CN115232868B - 一种用于鸸鹋性别鉴定的pcr引物、试剂盒及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于鸸鹋性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法，通过本发明的PCR引物进行PCR扩增和毛细管电泳，利用毛细管电泳结果的峰数来确定鸸鹋的性别，具有操作简单方便，鉴别结果快速准确，便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景，此外，基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。

Description

一种用于鸸鹋性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鸸鹋性别鉴定的PCR引物、试剂盒及其方法。

背景技术

鸸鹋原产于澳大利亚，浑身都是宝，肉质鲜美，皮柔韧、美丽、透气性好，蛋可以用来雕刻成工艺品，具有较高的养殖经济价值。鸸鹋适应能力比较强，在我国已经有了一定的养殖面积。鸸鹋的初生时，很难确定幼鸟的性别，要到接近性成熟时，才能凭经验进行鉴别。目前鸸鹋已经可以人工授精，需要的母鸸鹋的数量要远远大于公鸸鹋的数量。因此，早期确定鸸鹋的性别非常重要，可以提前将不需要的公鸸鹋淘汰掉，提高养殖效益。

鸟类的性别是由染色体决定的，其性别决定方式为ZW型，雄鸟有一对Z染色体，而雌鸟则是一个Z染色体和一个W染色体。染色体螺旋蛋白基因(Chromo helicase DNA-Binding gene,CHD)为鸟类W染色体第一个功能性基因，CHD基因在非平胸鸟类(除鸸鹋、鸵鸟以外的大部分鸟类)有两个同源拷贝CHD-Z和CHD-W，分别为Z连锁和W连锁，两个拷贝的内含子序列大小有很大差别，可以进行性别鉴定。鸸鹋等平胸鸟类Z染色体和W染色体的上的基因高度同源，现有技术无法根据序列长度的差异进行性别鉴定。

虽然有研究利用Z染色体和W染色体上同源基因的碱基突变位点不同进行鸸鹋的性别鉴定，如：付晶等建立的方法(付晶,白秀娟.鸸鹋性别鉴定的分子标记方法[J].东北农业大学学报,2010,41(6):85-89)，设计一对引物，在雄性鸸鹋中不能扩增出片段，雌性鸸鹋中能扩增出1条片段。Koshiishi等建立的方法，设计3条引物，在雄性鸸鹋扩增出1条片段，雌性鸸鹋中能扩增出2条片段。(Koshiishi Y,Wada K.A simplified protocol formolecular sexing in the emu(Dromaius novaehollandiae).Poult Sci.2018；97(4):1117-1119.)。但这些方法极易产生假阴性，如：付晶等方法中，扩增不出来有可能是样本本身是雄性，也有可能是PCR本身的问题。Koshiishi等方法中，3条引物两两结合本身就存在竞争关系，扩增出1条片段可能是样本本身是雄性，也有可能PCR本身的问题，另外一条片段没扩增出来，导致错判。

随着我国鸸鹋产业的快速发展，亟需开发一种简单方便，能够快速、准确鉴别鸸鹋性别的方法。

发明内容

本发明目的在于解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种设计合理，可用于鸸鹋早期性别快速鉴定的PCR引物。

本发明通过以下技术方案实现本发明的目的：

本发明目的之一在于提供一种性别鉴定用PCR引物，所述引物序列如下所示。即所述引物的核苷酸序列为：

正向引物：5'-AGCATGTGGCAGAGGTA-3'；

反向引物：5'-TGATGATGGCATTGGAC-3'。

本发明目的之二在于提供包含本发明所述的性别鉴定用PCR引物的试剂盒。

在本发明的一种实施例中，本发明所述的试剂盒包含本发明所述的PCR引物、PCR反应液，在一些实施例中，还可以包含DNA提取液。

本发明目的之三在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在养殖业中的应用。

本发明目的之四在于提供本发明所述的PCR引物或本发明所述的试剂盒在鸸鹋性别鉴定中的应用。

本发明所述的在鸸鹋性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行PCR扩增，毛细管电泳结果呈现272bp一个峰的为公鸸鹋，呈现272bp和282bp的两个峰时为母鸸鹋。

本发明所述的方法，步骤1)提取待测鸸鹋的基因组DNA可以按照本领域常规方法提取，例如可以选用包括但不限于羽毛、血液、组织、器官等进行待测鸸鹋的基因组DNA的提取。

本发明所述的方法，步骤2)中PCR反应体系可以为本领域的常规体系，在本发明的一种具体的实施方式中，2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正向和反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。

本发明所述的方法，步骤2)中PCR反应程序可以为本领域的常规体系，在本发明的一种具体的实施方式中，为：95℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃30s)35循环，72℃3min。

本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明通过设计的PCR引物，进行PCR扩增和毛细管电泳，利用毛细管电泳结果的峰数来确定鸸鹋的性别，具有操作简单方便，鉴别结果快速准确，便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景，此外，基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。

本发明的引物对鸸鹋品种限制性小，因此对于所述的本发明所述的鸸鹋没有具体品种的限制。

附图说明

图1为本发明实施例1公鸸鹋的PCR扩增产物的毛细管电泳图谱。

图2为本发明实施例1母鸸鹋的PCR扩增产物的毛细管电泳图谱。

图3～图13为本发明实施例2鸸鹋的PCR扩增产物的毛细管电泳图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

1已知性别鸸鹋鉴定

1.1样品采集

采集2只已知性别的成年鸸鹋，编号1为公鸸鹋，2为母鸸鹋，使用本发明设计引物扩增鸸鹋基因组。

正向引物：5'-AGCATGTGGCAGAGGTA-3'；5’端加上FAM荧光标记。

反向引物：5'-TGATGATGGCATTGGAC-3'。

1.2PCR扩增

PCR反应体系为：

2×PCR Mix(南京诺唯赞生物有限公司)25μL，10μmol/L正向和反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。

PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃30s)35循环，72℃3min。。

1.3毛细管电泳检测

反应结束后，PCR产物在ABI 3730分析仪进行基因型分型。公鸸鹋只有一个272bp的峰见结果如图1，母鸸鹋有272bp和282bp的两个峰，见结果如图2。

以上结果表明本发明能够快速准确对鸸鹋进行性别鉴定，并且简单易于操作。

实施例2

2未知性别鸸鹋鉴定

2.1样品采集

采集11只未知性别的雏鸸鹋，使用本发明设计的如下引物和扩增鸸鹋基因组。

正向引物：5'-AGCATGTGGCAGAGGTA-3'；5’端加上FAM荧光标记。

反向引物：5'-TGATGATGGCATTGGAC-3'。

2.2PCR扩增

PCR反应体系为：

2×PCR Mix(上海生工生物有限公司)12.5μL，10μmol/L正向和反向引物各0.5μL，50-100μg/ml模板DNA 1μL，超纯水10.5μL。

PCR反应程序为：95℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃30s)35循环，72℃3min。

2.3毛细管电泳检测

反应结束后，PCR产物在ABI 3730分析仪进行基因型分型，见结果如图3～图11(其中3、6、9、11、13为公鸸鹋，4、5、7、8、10、12为母鸸鹋)。

供试样本成年后，通过外观观察，验证以上鉴定结果准确率100％。

Claims (5)

1.PCR引物在鸸鹋性别鉴定中的应用，具体为对待测鸸鹋的基因组DNA进行PCR扩增，

电泳结果呈现272bp一个峰的为公鸸鹋，呈现272bp和282bp的两个峰时为母鸸鹋；

所述引物如下：

正向引物：5'-AGCATGTGGCAGAGGTA-3'；

反向引物：5'-TGATGATGGCATTGGAC-3'。

2.一种鸸鹋的性别快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测鸸鹋的基因组DNA；

2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增反应；所述引物如下：正向引物：5'-AGCATGTGGCAGAGGTA -3'；

反向引物：5'-TGATGATGGCATTGGAC-3'；

3)PCR产物进行毛细管电泳检测，电泳结果呈现272bp一个峰的为公鸸鹋，呈现272bp和282bp的两个峰的为母鸸鹋。

3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤1)提取待测家禽的基因组DNA选用羽毛、血液、组织或器官进行基因组DNA的提取。

4.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤2)中PCR反应体系为：2×PCR Mix25μL，10μmol/L正向和反向引物各1μL，50-100μg/ml模板DNA 2μL，超纯水21μL。

5.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤2)中PCR反应程序为：95℃ 5min，然后95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，35循环，72℃ 10min。

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