CN109811045A - 高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用。本申请方法，包括采用定制微孔芯片和ICELL8平台识别单细胞，并在微孔芯片微孔中，对单细胞进行细胞裂解、mRNA逆转录、cDNA预扩增和Tn5转座酶建库，产物可直接用于测序；在mRNA逆转录或Tn5转座酶建库过程中，引入5’端和3’端双端Barcode序列，以获得单细胞全长转录组。本申请方法，单细胞识别通量高，且产物可直接测序。采用本申请方法进行单细胞测序，只需两天时间，即可一次性高效获取数千个单细胞层面全长转录组库，大大降低了人工和时间成本，并且微量反应体系也大大降低了试剂成本，为大规模单细胞全长转录本测序奠定了基础。

Description

高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用

技术领域

本申请涉及单细胞测序领域，特别是涉及一种高通量的单细胞全长转录组库的制备方法及其应用。

背景技术

近年来单细胞测序技术飞速发展，在发育研究及癌症研究等领域取得了重要成果，但高昂的实验费用是矗立在研究人员面前一道难以逾越的障碍，因此高通量、低成本的单细胞制备技术和测序平台仍然有广阔的前景。

目前商品化的单细胞处理平台包括Fluidigm C1，10×genomics的GemCode，以及Wafergen的ICELL8。其中Fluidigm C1通过将细胞染色并拍照的方式可以识别确定单个细胞，该技术是在一个集成的芯片区域，有48×2共96个微小的微流控小室。每一个微流控小室均是独立分割开在不同位置，通过控制微流控小室的开关，来添加细胞液和后续的反应体系并完成反应。Fluidigm C1具有时间快速、重复性好、数据稳定性好等优点，并且，可以捕获制备全长转录本。但是，Fluidigm C1通量受限于其微流体芯片的设计，一次只能产生96个转录本，而且只能产生cDNA扩增产物，cDNA扩增完后需要手工将每个微流控小室的产物转移到对应的96孔板中进行后续的建库，不能直接形成文库进行测序，后续文库构建通量低、耗时长。

10×genomics公司的GemCode能够与现有的短读取测序仪互补，产生10-100kb的长片段信息，实现结构变异和单体型等分析。GemCode仪器基于液滴微流控的技术，其技术核心是对单细胞进行精确分区，形成包含分子条形码的皮升(缩写pL)大小的液滴，进行后续的转录本的构建。但是该技术只能检测含有条形码一端的信息，不能检测全长转录本，而且存在0.8％～5％的多细胞比例。GemCode基于液滴微流控的方法，有液滴双包裹单细胞之间交叉污染、包裹效率低、成本高，只能产生3’端转录本信息等缺点。

Wafergen公司的ICELL8也是通过将细胞染色并拍照的方式可以识别确定单个细胞。ICELL8平台能够一次分选并识别1000个以上单细胞孔位，进行后续的转录本分析。该技术预先在微孔芯片中添加3’端Barcode序列，然后单细胞在mRNA的分离和第一链cDNA的扩增过程中结合上这段Barcode序列；cDNA收集之后，只有含有这段Barcode的3’端序列才能被区分开来。ICELL8采用的是纳升(缩写nL)级微孔芯片技术，但受限于微孔芯片的容量问题，只能产生3’端转录本信息；后续文库构建通量低、耗时长。

因此目前尚没有理想的技术可以在单细胞层面实现高通量的全长转录本的扩增的同时，实现一体化的测序文库构建，以缩短测序时间和费用。

发明内容

本申请的目的是提供一种改进的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，包括对细胞进行染色后，采用定制的微孔芯片和ICELL8平台系统识别单细胞，并且在微孔芯片的微孔中，对识别获得的单细胞依序进行细胞裂解、mRNA逆转录、cDNA预扩增和Tn5转座酶建库，获得可以直接用于后续测序的单细胞转录组测序文库；其中，在mRNA逆转录过程中，添加5’端和3’端的双端Barcode序列，生成5’端和3’端分别具有Barcode序列的cDNA；或者在Tn5转座酶建库的核酸片段化过程，对核酸片段的5’端和3’端分别添加Barcode序列；又或者在Tn5转座酶建库的片段化DNA扩增过程时，分别在扩增的上下游引物中设计5’端Barcode序列和3’端Barcode序列；通过5’端和3’端的双端Barcode序列，获得单细胞的全长转录组。

其中，定制的微孔芯片是与ICELL8平台系统匹配的定制微孔芯片，与现有的Wafergen微孔芯片相比，定制微孔芯片的微孔容积为350nL，芯片高度2.2mm，微孔容积的增加使得后续在微孔中进行一体化建库得以实现。Barcode序列可以采用测序平台常规使用的Barcode序列，本申请的一种实现方式中，采用的是BGISEQ-500的10bp Barcode序列。

需要说明的是，本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，一方面，借助ICELL8平台能够准确的进行高通量的单细胞识别。另一方面，借助定制的微孔芯片可以实现在微孔中依序进行细胞裂解、mRNA逆转录、cDNA预扩增和Tn5转座酶建库，从而实现一体化操作，所得产物可以直接用于测序，自动化程度高，避免了如Fluidigm C1微流体芯片处理后还要进行后续人工建库的问题，提高了建库和测序效率，大大降低了人工操作时间和单细胞测序时间。再一方面，通过5’端和3’端双端Barcode序列的设计，可以制备全长转录本；保障了单细胞全长转录组测序的准确性和完整性。

优选的，Tn5转座酶建库依序包括以下步骤，(1)对cDNA预扩增的产物进行片段化；(2)对片段化的产物进行PCR扩增；(3)对PCR扩增产物进行片段选择；(4)对步骤(3)选择的片段进行单链DNA环化连接；(5)对单链DNA环化连接产物进行外切酶消化和磁珠纯化，获得可以直接用于后续测序的单细胞转录组测序文库。

需要说明的是，本申请的一种实现方式中，采用DNA纳米球(缩写DNB)测序技术，因此，需要对PCR扩增后选择的片段进行单链DNA环化连接。可以理解，如果不是采用DNA纳米球测序，则不需要进行单链DNA环化连接，直接步骤(3)选择的片段或者片段选择后磁珠纯化即可作为后续测序的单细胞转录组测序文库。

优选的，细胞进行染色具体包括，采用Hoechst和PI染料MIX对细胞进行染色。

本申请的另一面公开了本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法在单细胞测序中的应用。

本申请的再一面公开了一种高通量的单细胞测序方法，包括采用本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，进行单细胞测序文库构建，然后采用高通量测序平台进行测序。其中，高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法中，高通量是指能够一次性处理大量的单细胞；高通量测序是指能够一次性对大量的核酸进行测序。

优选的，高通量测序平台为BGISEQ-500平台。

优选的，高通量测序采用一条链测三段的测序模式。

需要说明的是，本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，能够高通量的获得大量单细胞的全长转录组测序文库，特别适合用于大量单细胞检测的实际应用；并且结合高通量测序平台，可以准确的对大量的单细胞进行测序；提高了单细胞测序的质量和效率。

本申请的再一面公开了本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法或本申请的单细胞测序方法在制备发育研究或癌症研究的检测试剂盒、检测装置或检测系统中的应用。

需要说明的是，本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法或单细胞测序方法，在本申请的一种实现方式中，只需两天时间，即可一次性高效地获取数千个单细胞层面的全长转录组库，直接高通量测序，大大降低了人工操作时间和测序时间；同时，微量的反应体系也大大降低了实验试剂成本，使得大规模单细胞全长转录本测序成为可能；特别适用于发育研究或癌症研究，因此，基于本申请的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法或单细胞测序方法，可以开发相应的发育研究或癌症研究的检测试剂盒、检测装置或检测系统。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法，采用ICELL8平台进行高通量的单个细胞识别，并在微孔中对识别出的单细胞进行后续的细胞裂解等操作，可以获得能够直接用于测序的单细胞转录组测序文库；并且，通过5’端和3’端双端Barcode序列的设计，可以制备全长转录本。采用本申请的方法进行单细胞测序，只需约两天时间，即可一次性高效地获取数千个单细胞层面的全长转录组库，大大降低了人工操作时间和测序时间；同时，微孔芯片的微量反应体系也大大降低了实验试剂成本，为大规模的单细胞全长转录本测序奠定了基础。

附图说明

图1是本申请实施例中ICELL8平台的单细胞孔位鉴定图；

图2是本申请实施例中cDNA预扩增产物的Agilent 2100检测结果图；

图3是本申请实施例中片段化核酸的PCR扩增产物的Agilent 2100检测结果图；

图4是本申请实施例中基于BGISEQ-500平台测序的全长转录本文库基因表达数量检测结果图；

图5是本申请实施例中基于BGISEQ-500平台测序的全长转录本文库Housekeeping基因表达量检测结果图。

具体实施方式

本申请的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法，与目前商品化的单细胞处理平台Fluidigm C1相比，克服了Fluidigm C1通量低，并且，Fluidigm C1只能获得cDNA扩增产物，cDNA扩增完后需要手工将每个微流控小室的产物转移到对应的96孔板中进行后续的建库，以至于后续文库构建通量低、耗时长，等缺陷和不足；本申请的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法，一次性可分选识别上千个单细胞，通量高，并且，所得产物可以直接用于测序，避免了后续的手工建库，以及Fluidigm C1建库通量低、耗时长的问题。与ICELL8相比，一方面，本申请能够制备单细胞的全长转录组；另一方面，同样也解决了ICELL8后续文库构建通量低、耗时长的问题。

本申请的高通量单细胞全长转录组测序文库的构建方法：1)结合ICELL8单细胞识别平台，能够高效、准确的识别单细胞；2)采用独特的双端标记的Barcode，真正实现高通量的全长转录本的扩增的同时，实现一体化的测序文库构建。

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

本例采用培养的新鲜HEK293T细胞系，采用Hoechst和PI染料MIX对细胞进行染色后，进行高通量单细胞全长转录组测序文库构建，与此同时，采用10pg total RNA作为阳性对照，用1×PBS作为阴性对照。详细如下：

一、细胞分离

1.细胞处理

将冻存的细胞从-80度冰箱拿出快速放入干冰中，转移到37度水浴锅内快速溶解。将解冻后细胞放入4度离心机500g离心7min。弃掉上清，加入1mL 1×PBS重悬。

2.细胞染色

先用细胞计数板进行计数，将细胞悬液稀释至浓度为1.3×10⁵～5×10⁵个/mL时开始染色。染色采用Hoechst和PI染料MIX。

Hoechst和PI染料MIX配制方法为：每80μL/每种染料/mL细胞，即每滴约40μL。每1mL细胞加入160μL配制好的Hoechst和PI染料MIX，轻弹管壁5次混匀，37度避光孵育20min。加入等体积的1×PBS到染色后的细胞液中，4度离心机100g离心3min，弃掉上清，加入1mL 1×PBS重悬，再次进行细胞计数。此时细胞量需大于2.5×10⁴个，进行后续反应。

3.细胞悬液检测体系配制

将染色后的细胞稀释到1cell/50nL配制成细胞悬液检测体系，用于后续检测。具体的，1000μL的细胞悬液检测体系包括：100×diluents 10μL、40U/μL的RNase Inhibitor10μL、含Ca²⁺和Mg²⁺的1×PBS将染色后的细胞液稀释至1cell/50nL。

100μL的Positive Control体系包括：100×Diluent 1μL、40U/μL的RNaseInhibitor 1μL、含Ca²⁺和Mg²⁺的1×PBS95.6μL、10ng/μL的Positive control 2.4μL。

100μL的Negative Control体系包括：100×Diluent 1μL、40U/μL的RNaseInhibitor 1μL、含Ca²⁺和Mg²⁺的1×PBS98μL。

4.加样到384孔板

细胞悬液检测体系的样本孔每孔80μL，Positive Control体系和NegativeControl体系的对照孔每孔50μL，fiducial每孔25μL。加样用ICELL 8进行喷样，点击Dispense cells，从样本孔或对照孔中吸液进行喷样，芯片每孔喷样50nL。

5.单细胞识别

喷样完成后，芯片封膜，300g离心5min后进行Imaging，通过ICELL8平台系统识别单细胞孔位，并将单细胞孔位表导入到ICELL8系统。将芯片放入提前预冷的Chip Holder中，并放入-80度暂存至少30min。单细胞孔位鉴定部分结果如图1所示，图1中a1和a2图为单细胞孔位，b1和b2图为死细胞，c1和c2图为多细胞孔位。

二、细胞裂解

将配制好的细胞裂解液分装到384孔板的4个孔中，每孔50μL。根据导入的单细胞孔位表，采用ICELL8将细胞裂解液喷射到单细胞的微孔中，每孔50nL。喷液完成后，芯片在4℃下3220rcf离心3min去除气泡。然后将芯片置于BioRad芯片专用PCR仪内，热盖75℃，72℃5min，4℃5min，4℃hold。将个单细胞微孔中的mRNAs从单细胞中释放，并且Oligo-dT引物也与mRNAs结合。

50nL细胞裂解液包括：1:50,000的ERCC spike10nL、10μM的Oligo-dTPrimer16nL、40U/μL的RNase Inhibitor 1.5nL、10％Triton X-100加入1nL、5×SuperScript II First-Strand Buffer5.5nL、10mM的dNTP 16nL，总计50nL。

三、mRNA逆转录

向每个细胞裂解产物的微孔中加入mRNA逆转录反应液50nL，然后将芯片置于BioRad芯片专用PCR仪内进行mRNA逆转录。

50nL的mRNA逆转录反应液包括：5×SuperScript II First-StrandBuffer15.2nL、5M Betaine 15.2nL、100mM MgCl₂ 0.8nL、100mM DTT2nL、100μM TSO0.8nL、200U/μL SSII 6nL，总计50nL。

mRNA逆转录的反应条件为：75℃热盖，42℃90min，然后进入2个循环：50℃2min、42℃2min，循环结束后，70℃15min、4℃待机。

mRNA逆转录完成后，即将mRNA逆转录为cDNA。

四、cDNA预扩增

向每个mRNA逆转录产物的微孔中加入cDNA预扩增反应液50nL，然后将芯片置于BioRad芯片专用PCR仪内进行cDNA预扩增。

50nL的cDNA预扩增反应液包括：2×KAPA HiFiHotStart Ready Mix41.67nL、10μMIS PCR Primer 0.83nL、Nuclease-free water7.5nL，总计50nL。

其中，IS PCR Primer为Seq ID No.1所示序列，

Seq ID No.1：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-3’。

cDNA预扩增反应条件为：98℃3min，然后进入20个循环：98℃20s、67℃15s、72℃6min，循环结束后，72℃5min、保持4℃。

将cDNA预扩增后的芯片4℃下3220rcf离心3min，然后用microstep仪器随机吸取几个单细胞孔位的cDNA预扩增产物，进行agilent 2100检测。microstep仪器取样的方式为，先将cDNA预扩增产物从芯片微孔中吸取出来，然后将吸取的cDNA预扩增产物排液到干净的无核酸污染的96孔板中，并补充18.2ΩMill-Q水使产物体系至4μL左右，然后取1μL进行agilent 2100检测。结果显示，所有抽查对象的片段范围在500-2000bp，主带1000bp，符合预期，判定为成功，部分结果如图2所示。

五、Tn5转座酶建库

1.cDNA片段化

将cDNA预扩增产物片段化，具体的，向每个cDNA预扩增产物的微孔中加入cDNA片段化反应液50nL，然后将芯片置于BioRad芯片专用PCR仪内进行cDNA片段化。

50nL的cDNA片段化反应液包括：5×TAGBuffer15nL、Tn5酶35nL，总计50nL。其中，Tn5酶为包埋接头的TN5酶。

cDNA片段化的条件为：55℃15min，4℃Hold。

2.片段化cDNA的PCR扩增

首先向每个cDNA片段化产物的微孔中加入50nL的片段化终止反应液。

50nL的片段化终止反应液包括：2.25％SDS2.66nL、0.5μM的Ad153-F-tag(72×)7nL、10μM的Primer F7nL、10μM的Primer R 7nL、5×KAPA HiFi buffer26.34nL，总计50nL。

其中，Primer F为Seq ID No.2所示序列，Primer R为Seq ID No.3所示序列，Ad153-F-tag(72×)为Seq ID No.4所示序列，

Seq ID No.2：5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3’

Seq ID No.3：5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTC-3’

Seq ID No.4：

5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTNNNNNNNNNNTCGTCGGCAG CGTC-3’。

其中，Seq ID No.2所示序列的Primer F的5’端具有磷酸化修饰，Seq ID No.4所示序列的Ad153-F-tag(72×)的5’端具有磷酸化修饰，Seq ID No.4所示序列中，中间10bp的N为Barcode序列。

需要说明的是，片段化终止反应液中起终止作用的是SDS，其它试剂的加入是为了对5’端和3’端进行Barcode序列添加，并配合后续的PCR扩增反应液，保障PCR反应体系正常进行，也就是说，PCR扩增反应液中的部分试剂是添加在片段化终止反应液中的。

将配制好的该片段化终止反应液，分装到洁净384孔板的72个孔，每孔16μL，芯片上每个微孔喷液50nL，喷样完成后封膜，3220rcf，4℃离心5min。然后室温放置10min进行终止反应。

终止反应完成后，向每个反应微孔中加入50nL的PCR扩增反应液，然后将芯片置于BioRad芯片专用PCR仪内进行PCR扩增。

50nL的PCR扩增反应液包括：5×KAPA HiFi buffer25.5nL、10mM dNTP10.5nL、0.5μM的Ad153-R-tag(72×)7nL、1U/μL的KAPA HiFi DNA Polymerase7nL，总计50nL。

其中，Ad153-R-tag(72×)为Seq ID No.5所示序列，

Seq ID No.5：

5’-TGTGAGCCAAGGAGTTGTTGTCTTCNNNNNNNNNNGTCTCGTGGG CTCGG-3’。

Seq ID No.5所示序列中，中间10bp的N为Barcode序列。

Ad153-F-tag(72×)和Ad153-R-tag(72×)的Barcode序列可以相同，也可以不同，在此不做具体限定。

将配制好的PCR扩增反应液，分装到洁净384孔板的72个孔，每孔16μL，芯片上每个微孔喷液50nl，喷样完成后封膜，3220rcf，4℃离心5min。在BioRad专用的芯片PCR仪上进行PCR扩增。

PCR扩增反应条件为：72℃3min，95℃3min，然后进入9个循环：98℃20s、60℃15s、72℃25s，循环结束后，72℃5min、4℃待机。

用microstep仪器随机吸取几个单细胞孔位的PCR扩增产物，进行agilent2100检测。同样的，microstep仪器取样的方式为，先将PCR扩增产物从芯片微孔中吸取出来，然后排液至干净的无核酸污染的96孔PCR板中，并补充18.2ΩMill-Q水使产物体系至4μL左右，然后取1μL进行agilent 2100检测。结果显示，所有抽查对象的主带是200bp，片段范围是150-500bp，可以看出cDNA打断完全，没有500bp以上的片段存在；而且产物峰浓度有500pg/μL，如图3所示，说明微孔扩增得到了全长PCR产物，PCR扩增产物检测合格。收集芯片PCR产物，将芯片正面2600rcf4℃离心5min，然后安装收集管，倒扣4000rpm离心15min收集PCR扩增产物。

3.PCR扩增产物片段选择

将PCR扩增产物使用0.6×+0.2×AgencourtAMPure XP beads，进行选择性纯化。详细如下：

a)涡旋震荡混匀AMPure XP beads并吸取0.6×体积至PCR扩增产物中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育10分钟。

b)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，转移上清至干净EP管中，丢弃磁珠。

c)涡旋震荡混匀AMPure XP beads并吸取0.2×体积至上清中，使用移液器轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5分钟。

d)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，小心移除上清。

e)保持EP管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒后，小心移除上清。

f)重复步骤e)，总计漂洗两次。

g)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠3分钟。

h)将EP管从磁力架中取出，加入50μL灭菌超纯水洗脱。涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀。将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后，吸取上清至灭菌EP管中，于-20℃保存。

将片段化选择的产物进行Agilent 2100和Qubit检测。结果显示，Agilent 2100检测的片段大小范围为200-500bp，符合预期；Qubit检测的浓度大于8ng/μL，能够进行后续环化试验。

注意：如果Qubit检测的浓度小于8ng/μL，可以将PCR产物重新再进行一次PCR扩增，再次PCR扩增的反应条件中循环个数可以设为6-10个cycles。

4.ssDNA环化

对选择的片段进行单链DNA环化连接，具体包括以下步骤：

首先，向片段化选择的产物中加入Splint oligo，体系为：20μM的Splint oligo5μL、片段化选择的产物25μL(总量390ng)、补足NF H₂O，合计70μL。将其置于95℃3min后，置于冰上备用。

其中，Splint oligo为Seq ID No.6所示序列，

Seq ID No.6：5’-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3’。

Splint oligo的两端和带有磷酸接头的单链DNA的两端互补。在95℃3min DNA双链变性之后，置于冰上Splint oligo会与变性后的单链DNA结合，然后在T4DNA ligase的作用下使单链DNA成环。

向70μL体系的冰浴PCR管中加入10×TA buffer12μL、100mM ATP1.2μL、600U/μL的T4DNA ligase0.42μL、NF H₂O36.38μL，合计120μL连接反应体系。

配制好连接反应体系后，vortex，轻甩5s；37℃孵育1h，4℃hold。

5.外切酶消化

将连接反应产物置于冰浴中，向120μL连接反应产物中加入10×TA buffer0.8μL、20U/μL的EXO I3.9μL、100U/μL的EXO III1.3μL、NF H₂O

2μL，合计128μL的外切酶消化体系。

配制好外切酶消化体系后，vortex，轻甩5s；37℃孵育30min，4℃hold。

外切酶消化后，取各单细胞的外切酶消化产物各1μL分别测dsDNA和ssDNA浓度。测得dsDNA的浓度为0.544ng/μL，ssDNA的浓度为1.23ng/μL。一般外切酶消化后dsDNA浓度0～0.2ng/μL，ssDNA浓度0.6～1.0ng/μL；本例的dsDNA浓度稍微偏高，含有一定双链DNA污染，但ssDNA浓度也较高，因此，外切酶消化后的产物合格，能够用于后续试验。

6.PEG32磁珠纯化

外切酶消化产物经过磁珠纯化，即获得本例的可以直接用于后续测序的单细胞转录组测序文库。磁珠纯化详细如下：

a)取170μL PEG32beads，加入到外切酶消化产物中，涡旋震荡混匀，室温孵育10分钟；

b)将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后，小心移除上清；

c)保持EP管始终处于磁力架中，加入200μL新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠；室温孵育30秒后小心移除上清；

d)重复步骤c)，总计漂洗两次；

e)保持EP管始终处于磁力架中，开盖空气干燥磁珠3分钟；

f)将EP管从磁力架中取出，加入40μL灭菌超纯水洗脱；涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀；将反应管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体；待溶液澄清后，小心吸取上清至灭菌EP管中，于-20℃保存；

g)纯化后产物取1μL测ssDNA浓度，结果显示各管的环化ssDNA总量均大于20ng；能够直接用于后续测序。

六、BGISEQ-500平台测序

采用BGISEQ-500平台对PEG32磁珠纯化产物进行测序。BGISEQ-500平台的测序方式为一条链测三段的测序模式，其中需要调整的参数如下：

a)变更Recipe：在传统BGISEQ-500SE测序的基础上，由原来的杂交两次引物变更成杂交三次；

b)测序cycle为70cycle，采用SE100试剂槽；

c)引物替换：Make DNB buffer-正常、Insert引物-Postload板8号孔、Barcode引物1-试剂槽12号孔、Barcode引物2-试剂槽17号孔；

其中，Insert引物为Seq ID No.7所示序列，Barcode引物1为Seq ID No.8所示序列，Barcode引物2为Seq ID No.9所示序列，

Seq ID No.7：5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’

Seq ID No.8：5’-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC-3’

Seq ID No.9：5’-CTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3’；

d)曝光时间表机器run上自动生成；

e)Reagent正常；

将环化后文库的PEG32磁珠纯化产物按上述要求进行SE50+10+10测序。

对测序结果进行全长转录本文库基因表达数量分析，并检测全长转录本文库Housekeeping基因表达量。

全长转录本文库基因表达数量分析的结果如图4所示，图4中，横坐标表示不同文库中Barcode号码，纵坐标表示检测的基因数目；图4的结果显示，平均每个单细胞检测的总基因数达到10000个基因，检测到的单细胞成功率达到85％以上。

全长转录本文库Housekeeping基因表达量检测结果如图5所示，图5中，横坐标表示不同的Housekeeping基因，纵坐标表示Housekeeping基因表达量；Housekeeping基因一般认为是在所有细胞中都表达，且表达量稳定在一定范围，不同细胞差异较小。图5的结果显示，检测到各细胞的Housekeeping基因的均有良好的表达，且差异较小，说明本实验方法具有良好的效果。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用

<130> 17I25269

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag agtac 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaacgacatg gctacgatcc gactt 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtgagccaa ggagttgttg tcttc 25

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(35)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

gaacgacatg gctacgatcc gacttnnnnn nnnnntcgtc ggcagcgtc 49

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(35)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

tgtgagccaa ggagttgttg tcttcnnnnn nnnnngtctc gtgggctcgg 50

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gccatgtcgt tctgtgagcc aagg 24

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cag 33

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctgtctctta tacacatctc cgagcccacg agac 34

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctcacagaac gacatggcta cgatccgact t 31

Claims (8)

1.一种高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，其特征在于：包括对细胞进行染色后，采用定制的微孔芯片和ICELL8平台系统识别单细胞，并且在微孔芯片的微孔中，对识别获得的单细胞依序进行细胞裂解、mRNA逆转录、cDNA预扩增和Tn5转座酶建库，获得可以直接用于后续测序的单细胞转录组测序文库；

其中，在mRNA逆转录过程中，添加5’端和3’端的双端Barcode序列，生成5’端和3’端分别具有Barcode序列的cDNA；

或者在Tn5转座酶建库的cDNA片段化过程，对核酸片段的5’端和3’端分别添加Barcode序列；

又或者在Tn5转座酶建库的片段化后DNA扩增过程时，分别在扩增的上下游引物中设计5’端Barcode序列和3’端Barcode序列；

通过5’端和3’端的双端Barcode序列，获得单细胞的全长转录组。

2.根据权利要求1所述的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，其特征在于：所述Tn5转座酶建库依序包括以下步骤，(1)对cDNA预扩增的产物进行片段化；(2)对片段化的产物进行PCR扩增；(3)对PCR扩增产物进行片段选择；(4)对步骤(3)选择的片段进行单链DNA环化连接；(5)对单链DNA环化连接产物进行外切酶消化和磁珠纯化，获得可以直接用于后续测序的所述单细胞转录组测序文库。

3.根据权利要求1或2所述的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，其特征在于：所述细胞进行染色具体包括，采用Hoechst和PI染料MIX对细胞进行染色。

4.根据权利要求1-3任一项所述的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法在单细胞测序中的应用。

5.一种高通量的单细胞测序方法，其特征在于：包括采用权利要求1-3任一项所述的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法，进行单细胞测序文库构建，然后采用高通量测序平台进行测序。

6.根据权利要求5所述的单细胞测序方法，其特征在于：所述高通量测序平台为BGISEQ-500平台。

7.根据权利要求5或6所述的单细胞测序方法，其特征在于：所述高通量测序采用一条链测三段的测序模式。

8.根据权利要求1-3任一项所述的高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法或权利要求5-7任一项所述的单细胞测序方法在制备发育研究或癌症研究的检测试剂盒、检测装置或检测系统中的应用。