CN108384859A - 与脂尾型绵羊的尾型性状相关的snp标记及应用 - Google Patents

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Abstract

一种与脂尾型绵羊的尾型性状相关的SNP标记及应用，属生物领域，该SNP标记位于绵羊第8号染色体第87804589碱基对，该位置碱基为T的绵羊具有短尾性状，此处碱基为G时拥有正常尾长。本发明还提供了检测SNP标记的引物及含有该引物的试剂盒，采用聚合酶链式反应(PCR)和测序技术筛选到与脂尾型绵羊尾型性状相关的SNP标记，并通过限制片段多态性(RFLP)方法来检测待测绵羊的基因型。及SNP标记在鉴定脂尾型绵羊尾型性状中的应用和在中国绵羊育种中的应用。根据基因型进行脂尾型绵羊尾型性状优势品种的选育,从而加快脂尾型绵羊的育种进程｡

Description

与脂尾型绵羊的尾型性状相关的SNP标记及应用
技术领域
本发明涉及一种与脂尾型绵羊的尾型性状相关的SNP标记及应用。
背景技术
随着人们对羊肉需求上升，养羊业也早已成为畜牧生产非常重要的组成部分。在内蒙古乃至我国的养羊产业中，一个重要的问题是羊尾巴脂肪沉积问题。全世界大约有25%的绵羊品种属于脂尾(臀)型(fat tail/fat rump)绵羊品种，这类品种具有超强的尾部脂肪沉积能力，一些品种如大尾寒羊尾脂含量甚至超过总胴体重的25%。改革开放前,羊尾脂肪,作为食用油脂被食用｡而现在羊尾脂肪已经很少用于食用，高脂肉类逐渐受到冷落，大脂尾型绵羊品种从饲养成本、效益的角度考虑，也难以更好推广。有学者研究，生产1kg脂肪消耗的饲草可产生2kg瘦肉，显然过多的尾脂沉积会加大饲养成本。从经济角度来说，每只羊臀部及尾部沉积脂肪少则3-4kg，多则7-8kg，因此羊肉加工企业在收购胴体羊时一般都要去除羊尾巴后再计算价格收购，造成养殖户效益损失。此外，牧民已经结束游牧状态，定居后，羊场圈舍保温措施得以加强，绵羊尾脂的“能量蓄积”、“保命”作用也已经淡化。因此在肉羊饲养过程中，养殖短尾羊、或者人为去除羊尾(断尾)逐渐成为养羊业必然选择，短尾或者“断尾”还可以利于生殖交配和减少生殖道寄生虫等疫病发生。由于“断尾”在自然放牧的草原地区增加了劳动量，对于羊本身也是十分痛苦的，动物福利一直受到质疑。此外，在北方寒冷地区，按照人工断尾方法，完全去除尾部，会导致肛门、外阴等暴露，产生冻疮，夏季易生寄生虫等。因此，脂尾型短尾羊培育成为未来肉羊育种的重要发展方向。
单核苷酸多态性标记(SNP)主要是指在基因组脱氧核酸(DNA)序列上由单个脱氧核苷酸的变异所引起的DNA片段的多态性。SNP的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现的形式有替换、插入和缺失等。SNP的检测方法，目前常用的包括：Sanger测序、DNA芯片、飞行时间质谱、以及最新的高通量二代测序等技术。通过检测单核苷酸多态性标记检测基因型是近些年兴起的一种方法。SNP作为遗传标记已经广泛地应用于基因定位、克隆、遗传育种以及遗传多样性等研究领域。分子标记在动物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种方法，分子育种大大加快了选育效率，节省了育种时间，使得育种学家可以在分子水平上不断探索并选育更优良的家畜品种。
发明内容
本发明的目的是提供一种与脂尾型绵羊的尾型性状相关的SNP标记及应用｡
本发明的另一目的是提供检测该分子标记的试剂盒。
本发明的再一目的是提供鉴定脂尾型绵羊尾型性状的方法。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种与脂尾型绵羊的尾型性状相关的SNP标记，其特征在于：其核苷酸序列如序列1所示，在该序列的第186bp的碱基为G或T。
本发明的与脂尾型绵羊的尾型性状相关的SNP标记，其特征在于：通过序列表的序列2所示的单链DNA分子和序列表的序列3所示的单链DNA分子组成的特异引物对扩增获得。
本发明提供了上述SNP标记在鉴定脂尾型绵羊尾型性状中的应用。
进一步地，当绵羊T基因如序列1所述186bp处，即8号染色体第87804589bp处，该位置碱基为 T 的绵羊具有短尾性状，此处碱基为G时拥有正常尾长｡
本发明提供上述SNP标记在中国脂尾型绵羊育种中的应用，包括以下步骤：检测待测脂尾型绵羊的 8号染色体第87804589 bp的基因型，TT 及T/G基因型的待测脂尾型绵羊的表现为短尾，GG基因型的待测脂尾型绵羊的表现为正常尾；所述8号染色体第87804589 bp为以所述待测样本的基因组 DNA 为模板用所述特异引物对进行 PCR 扩增得到的 PCR 扩增产物中第 186 位核苷酸。
本发明提供用于检测上述SNP标记的特异性引物，其特征在于：包括：
正向引物：5’- CACAAGAAGGTGCAGAGTCACA -3’；
反向引物：5’- CCTGCCTTTGGCCTCACGAT -3’。
本发明提供上述特异性引物在鉴定脂尾型绵羊尾型性状中的应用，以及在中国绵羊育种中的应用｡
本发明提供含有上述特异性引物的试剂盒在鉴定脂尾型绵羊尾型性状中的应用，以及在中国绵羊育种中的应用｡
本发明还提供了一种鉴定脂尾型绵羊尾型性状中的方法，其特征在于：它包括以下步骤 :
(1)、提取待测绵羊基因组DNA，以其为模板；
(2)、利用特异性引物，正向引物：5’- CACAAGAAGGTGCAGAGTCACA -3’；反向引物：5’-CCTGCCTTTGGCCTCACGAT -3’，进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；
配制50μl PCR 反应体系：50 ng/μl模板DNA 4μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各2μl，2×Taq PCR MasterMix 25μl，17μl去离子水；
PCR反应使用的扩增程序为：94℃，5分钟；94℃，30秒；57℃，30秒；72℃，30秒；35 个循环；72℃，10分钟，4℃保存；
（3）、PCR 扩增产物采用酶切法进行鉴定，具体为：用内切酶 PasI对 PCR 扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；如果检测结果为187bp和206bp的两条带，则待测脂尾型绵羊属于具有携带短尾性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT 型；检测结果仅为一条390bp的带，则待测脂尾型绵羊属于纯合GG基因型的正常尾长个体；检测结果为390bp、187bp和206bp三条带，则待测脂尾型绵羊属于具有携带短尾性状基因的优势品种，且基因型为杂合 TG 型。
本发明具有以下优点 :
(1)本发明提供的分子标记不受脂尾型绵羊品种、年龄、个体大小等限制，可用于脂尾型绵羊尾型性状的早期选育，甚至刚出生即可进行准确地筛选，可显著促进脂尾型绵羊的育种进程｡
(2)检出脂尾型绵羊T基因单核苷酸多态性的方法准确可靠，操作简便，普通实验室就可以进行检测，大大节省了获得结果的时间｡
(3)进行SNP基因检测，实现了低成本、高精度、高通量的闭管操作，大大降低了实验过程中由污染可能导致的误差。
(4)脂尾型绵羊T基因的SNP位点的检出，为脂尾型绵羊尾型性状的标记辅助选择提供了科学依据｡
附图说明
图 1为作为对照组的三种基因型测序峰图：分别为TT型、GG型、T/G型。
图 2为本发明对样本进行 PCR 检测结果。
图 3 相应样品酶切检测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1：一种与脂尾型绵羊的尾型性状相关的SNP标记的确定及检测该位点方法和应用
1、样本采集及DNA提取
随机采集乌珠穆沁羊、苏尼特羊、巴尔虎羊、呼伦贝尔短尾羊群体中各10只羊的EDTA抗凝血样，采用常规血液基因组提取试剂盒提取血液中的基因组DNA；
2、特异性引物序列
根据NCBI数据库收录的T基因座位的序列，设计针对筛选到的T基因SNP位点引物，引物序列为：正向引物(序列表序列2)：5’- CACAAGAAGGTGCAGAGTCACA -3’；反向引物(序列表序列3)：5’- CCTGCCTTTGGCCTCACGAT -3’。
3、体外扩增目的片段
（1）配制50μl PCR 反应体系：
50 ng/μl模板DNA 4μl，
10pmol/μl正向引物和反向引物各2μl，
2×Taq PCR MasterMix 25μl，
17μl去离子水；
（2）PCR反应使用的扩增程序为：
94℃，5分钟；94℃，30秒；57℃，30秒；72℃，30秒；35个循环；72℃， 10分钟；4℃保存；
4、酶切鉴定
（1）PCR产物用PasI酶进行酶切，
（2）配制20μl的酶切反应体系：
PasI内切酶1μl，
10×Buffer 2μl，
PCR产物 5μl，
加去离子水水12μl，
55℃反应6h；
（3）琼脂糖电泳对酶切产物进行检测：
A、如果检测结果为187bp和206bp的两条带，则待测脂尾型绵羊属于于具有携带短尾性状基因的优势品种，且基因型为纯和 TT 型；
B、检测结果仅为一条390bp的带，则待测脂尾型绵羊属于纯合GG基因型的正常尾长个体；
C、检测结果为390bp､187bp和206bp三条带，则待测脂尾型绵羊属于于具有携带短尾性状基因的优势品种，且基因型为杂合 TG 型。
5、上述SNP标记在中国脂尾型绵羊育种中的应用
该SNP标记作为脂尾型绵羊的尾型性状的分子标记，待测脂尾型绵羊为尾部性状未知或者将要配种生产的亲本，检测待测脂尾型绵羊的 8号染色体第87804589 bp的基因型，TT及T/G基因型的待测脂尾型绵羊的表现为短尾，GG基因型的待测脂尾型绵羊的表现为正常尾；所述8号染色体第87804589 bp为以所述待测样本的基因组 DNA 为模板用所述特异引物对进行 PCR 扩增得到的 PCR 扩增产物中第 186 位核苷酸。
实施例2：鉴定脂尾型绵羊尾型性状的试剂盒及应用
试剂盒中各成份组成如下：
10pmol/μl上游引物 100μl
10pmol/μl下游引物 100μl
2×Taq PCR MasterMix 1.25ml
Pas I内切酶 50μl
10×Buffer 100μl
去离子水 2ml，
试剂盒中的总PCR反应体系：
去离子水 补至50μl
2×Taq PCR MasterMix 25μl
模板DNA 200ng
10pmol/μl上游引物 2μl
10pmol/μl下游引物 2μl；
PCR反应程序：
94℃，5分钟；94℃，30秒；57℃，30秒；72℃，30秒；35 个循环；72℃，10分钟，4℃保存。
试剂盒中的Pas I酶切反应体系：
PasI内切酶 1μl
10×Buffer 2μl
PCR产物 5μl
去离子水水 12μl。
Pas I反应程序：
55℃反应6h。
反应所得产物为目的核苷酸片断，如序列表1所示，检测该序列186bp处位置碱基，该位置碱基为 T 的绵羊具有短尾性状，此处碱基为G时拥有正常尾长。采用本申请上述引物对待测DNA进行PCR扩增，扩增产物经酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择不同的带型PCR产物进行鉴定。
如果检测结果为187bp和206bp的两条带，则待测脂尾型绵羊属于具有携带短尾性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT 型；检测结果仅为一条390bp的带，则待测脂尾型绵羊属于纯合GG基因型的正常尾长个体；检测结果为390bp、187bp和206bp三条带，则待测脂尾型绵羊属于具有携带短尾性状基因的优势品种，且基因型为杂合 TG 型。
SEQUENCE LISTING
<110> 内蒙古农业大学
<120> 与脂尾型绵羊的尾型性状相关的SNP标记及应用
<130> 2017.12
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 390
<212> DNA
<213> Ovis aries
<400> 1
cctgcctttg gcctcacgat cccatcgggg tcctccagct gcgccccttc cttttcagga 60
ggatgttccc ggtgctgaag gtgaacgtat ccggcctgga ccccaacgcc atgtactcct 120
tcctgctgga cttcgtggcc gccgacaacc accgctggaa gtacgtgaac ggggagtggg 180
tgccctgggg caagccagag ccgcaggcgc ccagctgcgt ctacatccac cccgactccc 240
ccaacttcgg ggcgcactgg atgaaggcac ctgtctcctt cagcaaagtc aagctcacca 300
acaagctcaa tggagggggc caggtaggtg tgagggctgg agggtggggg ccgactctag 360
gaggggcctg tgactctgca ccttcttgtg 390
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cacaagaagg tgcagagtca ca 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctgcctttg gcctcacgat 20

Claims (10)

1.一种与脂尾型绵羊的尾型性状相关的SNP标记，其特征在于：其核苷酸序列如序列1所示，在该序列的第186bp的碱基为G或T。
2.根据权利要求1所述SNP标记，其特征在于：通过序列表的序列2所示的单链DNA分子和序列表的序列3所示的单链DNA分子组成的特异引物对扩增获得。
3.权利要求1或2所述SNP标记在鉴定脂尾型绵羊尾型性状中的应用。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于：当绵羊T基因如序列1所述186bp处，即8号染色体第87804589bp处，该位置碱基为 T 的绵羊具有短尾性状，此处碱基为G时拥有正常尾长。
5.权利要求1或2所述SNP标记在中国绵羊育种中的应用。
6.用于检测权利要求1或2 所述SNP标记的特异性引物，其特征在于：包括：
正向引物：5’- CACAAGAAGGTGCAGAGTCACA -3’；反向引物：5’- CCTGCCTTTGGCCTCACGAT-3’。
7.含有权利要求6所述SNP标记的特异性引物的试剂盒。
8.权利要求6所述SNP标记的特异性引物或权利要求7所述SNP标记的特异性引物的试剂盒在鉴定脂尾型绵羊尾型性状中的应用。
9.权利要求6所述SNP标记的特异性引物或权利要求7所述SNP标记的特异性引物的试剂盒在中国绵羊育种中的应用。
10.一种鉴定脂尾型绵羊尾型性状中的方法，其特征在于：它包括以下步骤 :
(1)、提取待测绵羊基因组DNA，以其为模板；
(2)､利用特异性引物，正向引物：5’- CACAAGAAGGTGCAGAGTCACA -3’；反向引物：5’-CCTGCCTTTGGCCTCACGAT -3’，进行PCR扩增反应，获得扩增产物片段；
配制50μl PCR 反应体系：50 ng/μl模板DNA 4μl，10pmol/μl正向引物和反向引物各2μl，2×Taq PCR MasterMix 25μl，17μl去离子水；
PCR反应使用的扩增程序为：94℃，5分钟；94℃，30秒；57℃，30秒；72℃，30秒；35 个循环；72℃，10分钟，4℃保存；
（3）、PCR 扩增产物采用酶切法进行鉴定，具体为：用内切酶 PasI对 PCR 扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；如果检测结果为187bp和206bp的两条带，则待测脂尾型绵羊属于具有携带短尾性状基因的优势品种，且基因型为纯和TT 型；检测结果仅为一条390bp的带，则待测脂尾型绵羊属于纯合GG基因型的正常尾长个体；检测结果为390bp、187bp和206bp三条带，则待测脂尾型绵羊属于具有携带短尾性状基因的优势品种，且基因型为杂合 TG 型。
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