CN116606905B - 一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒、方法及其应用 - Google Patents

一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒、方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒、方法及其应用。所述试剂盒包括细胞固定和打孔液、重悬缓冲液I、重悬缓冲液II、反转录试剂及Tn5转座试剂；本发明能够实现在保持细胞形态完整的情况下对细胞内mRNA进行原位反转录和基于Tn5酶的转座反应，进而通过简单的PCR扩增和片段筛选得到可用于转录组测序的细胞内全长转录组文库，避免了样本RNA提取过程中的损失，可用于极低样本量的转录组文库构建，并可以结合基于微流控或多孔板技术等的单细胞分选平台，进而构建单细胞全长转录组文库。

Description

一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒、方 法及其应用
技术领域
本发明涉及转录组测序技术领域，更具体地，涉及一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒、方法及其应用。
背景技术
转录组指在某一环境下细胞内所有基因转录产物的集合，它是连接生物体遗传元件(基因)和表型(蛋白质)之间的桥梁，因此对于转录组的测定有助于我们理解细胞在响应特定的环境下的基因表达情况。传统上对于基因表达的测定采用RT-qPCR方法，通过设计针对特定基因cDNA的引物，采用PCR扩增结合荧光基团来检测特定基因的cDNA丰度，进而反映目的基因在样品中的表达情况。但这种方法通量较低，一次只能检测很少的基因，而且对引物的设计要求较高，很难满足大规模鉴定的需要，也难以发现未知的转录本或表达基因。
随着高通量测序技术的出现，转录组测序(RNA-seq)技术孕育而生。通过提取组织的RNA后利用与mRNA的polyA互补的polyT作为引物，反转录得到完整的cDNA后再采用限制性内切酶或超声等手段随机打断cDNA，连接上测序接头后进行(或不进行)简单的PCR从而得到能够用高通量测序仪进行测序的文库，之后采用生物信息学手段获得样品中所有基因的表达量等信息。这种方法虽然可以实现大规模的检测样品中基因表达情况，但低效的加测序接头过程以及长时间操作增加了金钱和时间成本。
后来研究人员发现存在一种Tn5转座酶，这种酶可以与19bp的DNA片段形成复合体，并随机切割双链DNA，切割的同时将自身复合体中的19bp片段连接到切割产物的两端。利用这一特性，研究人员将这19bp与测序接头连接，使其可以在断裂DNA的同时加上测序接头，从而大大的节省了RNA-seq建库的时间和成本。然而这些方法均需要对样本进行RNA的提取，但在RNA提取的过程中，由于提取效率有限，导致样本中RNA量的损失，从而限制了这些方法在细胞量稀少的珍贵样品中的应用。
基于此，Picelli,S等于2013年发展出基于孔板的Smart-seq2技术(Picelli,S.etal.Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in singlecells.Nat.Methods 10,1096–1098,2013)。该技术是将单个细胞分选至96孔或384孔板中，在单个孔中进行细胞裂解，加入含有oligo(dT)的引物反转录合成cDNA第一条链，然后添加特殊的引物经过PCR过程合成cDNA第二条链，再利用改造后的高活性Tn5转座酶对DNA进行打断，同时将接头添加到cDNA的两端进行标记，再进行最后一次PCR扩增后，最终得到单细胞水平的转录组测序文库。这种方法虽然可以达到单细胞水平，而且能够研究mRNA的可变剪接信息，但是通量较低，操作比较耗时耗力，成本相对较高。之后研究人员又开发出基于微流控平台的单细胞测序技术，该技术可以实现高通量的单细胞水平转录组测序，已成为目前单细胞转录组测序的主流方法。但是由于测序仪读长的限制，这种方法要求在mRNA反转成cDNA后进行随机的打断，最终只能富集mRNA 5’或3’端的几百个碱基序列，因此无法用于mRNA可变剪接的研究，对mRNA的定量也存在一定误差。为此研究人员对测序仪和建库流程进行了进一步的改进，发展出了第三代高通量测序技术，解决了二代测序仪读长较短的问题。但由于技术的不完善，第三代高通量测序技术成本高昂，碱基错误率较高等特点也让大多数研究人员望而却步。除了测序技术的改进，最近研究人员也发现用于转座的Tn5酶本身也带有RNase H酶的结构域，即也存在可以切割RNA-DNA杂合链的潜能(Di,L.et al.RNAsequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids.Proc.Natl Acad.Sci.USA117,2886–2893,2020)。这样的特性就为开发转录组的测序文库构建方法提供了新的思路。
目前无论是基于孔板的Smart-seq2技术还是基于微流控的单细胞转录组技术，亦或是第三代高通量测序技术，都需要将细胞裂解后通过带polyT的引物进行反转录cDNA第一链后再以第一链为模板通过PCR合成第二链，最终形成双链cDNA。但RNA提取过程中RNA的损失以及PCR过程中的序列偏好性问题也极大阻碍了对转录组的定量和可变剪接的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座反应的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供所述试剂盒在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座扩增中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的方法。
本发明的再一目的在于提供所述方法在低细胞量或单细胞全长转录组测序文库构建中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种用于在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒，包括细胞固定和打孔液、重悬缓冲液I、重悬缓冲液II、反转录试剂及Tn5转座试剂；
所述细胞固定和打孔液为含35～60％甲醇与0.02～0.06％ BSA的PBS溶液；
所述重悬缓冲液I为含2～4×SSC、0.02～0.06％ BSA、0.5～2mM DTT与0.1～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液；
所述重悬缓冲液II为含0.5～2％ BSA、0.5～2mM DTT与0.1～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液。
所述BSA为牛血清白蛋白，SSC为柠檬酸钠盐缓冲液，DTT为二硫苏糖醇，PBS为磷酸盐缓冲液。
所述反转录试剂包括oligo-dT引物，反转录酶，反转录缓冲液。
所述Tn5转座试剂包括Tn5转座酶，转座缓冲液及接头序列。
本发明的核心点是在保证细胞完整性(细胞膜结构)的情况下，使反转录和Tn5转座的各种试剂可以顺利进入细胞，对细胞中的RNA进行原位的反转录并通过Tn5酶插入接头序列，实现对细胞内的cDNA进行扩增准备。目前固定剂、破膜剂在现有技术中主要用于流式细胞分析。固定剂起稳定细胞膜、保持细胞膜表面抗体与抗原结合的作用；破膜剂使流动的、完整的细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞。用流式细胞仪检测细胞内抗原及DNA时，对待测细胞进行固定、破膜处理后，加入相应抗体或检测试剂，孵育一定时间即可上机分析。然而，本发明的目的是想在细胞内进行原位反转录和转座扩增，要实现的固定和破膜的效果不同于现有用于流式细胞分析的场景。因此需要重新探究用于在细胞内进行原位反转录和转座扩增的固定剂、破膜剂等。
而本发明提供的上述试剂组合可实现在不破坏细胞结构的同时，在细胞内原位进行RNA的反转录和转座。其中，细胞固定和打孔液首先是用于细胞的固定，将细胞内的蛋白沉降，避免了细胞中蛋白等成分对反转录的影响，同时保证了细胞在整个操作过程中的形态完整；其次是用于细胞膜打孔，使反转录和转座试剂可以进入细胞内。由于核膜的脂质含量较高而避免了对核膜打孔，从而保证转座反应主要发生在细胞质内，避免细胞内的核酸分子流出细胞。本发明在细胞打孔后要采用重悬缓冲液I和II清洗细胞，从而防止细胞内RNA的降解以及过多流失。本发明在利用细胞固定和打孔液、重悬缓冲液I、重悬缓冲液II预处理细胞后，加入反转录试剂和Tn5转座试剂进行反应，能实现在保持细胞形态完整的情况下对细胞内mRNA进行原位反转录和基于Tn5酶的转座反应，具体是在完成cDNA第一链反转录之后直接进行Tn5酶的转座，实现了在细胞内使用Tn5转座酶片段化RNA-DNA杂合链的目的，进而通过简单的PCR扩增和片段筛选得到可用于转录组测序的细胞内全长转录组文库。本发明避免了传统样本RNA提取过程中的损失，可用于极低样本量的转录组文库构建。由于mRNA反转录和Tn5酶的转座接头插入均在细胞形态完整的情况下实现，因此可以结合基于微流控或多孔板技术等的单细胞分选平台，进而构建单细胞全长转录组文库。
优选地，所述细胞固定和打孔液为含38～50％甲醇与0.03～0.05％ BSA的PBS溶液；所述重悬缓冲液I为含3～4×SSC、0.03～0.05％ BSA、0.8～1.5mM DTT与0.2～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液；所述重悬缓冲液II为含0.8～1.5％ BSA、0.8～1.5mM DTT与0.2～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液。
进一步优选地，所述细胞固定和打孔液为含40％甲醇与0.04％ BSA的PBS溶液；所述重悬缓冲液I为含3×SSC、0.04％ BSA、1mM DTT与0.2U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液；所述重悬缓冲液II为含1％ BSA、1mM DTT与0.2U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液。
本发明还提供上述试剂盒在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座扩增中的应用。
本发明还提供一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的方法，包括如下步骤：
S1.细胞预处理：将待测细胞样本制备成单细胞悬液；
S2.细胞原位固定打孔：向单细胞悬液中加入上述任一所述细胞固定和打孔液进行原位固定打孔，之后除去细胞固定和打孔液，并用上述任一所述细胞清洗液I清洗细胞后再用细胞清洗液II重悬细胞；
S3.细胞原位反转录：调整细胞浓度后加入含oligo-dT引物的反转录试剂进行原位反转录反应合成cDNA第一链；
S4.Tn5酶转座：向步骤S3的反转录产物中直接加入Tn5转座酶和转座缓冲液进行转座反应，用于后续的文库构建。
本发明通过在细胞内原位进行RNA的反转录和转座，RNA经过oligo-dT引物的反转录后合成第一链，Tn5转座酶随机结合在RNA/DNA杂合链上进行切割，同时Tn5转座酶会在杂合链两端加上测序接头，随后进行延伸反应得到完整的含接头的双链DNA，最后在测序引物作用下进行之后的PCR文库扩增。
本发明上述方法能在保证细胞完整性(细胞膜结构)的情况下，使反转录酶和Tn5转座酶可以进入细胞，对细胞中的RNA进行原位的反转录并通过Tn5酶插入接头序列，实现对细胞内的cDNA进行扩增准备。此外本发明中避免了cDNA第二链合成步骤，在完成第一链反转录形成DNA-RNA杂合链后直接采用Tn5酶进行转座加接头反应，一方面缩短了实验周期，另一方面也避免了前述的PCR偏倚。本发明在mRNA反转录之后直接采用Tn5酶进行片段化和加上测序接头，从而保留了mRNA的全长信息。
优选地，步骤S1中细胞活率>90％。
优选地，步骤S2为每100万细胞，加入1mL细胞固定和打孔液。
优选地，步骤S2所述原位固定打孔为-20℃固定30min。
优选地，步骤S3为将细胞浓度调整至5×103个/μL。
优选地，步骤S3细胞原位反转录时，每管反应不多于2万细胞。
优选地，步骤S3为加入含oligo-dT的退火缓冲液后孵育，进行退火反应，退火结束后加入反转录试剂进行原位反转录反应合成cDNA第一链。
本发明还请求保护上述任一所述方法在低细胞量或单细胞全长转录组测序文库构建中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种在细胞内原位反转录和转座扩增进而实现单细胞全长转录组测序文库构建的新技术。本发明能够实现在保持细胞形态完整的情况下对细胞内mRNA进行原位反转录和基于Tn5酶的转座反应，在完成第一链反转录形成DNA-RNA杂合链后直接采用Tn5酶进行转座加接头反应，避免了cDNA第二链合成步骤，一方面缩短了实验周期，另一方面也避免了PCR过程中的序列偏好性问题。由于mRNA反转录和Tn5转座接头插入均在细胞形态完整的情况下原位实现，且在mRNA反转录之后直接采用Tn5酶进行片段化和加上测序接头，从而保留了mRNA的全长信息，避免了样本RNA提取过程中的损失，可用于极低样本量的转录组文库构建，可以结合基于微流控或多孔板技术等的单细胞分选平台，进而构建单细胞全长转录组文库。
附图说明
图1为不同细胞固定剂、破膜剂固定以及打孔细胞后的反转录效果。DL2000：DNA分子marker；cDNA：直接使用提取的细胞RNA进行反转录；0.01％甲醛：只进行0.01％甲醛的固定处理；0.05％ NP40：只进行0.05％ NP40的破膜处理；0.01％皂素：只进行0.01％皂素的破膜处理；0.01％甲醛+0.01％皂素：采用0.01％甲醛进行固定，并用0.01％皂素进行破膜；甲醇13-1，甲醇13-2：使用100％甲醇对细胞进行破膜与打孔。左右两边点样顺序一致；左边扩增小片段，右边扩增cDNA全长。
图2为不同浓度的甲醇固定细胞后对细胞完整性的影响。
图3为不同浓度的甲醇固定细胞后获得的文库测序后的reads分别比对到基因组的外显子区(exonic)，基因间区(intergenic)和内含子区(intronic)的数量。
图4为不同浓度的甲醇固定细胞后获得的文库测序后reads分别比对到基因不同区域的量。其中3UTR_Exons表示基因外显子的3’UTR区域；5UTR_Exons表示基因外显子的5’UTR区域；CDS_Exons表示基因外显子的编码区域(CDS)；Introns表示基因的内含子区；TES_down_10kb表示基因的转录终止位点下游10kb区域；TES_down_1kb表示基因的转录终止位点下游1kb区域；TES_down_5kb表示基因的转录终止位点下游5kb区域；TSS_up_10kb表示基因的转录起始位点上游10kb区域；TSS_up_1kb表示基因的转录起始位点上游1kb区域；
TSS_up_5kb表示基因的转录起始位点上游5kb区域。表明随着甲醇浓度的降低，核膜的打孔效率逐步降低，使用40％甲醇时获得的mRNA reads比例已接近对照组(met100、met80、met60、met40指固定和打孔液中分别使用100％、80％、60％和40％甲醇；SRR3192398_20M为一例普通bulk RNA-seq数据，作为对照)。
图5为镜检转座后的细胞，表明细胞结构完整性较好，核膜和细胞膜清晰呈现。
图6为使用Bioptic公司的标准S2卡夹测定的最终文库片段分布，呈单峰状态(20bp和1000bp为Marker，136bp处较弱的峰为过多测序接头污染，对最终数据影响不大)。
图7为利用本发明得到的GM12878细胞系测序文库测序结果在转录组上的覆盖度。
图8为混合人源HEK293T细胞和鼠源NIH/3T3细胞，利用本发明结合微流控平台制备的单细胞全长转录组文库，结果显示不同种细胞的RNA相互影响较小，细胞可以较好的区分开(HS指人源的HEK293T细胞(图中红色点表示)，MM指鼠源的NIH/3T3细胞(图中蓝色点表示))。说明本发明可以用来在单细胞水平区分不同的细胞类型。
图9为本发明在保持细胞完整性的情况下进行细胞内的反转录和转座反应的示意图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1细胞固定和打孔液、重悬缓冲液I、重悬缓冲液II的筛选过程
固定剂、破膜剂用于细胞内细胞因子染色前对细胞膜的处理，目前现有技术中主要用于流式细胞分析。固定剂起稳定细胞膜、保持细胞膜表面抗体与抗原结合的作用；破膜剂使流动的、完整的细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞。用流式细胞仪检测细胞内抗原及DNA时，对待测细胞进行固定、破膜处理后，加入相应抗体或检测试剂，孵育一定时间即可上机分析。然而，本发明的目的是想在细胞内进行原位反转录和转座扩增，要实现的固定和破膜的效果不同于现有用于流式细胞分析的场景。因此需要重新探究用于在细胞内进行原位反转录和转座扩增的固定剂、破膜剂等。
本发明需要重点解决以下几方面的问题：
1)为了能够适配目前通用的高通量单细胞建库试剂盒，实现高通量的单细胞水平全长转录组测序，需要保证细胞在转座之后的完整性；
2)在细胞完整的情况下进行原位的RNA反转录；
3)由于Tn5酶对DNA的切割效率远远高于对RNA-DNA hybrid的切割效率，因此为了避免Tn5切割过多的DNA，需要在对细胞进行打孔时尽量避免对细胞核膜的破坏；
4)根据以往的经验和相关文献报道，如果对细胞采用较强的固定剂进行固定，mRNA上的多聚核糖体会紧密的结合到mRNA上，从而阻碍mRNA的反转录。
基于以上几点，本发明开发的难点在于：
1)各种反应过程中的非等渗液与较弱固定效果的要求之间的矛盾(固定剂效果强反转录效果减弱；固定效果弱细胞易破裂)；
2)每步反应中的相关试剂(离子、酶等)需要进入细胞与避免细胞内的核酸分子流出细胞之间的矛盾。
因此，需要进行细胞固定液、细胞重悬缓冲液等试剂的筛选和优化。
1、关于细胞固定液的筛选：
我们最初的设计是采用低浓度甲醛做固定剂对细胞进行轻微的固定(目前固定细胞的主流方法)；为了避免过多的对核膜进行打孔，选用对细胞质膜打孔效率远高于核膜的皂素做破膜剂进行检测。经过反转录后，采用两对特异PCR引物扩增所用细胞系(GM12878)中高表达的基因CD74的cDNA(其中一对扩增cDNA中间的一段443bp片段；另一对扩增cDNA的全长，共918bp)，通过PCR的结果检测是否可以得到mRNA反转录的全长；此外，我们还测试了在不固定的情况下采用一种常用的破膜剂NP40对细胞进行破膜以及直接采用皂素进行破膜，检测标准同上；同时甲醇也是一种常见的固定剂，因此我们也测试了采用甲醇固定后细胞的反转录效果，检测标准同上。
结果如图1所示，根据电泳结果，即使采用很低浓度的甲醛固定(通常使用1％或0.1％，此次降低到0.01％)，cDNA的反转录效果也较差，即便cDNA的中间一部分片段也无法扩增出来(结合以往相关实验的经验，甲醛固定后大部分只能得到mRNA 3’端的cDNA，因此中间片段很难扩增出来)。采用0.05％ NP40、0.01％皂素以及甲醇处理后对于短片段均有较好扩增(由于细胞上样量一致，甲醇固定的条带更亮，说明扩增效果更好，间接说明反转录效果更好)；此外，对于长片段的扩增，只有甲醇处理的才能扩增出全长片段。基于此，说明对于细胞的原位全长扩增，选用甲醇进行固定和破膜效果较好。此外，对甲醇固定后的细胞形态进行鉴定，结果显示在实验结束后细胞的形态仍然保持完整：基于以上结果，甲醇处理细胞更适合我们的实验要求，因此我们选择甲醇作为最终的固定破膜剂。
目前也有研究使用甲醇固定细胞进行转录组测序，但大多采用80％甲醇进行固定。本发明要求对核膜的打孔效果较弱而对细胞质膜的打孔较强。核膜与细胞膜的差异主要在脂质含量上，细胞质膜的脂质含量低于核膜。甲醇属于脂溶性物质，因此我们猜想降低甲醇浓度就能降低对核膜的打孔效果。首先检测降低甲醇浓度后细胞的完整性：90％甲醇、80％甲醇、70％甲醇、60％甲醇，结果如图2所示，从实验结果看，当甲醇浓度降低到40％后细胞仍然较为完整，但再降低甲醇浓度后就很难回收到细胞，猜测细胞可能碎裂。
使用不同浓度的甲醇进行本发明的检测，根据本发明中实施例2、3中方法进行实验，对最终获得的文库进行测序，分析结果如图3、图4所示，从分析结果看，与猜想一致，随着甲醇浓度的降低，文库中比对到基因组外显子(exonic或CDS_Exon)区域的reads比例逐步升高，当甲醇浓度降低到40％时该比例已接近对照样本(SRR3192398_20M，为一例普通的RNA-seq文库数据)。说明：1)本发明可以在细胞原位获得与正常RNA-seq一致的结果，而不需要进行RNA的提取等步骤；2)使用40％甲醇固定细胞可以保证细胞在反应结束后仍处于完整状态，且RNA的捕获效率最高。故本发明使用低浓度的40％甲醇进行固定。
相关溶液配置：
(1)细胞固定和打孔液：
其中PBS为磷酸盐缓冲液，是一种最常用的细胞清洗液，与细胞内液等渗，可以防止细胞吸水膨胀；BSA一方面可以提供液体环境的蛋白渗透压，另一方面有助于防止细胞之间的黏连。
(2)重悬缓冲液I：
(3)重悬缓冲液II：
上述重悬缓冲液I中，3×SSC有助于维持RNA的完整性，另一方面也可防止细胞内核酸分子的渗漏；而3×SSC在后期实验中的残留会影响反转录酶活性，因此我们考虑增加一个重悬缓冲液II，尽量去除3×SSC对后续实验的影响；Recombinant RNase Inhibitor(40U/μL)主要抑制RNA的降解，在缓冲液中起主要作用；DTT的加入是为了提高抑制剂的活性；BSA主要是为了防止细胞黏连，两种缓冲液浓度不一样主要是考虑使用重悬缓冲液II重悬细胞后细胞的密度较高，因此将BSA的浓度调高到1％。上述重悬缓冲液I、II能最大发挥抑制RNA降解以及防止RNA流出细胞的作用。
实施例2人B淋巴细胞系(GM12878)转录组文库构建
1、方法
(1)取100万培养的GM12878细胞至1.5mL离心管中，4℃300rcf离心3min；
(2)用1mL冷的PBS轻柔重悬并4℃300rcf离心3min，沉淀细胞，重复两次；
(3)用1mL-20℃预冷的细胞固定和打孔液-20℃固定30min；
(4)用1mL冷的重悬缓冲液I清洗细胞两次；
(5)用50μL冷的重悬缓冲液II充分重悬细胞；
(6)取2μL细胞十倍稀释后计数，用冷的重悬缓冲液II将细胞浓度调整至5×103个/μL；
(7)取2μL细胞悬液至PCR管中，加入2μL含oligo-dT的退火缓冲液，混匀后55℃孵育5min后迅速置于冰上2min；
其中所述退火缓冲液包含1μL 100mM oligo-dT引物和1μL 10mM dNTP mix。其中oligo-dT引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN(其中V代表A、C、G任一碱基，N代表A、C、G、T任一碱基)；dNTP mix选自Invitrogen公司的dNTP mix(R0192)。
(8)加入6μL第一链反转录缓冲液(表1)，进行反转录反应；反转录条件如下表2所示：(PCR仪盖温设置为70℃)
表1第一链反转录缓冲液
其中所述Maxima H Minus reverse transcriptase选自Invitrogen公司的Maxima H Minus Reverse Transcriptase(EP0752)，Recombinant RNase Inhibitor选自TaKaRa公司的Recombinant RNase Inhibitor(2313A)。
表2反转录条件
(9)反转完成后直接进行Tn5酶转座：向反转录产物中直接加入Tn5转座酶和转座缓冲液，37℃孵育2h。
其中所述转座体系来源于Vazyme公司的TruePrep DNA Library Prep Kit V2forIllumina试剂盒(TD501-01)。
(10)转座完成后4℃300rcf离心3min，去除转座试剂后用细胞裂解液裂解细胞，用片段纯化试剂盒纯化转座片段；
其中所述细胞裂解液主要成分为蛋白酶K，选自生工生物公司的蛋白酶K溶液(20mg/ml)(B600452-0001)；片段纯化试剂盒选自Zymo Research公司的DNA Clean&ConcentratorTM-5(D4013)。
(11)加入PCR缓冲液进行PCR扩增，PCR体系如下表3所示，PCR条件如下表4所示：
表3PCR体系
其中所述Ad1 primer序列为：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC+i5index+TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTAT；Ad2 primer序列为：CAAGCAGAA GACGGCATACGAGAT+i7 index+GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG；Next High-Fidelity 2X PCR Master Mix选自NEB公司的NextHigh-Fidelity 2X PCR Master Mix(M0541L)。
表4PCR条件
(12)PCR结束后进行片段筛选与文库纯化，测定文库质量，并进行测序。
其中所述片段筛选与纯化采用Vazyme公司的VAHTS DNA Clean Beads(N411-01)进行。
2、结果：
根据上述方案进行实验，结果如图5所示，在转座之后镜检细胞完整性较好，核膜和细胞膜清晰呈现。文库片段分布如图6所示，最终得到的文库为单峰状态。如图7所示，通过测序分析发现reads在转录组上均有覆盖，即能够得到转录组的全长信息。
实施例3 HEK293T细胞系和NIH/3T3细胞系的单细胞转录组文库构建
(1)各取50万培养的HEK293T细胞和NIH/3T3细胞混合至1.5mL离心管中，4℃300rcf离心3min；
(2)用1mL冷的PBS轻柔重悬并4℃300rcf离心3min，沉淀细胞，重复两次；
(3)用1mL-20℃预冷的细胞固定和打孔液-20℃固定30min；
(4)用1mL冷的重悬缓冲液I清洗细胞两次；
(5)用50μL冷的重悬缓冲液II充分重悬细胞；
(6)取2μL细胞十倍稀释后计数，用冷的重悬缓冲液II将细胞浓度调整至5×103个/μL；
(7)取2μL细胞悬液至PCR管中(共做20管)，每管加入2μL含oligo-dT的退火缓冲液，混匀后55℃孵育5min后迅速置于冰上2min；
(8)每管加入6μL第一链反转录缓冲液，进行反转录反应(条件与实施例2相同)；
(9)反转完成后直接进行转座(条件与实施例2相同)；
(10)转座结束后将20管反应产物汇合至1.5mL离心管中，4℃300rcf离心3min弃上清；
(11)用10X Genomics公司Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits中的Diluted Nuclei Buffer清洗细胞一次后再用适量Diluted Nuclei Buffer重悬细胞，计数。取1万细胞按照试剂盒说明书进行后续包装GEM和单细胞文库构建过程，并按标准scATAC-seq文库进行测序。
2、结果
根据上述方案进行实验，在转座之后镜检细胞完整性较好，核膜和细胞膜清晰呈现。最终得到的文库为单峰状态。如图8所示，通过测序分析发现在HEK293T和NIH/3T3之间RNA的相互污染较少，可以较好的区分不同种的细胞。
综上所述，如图9所示，本发明提供了一种保持细胞完整性的情况下进行细胞内原位反转录和转座反应的方法，先通过特定浓度的甲醇固定剂固定细胞，然后在细胞内进行原位退火和逆转录及Tn5转座反应，再进行PCR扩增，构建得到全长mRNA文库。可用于极低样本量的转录组文库构建，并可以结合基于微流控或多孔板技术等的单细胞分选平台，进而构建单细胞全长转录组文库。

Claims (10)

1.一种用于在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的试剂盒，其特征在于，包括细胞固定和打孔液、重悬缓冲液I、重悬缓冲液II、反转录试剂及Tn5转座试剂；
所述细胞固定和打孔液为含35～60%甲醇与0.02～0.06% BSA的PBS溶液；
所述重悬缓冲液I为含2～4× SSC、0.02～0.06% BSA、0.5～2mM DTT与0.1～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液；
所述重悬缓冲液II为含0.5～2% BSA、0.5～2mM DTT与0.1～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述细胞固定和打孔液为含38～50%甲醇与0.03～0.05% BSA的PBS溶液；所述重悬缓冲液I为含3～4× SSC、0.03～0.05% BSA、0.8～1.5mM DTT与0.2～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液；所述重悬缓冲液II为含0.8～1.5% BSA、0.8～1.5mM DTT与0.2～0.3U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液。
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述细胞固定和打孔液为含40%甲醇与0.04% BSA的PBS溶液；所述重悬缓冲液I为含3× SSC、0.04% BSA、1mM DTT与0.2U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液；所述重悬缓冲液II为含1% BSA、1mM DTT与0.2U/μL重组RNase酶抑制剂的PBS溶液。
4.权利要求1～3任一所述试剂盒在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座扩增中的应用。
5.一种在细胞内原位进行全长mRNA反转录和转座的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.细胞预处理：将待测细胞样本制备成单细胞悬液；
S2.细胞原位固定打孔：向单细胞悬液中加入权利要求1～3任一所述细胞固定和打孔液进行原位固定打孔，之后除去细胞固定和打孔液，并用权利要求1～3任一所述重悬缓冲液I清洗细胞后再用重悬缓冲液II重悬细胞；
S3.细胞原位反转录：调整细胞浓度后加入含oligo-dT引物的反转录试剂进行原位反转录反应合成cDNA第一链；
S4.Tn5酶转座：向步骤S3的反转录产物中直接加入Tn5酶和转座缓冲液进行转座反应，用于后续的文库构建。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S1中细胞活率>90%。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S2为每100万细胞，加入1 mL细胞固定和打孔液。
8.根据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S3为将细胞浓度调整至5×103个/μL。
9.据权利要求5所述方法，其特征在于，步骤S3为加入含oligo-dT的退火缓冲液后孵育，进行退火反应，退火结束后加入反转录试剂进行原位反转录反应合成cDNA第一链。
10.权利要求5～9任一所述方法在单细胞全长转录组测序文库构建中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6197554B1 (en) * 1998-11-20 2001-03-06 Shi-Lung Lin Method for generating full-length cDNA library from single cells
CN109811045A (zh) * 2017-11-22 2019-05-28 深圳华大智造科技有限公司 高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用
WO2021202564A1 (en) * 2020-03-30 2021-10-07 King Abdullah University Of Science And Technology Compositions and methods for controlling cellular identity
CN114015755A (zh) * 2020-12-31 2022-02-08 中国科学院北京基因组研究所(国家生物信息中心) 用于标记核酸分子的方法和试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6197554B1 (en) * 1998-11-20 2001-03-06 Shi-Lung Lin Method for generating full-length cDNA library from single cells
CN109811045A (zh) * 2017-11-22 2019-05-28 深圳华大智造科技有限公司 高通量的单细胞全长转录组测序文库的构建方法及其应用
WO2021202564A1 (en) * 2020-03-30 2021-10-07 King Abdullah University Of Science And Technology Compositions and methods for controlling cellular identity
CN114015755A (zh) * 2020-12-31 2022-02-08 中国科学院北京基因组研究所(国家生物信息中心) 用于标记核酸分子的方法和试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
High-throughput sequencing of the transcriptome and chromatin accessibility in the same cell;Song Chen等;《Nature Biotechnology》;第37卷;第1452–1457页 *
Tn5 转座子及其在生物技术领域的应用;高畅等;《中国实验动物学报》;第30卷(第8期);第1087-1094页 *

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