CN108676896A

CN108676896A - 小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂、检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN108676896A
Application number: CN201810544512.2A
Authority: CN
Inventors: 方同华; 许照芹; 代喜国
Original assignee: HAERBIN ZHENBAO PHARMACEUTICAL CO Ltd; HEILONGJIANG ZBD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HAERBIN ZHENBAO PHARMACEUTICAL CO Ltd; HEILONGJIANG ZBD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2018-10-19

Abstract

本发明提供了小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂、检测试剂盒及检测方法与应用，属于生物学检验检疫领域。本发明提供的小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂针对性强、特异性高以及比较好的灵敏度；将上述检测动物源成分的检测试剂在小牛血去蛋白提取物中的动物源成分，检测结果更为准确可靠，可以实现对产品的有效控制；将小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂用于检测试剂盒，能更利于方便快捷且准确可靠的检测动物源成分，具有较高的试剂应用价值和推广价值。

Description

小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂、检测试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物学检验检疫领域，具体而言，涉及小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂、检测试剂盒及应用。

背景技术

小牛血去蛋白提取物是一种生物制剂，它为新鲜小牛血或血清经去蛋白、浓缩、超滤或透析等工艺制得的含有无机物及小分子有机物的无菌溶液。用于脑血管疾病、脑缺血发作、脑外伤及大脑器质性疾病后遗症。也可用于早期阿尔茨海默病等。

小牛血去蛋白提取物在上市前，需要经过一系列的安全检测，其中对提取物中的动物源成分的检测是一项重要的检测项目。

目前的检测，存在检测精度不够，存在误检的问题，需要提高检测的精度和准确性。

发明内容

本发明的第一目的在于提供小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂，利用该检测试剂，方便对小牛血去蛋白提取物中动物源成分的检测。

本发明的第二目的在于提供上述的小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂在动物源成分检测中的应用。

本发明的第三目的在于提供上述的小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂在制备小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂盒中的应用。

本发明的第四目的在于提供小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂盒，试剂盒集成检测试剂，方便对小牛血去蛋白提取物动物源成分进行检测。

本发明的第五目的在于提供上述的检测动物源成分的检测试剂盒在检测小牛血去蛋白提取物动物源成分中的应用。

为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：

小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂，检测试剂包括动物源成分的检测引物组合及反应试剂；检测引物组合包括检测猪源成分的第1引物对、检测马源成分的第2引物对、检测牛源成分的第3引物对和检测羊源成分的第4引物对中的至少一种；第1-4引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-8所示；反应试剂包括猪、牛、羊和马的阳性标准品、氨苄青霉素和酵母提取物。

上述的小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂在动物源成分检测中的应用。

上述的小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂在制备小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂盒中的应用。

小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂。

本发明的有益效果为：本发明提供的小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂针对性强、特异性高以及比较好的灵敏度；将上述检测动物源成分的检测试剂在小牛血去蛋白提取物中的动物源成分，检测结果更为准确可靠，可以实现对产品的有效控制；将小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂用于检测试剂盒，能更利于方便快捷且准确可靠的检测动物源成分，具有较高的试剂应用价值和推广价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实验例1提供的检测猪阳性标准品电泳结果图；

图2为本发明实验例1提供的检测马阳性标准品电泳结果图；

图3为本发明实验例1提供的检测牛阳性标准品电泳结果图；

图4为本发明实验例1提供的检测羊阳性标准品电泳结果图；

图5为本发明实验例2提供的猪源成分溶解曲线图；

图6为本发明实验例2提供的马源成分溶解曲线图；

图7为本发明实验例2提供的牛源成分溶解曲线图；

图8为本发明实验例2提供的羊源成分溶解曲线图；

图9为本发明实验例2提供的猪源成分标准曲线图；

图10为本发明实验例2提供的马源成分标准曲线图；

图11为本发明实验例2提供的牛源成分标准曲线图；

图12为本发明实验例2提供的羊源成分标准曲线图；

图13为本发明实验例2提供的猪源成分敏感性实验结果图；

图14为本发明实验例2提供的马源成分敏感性实验结果图；

图15为本发明实验例2提供的牛源成分敏感性实验结果图；

图16为本发明实验例2提供的羊源成分敏感性实验结果图；

图17为本发明实验例3提供的产品检测结果图；

图18为本发明实验例3提供的产品扩增曲线图；

图19为本发明实验例3提供的产品的溶解曲线图；

图20为本发明实验例3提供的产品粗提物的电泳结果图；

图21为本发明实验例3提供的产品粗提物的溶解曲线图；

图22为本发明实验例3提供的产品粗提物的扩增曲线图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂、检测试剂盒及应用进行具体说明。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，还包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、2×Super Real PreMix、荧光试剂和Mg2+中的至少一种。

在试剂盒中，集成检测引物及相关配套的化学试剂，方便对小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测；同时，通过试剂盒提供相应的检测试剂，能提高检测的稳定、可靠性和精确度。

上述检测动物源成分的引物组合在制备小牛血去蛋白提取物注射液动物源成分检测试剂盒中的应用。

一种检测动物源成分的检测试剂盒，检测试剂盒包括上述的检测动物源成分的引物组合。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，还包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、2×Super Real PreMix、荧光试剂、目的片段标准品和Mg²⁺中的至少一种。

试剂盒中，包括进行普通PCR的试剂，可以对样本进行先期的定性分析；同时，试剂盒中还包括进行荧光定量PCR的试剂，选用荧光定量PCR的试剂可以对注射用小牛血去蛋白提取物样本动物源成分的定量分析；另外，试剂盒中还包括目的片段标准品，可在检测待检样本的时候，作为阳性对照。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，荧光试剂包括SYBR Green I或者SYBRGreen Ⅱ。

SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

SYBR Green II染料是一种高敏感的核酸染色试剂，可以对RNA或者是单链的DNA进行染色。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，检测试剂盒，还包括DNA提取试剂。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，DNA提取试剂包括PBS溶液、DNA洗脱液和RNaseA中的至少一种。

上述的检测动物源成分的检测试剂盒在检测小牛血去蛋白提取物动物源成分中的应用。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，包括以下步骤：

以动物源成分阳性标准品进行荧光定量PCR处理，得到阳性标准品Ct值及浓度数据，建立标准曲线；

取待检样本，提取基因组DNA，并进行荧光定量PCR试验，根据标准曲线计算得到待检样本Ct值；

当待检样本Ct值<30时，待检样本含有动物源成分。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂，检测试剂包括动物源成分的检测引物组合及反应试剂；所述检测引物组合包括检测猪源成分的第1引物对、检测马源成分的第2引物对、检测牛源成分的第3引物对和检测羊源成分的第4引物对中的至少一种；所述第1-4引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-8所示；所述反应试剂包括猪、牛、羊和马的阳性标准品、氨苄青霉素和酵母提取物。

上述小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂，针对小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测，因此可以将该检测试剂应用到检测试剂在动物源成分检测中。

同时，还可以将小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂应用于制备小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂盒。

实施例2

本实施例提供小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂盒，该检测试剂盒包括动物源成分的检测引物组合及反应试剂；检测引物组合包括检测猪源成分的第1引物对、检测马源成分的第2引物对、检测牛源成分的第3引物对和检测羊源成分的第4引物对中的至少一种；第1-4引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-8所示；反应试剂包括猪、牛、羊和马的阳性标准品、氨苄青霉素和酵母提取物。

实施例3

当然上述检测试剂盒还可以包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、2×Super Real PreMix、荧光试剂和Mg2+中的至少一种。

荧光试剂包括SYBR Green I或者SYBR Green Ⅱ。

还包括DNA提取试剂，DNA提取试剂包括PBS溶液、DNA洗脱液和RNase A中的至少一种。

因此可以将上述小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂盒应用于小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测中。

实验例1

本实验例对实施例3提供的检测动物源成分的检测试剂盒的引物组合的最佳引物浓度、退火温度以及阳性标准品的制备。

阳性标准品的制备，具体步骤如下：

根据NCBI数据库的提供的数据，分别选择猪、马、牛和羊参考长片段保守序列；通过克隆的方法，分别将猪、马、牛和羊参考长片段保守序列连接到pUC57载体上；并进行检测。

结果如图1-4所示，图中泳道1表猪标准品，泳道2用NdeI和HindIII酶切，M表示DNAMarker；图2、3和4与图1类似，通过实验，发现检测结果呈阳性；所以猪、马、牛和羊参考长片段保守序列成功克隆到pUC57载体；分别得到猪、马、牛和羊的阳性标准品。得到扩增产物条大小与预期目的片段大小相符。猪的阳性质粒的浓度143.7ng/μL,大小为2986bp，马的阳性质粒的浓度114ng/μL，大小为2842bp，牛的阳性质粒的浓度76ng/μL，大小为2989bp，羊的阳性质粒的浓度155ng/μL，大小为2992bp，拷贝数(Copies)＝(amount×6.022×10²³)/(DNAlength×10⁹×660)，经计算，调整重组阳性标准质粒的DNA分子数。

引物浓度和退火温度的优化，具体方法如下：

将获得的猪、马、牛和羊的阳性标准品分别稀释到浓度为1.0×10⁵copies/μL，并且分别作为模板。将试剂盒中猪、马、牛和羊动物源成分检测的引物组合稀释到10μmol/L的浓度；用20μL的反应体系，检测动物源成分的引物组合均设置5个实验组，依次为实验组1到实验组5，实验组1到实验组5添加的引物体积为0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL和1.0μL；在加入10μL的2×Taq Mix，阳性标准品0.5μL；然后用ddH₂O补足到20μL。进行PCR反应。

试剂盒中猪、马、牛和羊动物源成分检测的引物组合的最佳浓度均为20μL反应体系中，使用10μmol/L的引物0.6μL即可。

将获得的猪、马、牛和羊的阳性标准品分别稀释到浓度为1.0×10⁵copies/μL，并且分别作为模板。将试剂盒中猪、马、牛和羊动物源成分检测的引物组合稀释到10μmol/L的浓度；用20μL的反应体系，检测动物源成分检测的引物组合均设置10个实验组，分别为第一组到第十组；第一组到第十组的退火温度依次设置为56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃。分别进行PCR反应。

检测猪源成分的第1引物对、检测马源成分的第2引物对、检测牛源成分的第3引物对和检测羊源成分的第4引物对最佳退火温度均为63.5℃。

实验例2

本实验例对实施例3提供的检测动物源成分的检测试剂盒的灵敏度检测以及标准曲线的建立。

特异性实验

以获得的猪、马、牛和羊的阳性标准品为模板，模板浓度为1×10⁵copies/μL，以SYBR Green Ⅰ进行荧光定量PCR。反应总体系20μL：DNA聚合酶1μL、dNTPs2μL、PCR反应缓冲液10μL、ROX Reference Dye Ⅱ0.5μL、上下游引物各0.6μL，模板2μL，Nuclease-FreeWater补足至20μL。反应程序：95℃反应15s，在60℃-95℃范围内观测荧光信号20min，95℃反应15s。得到各反应的熔解曲线图。

将获得的猪、马、牛和羊的阳性标准品经10倍梯度浓度稀释，依次稀释至1.0×10⁸copies/μL-1.0×10²copies/μL，共7个浓度梯度，并且分别作为模板。反应总体系20μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.5μL、上下游引物各0.6μL，模板2μL，Nuclease-Free Water补足至20μL。采用两步法进行荧光定量PCR反应；反应条件为:95℃预变性2min；95℃变性15s；63.5℃退火1min，扩增40个循环。

如图5-8所示，检测动物源成分的检测试剂盒用的猪、马、牛和羊的引物扩增出现单一熔解峰，说明实施例3提供的试剂盒中的引物组合具有较好的特异性。

反应结束后，得到猪、马、牛和羊动物源成分检测的引物组合各自的Ct值，以Ct值为纵坐标，以起始模板浓度的对数为横坐标，建立标准曲线。从实验数据和图5-8所示的结果可以看出，Ct值<30的时候，可以认定为样本中含有相应的动物源成分，即样本检测结果呈阳性。

结果如图9所示，检测猪源成分的检测引物的标准曲线方程为：y＝-4.1449x+40.098，R²＝0.9947。

结果如图10所示，检测马源成分的检测引物的标准曲线方程为：y＝-3.4321x+35.776，R²＝0.9944。

结果如图11所示，检测牛源成分的检测引物的标准曲线方程为：y＝-3.7071x+37.687，R²＝0.9883。

结果如图12所示，检测羊源成分的检测引物的标准曲线方程为：y＝-4.2997x+37.557，R²＝0.9928。

如图13-16所示，可以看出，猪、马和牛的检测引物在浓度低至1.0×10²copies/μL，依然能检测到并得到扩增曲线；而检测羊的检测引物在1.0×10³copies/μL能够检测到并得到扩增曲线；可以看出，实施例3提供的试剂盒中的引物组合具有较高的灵敏度。

实验例3

本实验例对实施例3提供的检测动物源成分的检测试剂盒的应用。将该试剂盒应用于生产的小牛血去蛋白提取物注射液的动物源成分的检测。

样本选自黑龙江珍宝岛药业股份有限公司生产的三个批次小牛血去蛋白提取物注射液，三批次的小牛血去蛋白提取物注射液产品批号分别为：B20150301、B20160101和B20160501。

小牛血去蛋白提取物注射液产品中基因组DNA的提取(参考OMEGA公司的DNA提取试剂盒(Tissue DNA kit 200))。

1.1小牛血去蛋白提取物注射液200μL加入到1.5mL的RNase-free的离心管中，得到样本溶液；

1.2再加入350μL RLT Solution，剧烈振荡，以保证充分裂解；如果有不溶物存在，10000rpm离心2min，吸取上清到一个RNase-free 1.5mL离心管中；

1.3加入250μL的OB溶液，混匀，于65℃孵育5min；

1.4加入5μLRNaseA(25mg/mL)，室温孵育25min；

1.5加入220μL的BLBuffer，混匀，70℃孵育10min；

1.6加入220μL的无水乙醇，蜗旋15s混匀；

1.7将液体转移至吸附柱，吸附柱放置于2mL的离心管内，8000g离心1min，弃废液；

1.8加入500μL的HBBuffer到吸附柱中，8000g离心1min，弃废液；

1.9在吸附柱加入700μLDNA洗脱液，8000g离心1min弃废液，并重复本步骤一次；

1.10在吸附柱中加入80的Elution Buffer，室温静置3min，1000g离心2min，得到样本基因组DNA。

荧光定量PCR

利用实验例2提供的反应体系及反应程序，进行检测。PCR反应完成后，进行凝胶电泳实验，结果如17-19所示，检测结果为阴性；未检测出猪、马、牛和羊动物源成分。因此，产品中不含猪、马、牛和羊的DNA成分。

由于小牛血去蛋白提取物注射液制备工艺条件较为剧烈，经过了高温、超滤等多步骤纯化，最终产品中已不含有可以检出的DNA成份，因此采用荧光定量PCR方法无法对小牛血去蛋白提取物注射液的物种来源进行确定。因此采用荧光定量PCR方法无法对小牛血去蛋白提取物注射液的物种来源进行确定。因此考虑采用小牛血去蛋白提取物注射液生产过程中的粗提物，在DNA未被完全破坏的条件下检测。选取样本对应产品批号黑龙江珍宝岛药业股份有限公司生产的小牛血去蛋白提取物注射液的粗提物，对应产品批号为：YL13161001。

DNA提取方法参考前述小牛血去蛋白提取物注射液产品中基因组DNA的提取。然后用提取的样本基因组DNA进行荧光定量PCR反应。结果如图20-22及表1-表3所示。

表1小牛血去蛋白提取物一次提取液各物种基因测定结果(CT)

注.“——”表示未扩增出

表2小牛血去蛋白提取物一次提取液猪基因定量测定结果

表3小牛血去蛋白提取物一次提取液各物种基因测定结果判定

从图20-22表1到表3的结果可以看出，结果表明以小牛全血作为检测样品，可以采用荧光定量PCR方法能够对牛、猪、马、羊基因进行定量测定。因此可以作为小牛血去蛋白提取物注射液生产过程能够中原料物种来源的有效控制方法。

综上所述，本发明实施例提供的检测猪、马、牛和羊动物源成分检测试剂具有较好的特异性和较高的灵敏度，使用该检测试剂应用于小牛血去蛋白提取物注射液生产过程中粗提物的检测，具有较好的检测特异性，以及应用于制备小牛血去蛋白提取物的检测试剂盒，都具有较好的特异性和较高的灵敏度；检测试剂盒方便提取样品粗提物的核酸并进行鉴定，具有较高的实用性和较高的推广应用价值。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司、哈尔滨珍宝制药有限公司

<120> 小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂、检测试剂盒及应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> swine

<400> 1

caaactactc atacccagca agc 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> swine

<400> 2

cctttttggt tgtgaatagc 20

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> horse

<400> 3

acaacgaagc ataatattcc ggcctct 27

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> horse

<400> 4

cagttggccg ataattacgt atgggt 26

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> bovine

<400> 5

gccatatact ctccttggtg aca 23

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> bovine

<400> 6

gtaggcttgg gaatagtacg a 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> sheep

<400> 7

cctaggcatt tgcttaattt ta 22

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> sheep

<400> 8

atgctgtggc tattgtc 17

Claims

1.小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括动物源成分的检测引物组合及反应试剂；所述检测引物组合包括检测猪源成分的第1引物对、检测马源成分的第2引物对、检测牛源成分的第3引物对和检测羊源成分的第4引物对中的至少一种；所述第1-4引物对的碱基序列分别如SEQ ID No.1-8所示；所述反应试剂包括猪、牛、羊和马的阳性标准品、氨苄青霉素和酵母提取物。

2.如权利要求1所述的小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂在动物源成分检测中的应用。

3.如权利要求1所述的小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂在制备小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂盒中的应用。

4.小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的小牛血去蛋白提取物动物源成分的检测试剂。

5.根据权利要求4所述的检测动物源成分的检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs、2×Super Real PreMix、荧光试剂和Mg²⁺中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的检测动物源成分的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光试剂包括SYBR GreenI或者SYBR GreenⅡ。

7.根据权利要求7所述的检测动物源成分的检测试剂盒，其特征在于，还包括DNA提取试剂。

8.根据权利要求7所述的检测动物源成分的检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取试剂包括PBS溶液、DNA洗脱液和RNase A中的至少一种。

9.如权利要求5-8任一项所述的检测动物源成分的检测试剂盒在检测小牛血去蛋白提取物动物源成分中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

以动物源成分阳性标准品进行荧光定量PCR处理，得到所述阳性标准品Ct值及浓度数据，建立标准曲线；

取待检样本，提取基因组DNA，并进行荧光定量PCR试验，根据所述标准曲线计算得到待检样本Ct值；

当所述待检样本Ct值<30时，所述待检样本含有所述动物源成分。