CN112608984B - 一种用于核酸扩增的预装pcr反应试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂及其制备方法，包括PCR反应试剂，其特征在于：所述的PCR反应试剂中含有抗冻蛋白和抗冻蛋白抗体。本发明试剂能够常温保存或运输。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂及其制备方法。
背景技术
PCR反应(聚合酶链式反应)自发明以来在生物学实验中发挥重要的作用，尤其是荧光PCR(qPCR)技术在微生物检测领域发挥日益重要的作用。实时荧光定量PCR是一种能够定量监测目的基因拷贝数量的PCR技术，是在PCR体系中加入荧光染料或荧光标记物与扩增产物结合发出荧光，通过荧光信号探测器直接检测反应体系的荧光信号的变化，绘制荧光强度与PCR循环数的关系图来定量估计PCR扩增量和初始样本靶基因的核酸量。该技术具有灵敏度高，检测时间短，不易发生交叉污染等优点。
PCR反应所需组分包括DNA聚合酶，引物，探针，dNTP，模板及反应所需缓冲液系统，这些组分中DNA聚合酶，引物，探针均需低温保存，DNA聚合酶是一种蛋白质，温度过高会使其变性从而丧失生物学活性，因此PCR试剂在运输过程及使用过程均需在低温下进行。
对于RNA的检测一般是将RNA反转录为DNA后进行荧光PCR，这就需要反转录酶，反转录酶也需低温保存，与DNA聚合酶的运输条件一致。
荧光PCR检测试剂对于病原体的检测简洁方便，尤其是对多种传染性的病原体检测尤为重要，质量也会保持稳定。然而，对于偏远地区试剂盒应用，低温运输增大了经济成本，运输时间也会大大增加。
发明内容
为解决上述问题，本发明设计出一种能够在常温下运输和保存的预装PCR反应试剂。
本发明的技术方案如下：
一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂，包括PCR反应试剂，其中，所述的PCR反应试剂中含有浓度分别为0.005-0.300mg/L抗冻蛋白和抗冻蛋白抗体，之后制备成冻干粉。
在本发明中，所述的PCR反应试剂包括但不限于常规PCR反应试剂、实时定量PCR反应试剂、荧光PCR反应试剂等。试剂中通常包括dNTP、扩增缓冲液、聚合酶、Mg2+等。
优选地，所述的PCR反应试剂中含有浓度分别为0.01-0.20mg/L的抗冻蛋白和抗冻蛋白抗体。
优选地，所述的PCR反应试剂中含有浓度分别为0.01-0.15mg/L抗冻蛋白和抗冻蛋白抗体。
优选地，所述的PCR反应试剂中含有浓度分别为0.01-0.10mg/L抗冻蛋白和抗冻蛋白抗体。
抗冻蛋白(AFPs，AntiFreeze Proteins)是一种能抑制冰晶生长的蛋白质或糖蛋白质，研究发现低温导致结晶生成时，该蛋白便会活化，参入阻止晶格的形成，而一旦温度回升，或是酸碱度降低时，抗冻蛋白又会完全失去活性。本发明中还添加了抗冻蛋白抗体，进一步降低了抗冻蛋白对PCR的影响。抗冻蛋白的加入为PCR试剂在各种环境(如偏远山区，极地等)下使用提供了可能。本发明中，所使用的抗冻蛋白包括但不限于抗冻糖蛋白、抗冻蛋白Ⅰ、抗冻蛋白Ⅱ、抗冻蛋白Ⅲ、抗冻蛋白Ⅳ中的至少一种。
优选地，所述的预装PCR反应试剂还包括另外包装的、用于溶解冻干粉使其成为PCR反应液的复溶液，所述的复溶液优选DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理的超纯水。
本发明的另一目的，在于提供一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂的运输和/或保存方法，在常温条件下进行。本发明所述的常温为20-30℃。
本发明的另一目的，在于提供一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂的制备方法，包括如下步骤：
将抗冻蛋白：抗冻蛋白抗体：PCR反应试剂按照比例混合好，混合液放入冻干机中-40℃--30℃预冻3-5小时；之后，冻干机气压降到10Pa以下，-40℃--30℃真空处理2-3小时；真空状态下将冻干机内部温度升至8-12℃真空处理2-3小时；最后在真空状态下将冻干机内部温度升至25-35℃真空处理2-3小时。
分段式升温真空处理，相较于传统的固定温度冻干方法，能够显著加快冻干过程、提高样品的干燥度；在最后一段采用25-35℃干燥，使得样品高于环境温度，能够保证无法在冻干机内部压盖的样品，在冻干完成后取出来盖盖子的过程中不受环境湿度影响，延长冻干粉保存期，保证冻干的稳定性。
在本发明的优选实施例中，混合液冻干前按照20-50μL/管分装到PCR扩增管中。
在本发明的优选实施例中，冻干粉制剂用复溶液进行溶解。
在本发明的优选实施例中，复溶液为DEPC处理后的超纯水。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了一种用于核酸扩增的预装PCR反应管，减少使用操作步骤；提高试剂稳定性；实现常温保存及运输。本发明提供的PCR扩增冻干预存试剂，使核酸扩增试剂冷冻干燥后能在常温条件下运输，适用于任何一种荧光PCR扩增试剂的预处理，检测效果好：使用时仅需加入缓冲剂复溶，再加入待检测的模板，即可进行检测，且灵敏度无损失或损失很小；保护剂组分简单，成本低廉。
附图说明
图1为本发明实施例1中标准品浓度为2×104CFU/mL时ORF1ab基因扩增结果；图中，横坐标为循环数(cycles)，数值为0-45，纵坐标为荧光值(Fluorescence,ΔR),数值为0-3000；
图2为本发明实施例1中标准品浓度为2×104CFU/mL时N基因扩增结果；图中，横坐标为循环数(cycles)，数值为0-45，纵坐标为荧光值(Fluorescence,ΔR),数值为0-2500；
图3为本发明实施例1中标准品浓度为2×103CFU/mL时ORF1ab基因扩增结果；图中，横坐标为循环数(cycles)，数值为0-45，纵坐标为荧光值(Fluorescence,ΔR),数值为0-700。
图4为本发明实施例1中标准品浓度为2×103CFU/mL时N基因扩增结果。图中，横坐标为循环数(cycles)，数值为0-45，纵坐标为荧光值(Fluorescence,ΔR),数值为0-700。
具体实施方式
实施例1
冠状病毒(coronavirus，CoV)是直径为80～120nm的正链RNA病毒，是人类及许多动物的重要病原，可以引起多种急、慢性疾病。CoV种类繁多，其中感染哺乳动物的为α属(包括CoV-229E、CoV-NL63)和β属(包括CoV-OC43、CoV-HKU1、SARS-CoV、MERSCoV和SARS-CoV-2)。SARS-CoV-2是目前发现的第7种可感染人类的冠状病毒，基因组大小为29891个核苷酸，包含两端非编码区序列(untranslated regions，UTR)和一个完整的开放阅读框基因(openreading frame，ORF)，可编码960个氨基酸。
现阶段SARS-CoV-2的荧光PCR检测产品还是采用常规的1管液体反应缓冲液+1管液体酶的形式，使用操作步骤较为繁琐，而保存及运输都要在低温下进行，保存及运输成本较高。本发明包含的荧光PCR试剂冻干方法，能够很好的解决以上问题。
为了验证冻干工艺的有效性，采用以下方法进行SARS-CoV-2核酸检测试剂(荧光PCR法)的配制和冻干：以下的例子仅为验证而非限制本发明的范围。
1引物及探针设计
现行SARS-CoV-2核酸检测中，主要检测SARS-CoV-2的N基因及ORF1ab基因，因此本实验也设计这两个基因的引物及探针。另外核酸检测需设内参，本发明以RNAse P作为内参设计引物及探针。
具体序列如下
ORF1ab上游引物：
CCCTGTGGGTTTTACACTTAA SEQ ID NO：1
ORF1ab下游引物：
ACGATTGTGCATCAGCTGA SEQ ID NO：2
ORF1ab探针引物：
5'-荧光报告基团-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-荧光淬灭基团-3'(SEQ IDNO：3)
N基因上游引物：
GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT SEQ ID NO：4
N基因下游引物：
CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG SEQ ID NO：5
N基因探针引物：
5'-荧光报告基团-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-荧光淬灭基团-3'SEQ ID NO：6
RNAse P上游引物：
AGATTTGGACCTGCGAGCG SEQ ID NO：7
RNAse P下游引物：
GAGCGGCTGTCTCCACAAGT SEQ ID NO：8
RNAse P探针引物：
5’-荧光报告基团-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG–荧光淬灭基团-3’SEQ ID NO：9
2按如下比例将各组成部分混合
配方如下：
| 试剂组分 | 终浓度 |
| 10×Reaction Mix | 1X |
| BSA | 0.3mg/mL |
| 甲酰胺 | 3％ |
| DTT | 10mM |
| dATP | 150uM |
| dTTP | 150uM |
| dCTP | 150uM |
| dGTP | 150uM |
| dUTP | 150uM |
| HotStart Hi Taq DNA聚合酶 | 0.025U |
| Super-M-MLV反转录酶 | 200U |
| RNA酶抑制剂 | 100U |
| 引物 | 200nM |
| 探针 | 100nM |
| 抗冻蛋白 | 0.05mg/L |
| 抗冻蛋白抗体 | 0.05mg/L |
以上组分中试剂Super-M-MLV反转录酶购自于Promega，抗冻蛋白为抗冻蛋白IV，基因序列见登录号No.Q8JI37(Genebank)、制备参考文献Lee and Kim,Cloning,expression,and activity of type IV antifreeze protein from culturedsubtropical olive flounder(Paralichthys olivaceus)[J].Fisheries and AquaticSciences(2016)19:33，抗冻蛋白抗体购自于Antibodies-online.com，其余试剂均购自于Thermo。将上述混合液按照50μL/管分装到0.2mLPCR扩增管或者八联管中。
将上述混合液按照50μL/管分装到0.2mL PCR扩增管或者八联管中。
将分装好的试剂放入冻干机中-35℃预冻4小时；冻干机气压降到10Pa以下-35℃真空处理2-3小时；真空状态下将冻干机内部温度升至10℃真空处理2小时；真空状态下将冻干机内部温度升至30℃真空处理3小时。
分段式升温真空处理，相较于传统的固定温度冻干方法，能够显著加快冻干过程、提高样品的干燥度；在最后一段采用30℃干燥，使得样品高于环境温度，能够保证无法在冻干机内部压盖的样品，在冻干完成后取出来盖盖子的过程中不受环境湿度影响，延长冻干粉保存期，保证冻干的稳定性。
冻干完毕后，盖上扩增管或者八联管盖，制备好的荧光PCR冻干粉试剂常温避光保存。
将上述干粉制剂用DEPC处理后的超纯水溶解后进行检测。
采用不同浓度阳性质控品对冻干试剂进行验证，同时做一组液体试剂作为对照试剂。
扩增反应条件如下
结果分析
检测CT值分别为
实施例2
以上述实施例1中的PCR冻干粉为对照组，未冻干的PCR试剂为实验组，将两组分别在室温保存48小时后进行QPCR检测，检测方法如实施例1。
结果显示
实施例3
将冻干的PCR制剂分别置于70℃，0℃及-20℃分别模拟在高温，低温及极低温度下的稳定性，每个温度下放置3h，进行QPCR检测，检测方法如实施例1。
结果显示
实施例4
将加有抗冻蛋白对照组和不加抗冻蛋白的PCR制剂同时冻干，分别设为对照组和实验组，进行QPCR检测，检测方法如实施例1。
结果
实施例5
将冻干的PCR试剂与现有商品化一步法qPCR试剂盒(购于Qiagen)同时在室温下放置2周，分别设为对照组和实验组，进行QPCR检测，检测方法分别如实施例1及试剂盒说明书。
结果
序列表
<110> 厦门大学
<120> 一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂及其制备方法
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccctgtgggt tttacactta a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgattgtgc atcagctga 19
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgctgctgc ttgacagatt 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agatttggac ctgcgagcg 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagcggctgt ctccacaagt 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttctgacctg aaggctctgc gcg 23
Claims (10)
1.一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂，其特征在于：所述的PCR反应试剂中含有浓度分别为0.005-0.300mg/L抗冻蛋白和抗冻蛋白抗体，之后制备成冻干粉。
2.根据权利要求1所述的一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂，其特征在于：所述的PCR反应试剂中含有浓度分别为0.01-0.20mg/L抗冻蛋白和抗冻蛋白抗体。
3.根据权利要求1所述的一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂，其特征在于：所述的PCR反应试剂中含有浓度分别为0.01-0.15mg/L抗冻蛋白和抗冻蛋白抗体。
4.根据权利要求1所述的一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂，其特征在于：所述的PCR反应试剂中含有浓度分别为0.01-0.10mg/L抗冻蛋白和抗冻蛋白抗体。
5.根据权利要求1所述的一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂，其特征在于：还包括另外包装的、用于溶解冻干粉使其成为PCR反应液的复溶液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂的运输和/或保存方法，其特征在于，在常温条件下进行。
7.根据权利要求1-5任一项所述的一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂的制备方法，包括如下步骤：
将抗冻蛋白：抗冻蛋白抗体：PCR反应试剂按照比例混合好，混合液放入冻干机中-40℃- -30℃预冻3-5小时；之后，冻干机气压降到10Pa以下，-40℃- -30℃真空处理2-3小时；真空状态下将冻干机内部温度升至8-12℃真空处理2-3小时；最后在真空状态下将冻干机内部温度升至25-35℃真空处理2-3小时。
8.根据权利要求7所述的一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂的制备方法，其特征在于：混合液冻干前按照20-50μL/管分装到PCR扩增管中。
9.根据权利要求1-5任一项所述的一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂的使用方法，其特征在于：冻干粉制剂用复溶液进行溶解。
10.根据权利要求9所述的一种用于核酸扩增的预装PCR反应试剂的使用方法，其特征在于：复溶液为DEPC处理后的超纯水。
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