CN113604584A - 一种栉孔扇贝遗传性别相关的分子标记及其应用 - Google Patents

一种栉孔扇贝遗传性别相关的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴定栉孔扇贝遗传性别的分子标记及其应用。用于鉴定栉孔扇贝遗传性别的分子标记为两个雌性特异标记和一个雌雄共有分子标记，两个雌性特异标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4，雌雄共有分子标记的核苷酸序列为SEQ ID NO：7。应用上述分子标记可进行栉孔扇贝遗传性别鉴定。本发明方法快速准确地鉴定栉孔扇贝的遗传性别，不依赖组织和性腺发育程度，简单快速、稳定性好、准确率高，对于栉孔扇贝遗传育种工作的发展具有重要意义。

Description

一种栉孔扇贝遗传性别相关的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于水产养殖动物性别鉴定技术领域，具体涉及一种栉孔扇贝遗传性别相关的分子标记及其应用。
背景技术
栉孔扇贝(Azumapecten farreri)隶属于软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Bivalvia)、海扇蛤目(Pectinida)、扇贝科(Pectinidae)，是我国北方重要的海水经济养殖贝类品种，具有较高的经济价值。栉孔扇贝为雌雄异体，一般一年可发育至性成熟。在栉孔扇贝性腺发育过程中，性腺中的生殖细胞发育成配子，排列在滤泡中直至饱满成熟，扇贝性成熟之后会受到环境因子的刺激从而排精产卵。为了方便起见，通常将这一发育过程划分为四个阶段：增殖期、生长期、成熟期、休止期。当扇贝处于生长期、成熟期时，性腺较为丰满，性别可以通过性腺颜色进行区分，雌性性腺呈橘黄色，雄性性腺呈奶白色。
对于处于性腺发育休止期、增殖期的成贝，由于性腺透明，无法通过肉眼判定雌雄，必须通过性腺的组织学切片或性别相关基因定量表达分析进行性别鉴定。而对于性别尚未分化的幼贝，组织学切片和基因表达定量分析也无法判定性别。已有性别鉴定方法受性腺形态、发育时期等各种因素的限制，给栉孔扇贝遗传育种工作带来了较大挑战，因此，急需要一种方便有效的栉孔扇贝遗传性别鉴定的方法。对于水产养殖动物来说，开发简单有效并且成本低廉的性别鉴定方法有助于实现性控育种，加快育种培育进程，对性别决定机制研究也具有重要意义。DNA分子标记是性别鉴定的重要工具，不受发育时期和组织部位的限制，并可以做到活体鉴定，具有操作简单、成本低廉、结果准确等优点，已经在大多数水生生物中广泛应用，但迄今为止在栉孔扇贝中尚未建立遗传性别的鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定栉孔扇贝遗传性别的分子标记及其应用，从而解决现有技术中存在的上述技术问题。
本发明首先提供一种雌性栉孔扇贝特异性分子标记，所述分子标记包含有：
1)核苷酸序列为SEQ ID NO：1的片段；或
2)核苷酸序列为SEQ ID NO：4的片段；或
3)与1)或2)中序列互补的片段；
本发明还提供一种鉴别雌性栉孔扇贝性别的方法，所述的方法是通过检测上述的分子标记来实现的；
所述的方法，为PCR扩增检测方法，其中使用的，用于检测序列为SEQ ID NO：1的片段的引物对，上游引物的序列为SEQ ID NO：2，下游引物的序列为SEQ ID NO：3；
用于检测序列为SEQ ID NO：4的片段的引物对，其上游引物序列为SEQ ID NO：5，下游引物序列为SEQ ID NO：6。
本发明再一个方面还提供一种鉴别雌雄栉孔扇贝的方法，所述的方法是检测雌性栉孔扇贝特异性分子标记，同时还检测雌雄栉孔扇贝共有的分子标记；
所述的雌雄栉孔扇贝共有的分子标记，其序列为SEQ ID NO：7；检测该标记的引物对，其上游引物序列为SEQ ID NO：8，下游引物序列为SEQ ID NO：9。
本发明还提供一种鉴定栉孔扇贝遗传性别的方法，包括如下的步骤：
1)获得栉孔扇贝的基因组DNA，
2)以所得的DNA为模板，使用针对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4序列设计的引物和针对SEQ ID NO：7设计的引物进行PCR反应，
3)对PCR反应产物进行电泳检测，雌雄均扩增出376bp条带，说明PCR成功，出现长度为510bp和886bp特异性条带的为雌性个体，否则为雄性个体。
本发明还提供一种鉴定栉孔扇贝遗传性别的分子检测试剂盒，所述的试剂盒中包含有用于检测雌性栉孔扇贝特异性分子标记的引物对和检测雌雄栉孔扇贝共有的分子标记的引物对。
与现有技术相比，本发明只需要少量栉孔扇贝DNA，采取常规PCR手段即可进行性别鉴定，雌性特异和雌雄共有分子标记联合使用，对栉孔扇贝性别鉴定的准确率达99％。该方法可实现活体检测，不依赖组织和性腺发育程度，简单快速、稳定准确，该方法对于栉孔扇贝遗传育种工作的发展具有重要意义。
附图说明
图1为栉孔扇贝闭壳肌DNA电泳结果示意图，其中个体编号1-12为雌性个体，个体编号13-24为雄性个体，M表示2Kb DNA ladder。
图2为雌性特异性分子标记FSP1(A)和FSP2(B)在栉孔扇贝中的遗传性别鉴定结果示意图，其中1-12为雌性个体，13-24为雄性个体，所有个体均能扩增出376bp的对照条带，雌性个体能扩增出510bp(A)和886bp(B)特异性条带。M表示100bp DNA ladder。
图3为处于性腺不同发育时期未知性别栉孔扇贝的遗传性别鉴定结果示意图，其中图3A为雌性特异性分子标记FSP1的性别鉴定结果示意图，图3B为雌性特异性分子标记FSP2的性别鉴定结果示意图；1-24号个体均为肉眼难以分辨性别的栉孔扇贝个体，第一组(1-8号个体)为处于增殖期的成贝，第二组(9-16号个体)为处于休止期的成贝，第三组(17-24号个体)为性别未分化的幼贝。
图4为处于性腺不同发育时期未知性别栉孔扇贝样本的性腺组织学切片结果图，其中A为增殖期雄性性腺，B为增殖期雌性性腺，C为休止期性腺，D为未分化性腺；FC为滤泡细胞；GSC为生殖干细胞；SC为精母细胞；SG为精原细胞；ST为精细胞；OG为卵原细胞；VO为卵母细胞。
具体实施方式
本发明在筛选获得了栉孔扇贝雌性特异性分子片段的基础上，分别针对雌性特异性序列(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4)设计雌性特异性引物，再加上针对对照核苷酸序列(SEQ ID NO:7)设计的引物，联合使用来进行栉孔扇贝雌雄性别检测。
本发明的实施例中采用传统的酚氯仿抽提方法提取栉孔扇贝基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪进行检测。
下面将进一步描述本发明具体实施方案，以便于本领域人员进一步理解，而不构成对其权利的限制。
实施例1：栉孔扇贝性别特异性分子标记筛查
采用传统酚氯仿法抽提一个雌性栉孔扇贝闭壳肌基因组DNA；通过Nanopore测序仪进行测序，深度为100x；利用Canu进行基因组拼接，获得雌性栉孔扇贝的基因组；选取雌雄各20个个体进行重测序，测序深度为20x,使用bwa对clean reads同基因组进行mapping，统计各位点的覆盖深度，最终筛选获得雌性特异片段。其片段序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO:4所示。
SEQ ID NO：1的序列信息如下：
attactaactcggctcgttctctatttttctcacactttatatacataacctggatccaaagttcttatttatgtaatgcatgtaatgcaattgtgtacatatataataccaaatgctttgggtataatactatgttattctttgtaaccttcattttggaggcaataaagacaataataataataataatcgacaagggaagggagtagattattaagatagttaggagttatattattgtgaattttataaaataattgtagttttcgacgggatctccgatgggctggagaatcccaaccagtttcattatatatagattgtctactcgcaaaagatggtaaaccagtgacaatacgaccagcttcgagttgaagcttttctaatttatctgcatcagtaatagaacaaccatccaaaagttcacaacaatattctaaaataggaagtataaatgatctatatatcttactcagtgtacgtctgttaagggtatacttcagtttgcg；
SEQ ID NO：4的序列信息如下：
aggcgcatattcatttagttcgtgataaagcttaattctttgtgcggtatatttatcacatgtaaaaaagaaatggtgtgcgtcttcaatagcgaagccacatatacaacgttggttatcaataaggttgacacgatacagatctctttttaaactacgcgaacgatttcttaatcttgtatgcagaatattattttttctgtctccacagtaaaagtaatttggaacaacgggcacattaacgtctcgaatggcatttctaaatgatgagaatgtagcgctatgtcgtataatagtaggtaactggttccacagtctaacagtagaaggaaagaagaattcgttagataattcaagtctattgttaggtaggttgtaattttcagcgtttcgaagattatagtttgggttatcgacaagggaagggagtagattattaggatagttaggagttatattattgtgaattttataaaataattgtagttttcgacgggatctccgatgggctagagaatcccaaccagtttcattatatatagattgtctactcgctggatcattacttggctggacctccattgaggcatatatagacattaaaaaattattatttttcggaagattgtgtagaatgaaaccaatgtctctagtttataaagtttttattaccagactatttttgtttcgactaggtagaccgtaccagaacggaattatacctgatattgtcaaaatattaaaaaagtattcgttgtatcagagtttggaaagttttgtcgaaactggaatatttcgaaagaaaagtgattggaaaaccaaagtttataattcagttattaagtatgaggaacacaatctaaaggaacgtatgaaagcggactgt。
引物合成：根据获得的雌性特异性片段设计雌性特异性引物FSP1(用于检测序列为SEQ ID NO：1的片段)、FSP2(用于检测序列为SEQ ID NO：4的片段)，结合对照核苷酸(SEQID NO：7)设计引物Ref。具体序列见下表：
Figure BDA0003209111560000051
Figure BDA0003209111560000061
受检样品取材：采集雌性、雄性栉孔扇贝各20只。取材时性腺处于成熟期，通过肉眼观察性腺颜色可分辨性别。
DNA提取：采用传统酚氯仿法抽提栉孔扇贝闭壳肌的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对抽提的DNA进行质量检测。
PCR扩增：利用上述引物对已知性别的栉孔扇贝基因组进行扩增。
雌性特异性引物FSP1反应体系：DNA模板50ng；2×Taq PCR Master Mix 5μL；FSP1上游引物(2μM)1μL；FSP1下游引物(2μM)1μL；Ref上游引物(2μM)0.5μL；Ref下游引物(2μM)0.5μL；灭菌水补至10μL。PCR反应程序为1，95℃ 30S；2，95℃，30S；3，60℃，30S；4，72℃，40S；2-4，30个循环；5，72℃，10min；6，4℃保存。
雌性特异性引物FSP2反应体系：DNA模板50ng；2×Taq PCR Master Mix 5μL；FSP2上游引物(2μM)1μL；FSP2下游引物(2μM)1μL；Ref上游引物(2μM)0.5μL；Ref下游引物(2μM)0.5μL；灭菌水补至10μL。PCR反应程序为1，95℃ 30S；2，95℃，30S；3，60℃，30S；4，72℃，50S；2-4，30个循环；5，72℃，10min；6，4℃保存。
对PCR反应产物进行电泳检测，雌雄均扩增出376bp条带，说明PCR成功，出现长度为510bp和886bp特异性条带的为雌性个体，否则为雄性个体。
扩增结果检测及性别鉴定：配置1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，电泳结果为如图2所示：所有样品都能扩增出376bp的对照片段条带，说明PCR反应成功，1-12号样品还能扩增出长度为510bp(图2A)和886bp(图2B)的特异性条带，判定为雌性个体，13-24号样品未能扩增出雌性特异性条带，判定为雄性个体，遗传性别与表型性别一致。
实施例2：栉孔扇贝遗传性别鉴定
为了进一步验证专利所述的雌性特异性分子标记鉴定性别的适用性及有效性，选取了24个处于性腺不同发育时期未知性别的栉孔扇贝个体进行试验验证。第一组(1-8号个体)为处于增殖期的成贝，第二组(9-16号个体)为处于休止期的成贝，第三组(17-24号个体)为性别未分化的幼贝。
DNA提取：采用传统酚氯仿法抽提栉孔扇贝闭壳肌的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对抽提的DNA进行质量检测。
PCR扩增：分别利用FSP1、FSP2对未知性别的栉孔扇贝基因组进行扩增。扩增步骤参照实施例1中记载的方法。
扩增结果检测及性别鉴定：配置1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，电泳结果为如图3所示：所有样品都能扩增出376bp的对照片段条带，说明PCR反应成功，5、6、7、8、9、11、12、20、21号个体能扩增出长度为510bp(图3A)和886bp(图3B)的特异性条带，判定为雌性个体，其它样品未能扩增出雌性特异性条带，判定为雄性个体。
性腺组织学判定：将上述24个未知性别的栉孔扇贝性腺置于4％多聚甲醛中固定过夜，使用梯度甲醇进行脱水，二甲苯、石蜡透明透蜡，将组织进行石蜡包埋，使用切片机进行石蜡切片，用伊红/苏木精染色后，在显微镜下进行观察，判定栉孔扇贝性腺所处的时期及性别。切片结果显示，1-4号个体为增殖期雄性性腺，如图4A所示，5-8号个体为增殖期雌性性腺，如图4B所示。第二组(9-16号个体)和第三组(17-24号个体)切片结果分别如图4C、4D所示，无法判定性别。
第一组分子鉴定结果和性腺组织学判定结果吻合，可以证明对于未知性别的样品来说，本发明的雌性特异性分子标记可以保证对性别鉴定的有效性。第二组、第三组鉴定结果表明，对于切片无法判定雌雄的样品，分子标记也可进行性别鉴定。本发明的雌性特异性分子标记检测性别的方法不受性腺形态及发育时期等多种因素的限制，简单快速，稳定准确。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种栉孔扇贝遗传性别相关的分子标记及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 510
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
attactaact cggctcgttc tctatttttc tcacacttta tatacataac ctggatccaa 60
agttcttatt tatgtaatgc atgtaatgca attgtgtaca tatataatac caaatgcttt 120
gggtataata ctatgttatt ctttgtaacc ttcattttgg aggcaataaa gacaataata 180
ataataataa tcgacaaggg aagggagtag attattaaga tagttaggag ttatattatt 240
gtgaatttta taaaataatt gtagttttcg acgggatctc cgatgggctg gagaatccca 300
accagtttca ttatatatag attgtctact cgcaaaagat ggtaaaccag tgacaatacg 360
accagcttcg agttgaagct tttctaattt atctgcatca gtaatagaac aaccatccaa 420
aagttcacaa caatattcta aaataggaag tataaatgat ctatatatct tactcagtgt 480
acgtctgtta agggtatact tcagtttgcg 510
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
attactaact cggctcgttc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcaaactga agtataccct 20
<210> 4
<211> 886
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggcgcatat tcatttagtt cgtgataaag cttaattctt tgtgcggtat atttatcaca 60
tgtaaaaaag aaatggtgtg cgtcttcaat agcgaagcca catatacaac gttggttatc 120
aataaggttg acacgataca gatctctttt taaactacgc gaacgatttc ttaatcttgt 180
atgcagaata ttattttttc tgtctccaca gtaaaagtaa tttggaacaa cgggcacatt 240
aacgtctcga atggcatttc taaatgatga gaatgtagcg ctatgtcgta taatagtagg 300
taactggttc cacagtctaa cagtagaagg aaagaagaat tcgttagata attcaagtct 360
attgttaggt aggttgtaat tttcagcgtt tcgaagatta tagtttgggt tatcgacaag 420
ggaagggagt agattattag gatagttagg agttatatta ttgtgaattt tataaaataa 480
ttgtagtttt cgacgggatc tccgatgggc tagagaatcc caaccagttt cattatatat 540
agattgtcta ctcgctggat cattacttgg ctggacctcc attgaggcat atatagacat 600
taaaaaatta ttatttttcg gaagattgtg tagaatgaaa ccaatgtctc tagtttataa 660
agtttttatt accagactat ttttgtttcg actaggtaga ccgtaccaga acggaattat 720
acctgatatt gtcaaaatat taaaaaagta ttcgttgtat cagagtttgg aaagttttgt 780
cgaaactgga atatttcgaa agaaaagtga ttggaaaacc aaagtttata attcagttat 840
taagtatgag gaacacaatc taaaggaacg tatgaaagcg gactgt 886
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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<210> 7
<211> 376
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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ccttactacg aacgaaacaa gaagggctgg caaaacagta tccgccacaa cctcagtctg 180
aacgagtgtt tcgtcaaggt gccgagggaa ggtggaggtg aacggaaagg aaacttctgg 240
actttggacc ctgcatttaa cgacatgttt gaaaaaggaa attaccgccg acgtcgaagg 300
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggttataggg accgcagtgg 20

Claims (10)

1.一种雌性栉孔扇贝特异性分子标记，其特征在于，所述的分子标记包含有如下一种或几种片段：
1)核苷酸序列为SEQ ID NO：1的片段；
2)核苷酸序列为SEQ ID NO：4的片段；
3)与1)或2)中序列互补的片段。
2.一种鉴别栉孔扇贝性别的方法，其特征在于，所述的方法是通过检测权利要求1所述的分子标记来实现的。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法中，用于检测序列为SEQ ID NO：1的片段的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO：2，下游引物的序列为SEQ ID NO：3。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法中，用于检测序列为SEQ ID NO：4的片段的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO：5，下游引物的序列为SEQ ID NO：6。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的方法还检测雌雄栉孔扇贝共有的分子标记。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的雌雄栉孔扇贝共有的分子标记，其序列为SEQ ID NO：7。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的检测雌雄栉孔扇贝共有的分子标记的引物对，其上游引物序列为SEQ ID NO：8，下游引物序列为SEQ ID NO：9。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)获得栉孔扇贝的基因组DNA，
2)以所得的DNA为模板，使用针对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4序列设计的引物，分别加入针对SEQ ID NO：7设计的引物进行PCR反应，
3)对PCR反应产物进行电泳检测，雌雄均扩增出376bp条带，说明PCR成功，出现长度为510bp和886bp特异性条带的为雌性个体，否则为雄性个体。
9.一种鉴定栉孔扇贝遗传性别的分子检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有用于检测权利要求1所述的分子标记的引物对。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含有检测雌雄栉孔扇贝共有的分子标记的引物对。
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