CN110106276B - 一种鉴别当归的试剂盒及鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别当归的试剂盒及鉴别方法。该试剂盒中包括当归探针，探针连接有荧光标记。上述探针与模板结合的热动力学效能提高，使探针能够更好地与当归结合，而不与独活的DNA结合，重复性好，假阳性率低，与DNA杂交后即可通过荧光检测进行当归和独活的鉴别，操作简便快捷、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种鉴别当归的试剂盒及鉴别方法。
背景技术
当归是伞形科多年生草本植物当归的根，具有补血、活血、调经止痛、润燥滑肠的功效。独活与当归为同科植物，是伞形科植物重齿毛当归的根，具有祛风、除湿、散寒、止痛的功效。由于当归价格逐年呈上涨趋势，而独活与当归外观极为相似，肉眼不易分辨，特别是以饮片及粉末存在时更不易区分，一些商贩便将独活加工后冒充当归进行出售。但二者功效各不相同，若混淆或代替使用，则会贻误治疗。因此准确将当归与独活鉴别开，对于当归市场以及人民健康具有重要意义。目前常规的中药鉴定方法有基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定等，但对于已被加工的中药饮片则有一定的局限性。
近年来，以DNA条形码为基础的分子鉴定方法快速发展，成为了继传统鉴定方法后的中药鉴定新方法。现有的分子鉴定技术多基于聚合酶链式反应(PCR)及测序技术：PCR获得ITS2序列后，通过对PCR产物进行测序、比对序列信息，从而能够区分正品和伪品。分子鉴定技术可以保证试验数据的可靠性，且重复性高，结果可靠，从分子水平进行鉴定不受样品的状态及采收加工影响。但是由于需要特殊而昂贵的测序仪器对其进行测序(一般需要由测序公司进行)，其经济成本及易用性限制了其推广的可能性。
后又有人利用荧光标记的方式，通过设计特异性引物，在PCR合成过程中于碱基间插入荧光标记以鉴别正品和伪品。该方法从一定程度上改善了原有技术的缺点，但是，全序列标记的荧光标记成本过高，且特异性引物的设计和筛选费时费力，针对不同的待鉴定中药很难获得相应的特异性引物，同样限制了此类技术的推广和应用。
发明内容
针对独活与当归饮片及粉末不易区分，以及现有技术中分子鉴定方法成本高、不易设计和筛选特异性引物的技术问题，本发明提供了一种鉴别当归的试剂盒。
以及，本发明还提供了鉴别当归的方法。
以及，本发明还提供了上述鉴别当归的试剂盒在鉴别当归与独活中的应用。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种鉴别当归的试剂盒，包括当归探针，所述当归探针连接有荧光标记；所述当归探针的序列为5′-CGCATCACCTT-3′(如SEQ ID NO.1所示)。
本试剂盒中的探针序列以当归与独活的ITS2差异序列中差异较大的序列为基础，经人工设计后得到。与根据差异序列直接得到的探针相比，上述探针与模板DNA结合的热动力学效能提高，能够更好地和当归DNA结合，而不与独活DNA结合，重复性好，假阳性率低。将探针与DNA杂交后，即可通过荧光检测进行当归与独活的鉴别。本试剂盒利用上述探针可获得准确的鉴别结果，可应用于当归与独活鲜材、饮片、粉末的鉴定，并有效降低了单次反应成本，且不需要特殊检测仪器，大大提升了检测手段的易用性，可在涉及当归与独活鉴别的科研机构、药房、医院、加工采收厂、中药供应商等地广泛应用。
优选地，所述试剂盒还包括植物ITS2引物，用于扩增当归与独活的基因组DNA。
优选地，所述荧光标记连接于所述探针的5′端。一个探针仅连接一个荧光标记，可有效降低荧光基团的使用量，降低成本。
优选地，所述荧光标记为Cy2荧光标记或AlexaFluor488荧光标记。
以及，本发明实施例还提供了一种鉴别当归的方法，用上述鉴别当归的试剂盒对当归进行鉴别。
优选地，具体操作为：扩增待测物的基因组DNA，扩增完成后加入上述当归探针进行杂交，然后电泳，荧光检测。
优选地，所述杂交的方法为：向所述扩增引物中加入所述当归探针，95℃变性5min，61.5℃退火1min。在优选的变性、退火的温度和时间条件下，能够更好地使当归探针与当归DNA结合，而不与独活DNA结合，从而可以将这两种物质鉴别区分。
优选地，所述荧光检测的激发波长为488nm。
优选地，所述电泳的条件为1％琼脂糖凝胶电泳，电压为180V。
优选地，扩增所述基因组DNA的反应体系为：100ng基因组DNA或10ng质粒DNA，ITS2引物10pmol/μL，DNA聚合酶1×，用双蒸水补齐至50μL；反应程序为：95℃5min，共1个循环；95℃30s，54℃30s，72℃30s，共25个循环；72℃，5min，共1个循环；所述当归探针的加入量为1pmol/μL。
以及，本发明实施例还提供了上述鉴别当归的试剂盒在鉴别当归与独活中的应用。该试剂盒可用于将当归与其伪品独活区别开。
附图说明
图1为本发明实施例2中荧光检测结果；
图2为本发明实施例3中荧光检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种鉴别当归的试剂盒，具体包括：
(1)当归探针：序列为5′-CGCATCACCTT-3′。
(2)ITS2引物；正向引物序列为5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′(如SEQ ID NO.2所示)，反向引物序列为5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′(如SEQ ID NO.3所示)。
(3)PCR反应试剂：DNA聚合酶1×，双蒸水。
实施例2
本发明实施例提供了一种鉴别当归的方法，用实施例1的试剂盒进行鉴定，步骤具体如下：
(1)PCR反应
提取待测物的基因组DNA，以该基因组DNA为模板，按以下体系及程序进行PCR反应：
体系：待测物的基因组DNA100ng，ITS2引物10pmol/μL，加入DNA聚合酶1×混合，用双蒸水补齐至50μL。
反应程序：
95℃，5min，共1个循环；
95℃30s，54℃30s，72℃30s，共25个循环；
72℃5min，共1个循环。
(2)原位探针结合
向扩增引物中加入当归探针1pmol/μL，95℃变性5min，61.5℃退火1min。
(3)电泳检测
经1％琼脂糖凝胶电泳检查上述退火后的样品(180V)，10min后在488nm激发波长下进行荧光检验。检验结果如图1所示。当归出现明显荧光条带，而独活则未出现荧光条带。
实施例3
本发明实施例提供了一种鉴别当归的方法，用实施例1的试剂盒进行鉴定，步骤具体如下：
(1)PCR反应
提取待测物的质粒DNA，以该质粒DNA为模板，按以下体系及程序进行PCR反应：
体系：待测物的质粒DNA10ng，ITS2引物10pmol/μL，加入DNA聚合酶1×混合，用双蒸水补齐至50μL。
反应程序：
95℃，5min，共1个循环；
95℃30s，54℃30s，72℃30s，共25个循环；
72℃5min，共1个循环。
(2)原位探针结合
向扩增引物中加入当归探针1pmol/μL，95℃变性5min，61.5℃退火1min。
(3)电泳检测
经1％琼脂糖凝胶电泳检查上述退火后的样品(180V)，10min后在488nm激发波长下进行荧光检验。检验结果如图2所示，当归出现明显荧光条带，而独活则未出现荧光条带。
由结果可见，本发明所提供的试剂盒在当归与独活的鉴别方面具有操作简便快捷、成本低的优势。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北中医学院
<120> 一种鉴别当归的试剂盒及鉴别方法
<130> 2019.05.05
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> DNA
<213> 当归探针
<400> 1
cgcatcacct t
11
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> ITS2正向引物
<400> 2
atgcgatact tggtgtgaat
20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> ITS2反向引物
<400> 3
gacgcttctc cagactacaa t
21
Claims (6)
1.一种鉴别当归的方法，其特征在于，用鉴别当归的试剂盒对当归进行鉴别，所述鉴别当归的试剂盒包括当归探针和植物ITS2引物，所述当归探针连接有荧光标记；
所述当归探针的序列为5´-CGCATCACCTT-3´；
所述方法的具体操作为：提取待测物的基因组DNA，以该基因组DNA为模板按以下体系进行PCR反应，体系：待测物基因组DNA，ITS2引物，DNA聚合酶1×，双蒸水；扩增完成后加入所述当归探针进行杂交，然后电泳，荧光检测，所述杂交的方法为：向扩增引物中加入所述当归探针，95℃变性5min，61.5℃退火1min。
2.根据权利要求1所述的鉴别当归的方法，其特征在于，所述荧光标记连接于所述探针的5´端。
3.根据权利要求2所述的鉴别当归的方法，其特征在于，所述荧光标记为Cy2荧光标记或AlexaFluor488荧光标记。
4.根据权利要求1所述的鉴别当归的方法，其特征在于，所述荧光检测的激发波长为488nm；和/或
所述电泳的条件为1%琼脂糖凝胶电泳，电压为180V。
5.根据权利要求1所述的鉴别当归的方法，其特征在于，所述PCR反应体系为：100ng基因组DNA或10ng质粒DNA，ITS2引物10pmol/µL，DNA聚合酶1×，用双蒸水补齐至50µL；
反应程序为：95℃ 5min，共1个循环；95℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s，共25个循环；72℃，5min，共1个循环；
所述当归探针的加入量为1pmol/µL。
6.权利要求1所述的鉴别当归的方法在鉴别当归与独活中的应用。
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| "A nucleotide signature for the identification of Angelicae sinensis radix(Danggui) and its products 附表1";Xiaoyue Wang, et al.;《Scientific Reports》;20161007;第6卷;附表1 * |
| "A nucleotide signature for the identification of Angelicae sinensis radix(Danggui) and its products";Xiaoyue Wang, et al.;《Scientific Reports》;20161007;第6卷;摘要，材料和方法部分，附表1 * |
| "基于ITS2序列鉴别道地药材岷县当归及其混伪品";刘新星 等;《中草药》;20181028;第49卷(第20期);摘要，材料和方法部分，第3.1-3.2节 * |
| "基于ITS条形码标记对当归属药用植物的鉴别";阎梦颖 等;《中草药》;20160328;全文 * |
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