CN104178570A - 鹿猪马驴牛羊动物骨组织的pcr鉴定用引物体系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物及基于该引物的鉴定方法和试剂盒，引物体系可一次检测多达六个物种动物骨cDNA，且引物均仅对各自物种目标片段特异性扩增，适用于一次PCR反应中导入多种引物对的多重PCR，有效缩短实验时间；本发明从骨组织中提取总RNA，经逆转录将总RNA转为cDNA，以该cDNA为鉴定PCR模板，缩短了从骨组织中提取总DNA并脱钙的时间，提高了检测鉴定效率，且进行PCR时使用优化特定PCR反应体系及程序，采用统一检测方法，建立了快速高效且特异性高的鉴定方式，从而有效鉴定鹿骨生物制品的真伪及掺假情况；此外该引物体系制成的试剂盒方便使用，可进行工业化生产及应用。

Description

鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物体系

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及鹿、猪、马、驴、牛、羊尤其是绵羊动物骨组织的PCR鉴定用引物体系及PCR鉴定方法，以及相应的试剂盒，适用于上述六种动物骨组织制品的快速检测及鉴定，尤其适用于鹿骨产品的快速防伪鉴定。

背景技术

鹿骨是我国传统中药，药用历史悠久。早在《本草纲目》中就有关于鹿骨“安胎下气，杀鬼精物，久服耐老，可酒浸服之。作酒，主内虚，续绝伤，补骨除风。烧灰水服，治小儿洞注下痢。磨汁涂面，光泽如玉。酿酒饮，肥白”的记载；《四川中药志》中也记载了其“治风湿四肢疼痛及筋骨冷痹”的功效。以梅花鹿骨为原料加工精制而成的鹿骨产品具有补虚、强筋、壮骨的功效，适用于久病体弱、精髓不足、贫血、风湿、四肢痛疼等症。

利用传统的理化方法无法区分以动物骨为原料所制成的骨产品等性质十分相似的产品，如鹿骨产品、猪骨产品等常见动物的骨制品。而现代分子生物学技术具有响应快速、灵敏度高的特点，如可利用聚合酶链式反应(PCR)从微量的DNA样品中扩增出特定的DNA片段，由于引物序列的差异性保证了实验结果的特异性极高，因此上述PCR技术目前已被广泛用于物种鉴定及检测的领域，在保证产品质量、打击假冒产品方面有着巨大作用。目前已有研究人员利用PCR技术进行了物种的鉴定及检测方面的研究，如本公司前期所申请的发明专利(CN102876805 B)建立了鹿及猪牛羊马驴兔鸡常见物种动物血液DNA的PCR鉴定技术。

但当采用从动物骨组织中直接提取总DNA的传统方法进行PCR鉴定时，由于从动物骨组织中提取总DNA时需要经过脱钙过程，而脱钙时间较长，通常需要一天的时间，对DNA抽提结果影响较大；且由于骨组织与血液的DNA组成差别巨大，血液中占绝大比例的红细胞不含基因组DNA，仅白细胞含有少量基因组DNA；而骨组织中基因组DNA占绝大比例，因此DNA成分更为复杂，极易对PCR结果造成干扰，实验检测中也证实了非特异性干扰的存在。因此本发明在前述发明的基础上，针对鹿猪马驴牛羊常见物种动物骨组织的cDNA的PCR条件进行了优化，并且对其中部分物种的鉴定引物进行了重新设计及有效性验证。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物体系，该引物体系及基于该引物体系进行的鉴定方法和试剂盒可快速且特异性高的检测鹿猪马驴牛羊动物骨制品的真伪及其是否有掺假，尤其适用于鹿骨产品鉴定与检测，其对常见物种的检测覆盖面广泛，可信度高；此外本方法是从骨组织中提取总RNA，再经过逆转录将RNA转为cDNA，用此cDNA作为鉴定PCR的模板，整个实验过程所花费时间大大小于从骨组织中提取总DNA并进行脱钙的时间，提高了检测鉴定的时间效率。

本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物，由下列引物对组成：

(1)对鹿线粒体12S rRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对Ⅰ：

正向引物：5’-CAGCCTTCCTATTGACCCTTAAT-3’

反向引物：5’-CGGCTGTAAAGTTACTTTCGTTG-3’；

(2)对猪线粒体12S rRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对II：

正向引物：5’-GCACACCTATAACGGTAGCTCAT-3’

反向引物：5’-TCCTAGCTATCGTGTGTCAGGAT-3’；

(3)对马线粒体16S rRNA基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对III：

正向引物：5’-CAAGCTCAACGACACATCTATC-3’

反向引物：5’-CCCTGAAGGTTAAGGTTTGTG-3’；

(4)对驴线粒体16S rRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对IV：

正向引物：5’-CAAGCTCAACGTCACACATATC-3’

反向引物：5’-CCTGTGTTGGGTTAACAATAGTC-3’；

(5)对牛线粒体细胞色素b(Cytb)基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对V：

正向引物：5’-GGCCCTCTTACTAATTCTAGCT-3’

反向引物：5’-CCGATGGTGATATATGGGTGTT-3’；

(6)对羊(绵羊)线粒体细胞色素b(Cytb)基因进行扩增生成羊(绵羊)特异性扩增片段的引物对VI：

正向引物：5’-GGTGCTATCCTACTAATCCTCAT-3’

反向引物：5’-GAGGAGGGGTATAATTACTAGGA-3’。

本发明通过对鹿、猪、马、驴、牛、羊(绵羊)六物种线粒体DNA中的遗传不保守区域基因(包括12S rRNA、16SrRNA和Cytb)，分别设计了各物种的特异性PCR引物对并进行了实验验证，其仅对相应的物种骨组织cDNA模板有扩增信号，对其他物种没有目的扩增信号，因此能够快速准确的对各物种进行定性检测。本发明的引物对均可通过利用本领域技术人员公知的化学合成方法进行DNA合成技术来获得。

本发明还提供了一种基于如前所述鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物的鉴定方法，该方法为：从动物骨样品中抽提总RNA，经逆转录为cDNA，以cDNA作为模板，利用所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、引物对Ⅴ和引物对Ⅵ分别进行PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；所述样品cDNA模板来自鹿、猪、马、驴、牛、羊物种动物骨组织的混合，或上述各物种动物骨组织产品中的一种。

所述PCR扩增实验中的特定PCR反应体系包括下列组分：双蒸水4.9体积份、10×PCR反应缓冲液1体积份、2mMeach的dNTPs1体积份、2.5U/μL的热启动高效Taq酶0.1体积份、经稀释20倍的cDNA模板1体积份、2μM正向引物1体积份和2μM反向引物1体积份。其最优组分为，双蒸水4.9μL、10×PCR反应缓冲液1μL、2mM each的dNTPs1μL、2.5U/μL的热启动高效Taq酶0.1μL、经稀释20倍的cDNA模板1μL、2μM正向引物1μL和2μM反向引物1μL。

所述PCR扩增实验中特定PCR反应程序为：依次进行94℃下预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行30次循环，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后结束。

本发明所述鉴定方法中进行琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、引物对Ⅴ和引物对Ⅵ分别扩增出的DNA片段大小；其中：

鹿物种的引物对Ⅰ扩增出的DNA片段大小为376bp；

猪物种的引物对Ⅱ扩增出的DNA片段大小为300bp；

马物种的引物对Ⅲ扩增出的DNA片段大小为586bp；

驴物种的引物对Ⅳ扩增出的DNA片段大小为232bp；

牛物种的引物对Ⅴ扩增出的DNA片段大小为360bp；

羊(绵羊)物种的引物对Ⅵ扩增出的DNA片段大小为231bp。

本发明还提供了一种基于如前所述鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物的试剂盒，该试剂盒中包括所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、引物对Ⅴ和引物对Ⅵ。可以将本发明所述引物体系以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。其中所述相关试剂可以为本发明中所述的特定PCR反应体系中除了cDNA模板以外的其他试剂；也可以为其他适用的除样品cDNA模板外的试剂，如用于PCR反应的一些常规试剂，或由本领域技术人员经有限次实验得到的常规试剂的组合物等。此外本发明试剂盒中还包括有实施本发明所需的基本用具。

本发明试剂盒可以是由多个隔断所形成，用以容纳固定一个或多个如管或小瓶类的容器。这些容器中可以分别装有本发明中各物种的引物对，也可以将各物种的引物对按照一定比例混合成引物对混合物后装于其中，根据实际需要各物种的引物对或引物对混合物可以是冻干形式或者溶于前述相关试剂中的状态。

本发明所述试剂盒用于单物种动物骨cDNA模板进行鹿、猪、马、驴、牛和羊(绵羊)的物种鉴定。且所述试剂盒用于多物种动物骨混合cDNA模板进行鹿、猪、马、驴、牛和羊(绵羊)的物种鉴定。所述试剂盒尤其适用于鹿骨产品的真伪及掺假判定。

本发明的有益技术效果是：通过使用本发明的引物，可以一次性检测多达六个物种动物骨的cDNA，达到对常见动物物种基本覆盖的目的；并且本发明的引物均仅对各自物种的目标片段进行特异性扩增，不会扩增到其它区域且不会与其他物种起反应，因此也能适用于一次PCR反应中导入两种或两种以上引物对的多重PCR反应，从而能有效的缩短实验时间；此外本发明方法是从骨组织中提取总RNA，再经过逆转录将RNA转为cDNA，用此cDNA作为鉴定PCR的模板，整个实验过程所花费时间大大小于从骨组织中提取总DNA并进行脱钙的时间，提高了检测鉴定的时间效率，且进行PCR时，使用优化的特定PCR反应体系及反应程序，采用统一PCR检测方法，简化了检测流程，建立了快速高效且特异性高的鉴定方式，从而有效的鉴定鹿骨生物制品的真伪及掺假情况，为鹿骨的质量控制提供了现代分子生物学的检测手段；此外该引物体系还能配合相关试剂制成试剂盒，方便使用，同时为工业化生产及应用提供了可能，其应用前景极好。

附图说明

图1是本发明所述六种动物骨组织提取出的总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；

图2是以本发明所述鹿线粒体12S rRNA基因的引物对I作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图3是以本发明所述猪线粒体12S rRNA基因的引物对II作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图4是以本发明所述马线粒体16S rRNA基因的引物对III作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图5是以本发明所述驴线粒体16S rRNA基因的引物对Ⅳ作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图6是以本发明所述牛线粒体细胞色素b(Cytb)基因的引物对V作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图7是以本发明所述羊(绵羊)线粒体细胞色素b(Cytb)基因的引物对VI作为引物进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图8是以本发明所述各物种动物cDNA模板按同体积混合后的混合cDNA样品为模板，使用各物种特异性引物分别与此混合cDNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图9是以本发明所述鹿、猪、马、驴、牛、羊(绵羊)各引物对与鹿cDNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图10是以本发明所述鹿、猪、马、驴、牛、羊(绵羊)各引物对与猪cDNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图11是以本发明所述鹿、猪、马、驴、牛、羊(绵羊)各引物对与马cDNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图12是以本发明所述鹿、猪、马、驴、牛、羊(绵羊)各引物对与驴cDNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图13是以本发明所述鹿、猪、马、驴、牛、羊(绵羊)各引物对与牛cDNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

图14是以本发明所述鹿、猪、马、驴、牛、羊(绵羊)各引物对与羊(绵羊)cDNA模板进行PCR扩增所得琼脂糖凝胶电泳图；

以上各图中M代表标准核算分子量标签。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商建议的条件进行。

一、材料和试剂：

试剂：RNA抽提试剂Trizol购自上海闪晶分子生物技术研究所；热启动高效Taq酶-Blend Taq-Plus-试剂盒购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；DNA标记物为分子量标准50bpDNA Ladder Marker，D2000DNA Marker购自天根生化科技(北京)有限公司；琼脂糖购自Sigma公司；DNA荧光染料GelRed购自Biotium公司；各物种引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

二、各物种特异性引物的设计：

利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)核酸序列数据库，针对鹿、猪、马、驴、牛、羊(绵羊)六个物种的线粒体DNA进行序列比对分析，并选定遗传多变的特定基因目标区域，包括12SrRNA、16S rRNA和Cytb3个基因，针对上述基因各序列上的特异性碱基位点分别设计了各物种的特异性PCR引物对，并经NCBI BLAST数据进行在线比对，用于PCR扩增目的片段，且经实验验证各引物对的有效性及物种特异性。

各引物如下所述：

对鹿线粒体12S rRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对Ⅰ：

正向引物：5’-CAGCCTTCCTATTGACCCTTAAT-3’(SEQID NO.1)

反向引物：5’-CGGCTGTAAAGTTACTTTCGTTG-3’(SEQID NO.2)；

对猪线粒体12S rRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对II：

正向引物：5’-GCACACCTATAACGGTAGCTCAT-3’(SEQID NO.3)

反向引物：5’-TCCTAGCTATCGTGTGTCAGGAT-3’(SEQID NO.4)；

对马线粒体16S rRNA基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对III：

正向引物：5’-CAAGCTCAACGACACATCTATC-3’(SEQID NO.5)

反向引物：5’-CCCTGAAGGTTAAGGTTTGTG-3’(SEQID NO.6)；

对驴线粒体16S rRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对IV：

正向引物：5’-CAAGCTCAACGTCACACATATC-3’(SEQID NO.7)

反向引物：5’-CCTGTGTTGGGTTAACAATAGTC-3’(SEQID NO.8)；

对牛线粒体细胞色素b(Cytb)基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对V：

正向引物：5’-GGCCCTCTTACTAATTCTAGCT-3’(SEQID NO.9)

反向引物：5’-CCGATGGTGATATATGGGTGTT-3’(SEQID NO.10)；

对羊(绵羊)线粒体细胞色素b(Cytb)基因进行扩增生成羊(绵羊)特异性扩增片段的引物对VI：

正向引物：5’-GGTGCTATCCTACTAATCCTCAT-3’(SEQID NO.11)

反向引物：5’-GAGGAGGGGTATAATTACTAGGA-3’(SEQ ID NO.12)；

三、各物种动物骨组织总RNA的抽提：

(1)将不锈钢研钵洗净，放入高压灭菌锅121℃灭菌15分钟，取出烘干；将动物骨小块(约3-5克)洗净，去除表面软组织，放入液氮中冷冻过夜；

(2)将冷冻过夜的动物骨取出，放入已灭菌的研钵中，倒入适量液氮，将骨头在液氮中捣碎；将大部分骨头基本捣成粉末状，待液氮挥发完毕，加入1mL Trizol试剂，继续研磨一段时间；

(3)将研钵至于室温，待凝固的Trizol试剂融化后，收集于干净的离心管中；在该离心管中加入100μL氯仿，剧烈震荡后室温放置15分钟；将该离心管于12000g离心15分钟，取出离心管后小心吸取上层水相并放置于干净离心管中；

(4)加入与吸出的上层水相等体积的异丙醇，小心混匀后置于-20℃沉淀20分钟；然后将离心管于12000g离心5分钟，弃去上清液得到沉淀；加入1mL 75％乙醇洗涤(4)中得到的沉淀，12000g离心5分钟，弃去上清液，重复一次；

(5)将离心管盖敞开，于室温放置约10分钟，待乙醇完全挥发，得到RNA沉淀；并根据该RNA沉淀的量加入20-50μL无RNA酶的蒸馏水溶解该RNA沉淀；并将该RNA溶液长期保存于-80℃冰箱，得到动物骨组织的骨总RNA样品。

将经上述步骤抽提所得各动物的骨总RNA样品进行1wt.％琼脂糖凝胶电泳实验，并在凝胶中加入GelRed核酸染料进行染色。采用120V电泳30分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。其中各加样孔上样量为10μL，所得结果如图1所示。本发明所述各动物骨组织抽提所得的总RNA样品经电泳染色后，可以看出总RNA样品均存在条带弥散的现象，说明总RNA样品成分复杂。

四、将总RNA逆转录为cDNA的实验：

(1)在PCR管中加入1μL动物骨总RNA，1μg Oligo dT引物，加双蒸水至15μL体系；将PCR管放入PCR仪中于70℃保温5分钟，取出后与4℃冷却5分钟；

(2)在此PCR管中再加入5μL Promega公司M-MLV RT5x Buffer，1.25μL dNTP(10mM each)，0.5μL RNA酶抑制剂(每微升40u)，1μL Promega公司M-MLV逆转录酶，最后加双蒸水至25μL体系；将此PCR管于PCR仪中于42℃保温1小时进行反应，再于75℃保温10分钟使酶失活；

(3)将所得逆转录产物cDNA于-20℃保存。

五、各物种特异性引物对进行PCR实验：

采用步骤二中合成所得各动物物种的特异性引物对进行PCR实验，所选用的cDNA模板可以为步骤四中各动物物种的cDNA样品，也可以为将步骤四中所得各动物物种cDNA样品按一定比例混合后的混合cDNA样品。在本发明中，针对所述各物种cDNA样品和混合cDNA样品均在同样的PCR反应系统和同样的PCR反应程序下进行。具体如下所述。

实施方式一：以所述各物种cDNA样品为cDNA模板：

(1)各物种cDNA样品的处理：将所述六种动物骨组织的cDNA样品各取2μL分别用双蒸水稀释20倍，作为cDNA模板，并将引物用双蒸水释至2μM；

(2)反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系10μL/管。内含双蒸水4.9μL、10×PCR反应缓冲液1μL、2mM each的dNTPs 1μL、2.5U/μL的热启动高效Taq酶0.1μL、(1)中所述cDNA模板1μL、2μM正向引物1μL和2μM反向引物1μL；其中Taq酶为热启动高效Taq酶-Blend Taq-Plus-(参见TOYOBO公司的说明书)；

(3)PCR反应程序的制定：依次进行94℃下预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行30次循环，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后结束，得PCR反应产物；

(4)1.5wt.％琼脂糖凝胶电泳：将(3)中所得PCR反应产物进行1.5wt.％琼脂糖凝胶电泳，凝胶中加入GelRed进行核酸染色，然后120V电泳30分钟，当溴酚蓝条带迁移至凝胶边缘时停止电泳，则凝胶成像。

所得凝胶成像结果如图2至图7所示。

其中图2是分别采用六种动物骨组织中提取出来的cDNA模板，以鹿线粒体12S rRNA基因的引物对Ⅰ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示鹿物种特异引物对Ⅰ仅对鹿cDNA模板特异扩增出376bp大小的条带，而其它物种cDNA模板无扩增。

图3是分别采用六种动物骨组织中提取出来的cDNA模板，以猪线粒体12S rRNA基因的引物对Ⅱ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示猪物种特异引物对Ⅱ仅对猪cDNA模板特异扩增出300bp大小的条带，而其它物种cDNA模板无扩增。

图4是分别采用六种动物骨组织中提取出来的cDNA模板，以马线粒体16S rRNA基因的引物对Ⅲ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示马物种特异引物对Ⅲ仅对马cDNA模板特异扩增出586bp大小的条带，而其它物种cDNA模板无扩增。

图5是分别采用六种动物骨组织中提取出来的cDNA模板，以驴线粒体16S rRNA基因的引物对Ⅳ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示驴物种特异引物对Ⅳ仅对驴cDNA模板特异扩增出232bp大小的条带，而其它物种cDNA模板无扩增。

图6是分别采用六种动物骨组织中提取出来的cDNA模板，以牛线粒体细胞色素b(Cytb)基因的引物对Ⅴ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示牛物种特异引物对Ⅴ仅对牛cDNA模板特异扩增出360bp大小的条带，而其它物种cDNA模板无扩增。

图7是分别采用六种动物骨组织中提取出来的cDNA模板，以羊(绵羊)线粒体细胞色素b(Cytb)基因的引物对Ⅵ作为引物进行PCR扩增得到的DNA条带。结果显示羊(绵羊)物种特异引物对Ⅵ仅对羊(绵羊)cDNA模板特异扩增出231bp大小的条带，而其它物种cDNA模板无扩增。

通过上述实验及实验结果可知，当上述各物种的单对引物均分别与六种动物骨组织的cDNA模板进行PCR实验时，确定该引物对仅对其自身物种骨组织的cDNA模板有反应，而对其他五个物种骨组织的cDNA模板没有反应，以单物种cDNA模板方式验证了各物种引物的特异性。

实施方式二：以所述各物种cDNA样品按照一定比例混合后的混合cDNA样品为模板：

(1)混合cDNA样品的处理：将所述六种动物骨组织的cDNA样品等体积混合，其中每种各占16.7vol.％，所得为混合cDNA样品。取1μL该混合cDNA样品并用双蒸水稀释20倍，作为混合cDNA模板；

(2)反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系10μL/管。内含双蒸水4.9μL、10×PCR反应缓冲液1μL、2mM each的dNTPs1μL、2.5U/μL的热启动高效Taq酶0.1μL、1中所述混合cDNA模板1μL、2μM正向引物1μL和2μM反向引物1μL；其中Taq酶为热启动高效Taq酶-Blend Taq-Plus-(参见TOYOBO公司的说明书)。

(3)PCR反应程序的制定：该反应程序同实施例一中的反应程序。

(4)1.5wt.％琼脂糖凝胶电泳：该电泳过程及条件同实施例一中的电泳。

所得凝胶成像结果如图8所示。该方法以各物种特异性引物分别与骨组织混合cDNA模板进行PCR扩增反应，进一步验证了复杂cDNA模板条件下各物种特异性引物的有效性和特异性。由图8可以看出，各物种特异性引物均能很好的从cDNA混合模板中扩增出其对应物种的特异性大小的条带。

实施方式三：

以前述骨组织RNA提取方法分别提取各种动物骨制品的总RNA，再经过逆转录制备cDNA模板，使用不同物种特异性引物进行鉴定PCR：

(1)cDNA样品的处理：将所述各动物骨组织的cDNA样品分别用蒸馏水稀释20倍，作为cDNA模板；

(2)反应体系的配制：在PCR薄壁管中加入如下各反应组分，反应体系10μL/管。内含双蒸水4.9μL、10×PCR反应缓冲液1μL、2mM each的dNTPs1μL、2.5U/μL的热启动高效Taq酶0.1μL、1中所述动物cDNA模板1μL、2μM正向引物1μL和2μM反向引物1μL；其中Taq酶为热启动高效Taq酶-Blend Taq-Plus-(参见TOYOBO公司的说明书)。

(3)PCR反应程序的制定：该反应程序同实施例一中的反应程序。

(4)1.5wt.％琼脂糖凝胶电泳：该电泳过程及条件同实施例一中的电泳。

所得凝胶成像结果如图9至图14所示。

其中图9是以各物种特异性引物对分别和鹿cDNA模板进行PCR扩增反应，仅鹿特异性引物对I扩增出376bp大小的条带，而其他物种引物对无非特异性扩增。

图10是以各物种特异性引物对分别和猪cDNA模板进行PCR扩增反应，仅猪特异性引物对II扩增出300bp大小的条带，而其他物种引物对无非特异性扩增。

图11是以各物种特异性引物对分别和马cDNA模板进行PCR扩增反应，仅马特异性引物对III扩增出586bp大小的条带，而其他物种引物对无非特异性扩增。

图12是以各物种特异性引物对分别和驴cDNA模板进行PCR扩增反应，仅驴特异性引物对IV扩增出232bp大小的条带，而其他物种引物对无非特异性扩增。

图13是以各物种特异性引物对分别和牛cDNA模板进行PCR扩增反应，仅牛特异性引物对V扩增出360bp大小的条带，而其他物种引物对无非特异性扩增。

图14是以各物种特异性引物对分别和羊(绵羊)cDNA模板进行PCR扩增反应，仅羊(绵羊)特异性引物对VI扩增出231bp大小的条带，而其他物种引物对无非特异性扩增。

根据上述实施例一、实施例二和实施例三中所述的PCR反应体系，本发明所述引物体系可以配合相关试剂制成不同组合的试剂盒，可用于对鹿、猪、马、驴、牛、羊(绵羊)的物种鉴定，尤其适用于用于鹿骨产品的真伪及掺假判定。

Claims (10)

1.一种鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物，其特征在于：由下列引物对组成：

(1)对鹿线粒体12S rRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对Ⅰ：

正向引物：5’-CAGCCTTCCTATTGACCCTTAAT-3’

反向引物：5’-CGGCTGTAAAGTTACTTTCGTTG-3’；

(2)对猪线粒体12S rRNA基因进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对II：

正向引物：5’-GCACACCTATAACGGTAGCTCAT-3’

反向引物：5’-TCCTAGCTATCGTGTGTCAGGAT-3’；

(3)对马线粒体16S rRNA基因进行扩增生成马特异性扩增片段的引物对III：

正向引物：5’-CAAGCTCAACGACACATCTATC-3’

反向引物：5’-CCCTGAAGGTTAAGGTTTGTG-3’；

(4)对驴线粒体16S rRNA基因进行扩增生成驴特异性扩增片段的引物对IV：

正向引物：5’-CAAGCTCAACGTCACACATATC-3’

反向引物：5’-CCTGTGTTGGGTTAACAATAGTC-3’；

(5)对牛线粒体细胞色素b基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对V：

正向引物：5’-GGCCCTCTTACTAATTCTAGCT-3’

反向引物：5’-CCGATGGTGATATATGGGTGTT-3’；

(6)对羊线粒体细胞色素b基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对VI：

正向引物：5’-GGTGCTATCCTACTAATCCTCAT-3’

反向引物：5’-GAGGAGGGGTATAATTACTAGGA-3’。

2.基于权利要求1所述鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物的鉴定方法，其特征在于：从动物骨样品中抽提总RNA，经逆转录为cDNA，以cDNA作为模板，利用所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、引物对Ⅴ和引物对Ⅵ分别进行PCR扩增实验，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果；所述样品cDNA模板来自鹿、猪、马、驴、牛、羊物种动物骨组织的混合，或上述各物种动物骨组织产品中的一种。

3.根据权利要求2所述基于鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物的鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增实验中的特定PCR反应体系包括下列组分：双蒸水4.9体积份、10×PCR反应缓冲液1体积份、2mM each的dNTPs1体积份、2.5U/μL的热启动高效Taq酶0.1体积份、经稀释20倍的cDNA模板1体积份、2μM正向引物1体积份和2μM反向引物1体积份。

4.根据权利要求3所述基于鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物的鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增实验中的特定PCR反应体系包括下列组分：双蒸水4.9μL、10×PCR反应缓冲液1μL、2mM each的dNTPs1μL、2.5U/μL的热启动高效Taq酶0.1μL、经稀释20倍的cDNA模板1μL、2μM正向引物1μL和2μM反向引物1μL。

5.根据权利要求2所述基于鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物的鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增实验中特定PCR反应程序为：依次进行94℃下预变性2min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，进行30次循环，72℃下延伸10min，最后在4℃下保持1min后结束。

6.根据权利要求2至5中任一权利要求所述基于鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物的鉴定方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳结束后判定结果时，判定依据为所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、引物对Ⅴ和引物对Ⅵ分别扩增出的DNA片段大小；其中

鹿物种的引物对Ⅰ扩增出的DNA片段大小为376bp；

猪物种的引物对Ⅱ扩增出的DNA片段大小为300bp；

马物种的引物对Ⅲ扩增出的DNA片段大小为586bp；

驴物种的引物对Ⅳ扩增出的DNA片段大小为232bp；

牛物种的引物对Ⅴ扩增出的DNA片段大小为360bp；

羊物种的引物对Ⅵ扩增出的DNA片段大小为231bp。

7.一种基于权利要求1所述鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物的试剂盒，其特征在于：包括所述引物对Ⅰ、引物对Ⅱ、引物对Ⅲ、引物对Ⅳ、引物对Ⅴ和引物对Ⅵ。

8.根据权利要求7所述的基于鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于单物种动物骨cDNA模板进行鹿、猪、马、驴、牛和羊的物种鉴定。

9.根据权利要求7所述的基于鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于多物种动物骨混合cDNA模板进行鹿、猪、马、驴、牛和羊的物种鉴定。

10.根据权利要求7所述的基于鹿猪马驴牛羊动物骨组织的PCR鉴定用引物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒用于鹿骨产品的真伪及掺假判定。