CN113025728B - 活体鉴定光棘球海胆性别用dna分子标记及鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记及鉴定方法，DNA分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，鉴定方法按照如下步骤进行：采集光棘球海胆管足，提取光棘球海胆DNA；以所得到的DNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述PCR反应体系为模板30~100ng，2XPCRmix10µL，上游引物2µmol，1µL，下游引物2µmol，1µL，灭菌水补至20µl；所述PCR反应程序为98℃变性30s；98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、进行30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反应产物；对PCR反应产物进行电泳检测，扩增出长度为405bp特异性条带的为雌性个体，否则为雄性个体。

Description

活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记及鉴定方法
技术领域
本发明属于水产养殖性别鉴定技术领域，尤其涉及一种活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记及鉴定方法。
背景技术
光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus）是重要的海水养殖品种，市场价值极高，性腺组织是其唯一可食用部分。近年来，巨大的市场需求推动了养殖产业的发展，也导致了野生资源的衰退，培育优良品种及实现性控育种是目前海胆养殖产业的难题。然而，光棘球海胆不具备明显的性别二态性，在其生长发育的各个阶段都无法从外观分辨性别，这严重阻碍了光棘球海胆良种培育和单性群体养殖的进程。目前，海胆性别鉴定方法大多数需要解剖获得性腺，通过组织学切片或基因表达定量分析，无法满足活体鉴定的要求。DNA分子标记是活体性别鉴定的重要工具，不受发育时期、环境等因素的限制，使用PCR操作技术即可实现鉴定，具有操作简单快速、结果准确等优点。但是，迄今为止并没有基于DNA分子标记进行光棘球海胆活体性别鉴定的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记及鉴定方法。
本发明的技术解决方案是：一种活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。
一种基于上述的活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记的鉴定方法，其特征在于按照如下步骤进行：
a. 采集光棘球海胆管足，提取光棘球海胆DNA；
b. 以所得到的DNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物
的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2 和SEQ ID NO：3所示；所述PCR反应体系为模板30~100ng，2XPCRmix10µL，上游引物2µmol，1µL，下游引物2µmol，1µL，灭菌水补至20µl；所述PCR反应程序为98℃变性30s；98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、进行30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反应产物；
c.对PCR反应产物进行电泳检测，扩增出长度为405bp特异性条带的为雌性个体，否则为雄性个体。
本发明只需采集少量光棘球海胆的管足组织，即可实现活体性别鉴定，准确率达100%，采集管足后个体的生长状态及存活率与对照组相比无明显差异，具有操作简单、快速及可信度高等优点。
附图说明
图1是本发明实施例样本的PCR反应产物进行电泳检测结果图。
图2是本发明实施例样本性腺组织学判定结果图。
具体实施方式
本发明采用经典酚氯仿法分别提取十只雄性光棘球海胆管足的基因组DNA和十只雌性光棘球海胆管足的基因组DNA，利用Illumina Hiseq Xten测序平台，进行2b-Rad测序。根据2b-Rad测序结果进行GWAS分析，筛选性别差异的DNA标签位点。经比较发现了核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的一段长度为27bp的序列只存在于雌性个体中，在雄性个体中没有，故发明了核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示的405bp的活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记。
基于上述活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记的鉴定方法，按照如下步骤进行：
a. 分别采集18只光棘球海胆管足，可采用试剂盒法或碱裂解法提取光棘球海胆DNA；
b. 以所得到的DNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物
的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2 和SEQ ID NO：3所示；所述PCR反应体系为模板30~100ng，2XPCRmix10µL，上游引物（2µmol），1µL，下游引物（2µmol），1µL，灭菌水补至20µl；所述PCR反应程序为98℃变性30s；98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、进行30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反应产物；
c. 配制1%的琼脂糖凝胶对PCR反应产物进行电泳检测，电泳结果为如图1所示：扩增出特异性条带为雌性个体，扩增不出特异性条带为雄性个体。1引物扩增出的特异性条带长度为405bp，M表示2kbDNAladder。
结果表明18只光棘球海胆中有9只为雌性，9只为雄性，分别编号为雌性1~9、雄性1~9。
光棘球海胆性腺组织学鉴定实验：
a. 将经过本发明鉴定的18只受检个体与对照组（未经过采集管足的18只光棘球海胆）在同等条件下饲养一个月，生长状态及存活率与对照组相比无明显差异。
b. 将经过上述一个月饲养的18只受检个体性腺分别置于4%多聚甲醛中固定，用于下述性腺组织学判定；4%多聚甲醛固定过夜，倒掉固定液并用PBS洗三次，随后用30%蔗糖室温渗透2~3小时，OCT包埋机包埋性腺组织块，使用冰冻切片机进行冰冻切片，用伊红/苏木精染色后，在显微镜下拍照，判定所取得的海胆性腺性别。结果如图2所示，18个图片分别为编号1~9的雌性和编号1~9的雄性，表明本发明实施例的光棘球海胆活体性别鉴定方法准确率为100%。
序列表
<110> 大连海洋大学
<120> 活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记及鉴定方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1 )..(405)
<223> 人工序列（Artificial）
<400> 1
ggagtagtgt cccaatatcc gggcccaata tctattaaaa atcaccatgg ctgaagccat 60
ttggtctagg tcattcaact aaaggtctaa cacccccctt acattacgct ttctccgact 120
ggcttggaag tattaaacgg ccaatcataa ttgtcggacc gcgaacatca atattcatga 180
tgagcgcata gtctcgcacg ctgtacagct tgcaaggctc caagaagtac aggtctgatc 240
atggttgtag tagaaatcat ttgaattctg tcatgtatat gaaaaatgca cggttgtatt 300
tgaatttatt tttaactctg tcattattat ttaaaaaacg catagttgta gtagaaatta 360
ttgaaacacc gccatgtgta tataaaacaa acacagggtc gtagt 405
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1 )..(21)
<223> 引物
<400> 2
ggagtagtgt cccaatatcc g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1 )..(21)
<223> 引物
<400> 3
actacgaccc tgtgtttgtt t 21
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)
<400> 4
ccttacatta cgctttctcc gactggc 27

Claims (2)

1.一种活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记，其特征在于：核苷酸序列如SEQ IDNO：1 所示。
2.一种基于权利要求1所述的活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记的鉴定方法，其特征在于按照如下步骤进行：
a. 采集光棘球海胆管足，提取光棘球海胆DNA；
b. 以所得到的DNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物
的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2 和SEQ ID NO：3所示；所述PCR反应体系为模板30~100ng，2XPCRmix10µL，上游引物2µmol，1µL，下游引物2µmol，1µL，灭菌水补至20µl；所述PCR反应程序为98℃变性30s；98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、进行30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反应产物；
c.对PCR反应产物进行电泳检测，扩增出长度为405bp特异性条带的为雌性个体，否则为雄性个体。
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"Gonadal transcriptomic analysis and identification of candidate sex-related genes in Mesocentrotus nudus";Zhi-Hui Sun et al.;《Gene》;第72-81页 *
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"光棘球海胆性别特异分子标记的鉴定及应用";崔洲平;《中国硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》(第09期);第1-65页 *

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