。
解决上述问题的方案目前有如下两种:
一、成熟的高通量单细胞RNA建库技术结合单分子测序:
比如利用10X Genomics公司的单细胞RNA建库试剂盒得到单个细胞的全长cDNA文库,然后用Pacbio平台或ONT平台的建库技术进行建库,然后利用单分子测得单个细胞全长转录本,通过研究不同亚群细胞的转录本特征,发现了亚群特异的转录本,这从另外一个视野研究了细胞的异质性。单细胞RNA建库结合单分子测序具体方案:使用现有smart-seq或smart-seq2的方法得到单细胞中全长的cDNA,即采用带有oligo-dT的逆转录引物与单细胞中的mRNA上的polyA进行杂交,使用的MMLV逆转录酶可以在完成全长RNA逆转录后,在cDNA的5’末端加上3个C碱基,然后使用TSO(Template switch oligo)引物进行模板转换,TSO引物3’由3个鸟嘌呤核糖核苷酸(rGrGrG)和5’的同用引物组成,完成逆转录后,使用通用引物可以扩增得到全长的双链cDNA,再根据使用的单分子测序平台对应的建库技术,进行建库(比如Pacbio和ONT),之后对全长的cDNA文库进行测序,从而得到单细胞的全长转录本。
单细胞RNA建库再结合单分子测序在一定程度上解决了无法获得单细胞全长转录本的问题。但是目前的高通量单细胞RNA建库试剂和单分子测序的成本都非常高,两者结合起来之后成本成倍增加,让这个方法难以大规模推广。而且目前的单分子测序的测序准确性偏低,在对转录本进行定量时,会造成定量的准确性降低,为了增加准确性,需要加大数据量,这又进一步增加了测序成本。因此,单细胞RNA建库结合单分子测序的方案虽然能得到完整的全长转录本,但是成本很高;同时由于单分子测序的准确性较低,会影响转录本分析的准确性,如果需要得到测序准确性高的数据,就需要加大测序量,这样则进一步增加了测序成本。所以需要一个低成本的单细胞全长转录本的方案。
二、smart-seq3技术实现低成本的单细胞全长转录组
在smart-seq2的基础上,通过改进开发的smart-seq3技术是一种低成本的单细胞全长转录组的解决方案。这种方式得到的转录本当然没有Pacbio等三大方法得到的全长转录本长与完整,但是相对于普通单细胞转录组来说,转录本长度大大增加了,提供了单细胞水平的转录组的特征。Smart-seq3建库方法的方案:其建库方式基本上与smart-seq2一致,不同点在于:在Tn5转座酶包埋序列中带有唯一标签序列(UMI),其建库流程是先通过oligo-dT的引物与含有polyA尾巴的mRNA杂交,使用逆转录酶进行逆转录,在完成全长RNA逆转录后,逆转录酶在cDNA的5’末端加上3个C碱基,然后使用TSO引物进行模板转换,TSO引物由3个鸟嘌呤核糖核苷酸(rGrGrG)和UMI序列和Tag序列以及Tn5通用序列组成,完成逆转录后,合成全长cDNA文库。再通过PCR扩增,将逆转录得到的序列进行扩增,扩增出多条带相同标签的序列。再使用Tn5转座酶进行打断和标记以构建测序上机文库,之后对文库进行双端测序。得到的双端序列,挑选带有唯一标签序列的reads来构建延伸转录本。在构建转录组的过程中,主要是挑选5’端UMI序列的双端序列,对于来自同一个转录本的reads,其5’端的reads带有的UMI序列是一致的,但是3’端的序列不一致,因此可以将具有相同UMI的5’端的序列与不同3’端的序列进行合并,延伸转录本,得到更长的转录本(图1,参考文献:Hagemann-Jensen,M.,et al.(2020)."Single-cell RNA counting at allele andisoform resolution using Smart-seq3."Nat Biotechnol 38(6):708-714.)。
Smart-seq3的建库方法虽然可以得到较长的转录本,但是对数据的利用率低,位于mRNA中间的reads由于没有对应的5’端UMI信息,无法对应到相应转录本上而无法使用,造成数据浪费。并且需要长短不同文库来保证延伸的转录本长度,造成文库长度不均一,影响测序质量,并且由于过长的文库的测序难度也会增加,所以最终的转录本的长度和完整度会受到限制。由于以上问题,这个方法在高通量单细胞RNA测序上的应用时,会浪费更多数据,也难以得到的完整的全长转录本长。
因此,选择一种更为合适的高通量单细胞全长转录组测序技术成为研究的热点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种单细胞全长转录本建库测序方法。
本发明提供的方法,包括如下步骤:
A)对单细胞的mRNA进行双标记和C转化,得到双标记cDNA;
所述双标记包括单细胞标记和U组合标记;
所述单细胞标记为用带有单细胞标记序列的PolyT的oligo引物捕获所述mRNA;
所述U组合标记为将所述mRNA在模板转换TSO引物和逆转录酶作用下进行逆转录和模板转换反应,且反应时加入甲基化C或羟甲基化C实现再次标记,形成带有甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA;
所述逆转录和模板转换反应体系中包括甲基化C或羟甲基化C、模板转换TSO引物和逆转录酶;
所述C转化为将带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的甲基化C或非甲基化C转化为U,得到不同位置U碱基和非甲基化C的组合标记的cDNA或不同位置U碱基和甲基化C的组合标记的cDNA,记作双标记cDNA;
上述单细胞标记和U组合标记可以在一个体系中实现,也可以先进行单细胞标记,再进行U组合标记。
B)将所述双标记cDNA进行预扩增、打断、文库构建,得到单细胞全长转录本文库;
C)测序所述单细胞全长转录本文库,实现单细胞全长转录本建库测序。
上述方法中,所述对单细胞的mRNA进行双标记和C转化的方法可以为:
1)先裂解单细胞mRNA,再采用带有单细胞标记序列的PolyT的oligo引物捕获所述mRNA,得到带有单细胞标记的mRNA;
可以采用微液滴法实现单细胞mRNA的获得及捕获,在本发明的实施例中具体为裂解单细胞mRNA,再采用DNBelab C系列单细胞RNA文库制备试剂盒(深圳华大智造科技有限公司,产品货号1000021082)对单细胞进行裂解和试剂盒中的带有PolyT的oligo引物的磁珠对单细胞分离标记;
2)将带有单细胞标记的mRNA在所述模板转换TSO引物和逆转录酶作用下进行逆转录和模板转换反应,且反应时加入甲基化C或羟甲基化C实现再次标记,得到带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA;
3)将所述带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的甲基化C转化为U,得到不同位置U碱基和非甲基化C的组合标记的cDNA,记作双标记cDNA;
或将所述带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的非甲基化C转化为U,得到不同位置U碱基和甲基化C的组合标记的cDNA,记作双标记cDNA。
上述步骤A中所述对单细胞的mRNA进行单细胞标记和U组合标记也可以按照如下方法实现:
1)裂解单细胞的mRNA作为模板,在所述PolyT的oligo引物、所述模板转换TSO引物的作用下进行逆转录和模板转换反应,且在所述逆转录和模板转换反应中加入甲基化C或羟甲基化C,得到带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA;
2)将所述带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的甲基化C转化为U,得到不同位置U碱基和非甲基化C的组合标记的cDNA,记作双标记cDNA;
或将所述带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的非甲基化C转化为U,得到不同位置U碱基和甲基化C的组合标记的cDNA,记作双标记cDNA。
上述使cDNA中甲基化的C转化成U的方法在本发明的实施例为:使用TET酶和吡啶硼烷进行转化,让甲基化的C转化成U,也可以不限于此方法,其他能够实现该目的的方法均可。
或将所述带有甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的非甲基化C转化为U,得到不同位置U碱基和甲基化C的组合标记的cDNA,记作双标记cDNA。
上述使cDNA中非甲基化的C转化为U的方法在本发明的实施例为:使用胞嘧啶双加氧酶(TET)和T4β-葡糖基转移酶对cDNA进行处理,再使用脱氨酶APOBEC对C碱基进行脱氨反应,使未甲基化的C转化为U,也可以不限于此方法,其他能够实现该目的的方法均可。
上述方法中,所述PolyT的oligo引物包括通用引物序列、接头序列、细胞标记序列、UMI、PolyT和NV核苷酸;
具体的:通用引物序列为TTGTCTTCCTAAGGAA;
接头序列为CGACATGGCTACGATTCTGCG(对应华大智造的DNBSEQ平台);如果是使用illumina的测序平台,接头序列使用illumina对应的接头序列。
细胞标记序列(cell barcode)是已知的固定序列组合,组合的数目可以达到几十万种,其目的是标记单个细胞,n个细胞标记n个细胞标记序列。在本发明的实施例中为DNBelab C系列单细胞RNA文库制备试剂盒MGI,1000021082中的细胞标记序列。
UMI序列由6到12个的随机碱基碱基组成,其作用是对mRNA分子进行唯一标记,用于区分不同转录本。
PolyT可以是10-30T组成,在本发明的实施例中具体以21个T组成为例。
N为A/T/C/G四种碱基任意一种,V为A/C/G三种碱基任意一种。
所述模板转换TSO引物包括所述通用引物序列和连续的三个rG,具体为CGACATGGCTACGAT(通用引物)/rG/rG/rG。
上述步骤B中,将所述双标记cDNA进行预扩增、打断、文库构建,得到单细胞全长转录本文库;具体如下:
采用与通用引物对应的CGACATGGCTACGAT引物对双标记cDNA进行预扩增,在采用打断酶(本发明实施例为MGI的高通量单细胞RNA文库制备试剂盒中的打断酶)对cDNA打断、末端修复、末端修复AT、加接头、PCR扩增、单链环化、酶切得到测序文库。
本发明提供的一种单细胞全长转录本建库方法,为上述方法的步骤A)-B)。
本发明还有一个目的是提供一种单细胞全长转录本建库测序的试剂盒。
本发明提供的试剂盒,包括如下物质:
1)所述PolyT的oligo引物;
2)所述模板转换TSO引物;
3)用于甲基化C转化为U的试剂或用于非甲基化C转化为U的试剂。
上述的方法在进行单细胞全长转录本建库测序中的应用也是本发明保护的范围;
或上述方法在空间转录全长转录本建库测序中的应用也是本发明保护的范围。
上述试剂盒在进行单细胞全长转录本建库测序中的应用也是本发明保护的范围;
或,上述试剂盒在空间转录全长转录本建库测序中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的技术方案解决使用单分子测序带来的极高测序成本和低测序准确性,并且可以解决Smart-seq3无法利用RNA中间部分reads而造成的数据浪费和转录本长度不完整,以及其无法用于高通量单细胞测序的问题。
本发明利用胞嘧啶与甲基化胞嘧啶或羟甲基化胞嘧啶可以在重亚硫酸盐或脱氨酶的作用发生转化而发生碱基改变(变成T)基础上,可以在对RNA分子进行逆转录的时候,使用甲基化胞嘧啶或羟甲基化胞嘧啶掺入的位置与频率对逆转录后的cDNA分子进行标记。对进行标记后的cDNA进行打断建库测序后,利用这些标记可以确定reads是否来自同一个RNA分子,从而可以将这些reads对应回来源的RNA分子,组装成完整的转录本。其中RNA可以来自单细胞并且带有单细胞标记的RNA,例如利用油包水液滴对细胞进行分离标记的单细胞RNA。如此,在测序之后,可以通过测得的带有单细胞标记(cell barcode)的reads1与带有特定位置的碱基改变(C转变为T)的标记的reads2的双端测序reads来确定RNA分子的细胞来源,从而可以实现高通量的单细胞全长转录本测序。
本发明是对全长的RNA分子进行标记之后建库测序,再使用二代测序平台进行测序,降低了测序成本,相对于单分子测序平台也增加了测序的准确性;并且由于对整个分子包括中间部分都进行标记,使得测到RNA中间部分的数据也可以被利用来组装转录本,增加组装成转录本的长度与完整性,也减少了数据浪费,同时还能和目前高通量单细胞建库技术结合,实现高通量的单细胞全长转录组测序,增加了应用的范围。
本发明使用胞嘧啶与甲基化胞嘧啶或羟甲基化胞嘧啶可以在重亚硫酸盐或脱氨酶的作用发生转化而发生碱基改变(变成T)基础上,使用甲基化胞嘧啶或羟甲基化胞嘧啶在逆转录时加入到cDNA上的位置组合来对原始的RNA分子进行标记,利用标记来确定测序序列是否来自同一RNA分子,从而组装成全长转录本。
附图说明
图1为Smart-seq3全长转录本测序方法示意图。
图2为基于胞嘧啶转化的全长转录本建库测序流程示意图,其中A\B\C代表的是不同的mRNA转录本,A1\A2\A3代表mRNA逆转录扩增后得到的各个拷贝。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、单细胞全长转录组测序方法的建立
本发明单细胞全长转录组测序方法的具体步骤如下(图2):
可以采用DNBelab C系列单细胞RNA文库制备试剂盒MGI,1000021082或者Chromium Next GEM Single Cell 3′Kit v3.1(10x Genomics,1000268)实现单细胞mRNA的获得及捕获,并进一步进行转录测序;
也可以先裂解细胞后,再用相应的引物进行捕获转录测序,下面会分别描述。
(一)、微液滴法进行单细胞全长转录组测序方法
一、微液滴法实现单细胞mRNA的获得及捕获
具体如下:
分离获得单细胞,使用MGI的高通量单细胞RNA文库制备试剂盒(DNBelab C系列单细胞RNA文库制备试剂盒,深圳华大智造科技有限公司,产品货号1000021082)对单细胞进行裂解和单细胞的分离标记,对单细胞进行裂解采用的试剂为试剂盒中的试剂;对单细胞分离标记采用的是试剂盒中带有PolydT的oligo的磁珠;收集液滴(含有破乳后的单细胞标记磁珠)到PCR管中,该液滴中含有结合带PolydT的oligo引物的mRNA和裂解物。
上述试剂盒中的带有PolydT的oligo的磁珠目的是捕获mRNA,其中PolyT的oligo引物从5'至3’端依次包括:通用引物序列、接头序列、细胞标记序列、UMI、PolyT和NV核苷酸(N为A/T/C/G四种碱基任意一种,V为A/C/G三种碱基任意一种);
通用引物序列为TTGTCTTCCTAAGGAA(序列1);
接头序列为CGACATGGCTACGATTCTGCG(序列2,对应华大智造的DNBSEQ平台);如果是使用illumina的测序平台,接头序列使用illumina对应的接头序列。
细胞标记序列(cell barcode)目的是标记单个细胞,n个细胞标记n个细胞标记序列。在本发明的实施例中为DNBelab C系列单细胞RNA文库制备试剂盒MGI,1000021082中的细胞标记序列。
UMI序列由6到12个的随机碱基碱基组成,其作用是对mRNA分子进行唯一标记,用于区分不同转录本。
PolyT可以是10-30T组成,在本发明的实施例中具体以21个T组成为例。
二、单细胞mRNA的逆转录和模板转换
1、设计并合成相关引物(图2所示)
用于模板转换的TSO引物从5'至3’端依次包括:通用引物序列和连续的三个rG;
具体序列为TSO:CGACATGGCTACGAT(通用引物)/rG/rG/rG
2、逆转录和模板转换
原理:在mRNA进行逆转录时,添加甲基化的C,使cDNA本来应该是C碱基的部分位置会被甲基化的5mC或5hmC随机替代,每个RNA分子逆转录的cDNA中C被替换的位置组合的都是几乎是唯一的,可以作为RNA分子的标记,每个RNA分子都会有这样一串不同位置的非甲基化C和甲基化C的组合作为标记(类似于基因组的单倍体型)。另外,使用M-MLV逆转录进行逆转录时候,会在完成逆转录的cDNA 3‘末端加上三个C,TSO上的是三个rGrGrG会与这个三个C进行杂交,这时候逆转酶会继续以TSO为模板继续进行逆转录,这样就在cDNA的3‘端又加上了通用的序列。
方法:以上述与带有PolyT的oligo引物磁珠捕获的不同单细胞mRNA为模板,加入模板转换TSO引物对带PolyA的mRNA进行逆转录和模板转换,并且在反应体系按照掺入一定比例的5mdCTP或5hmCTP,得到cDNA,每个单细胞的cDNA会有这样一串不同位置的非甲基化C和甲基化C的组合作为标记。
按照表格配制如下体系:
表1为RT reaction buffer体系
组分 | 单个反应体积(μL) |
5x First Strand Buffer(BGI,01E022MM随逆转录酶一起) | 10μL |
25mM dNTP Solution Mix(ENZYMATICS,N2050-25) | 2μL |
10mM 5-methyl-dCTP(NEB,N0356S) | 11.25μL |
1M MgCl2 | 0.375μL |
100mM DTT(BGI,01E022MM随逆转录酶一起) | 2.5μL |
5M Betaine(Sigma,B0300) | 10μL |
分子级水 | 6.125μL |
总体积 | 41.25μL |
表2为RT enzyme mix体系
组分 | 单个反应体积(μL) |
Alpha Reverse Transcriptase(BGI,01E022MM) | 2.5μL |
RNase inhibitor(BGI,01E019MM) | 1.25μL |
总体积 | 3.75μL |
表3为RT Primer Mix体系
组分 | 单个反应体积(μL) |
PolyT的oligo引物 | 2.5μL |
模板转换TSO引物 | 2.5μL |
总体积 | 5μL |
上述逆转录和模板转换步骤具体如下:
将上述41.25μL体积表1中的RT reaction buffer、3.75μL体积上述表2中的RTenzyme mix和2.5μL体积100μM浓度模板转换TSO引物加入上述一收集的2.5μL体积液滴的PCR管(含有结合带PolydT的oligo引物的mRNA)中,得到逆转录和模板置换体系,将该体系短暂混匀后离心,立刻置于冰上。其中逆转录和模板置换体系中模板转换TSO引物的终浓度为5μM。
再将上述含有逆转录和模板置换体系的PCR管置于PCR仪上,按照下表4程序进行反应,再分离磁珠,得到逆转录和模板置换后cDNA。
表4为逆转录和模板置换程度
三、转化使C转化成U
采用如下任一方式进行:
1、使cDNA中甲基化的C转化成U
将上述二得到的cDNA进行转换,使cDNA中甲基化的C转化成U,得到含有U的cDNA,使cDNA的分子标记变成了不同位置U碱基和非甲基化C的组合标记。
使cDNA中甲基化的C转化成U的方法如下:使用TET酶和吡啶硼烷进行转化,让甲基化的C转化成U。
2、使cDNA中非甲基化的C转化为U
将上述二得到的cDNA进行转换,使cDNA中非甲基化的C转化为U,得到含有U的cDNA,使cDNA的分子标记变成了不同位置U碱基的组合和甲基化C的组合标记。
使cDNA中非甲基化的C转化为U的方法如下:使用胞嘧啶双加氧酶(TET)和T4β-葡糖基转移酶对cDNA进行处理,再使用脱氨酶APOBEC对C碱基进行进行脱氨反应,使未甲基化的C转化为U。
四、cDNA预扩增
以上述三中任一方式得到的含有U的cDNA为模板,用与通用序列对应的PCR引物进行PCR扩增,这样原始的cDNA分子会被扩增成多条带有相同组合标记的cDNA双链分子。
上述PCR引物的序列如下:CGACATGGCTACGAT。
五、打断建库
1、打断cDNA
用MGI的高通量单细胞RNA文库制备试剂盒中的打断酶对cDNA进行打断,得到打断后cDNA。
2、建立测序文库
将上述打断后cDNA依次经过末端修复加A、加上测序接头、PCR扩增等;得到测序文库。
上述测序接头可以是不同测序平台的接头序列,例如DNBSEQ和illumina平台。根据不同测序平台的要求完成建库步骤。
六、测序
完成建库后,使用相应的测序平台进行双端测序,测序长度可以根据文库长度进行调整,一般为50bp到250bp。
七、测序数据分析
完成测序之后,对测序数据进行过滤、比对之后,利用reads中存在的与参考基因组比对不上的T碱基组合分子标签的,对测到相同组合的reads进行不断组装,最终组装出全长转录组,再选择出带有cell barcode和UMI的reads1来确定组装出的全长转录组来源的细胞和表达量,从而实现高通量的单细胞全长转录组测序。
(二)、单细胞裂解后引物进行捕获转录测序进行单细胞全长转录组测序方法一、单细胞裂解释放mRNA
将不同待测序单细胞分别分离到单管中并裂解,得到含有不同单细胞mRNA的裂解液。
二、单细胞mRNA的捕获、逆转录和模板转换
引物与上述(一)中的相同,采用PolyT的oligo引物实现捕获,且配合TSO引物实现逆转录和模板转换,具体步骤如下:
将上述一得到的含有不同单细胞mRNA的裂解液、上述表1中的RT reactionbuffer体系、表2的RT enzyme mix体系和表3为RT Primer Mix体系混匀,得到反应,将该体系短暂混匀后离心,立刻置于冰上。其中,反应体系中的PolyT的oligo引物的终浓度为5μM,TSO引物的终浓度为5μM。
再将含有上述反应体系的PCR管置于PCR仪上,按照表4程序进行反应,再分离磁珠,得到逆转录和模板置换后cDNA。
三至七、步骤三至七与上述(一)相同。
实施例2、小鼠肾组织单细胞全长转录组测序
下述实施例样本来自购买的C57BL/6品系小鼠肾组织,实验重复2次,一次命名为M-1,另一次命名为M-2。
一、微液滴法实现单细胞mRNA的获得及捕获
1、分离小鼠肾组织单细胞
1)从解剖完成小鼠体内小心取出肾组织至培养皿中,培养皿置于冰上,全程保持低温,加2ml预冷的PBS冲洗组织,洗去血污,弃去液体,重复洗涤一次。
2)将冲洗干净组织放入新的培养皿中,培养皿放于冰盒背面,加入2ml预冷PBS(10010031Gibco)至培养皿中,用剪刀将组织充分剪碎,剪碎至0.5mm3左右。
3)准备好15ml离心管,做好标记,用胶头滴管将剪碎的组织连同培养基一同转移至15ml离心管,在培养皿中再加入1ml预冷PBS,冲洗重悬剩余组织,转移至离心管中,离心管中加预冷PBS至4ml,加入4ml 10%的胶原酶通用型(C0130 Sigma-Aldrich Collagenasefrom Clostridium histolyticum(胶原酶通用型))。
4)加入完成后缓慢颠倒混匀,放入37℃烘箱中混匀仪上,15r/min消化60min
5)取30μm Pre-Separation Filters(美天妮,130-041-407)放入15ml离心管中,用1ml预冷PBS润洗,润洗完成后用胶头滴管将管中所有样本过30μm Pre-SeparationFilter,液体均通过30μm Pre-Separation Filter后,用2mlPBS冲洗解离用离心管,过30μmPre-Separation Filter,收集得到细胞悬液。
6)离心机300g 7min低温离心,吸去上清,立即进行红细胞裂解。
7)细胞沉淀中加入300μl PBS,再加入3ml红细胞裂解液(碧云天C3702-120ml),吹打混匀,室温静置10min。
8)加入7ml PBS轻微颠倒混匀,离心机300g 7min低温离心,吸去上清,再加入3mlPBS重悬,得到肾组织单细胞重悬液。
2、单细胞进行裂解和单细胞的分离标记
按照实施例1的(一)中的步骤一对上述肾组织单细胞重悬液进行裂解和单细胞的分离标记,收集液滴(含有破乳后的单细胞标记磁珠)到PCR管中。
其中,PolyT的oligo引物从5'至3’端依次包括:TTGTCTTCCTAAGGAA(通用序列)CGACATGGCTACGATTCTGCG(接头序列)cell barcode序列NNNNNNNNNNNN(UMI)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN
二、单细胞mRNA的逆转录和模板转换
按照实施例1的(一)中的步骤二进行:
1、设计并合成相关引物
模板转换oligo TSO引物:CGACATGGCTACGAT(通用序列)/rG/rG/rG(3个核糖核苷酸修饰的G)。
2、逆转录和模板置换
1)将上述41.25μL体积表1中的RT reaction buffer、3.75μL体积上述表2中的RTenzymemix和2.5μL体积100μM浓度的模板转换TSO引物加入上述一收集的2.5μL体积液滴的PCR管(含有结合带PolydT的oligo引物的mRNA)中,得到逆转录和模板置换体系,将该体系短暂混匀后离心,立刻置于冰上。其中逆转录和模板置换体系中模板转换TSO引物的终浓度为5μM。再将上述含有逆转录和模板置换体系的PCR管置于PCR仪上,按照下表4程序进行反应。
2)反应完成后,瞬时离心收集PCR管中的液体到管底。
3)瞬时离心后,将PCR管放置与磁力架上,静置5min至液体澄清,用移液器吸取并丢弃上清液。
4)向PCR管中加入200ul 75%乙醇,静置30s,洗涤磁珠。
5)重复上一步。尽量吸干管内液体,有少量残留在管壁时可将PCR管瞬时离心,在磁力架上分离后,用小量程的移液器将管底液体吸干。
6)保持PCR管固定于磁力架上,打开管盖,室温干燥,直至磁珠表面无反光、无开裂。
7)将PCR管从磁力架上取下,加入30μL分子级水进行洗脱,用移液器轻轻吹打10次至完全混匀。
8)将28μL上清液转移到新的200ul PCR管中,得到连接磁珠的逆转录和模板转换后cDNA。
三、转化使C转化成U
按照实施例1的(一)中的步骤三进行,实现使cDNA中甲基化的C转化成U,具体如下:
使用NEBNext Enzymatic Methyl-seq Kit(NEB,E7120S)中的试剂对上述二得到的连接磁珠的逆转录和模板转换后cDNA中加入的5mC进行转化。
完成转化后,将纯化好的DNA转移到新的200ul PCR管中,得到连接磁珠的含有U的cDNA,使cDNA的分子标记变成了不同位置U碱基和非甲基化C的组合标记。
四、cDNA预扩增
以上述得到的连接磁珠的含有U的cDNA为模板,用PCR引物进行PCR扩增,得到cDNA预扩增产物,目的是增加cDNA的量。
上述PCR引物的序列如下:CGACATGGCTACGAT。
上述预扩增体系为如下表5所示:
表5为配制cDNA扩增反应液
步骤如下:
1)将配好的表5的cDNA扩增反应液加入到上述三得到的连接磁珠的含有U的cDNA的PCR管中,短暂的混匀离心后,放置到PCR仪上,按照下表6的反应条件反应。
表6为预扩增反应程度
2)向离心管中加入30ul纯化磁珠(来自DNBelab C系列单细胞RNA文库制备试剂盒MGI,1000021082),用移液器吹打10次到充分混匀后,常温孵育10min。
3)瞬时离心后,将1.5mL离心管放置与磁力架上,静置5min至液体澄清,用移液器吸取并丢弃上清液。
4)向1.5mL离心管中加入200ul 75%乙醇,静置30s,洗涤磁珠。
5)重复上一步。尽量吸干管内液体,有少量残留在管壁时可将1.5mL离心管瞬时离心,在磁力架上分离后,用小量程的移液器将管底液体吸干。
6)保持1.5mL离心管固定于磁力架上,打开1.5mL离心管管盖,室温干燥,直至磁珠表面无反光、无开裂。
7)将1.5mL离心管从磁力架上取下,加入22μL分子级水进行DNA洗脱,用移液器轻轻吹打10次至完全混匀。
8)室温下孵育5min。
9)瞬时离心,将1.5mL离心管置于磁力架上,静置5min至液体澄清,将20μL上清液转移到新的200ul PCR管中,得到cDNA预扩增产物。
五、打断建库
1、酶法打断
准备200ng上述四制备的cDNA预扩增产物到0.2mL PCR管中,使用NF Water补足体积到45μL,将PCR管置于冰盒上。使用来自DNBelab C系列单细胞RNA文库制备试剂盒中的打断酶对cDNA进行打断。
具体步骤如下:
1)取出Frag Enzyme(来自DNBelab C系列单细胞RNA文库制备试剂盒MGI,1000021082),轻轻颠倒混匀10次,瞬时离心后置于冰上待用。
2)按下表7在冰上配制打断反应液。
表7为打断反应液
3)用移液器吸取15μL配制好的打断反应液加入上述四得到的含有cDNA预扩增产物的PCR管中,涡旋震荡3次,每次3s,瞬时离心将反应液收集至管底。
4)当PCR仪温度降至4℃,将PCR管置于PCR仪上,按照下表8中的条件进行反应。
表8为打断反应程序
温度 | 时间 |
105℃热盖 | On |
4℃ | 1min |
30℃ | 15min |
72℃ | 10min |
4℃ | Hold |
5)瞬时离心将反应液收集至管底,全部液体转移到新的1.5mL离心管中,补TE到100μL。
6)提前取出DNA Clean Beads,置于室温平衡至少30min,使用前充分震荡混匀。
7)用移液器吸取70μL DNA Clean Beads(来自DNBelab C系列单细胞RNA文库制备试剂盒MGI,1000021082)到新的1.5mL离心管中,并轻轻吹打至少10次至完全混匀,最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中。
8)室温孵育10min,然后短暂离心后,将离心管置于磁力架上,静置2~5min,至液体澄清,用移液器小心吸取上清到新的1.5mL离心管中。
9)用移液器吸取20μL DNA Clean Beads到新的1.5mL离心管中,并轻轻吹打至少10次至完全混匀,最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中。
10)保持离心管置于磁力架上,加入200μL新鲜配制的80%乙醇,漂洗磁珠及管壁,静置30s,小心吸取并丢弃上清。
11)重复上一步,尽量吸干管内液体,有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心,在磁力架上分离后,用小量程的移液器将管底液体吸干。
12)保持离心管固定于磁力架上,打开离心管管盖,室温干燥,直至磁珠表面无反光。
13)将离心管从磁力架上取下,加入32μL TE Buffer洗脱DNA,用移液器轻轻吸打至少10次至完全混匀。
14)室温下孵育5min,然后瞬时离心,将离心管置于磁力架上,静置2-5min至液体澄清,将30μL上清液转移到新的0.2mL PCR管中,得到片段化cDNA。
2、末端修复
1)使用MGIEsay全基因组甲基化文库制备试剂盒(MGI,1000005251)中的试剂对上述1得到的片段化cDNA进行后续末端修复反应。
根据所需反应数,按照下表9配方在冰上配制末端修复反应液。
表9为末端修复反应液
组分 | 单个反应体积 |
ER Buffer Mix | 7.3μL |
ER Enzyme Mix | 2.7μL |
总体积 | 10μL |
2)用移液器吸取10μL配制好的末端修复反应液加入含有上述1得到的片段化cDNA的PCR管中,涡旋振荡3次,每次3s,瞬时离心将反应液收集至管底。
3)将PCR管置于PCR仪上,按照下表10中的条件进行反应。
表10为末端修复反应条件(反应体系40μL)
温度 | 时间 |
65℃热盖 | On |
25℃ | 30min |
4℃ | Hold |
4)反应结束后,瞬时离心将反应液收集至管底。
5)用移液器吸取6μL ER Stop Buffer加入0.2mL PCR管中,涡旋震荡3次,每次3s,瞬时离心将反应液收集至管底,静置2分钟.
6)将上述0.2mL PCR管置于提前预热至75℃的PCR仪上反应20min终止反应。
7)反应结束后,瞬时离心将反应液收集至管底,得到末端修复后产物。
3、末端修复AT
1)在冰上配制表11所示的末端修复AT反应液
表11为末端修复AT反应液
2)用移液器吸取4μL配制好的末端修复反应液加入上述2的含有末端修复后产物的PCR管中,涡旋振荡3次,每次3s,瞬时离心将反应液收集至管底。
3)将PCR管置于PCR仪上,按照下表12中的条件进行反应。
表12为AT反应条件(反应体系50μL)
温度 | 时间 |
65℃热盖 | On |
25℃ | 30min |
4℃ | Hold |
4)反应结束后,瞬时离心将反应液收集至管底,得到末端修复AT产物。
4、加接头
1)向上述3得到的含有末端修复AT产物的PCR管中加入5μL对应的甲基化DNAAdapter(MGIEsay全基因组甲基化文库制备试剂盒(MGI,1000005251)),涡旋振荡3次,每次3s,瞬时离心将反应液收集至管底。
2)根据所需反应数,按照下表13配方在冰上配制接头连接反应液。
表13为接头连接反应液
3)用移液器缓慢吸取25μL配制好的接头连接反应液加入上述1)的PCR管中,涡旋振荡6次,每次3s,瞬时离心将反应液收集至管底。
4)将上述PCR管置于PCR仪上,按照下表14中的条件进行反应。
表14为接头连接反应条件(反应体系80μL)
温度 | 时间 |
25℃热盖 | On |
23℃ | 30min |
4℃ | Hold |
5)反应结束后,瞬时离心将反应液收集至管底。全部转移到新的1.5mL离心管中。
6)提前取出DNA Clean Beads,置于室温平衡至少30min,使用前充分震荡混匀。吸取40μL DNA Clean Beads至上一步的新的1.5mL离心管中,用移液器轻轻吹打至少10次至所有磁珠悬浮,最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中。
7)室温孵育10min。
8)将离心管瞬时离心,置于磁力架上,静置2~5min至液体澄清,用移液器小心吸取上清并丢弃。
9)保持离心管置于磁力架上,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁,静置30s后小心吸取上清并丢弃。
10)重复上一步,尽量吸干管内液体,有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心,在磁力架上分离后,用小量程的移液器将管底液体吸干。
11)保持离心管置于磁力架上,打开离心管管盖,室温干燥,直至磁珠表面无反光。
12)将离心管从磁力架上取下,加入22μL TE Buffer进行DNA洗脱,用移液器轻轻吹打至少10次至所有磁珠悬浮。
13)室温下孵育10min。
14)将离心管瞬时离心,置于磁力架上,静置2~5min至液体澄清,用移液器吸取20μL上清液转移到新的1.5mL离心管中,得到加接头产物。
5、PCR扩增
1)在冰上配制PCR反应液。
表15为PCR反应液
PCR Primer Mix(primer1:/5Phos/GAACGACATGGCTACGATCCGAC-3’
Primer2:TGTGAGCCAAGGAGTTG)
2)用移液器吸取30μL配制好的PCR反应液加入步骤4的0.2mL含有加接头产物的PCR管中,涡旋震荡3次,每次3s,瞬时离心将反应液收集至管底。
3)用移液器吸取30μL配制好的PCR反应液加入PCR管中,涡旋振荡3次,每次3s,瞬时离心将反应液收集至管底。
4)将PCR管置于PCR仪上,按照下表16的条件进行PCR反应。
表16为PCR反应
5)反应结束后,瞬时离心将反应液收集至管底,加入50μL TE Buffer至总体系100μL,全部转移到新的1.5mL离心管中。
6)吸取60μL DNA Clean Beads至的1.5mL离心管中,用移液器轻轻吹打至少10次至所有磁珠悬浮,最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中。
7)室温孵育5min,然后短暂离心后,将离心管置于磁力架上,静置2~5min,至液体澄清,用移液器小心吸取上清并弃掉。
8)保持离心管置于磁力架上,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁,静置30s后小心吸取上清并丢弃。
9)重复上一步,尽量吸干管内液体,有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心,在磁力架上分离后,用小量程的移液器将管底液体吸干。
10)保持离心管置于磁力架上,打开离心管管盖,室温干燥,直至磁珠表面无反光。
11)将离心管从磁力架上取下,加入32μL TE Buffer进行DNA洗脱,用移液器轻轻吹打至少10次至完全混匀。
12)室温下孵育5min。
13)将离心管瞬时离心,置于磁力架上,静置2~5min至液体澄清,用移液器吸取30μL上清液转移到新的1.5mL离心管中。
6、单链环化
1)将上述5得到的含有PCR产物的PCR管置于PCR仪上,按照下表17的条件进行反应,使双链DNA变性成单链。
表17为双链DNA变性成单链条件
温度 | 时间 |
105℃热盖 | On |
95℃ | 3min |
2)反应结束后,立即将PCR管置于冰上,静置2min后。
根据反应数,按照下表18的配方在冰上配制单链环化反应液。
表18为单链环化反应液
组分 | 单个反应体积 |
Splint Buffer | 11.6μL |
DNA Rapid Ligase | 0.5μL |
总体积 | 12.1μL |
3)用移液器吸取12.1μL配制好的单链环化反应液加入2)的PCR管中,涡旋振荡3次,每次3s,瞬时离心将反应液收集至管底。
4)将PCR管置于PCR仪上,按照下表19的条件进行反应。
表19为PCR反应条件
温度 | 时间 |
75℃热盖 | On |
37℃ | 30min |
4℃ | Hold |
5)反应结束后,将PCR管瞬时离心并置于冰上,立即进入下步反应。
7、酶切
1)提前按照下表20的配方在冰上配制酶切消化反应液。
表20为酶切消化反应液
组分 | 单个反应体积 |
Digestion Buffer | 1.4μL |
Digestion Enzyme | 2.6μL |
总体积 | 4μL |
2)用移液器吸取4μL配制好的酶切消化反应液加入上述6得到的PCR管中,涡旋振荡3次,每次3s,瞬时离心将反应液收集至管底。
3)将PCR管置于PCR仪上,按照下表21的条件进行反应。
表21为酶切条件
温度 | 时间 |
75℃热盖 | On |
37℃ | 30min |
4℃ | Hold |
4)反应结束后,瞬时离心将反应液收集至管底。
5)立即向PCR管中加入7.5μL Digestion Stop Buffer,涡旋振荡3次,每次3s,瞬时离心将反应液收集至管底,吸取全部反应液转移到新的1.5mL离心管中。
6)提前取出DNA Clean Beads,置于室温平衡至少30min,使用前充分震荡混匀。吸取170μL DNA Clean Beads至酶切消化产物中,用移液器轻轻吹打至少10次至所有磁珠悬浮,最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入离心管中。
7)室温孵育10min。
8)将离心管瞬时离心,置于磁力架上,静置2~5min至液体澄清,用移液器小心吸取上清并丢弃。
9)保持离心管置于磁力架上,加入200μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁,静置30s后小心吸取上清并丢弃。
10)重复上一步,尽量吸干管内液体,有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心,在磁力架上分离后,用小量程的移液器将管底液体吸干。
11)保持离心管置于磁力架上,打开离心管管盖,室温干燥,直至磁珠表面无反光。
12)将离心管从磁力架上取下,加入22μL TE Buffer进行DNA洗脱,用移液器轻轻吹打至少10次至所有磁珠悬浮。
13)室温下孵育10min。
14)将离心管瞬时离心,置于磁力架上,静置2~5min至液体澄清,用移液器吸取20μL上清液转移到新的1.5mL离心管中。
得到测序文库。
六、测序
使用MGISEQ-2000测序仪进行测序,使用MGISEQ-2000高通量测序试剂套装(PE100)(MGI,货号1000012536),按照说明书指导进行DNB制作和测序。
七、测序结果分析
完成测序之后,对测序数据进行过滤、比对之后,利用reads中存在的与参考基因组比对不上的T碱基组合分子标签的,对测到相同组合的reads进行不断组装,最终组装出全长转录组,再选择出带有cellbarcode和UMI的reads1来确定组装出的全长转录组来源的细胞和它的表达量,从而实现高通量的单细胞全长转录组测序。
1、建库结果
结果如表22,可以看出建库成功。
表22为建库结果
2、分析结果
对测序数据进行过滤、与参考序列(mm10,GCA_000001635.2,2011.12)进行比对之后,对转录本进行表达量分析以及全长转录本的组装,每个细胞都能检测到足够的转录本,在对各个转录本进行准确定量之外,能完整的组装到表达量较高的绝大部分转录本,实现了高通量的单细胞全长转录组测序(如表23所示)。
表23为单细胞全长转录组测序的结果
SEQUENCE LISTING
<110>深圳华大智造科技股份有限公司
<120> 一种单细胞全长转录本建库测序方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ttgtcttcct aaggaa 16
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
cgacatggct acgattctgc g 21
Claims (8)
1.一种单细胞全长转录本建库测序方法,包括如下步骤:
A)对单细胞的mRNA进行双标记和C转化,得到双标记cDNA;
所述双标记包括单细胞标记和U组合标记;
所述单细胞标记为用带有单细胞标记序列的PolyT的oligo引物捕获所述mRNA;
所述U组合标记为将所述mRNA在模板转换TSO引物和逆转录酶作用下进行逆转录和模板转换反应,且反应时加入甲基化C或羟甲基化C进行实现再次标记,形成带有甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA;
所述C转化为将带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的甲基化C或非甲基化C转化为U,得到不同位置U碱基和非甲基化C的组合标记的cDNA或不同位置U碱基和甲基化C的组合标记的cDNA,记作双标记cDNA;
B)将所述双标记cDNA进行预扩增、打断、文库构建,得到单细胞全长转录本文库;
C)测序所述单细胞全长转录本文库,实现单细胞全长转录本建库测序。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤A按照如下方法实现:
1)裂解单细胞mRNA,再采用所述PolyT的oligo引物捕获所述mRNA,得到带有PolyT的oligo引物结合的mRNA;
2)将带有单细胞标记的mRNA在所述模板转换TSO引物和逆转录酶作用下进行逆转录和模板转换反应,且反应时加入甲基化C或羟甲基化C实现再次标记,得到带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA;
3)将所述带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的甲基化C转化为U,得到不同位置U碱基和非甲基化C的组合标记的cDNA,记作双标记cDNA;
或将所述带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的非甲基化C转化为U,得到不同位置U碱基和甲基化C的组合标记的cDNA,记作双标记cDNA。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
所述步骤A照如下方法实现:
1)裂解单细胞的mRNA作为模板,在所述PolyT的oligo引物、所述模板转换TSO引物的作用下进行逆转录和模板转换反应,且在所述逆转录和模板转换反应中加入甲基化C或羟甲基化C,得到带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA;
2)将所述带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的甲基化C转化为U,得到不同位置U碱基和非甲基化C的组合标记的cDNA,记作双标记cDNA;
或将所述带有单细胞标记序列以及甲基化C和非甲基化C组合标记的cDNA中的非甲基化C转化为U,得到不同位置U碱基和甲基化C的组合标记的cDNA,记作双标记cDNA。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于:
所述PolyT的oligo引物包括通用引物序列、接头序列、细胞标记序列、UMI、PolyT和NV核苷酸;
所述NV核苷酸中的N为A/T/C/G四种碱基任意一种,V为A/C/G三种碱基任意一种;
所述模板转换TSO引物包括所述通用引物序列和连续的三个rG。
5.一种单细胞全长转录本建库方法,包括权利要求1-4中任一项中的步骤A)-B)。
6.一种单细胞全长转录本建库测序的试剂盒,包括权利要求2-4中任一项中的如下物质:
1)所述PolyT的oligo引物;
2)所述模板转换TSO引物;
3)用于甲基化C转化为U的试剂或用于非甲基化C转化为U的试剂。
7.权利要求1-5任一项所述的方法在进行单细胞全长转录本建库测序中的应用;
或权利要求1-5任一项所述的方法在空间转录全长转录本建库测序中的应用。
8.权利要求6所述的试剂盒在进行单细胞全长转录本建库测序中的应用;
或,权利要求6所述的试剂盒在空间转录全长转录本建库测序中的应用。
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