CN107460248B - 一种检测动物源成分的引物组合及应用、检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测动物源成分的引物组合及应用、检测试剂盒，属于生物学检验检疫领域。本发明提供的动物源成分检测的引物组合针对性强、特异性高以及比较好的灵敏度；将上述检测动物源成分的引物组合在检测注射用骨肽中的动物源成分，检测结果更为准确可靠，可以实现对成品质量的有效控制；上述引物组合应用于制备检测动物源成分的检测试剂盒，更利于方便快捷的检测注射用骨肽原料的动物源成分，将更有利于试剂盒的应用推广，具有较高的试剂应用价值和推广价值。

Description

一种检测动物源成分的引物组合及应用、检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物生物学检验检疫领域，具体而言，涉及一种检测动物源成分的引物组合及应用、检测试剂盒。

背景技术

骨肽在临床上的应用非常广泛，具有较好的疗效。研究表明，骨肽中含有多种促进骨代谢的活性肽类及钙、磷、铁等无机元素，具有调节骨代谢、刺激成骨细胞增殖、促进新骨形成、以及调节钙磷代谢作用；具有明显增强骨钙代谢沉积，防止骨质疏松的作用；具有明显的抗炎、镇痛的作用，在骨组织的修复和形成过程中起着重要的调控作用。包括骨形成发生蛋白(BMP)、转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮细胞生长因子(EGF)等，其中BMP是已知效用最强的骨生长因子。

到达作用靶位，产生药理作用或诱导基因表达内源性骨生长因子产生药理作用。该药品用药方便，疗效肯定，是各类骨科病人期用药的理想选择。

但是，骨肽中动物源成分的基因水平检测，目前还少有报道，需要有针对性的检测手段。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种检测动物源成分的引物组合，该引物组合能快速方便的检测注射用骨肽中的动物源成分，方便进行质量控制，避免产品被污染。

本发明的第二目的在于提供上述的检测动物源成分的引物组合在检测骨肽注射液动物源成分中的应用。

本发明的第三目的在于提供上述检测动物源成分的引物组合在制备骨肽注射液动物源成分检测试剂盒中的应用。

本发明的第四目的在于提一种检测动物源成分的检测试剂盒，通过该试剂盒可以方便于检测，便于在质量控制。

本发明的第五目的在于提上述检测试剂盒在检测注射用骨肽动物源成分中的应用。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

一种检测动物源成分的引物组合，引物组合包括检测猪源成分的第1引物对、检测马源成分的第2引物对、检测牛源成分的第3引物对和检测羊源成分的第4引物对中的至少一种；第1-4引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-8所示。

上述的检测动物源成分的引物组合在检测骨肽注射液动物源成分中的应用。

上述检测动物源成分的引物组合在制备骨肽注射液动物源成分检测试剂盒中的应用。

一种检测动物源成分的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的检测动物源成分的引物组合。

上述的检测试剂盒在检测病毒中的应用。

本发明的有益效果为：本发明提供的动物源成分检测的引物组合针对性强、特异性高以及比较好的灵敏度；将上述检测动物源成分的引物组合在检测注射用骨肽中的动物源成分，检测结果更为准确可靠，可以实现对成品质量的有效控制；上述引物组合应用于制备检测动物源成分的检测试剂盒，能更利于方便快捷的检测注射用个骨肽的动物源成分，将更有利于试剂盒的应用推广，具有较高的试剂应用价值和推广价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例2提供的检测猪源成分的引物的熔解曲线图；

图2为本发明实验例2提供的检测马源成分的引物的熔解曲线图；

图3为本发明实验例2提供的检测牛源成分的引物的熔解曲线图；

图4为本发明实验例2提供的检测羊源成分的引物的熔解曲线图；

图5为本发明实验例2提供的猪源成分检测引物标准曲线图；

图6为本发明实验例2提供的马源成分检测引物标准曲线图；

图7为本发明实验例2提供的牛源成分检测引物标准曲线图；

图8为本发明实验例2提供的羊源成分检测引物标准曲线图；

图9为本发明实验例2提供的猪源成分检测引物的扩增曲线图；

图10为本发明实验例2提供的马源成分检测引物的扩增曲线图；

图11为本发明实验例2提供的牛源成分检测引物的扩增曲线图；

图12为本发明实验例2提供的羊源成分检测引物的扩增曲线图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种动物源成分检测的引物组合及应用、试剂盒进行具体说明。

一种检测动物源成分的引物组合，引物组合包括检测猪源成分的第1引物对、检测马源成分的第2引物对、检测牛源成分的第3引物对和检测羊源成分的第4引物对中的至少一种；第1-4引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-8所示。

上述的检测动物源成分的引物组合在检测骨肽注射液动物源成分中的应用。

骨肽注射液的生产，多选用猪、牛等家畜的四肢骨的提取物骨肽粉制成；在制备的过程中，有可能混入其他的动物源成分，使产品更为复杂，对质量控制和监督造成不必要的麻烦；因此，需要对成品进行最后的检测，进行质检。需要鉴定产品中，是否含有其他成分，而常见的，多为猪、牛、羊和马等，所以选择检测产品是否含有猪、牛、羊和马等动物源成分，是有必要的，也是合理的。

进一步地，上述的应用，包括以待检样本为模板进行PCR反应；第1-4引物对的退火温度为56-65℃。

选择56-65℃的退火温度，能扩增出较好的目的条带，避免扩增出非特异的条带干扰实验结果，将微量的模板放大，利于检测。

上检测动物源成分的引物组合在制备骨肽注射液动物源成分检测试剂盒中的应用。

一种检测动物源成分的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的检测动物源成分的引物组合。

进一步地，还包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、2×Super RealPreMix、荧光试剂、目的片段标准品和Mg²⁺中的至少一种。

试剂盒中，包括进行普通PCR的试剂，可以对样本的温州病毒进行先期的定性分析；同时，试剂盒中还包括进行荧光定量PCR的试剂，选用荧光定量PCR的试剂可以对注射用骨肽样本动物源成分的定量分析；另外，试剂盒中还包括目的片段标准品，可在检测待检样本的时候，作为阳性对照。

进一步地，荧光试剂包括SYBR Green I或者SYBR GreenⅡ。

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR GreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

SYBR Green II染料是一种高敏感的核酸染色试剂，可以对RNA或者是单链的DNA进行染色。

进一步地，检测试剂盒，还包括DNA提取试剂。

进一步地，DNA提取试剂包括PBS溶液、DNA洗脱液和RNaseA中的至少一种。

上述的检测试剂盒在检测病毒中的应用。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种检测动物源成分的引物组合，该引物组合包括检测猪源成分的第1引物对；第1引物对的碱基序列分别如SEQ IDNo.1-2所示。

实施例2

本实施例提供一种检测动物源成分的引物组合，该引物组合包括检测猪源成分的第1引物对、检测马源成分的第2引物对、检测牛源成分的第3引物对和检测羊源成分的第4引物对中的至少一种；第1-4引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-8所示。

实施例3

本实施例提供一种检测动物源成分的检测试剂盒，该检测试剂盒包括实施例1提供的检测动物源成分的引物组合。

实施例4

本实施例提供一种检测动物源成分的检测试剂盒，该检测试剂盒包括实施例2提供的检测动物源成分的引物组合。

实施例5

本实施例提供本实施例提供检测动物源成分的检测试剂盒，该检测试剂盒包括实施例1提供的检测动物源成分的引物组合。

当然，本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂，包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs、2×Super Real PreMix、2×SYBR Green I和Mg²⁺中的至少一种。

实施例6

本实施例提供本实施例提供检测动物源成分的检测试剂盒，该检测试剂盒包括实施例2提供的检测动物源成分的引物组合。

当然，本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂，包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs、2×Super Real PreMix、2×SYBR Green II和Mg²⁺中的至少一种。

实施例7

本实施例提供本实施例提供检测动物源成分的检测试剂盒，该检测试剂盒包括实施例2提供的检测动物源成分的引物组合。

当然，本试剂盒还包括可以直接进行PCR反应的试剂，包括PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTPs、2×Super Real PreMix、2×SYBR Green II和Mg²⁺中的至少一种。

另外，本试剂盒还包括包括DNA提取试剂，DNA提取试剂包括PBS溶液、洗脱液和RNaseA中的至少一种。

实验例1

本实验例对实施例7提供的检测动物源成分的检测试剂盒的引物组合的最佳引物浓度、退火温度以及阳性标准品的制备。

阳性标准品的制备，具体步骤如下：

根据NCBI数据库的提供的数据，分别选择猪、马、牛和羊参考长片段保守序列；通过克隆的方法，分别将猪、马、牛和羊参考长片段保守序列连接到pUC57载体上；并进行检测。

通过实验，发现检测结果呈阳性；所以猪、马、牛和羊参考长片段保守序列成功克隆到pUC57载体；得到阳性标准品。

引物浓度和退火温度的优化，具体方法如下：

将获得的猪、马、牛和羊的阳性标准品分别稀释到浓度为1.0×10⁵copies/μL，并且分别作为模板。将试剂盒中猪、马、牛和羊动物源成分检测的引物组合稀释到10μmol/L的浓度；用20μL的反应体系，检测动物源成分的引物组合均设置5个实验组，依次为实验组1到实验组5，实验组1到实验组5添加的引物体积为0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL和1.0μL；在加入10μL的2×Taq Mix，阳性标准品0.5μL；然后用ddH₂O补足到20μL。进行PCR反应。

试剂盒中猪、马、牛和羊动物源成分检测的引物组合的最佳浓度均为20μL反应体系中，使用10μmol/L的引物0.6μL即可。

将获得的猪、马、牛和羊的阳性标准品分别稀释到浓度为1.0×10⁵copies/μL，并且分别作为模板。将试剂盒中猪、马、牛和羊动物源成分检测的引物组合稀释到10μmol/L的浓度；用20μL的反应体系，检测动物源成分检测的引物组合均设置10个实验组，分别为第一组到第十组；第一组到第十组的退火温度依次设置为56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃。分别进行PCR反应。

检测猪源成分的第1引物对、检测马源成分的第2引物对、检测牛源成分的第3引物对和检测羊源成分的第4引物对最佳退火温度均为63.5℃。

实验例2

本实验例对实施例7提供的检测动物源成分的检测试剂盒的引物组合的特异性和灵敏度检测以及标准曲线的建立。

特异性实验

以获得的猪、马、牛和羊的阳性标准品为模板，模板浓度为1×10⁵copies/μL，以SYBR GreenⅠ进行荧光定量PCR。反应总体系20μL：DNA聚合酶1μL、dNTPs2μL、PCR反应缓冲液10μL、ROXReference DyeⅡ0.5μL、上下游引物各0.6μL，模板2μL，Nuclease-FreeWater补足至20μL。反应程序：95℃反应15s，在60℃-95℃范围内观测荧光信号20min，95℃反应15s。得到各反应的熔解曲线图。

将获得的猪、马、牛和羊的阳性标准品经10倍梯度浓度稀释，依次稀释至1.0×10⁸copies/μL-1.0×10copies/μL，共8个浓度，并且分别作为模板。反应总体系20μL：SYBRPremix Ex TaqⅡ10μL、ROXReference DyeⅡ0.5μL、上下游引物各0.6μL，模板2μL，Nuclease-FreeWater补足至20μL。采用两步法进行荧光定量PCR反应；反应条件为:95℃预变性2min；95℃变性15s；63.5℃退火1min，扩增40个循环。

将获得的猪、马、牛和羊的阳性标准品经10倍梯度浓度稀释，依次稀释至1.0×10⁸copies/μL-1.0×10²copies/μL，共7个浓度，并且分别作为模板。反应总体系20μL：SYBRPremix Ex TaqⅡ10μL、ROXReference DyeⅡ0.5μL、上下游引物各0.6μL，模板2μL，Nuclease-FreeWater补足至20μL。采用两步法进行荧光定量PCR反应；反应条件为:95℃预变性2min；95℃变性15s；63.5℃退火1min，扩增40个循环。

如图1-4所示，检测骨肽动物源成分用的猪、马、牛和羊的引物扩增出现单一熔解峰，说明实施例7提供的试剂盒中的引物组合具有较好的特异性。

反应结束后，得到猪、马、牛和羊动物源成分检测的引物组合各自的Ct值，以Ct值为纵坐标，以起始模板浓度的对数为横坐标，建立标准曲线。

结果如图5所示，检测猪源成分的检测引物的标准曲线方程为：y＝-4.1449x+40.098，R²＝0.9947。

结果如图6所示，检测马源成分的检测引物的标准曲线方程为：y＝-3.4321x+35.776，R²＝0.9944。

结果如图7所示，检测牛源成分的检测引物的标准曲线方程为：y＝-3.7071x+37.687，R²＝0.9883。

结果如图8所示，检测羊源成分的检测引物的标准曲线方程为：y＝-4.2997x+37.557，R²＝0.9928。

如图9-12所示，可以看出，猪、马和牛的检测引物在浓度低至1.0×10²copies/μL，依然能检测到并得到扩增曲线；而检测羊的检测引物在1.0×10³copies/μL能够检测到并得到扩增曲线；可以看出，实施例7提供的试剂盒中的引物组合具有较高的灵敏度。

实验例3

本实验例对实施例6提供的检测动物源成分的检测试剂盒的应用。将该试剂盒应用于生产的骨肽注射液的动物源成分的检测。

样本选自黑龙江珍宝岛药业股份有限公司生产的三个批次骨肽注射液，三批次的骨肽注射液产品批号分别为：A01160628、A01160629和A01160630。

骨肽注射液产品中基因组DNA的提取(参考OMEGA公司的DNA提取试剂盒(TissueDNAkit 200))。

1.1注射用骨肽样本500mg加入到200μL的PBS溶液中溶解，转移到1.5mL的RNase-free的离心管中，得到样本溶液；

1.2向步骤1.1中获得的样本溶液中加入350μLRLT溶液，剧烈震荡，10000rpm离心2min，取上清至另外一个1.5mL的RNase-free的离心管中；

1.3加入250μL的OB溶液，混匀，于65℃孵育5min；

1.4加入5μLRNaseA(25mg/mL)，室温孵育25min；

1.5加入220μL的BLBuffer，混匀，70℃孵育10min；

1.6加入220μL的无水乙醇，蜗旋15s混匀；

1.7将液体转移吸附柱，吸附柱放置于2ml的离心管内，8000g离心1min，弃废液；

1.8加入500μL的HBBuffer到吸附柱中，8000g离心1min，弃废液；

1.9在吸附柱加入700μLDNA洗脱液，8000g离心1min弃废液，并重复本步骤一次；

1.10在吸附柱中加入80的Elution Buffer，室温静置3min，1000g离心2min，得到样本基因组DNA。

荧光定量PCR

利用实验例2提供的反应体系及反应程序，进行检测。根据反应结果的Ct值，并通过标准曲线计算，检测结果为阴性；未检测出猪、马、牛和羊动物源成分。因此，产品中不含猪、马、牛和羊的DNA成分。

由于注射用骨肽中制备工艺条件较为剧烈，经过了高温、超滤等多步骤纯化，最终产品中已不含有可以检出的DNA成份，因此采用荧光定量PCR方法无法对注射用骨肽的物种来源进行确定。因此考虑采用注射用骨肽生产过程中的粗提物，在DNA未被完全破坏的条件下检测。选取样本对应产品批号黑龙江珍宝岛药业股份有限公司生产的骨肽注射液的粗提物，对应产品批号为：18161001、18161101、18161102。

DNA提取方法参考前述骨肽注射液产品中基因组DNA的提取。然后用提取的样本基因组DNA进行荧光定量PCR反应。结果如表1-表3所示。

表1骨肽一次提取液各物种基因测定结果(CT)

注.“——”表示未扩增出

表2骨肽一次提取液猪基因定量测定结果

表3骨肽一次提取液各物种基因测定结果判定

从表1到表3的结果可以看出，以骨肽注射液生产过程中的粗提物为检测样品，可以采用荧光定量PCR方法能够对猪、牛、马、羊基因进行定量测定。一次提取液样品已充分分散均匀，因此可以作为注射用骨肽生产过程能够中原料物种来源的有效控制方法。

采用三批一次提取液对样品采用荧光定量PCR方法对猪、牛、马、羊基因进行定量测定研究，结果三批样品猪基因均能定量检出，而牛、马、羊基因检测均为阴性，结果表明三批原料均为猪源性，不含牛、马、羊源性成份；因此可以得出，在进行注射用骨肽质量控制的过程中，需要在生产过程中的样品一次提取液进行动物源成分的检测。

综上所述，本发明实施例提供的检测猪、马、牛和羊动物源成分检测的引物组合具有较好的特异性和较高的灵敏度，使用该引物组合应用于骨肽注射液粗提物的检测，具有较好的检测特异性，以及应用于制备检测上述病毒的试剂盒，都具有较好的特异性和较高的灵敏度；检测试剂盒方便提取样品粗提物的核酸并进行鉴定，具有较高的实用性和较高的推广应用价值。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司

<120> 一种检测动物源成分的引物组合及应用、试剂盒

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caaactactc atacccagca agc 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cctttttggt tgtgaatagc 20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acaacgaagc ataatattcc ggcctct 27

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagttggccg ataattacgt atgggt 26

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gccatatact ctccttggtg aca 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtaggcttgg gaatagtacg a 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cctaggcatt tgcttaattt ta 22

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgctgtggc tattgtc 17

Claims (10)

1.一种检测动物源成分的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括检测猪源成分的第1引物对、检测马源成分的第2引物对、检测牛源成分的第3引物对和检测羊源成分的第4引物对中的至少一种；所述第1-4引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-8所示。

2.如权利要求1所述的检测动物源成分的引物组合在检测骨肽注射液动物源成分中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以待检样本为模板进行PCR反应；所述第1-4引物对的退火温度为56-65℃。

4.如权利要求1所述检测动物源成分的引物组合在制备骨肽注射液动物源成分检测试剂盒中的应用。

5.一种检测动物源成分的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括如权利要求1所述的检测动物源成分的引物组合。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、2×Super Real PreMix、荧光试剂、目的片段标准品和Mg²⁺中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光试剂包括SYBR GreenI或者SYBR GreenⅡ。

8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂。

9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂包括PBS溶液、DNA洗脱液和RNaseA中的至少一种。

10.如权利要求5-9任一项所述的检测试剂盒在检测注射用骨肽动物源成分中的应用。

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