CN113025728A - 活体鉴定光棘球海胆性别用dna分子标记及鉴定方法 - Google Patents

活体鉴定光棘球海胆性别用dna分子标记及鉴定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113025728A
CN113025728A CN202110470728.0A CN202110470728A CN113025728A CN 113025728 A CN113025728 A CN 113025728A CN 202110470728 A CN202110470728 A CN 202110470728A CN 113025728 A CN113025728 A CN 113025728A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr reaction
echinocandis
seq
dna
molecular marker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110470728.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113025728B (zh
Inventor
常亚青
孙志惠
崔洲平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Ocean University
Original Assignee
Dalian Ocean University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Ocean University filed Critical Dalian Ocean University
Priority to CN202110470728.0A priority Critical patent/CN113025728B/zh
Publication of CN113025728A publication Critical patent/CN113025728A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113025728B publication Critical patent/CN113025728B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记及鉴定方法，DNA分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，鉴定方法按照如下步骤进行：采集光棘球海胆管足，提取光棘球海胆DNA；以所得到的DNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述PCR反应体系为模板30~100ng，2XPCRmix10µL，上游引物2µmol，1µL，下游引物2µmol，1µL，灭菌水补至20µl；所述PCR反应程序为98℃变性30s；98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、进行30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反应产物；对PCR反应产物进行电泳检测，扩增出长度为405bp特异性条带的为雌性个体，否则为雄性个体。

Description

活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记及鉴定方法
技术领域
本发明属于水产养殖性别鉴定技术领域，尤其涉及一种活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记及鉴定方法。
背景技术
光棘球海胆（Strongylocentrotus nudus）是重要的海水养殖品种，市场价值极高，性腺组织是其唯一可食用部分。近年来，巨大的市场需求推动了养殖产业的发展，也导致了野生资源的衰退，培育优良品种及实现性控育种是目前海胆养殖产业的难题。然而，光棘球海胆不具备明显的性别二态性，在其生长发育的各个阶段都无法从外观分辨性别，这严重阻碍了光棘球海胆良种培育和单性群体养殖的进程。目前，海胆性别鉴定方法大多数需要解剖获得性腺，通过组织学切片或基因表达定量分析，无法满足活体鉴定的要求。DNA分子标记是活体性别鉴定的重要工具，不受发育时期、环境等因素的限制，使用PCR操作技术即可实现鉴定，具有操作简单快速、结果准确等优点。但是，迄今为止并没有基于DNA分子标记进行光棘球海胆活体性别鉴定的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记及鉴定方法。
本发明的技术解决方案是：一种活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记，核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示。
一种基于上述的活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记的鉴定方法，其特征在于按照如下步骤进行：
a. 采集光棘球海胆管足，提取光棘球海胆DNA；
b. 以所得到的DNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物
的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2 和SEQ ID NO：3所示；所述PCR反应体系为模板30~100ng，2XPCRmix10µL，上游引物2µmol，1µL，下游引物2µmol，1µL，灭菌水补至20µl；所述PCR反应程序为98℃变性30s；98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、进行30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反应产物；
c.对PCR反应产物进行电泳检测，扩增出长度为405bp特异性条带的为雌性个体，否则为雄性个体。
本发明只需采集少量光棘球海胆的管足组织，即可实现活体性别鉴定，准确率达100%，采集管足后个体的生长状态及存活率与对照组相比无明显差异，具有操作简单、快速及可信度高等优点。
附图说明
图1是本发明实施例样本的PCR反应产物进行电泳检测结果图。
图2是本发明实施例样本性腺组织学判定结果图。
具体实施方式
本发明采用经典酚氯仿法分别提取十只雄性光棘球海胆管足的基因组DNA和十只雌性光棘球海胆管足的基因组DNA，利用Illumina Hiseq Xten测序平台，进行2b-Rad测序。根据2b-Rad测序结果进行GWAS分析，筛选性别差异的DNA标签位点。经比较发现了核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的一段长度为27bp的序列只存在于雌性个体中，在雄性个体中没有，故发明了核苷酸序列如SEQ ID NO：1 所示的405bp的活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记。
基于上述活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记的鉴定方法，按照如下步骤进行：
a. 分别采集18只光棘球海胆管足，可采用试剂盒法或碱裂解法提取光棘球海胆DNA；
b. 以所得到的DNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物
的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2 和SEQ ID NO：3所示；所述PCR反应体系为模板30~100ng，2XPCRmix10µL，上游引物（2µmol），1µL，下游引物（2µmol），1µL，灭菌水补至20µl；所述PCR反应程序为98℃变性30s；98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、进行30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反应产物；
c. 配制1%的琼脂糖凝胶对PCR反应产物进行电泳检测，电泳结果为如图1所示：扩增出特异性条带为雌性个体，扩增不出特异性条带为雄性个体。1引物扩增出的特异性条带长度为405bp，M表示2kbDNAladder。
结果表明18只光棘球海胆中有9只为雌性，9只为雄性，分别编号为雌性1~9、雄性1~9。
光棘球海胆性腺组织学鉴定实验：
a. 将经过本发明鉴定的18只受检个体与对照组（未经过采集管足的18只光棘球海胆）在同等条件下饲养一个月，生长状态及存活率与对照组相比无明显差异。
b. 将经过上述一个月饲养的18只受检个体性腺分别置于4%多聚甲醛中固定，用于下述性腺组织学判定；4%多聚甲醛固定过夜，倒掉固定液并用PBS洗三次，随后用30%蔗糖室温渗透2~3小时，OCT包埋机包埋性腺组织块，使用冰冻切片机进行冰冻切片，用伊红/苏木精染色后，在显微镜下拍照，判定所取得的海胆性腺性别。结果如图2所示，18个图片分别为编号1~9的雌性和编号1~9的雄性，表明本发明实施例的光棘球海胆活体性别鉴定方法准确率为100%。
序列表
<110> 大连海洋大学
<120> 活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记及鉴定方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1 )..(405)
<223> 人工序列（Artificial）
<400> 1
ggagtagtgt cccaatatcc gggcccaata tctattaaaa atcaccatgg ctgaagccat 60
ttggtctagg tcattcaact aaaggtctaa cacccccctt acattacgct ttctccgact 120
ggcttggaag tattaaacgg ccaatcataa ttgtcggacc gcgaacatca atattcatga 180
tgagcgcata gtctcgcacg ctgtacagct tgcaaggctc caagaagtac aggtctgatc 240
atggttgtag tagaaatcat ttgaattctg tcatgtatat gaaaaatgca cggttgtatt 300
tgaatttatt tttaactctg tcattattat ttaaaaaacg catagttgta gtagaaatta 360
ttgaaacacc gccatgtgta tataaaacaa acacagggtc gtagt 405
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1 )..(21)
<223> 引物
<400> 2
ggagtagtgt cccaatatcc g 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1 )..(21)
<223> 引物
<400> 3
actacgaccc tgtgtttgtt t 21
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)
<400> 4
ccttacatta cgctttctcc gactggc 27

Claims (2)

1.一种活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记，其特征在于：核苷酸序列如SEQ IDNO：1 所示。
2.一种基于权利要求1所述的活体鉴定光棘球海胆性别用DNA分子标记的鉴定方法，其特征在于按照如下步骤进行：
a. 采集光棘球海胆管足，提取光棘球海胆DNA；
b. 以所得到的DNA为模板，进行PCR反应，所述PCR反应上下游引物
的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2 和SEQ ID NO：3所示；所述PCR反应体系为模板30~100ng，2XPCRmix10µL，上游引物2µmol，1µL，下游引物2µmol，1µL，灭菌水补至20µl；所述PCR反应程序为98℃变性30s；98℃变性10s、60℃退火15s、72℃延伸1min、进行30个循环；72℃后延伸5min；4℃保存PCR反应产物；
c.对PCR反应产物进行电泳检测，扩增出长度为405bp特异性条带的为雌性个体，否则为雄性个体。
CN202110470728.0A 2021-04-29 2021-04-29 活体鉴定光棘球海胆性别用dna分子标记及鉴定方法 Active CN113025728B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110470728.0A CN113025728B (zh) 2021-04-29 2021-04-29 活体鉴定光棘球海胆性别用dna分子标记及鉴定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110470728.0A CN113025728B (zh) 2021-04-29 2021-04-29 活体鉴定光棘球海胆性别用dna分子标记及鉴定方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113025728A true CN113025728A (zh) 2021-06-25
CN113025728B CN113025728B (zh) 2023-05-23

Family

ID=76454773

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110470728.0A Active CN113025728B (zh) 2021-04-29 2021-04-29 活体鉴定光棘球海胆性别用dna分子标记及鉴定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113025728B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006067804A (ja) * 2004-08-31 2006-03-16 Hokkaido Technology Licence Office Co Ltd ウニ内臓由来プロテアーゼ
CN108411002A (zh) * 2018-05-22 2018-08-17 大连海洋大学 用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的pcr引物及鉴别方法
CN109652523A (zh) * 2019-01-16 2019-04-19 中国水产科学研究院黄海水产研究所 斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006067804A (ja) * 2004-08-31 2006-03-16 Hokkaido Technology Licence Office Co Ltd ウニ内臓由来プロテアーゼ
CN108411002A (zh) * 2018-05-22 2018-08-17 大连海洋大学 用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的pcr引物及鉴别方法
CN109652523A (zh) * 2019-01-16 2019-04-19 中国水产科学研究院黄海水产研究所 斑石鲷雄性特异dna标记及遗传性别鉴定方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHI-HUI SUN ET AL.: ""Gonadal transcriptomic analysis and identification of candidate sex-related genes in Mesocentrotus nudus"", 《GENE》 *
ZHOUPING CUI ET AL.: ""Identification of Sex-Specific Markers Through 2b-RAD Sequencing in the Sea Urchin (Mesocentrotus nudus)"", 《FRONTIERS IN GENETICS》 *
崔洲平: ""光棘球海胆性别特异分子标记的鉴定及应用"", 《中国硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113025728B (zh) 2023-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112176049B (zh) 仿刺参活体性别鉴定用dna分子标记及鉴定方法
WO2016180009A1 (zh) 一种用于凡纳滨对虾遗传性别鉴定的dna探针序列及获取方法
CN110607359B (zh) 一种虾夷扇贝雌性特异性标记组合及应用
CN111088370B (zh) 一种卵形鲳鲹性别特异性分子标记引物、鉴别方法及其应用
CN105543249B (zh) 一种美丽库蠓特异基因及其分子鉴定方法
CN104878099B (zh) 山羊atbf1基因单核苷酸多态性的检测方法及其应用
CN109880890A (zh) 一种山羊hiat1基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用
CN105039364A (zh) 一种伊蚊dna条形码标准基因序列及其应用
CN117004701B (zh) 一种仿刺参性别鉴定的分子标记及应用
CN109852703A (zh) 一种与暗纹东方鲀肥满度相关的snp分子标记及其应用
CN111471756A (zh) 用于鲟鱼性别鉴定的特异性dna片段ssm1及应用
CN109880893B (zh) 用于丝尾鱯性别鉴定的特异性dna片段及应用
CN105349543A (zh) 用于中国明对虾遗传性别鉴定的dna序列及其获取和应用
CN113604584B (zh) 一种栉孔扇贝遗传性别相关的分子标记及其应用
CN112239779B (zh) 一种卵形鲳鲹性别快速鉴定引物、试剂盒及其应用
CN108441566A (zh) 一种山羊atbf1基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用
CN105349691A (zh) 一种鉴定中国明对虾遗传性别的dna序列标签及其应用
CN112680533A (zh) 一种快速准确鉴定鲟鱼性别的方法
CN113025728A (zh) 活体鉴定光棘球海胆性别用dna分子标记及鉴定方法
CN113046446A (zh) 光棘球海胆活体性别鉴定用dna分子标记及鉴定方法
CN110607376A (zh) 一种基于dna分子标记的虾夷扇贝活体性别鉴定方法
CN110172525A (zh) 林木差异表达基因ssr引物组及多态性ssr标记开发方法
CN102649958B (zh) 与猪生长速度相关的遗传标记及其应用
CN102134600B (zh) 一种朱鹮性别鉴定的pcr方法
CN108754015A (zh) 用于青杨雌性幼苗快速鉴定的特异性分子标记pcmi-f001

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant