CN103849618A - 与猪胴体和肉质性状相关的snp分子标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种猪胴体和肉质性状相关的SNP分子标记的制备与应用。从猪RTL1基因中克隆获得一种作为分子标记应用的猪胴体和肉质性状的基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，在序列表SEQ ID NO：1和附图4所示的序列中第363bp处有一个T/G的碱基替换，第395bp处有一个T/C的碱基替换，这两处突变位点的等位基因频率在中外猪种中存在显著的差异。本发明还公开了制备猪胴体和肉质性状分子标记的方法以及制备的分子标记在猪胴体和肉质性状多态性检测中的应用，为猪的标记辅助选择提供了一个新的标记。

Description

与猪胴体和肉质性状相关的SNP分子标记及应用

技术领域

本发明属于猪的分子标记制备技术领域，具体涉及一种猪RTL1基因的5’侧翼启动子区SNP作为猪胴体和肉质性状相关的分子标记及应用。

背景技术

培育具有优质、高产、高效瘦肉型猪一直是猪育种学家研究的重点。重要经济性状通过表型选择等常规育种方法进行遗传改良，所需时间长、成本高；随着分子生物学技术的发展，逐步出现了以分子标记为核心的分子标记辅助选择和分子标记渗入等分子育种技术，这些技术与常规育种技术相结合大大加速了猪育种的进程。分子标记辅助选择是基因工程在现代家畜育种中的一项重要应用，通过分子标记的方法，不仅能缩短育种时限，大大减少育种的人力物力消耗；另外，分子标记的多样性更使得分子标记在动物育种中的应用潜力大大提高（鲁绍熊,吴常信.,2000）。用于辅助选择的分子标记包括蛋白质标记，微卫星标记，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，简称SNP)标记等。

SNP标记指由基因组单核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括碱基转换、颠换、单碱基插入或缺失等，被公认为是最新的第三代DNA分子标记。根据SNP在基因中的位置可分为基因编码区SNP(coding-region SNP cSNP)、基因周边SNP(perigenic SNP，pSNP)以及基因间SNP(intergenic SNP，iSNP)三类。启动子是真核生物基因表达调控的顺式作用元件，含有基因表达调控网络的重要信息，基因表达的强度以及特异性很大程度上决定于它。因此，研究功能基因5’侧翼序列启动子中的SNP可能有更重要的生物学功能，能够影响基因的表达。

反转录转座子1(retrotransposon-like-1,RTL1)基因，又名父本表达基因11(paternallyexpressed gene11,PEG11)，定位于人的14号染色体长臂(HSA14q32.2)，位于母本表达基因MEG3和MEG8之间，但RTL1基因是一个父本表达基因，包含一个无内含子的ORF（OpenReading Frame），编码1358aa(Kagami et al.,2008)；在鼠上定位于12号染色体远端，没有内含子，编码1745aa，也表现为父本表达(Sekita et al.,2008)；在绵羊中的印记状态与上述两个物种相同(Charlier et al.,2001)。RTL1基因在胚胎和胎盘组织表达量很高，对于母体胎盘与胎儿的营养传递起着重要作用。在小鼠中缺失或者过表达该基因会导致小鼠胎儿生长迟缓或者新生儿的死亡(Sekita et al.,2008)；人的RTL1基因发生突变，会导致面部表情异常或者喇叭状胸，基因功能丧失，会导致生长停滞(Kotzot2004;Kagami et al.,2005)。RTL1基因位于DLK1-DIO3印记区域，此区域基因对肌肉密度和脂肪沉积有一定的影响（Kim et al.,2004;Liet al.,2008）。另外，该基因与callipyge绵羊的肌肉肥大相关，双肌臀的绵羊中RTL1基因的表达量是正常绵羊中的12倍(Bidwell et al.,2004;Fleming et al.,2009)。因此，可以将RTL1作为影响猪肌肉生长发育的候选基因。本发明提供了印记基因RTL1基因启动子区的遗传变异与胴体和肉质性状间的关联分析。

发明内容

本发明的目的在于获得与猪胴体和肉质性状相关的SNP分子标记及应用。从猪RTL1基因5’侧翼启动子区克隆得到一个特异的DNA片段，寻找SNP位点，并建立相应的SNP检测方法，分析其与猪猪胴体性状和肉质性状的关系，为猪的标记辅助选择提供一种新的分子标记。

本发明通过下列技术方案实现：

本发明通过对猪RTL1基因5’侧翼启动子区的分离克隆，发现了一种与猪胴体和肉质性状相关的SNP分子标记，该分子标记的核苷酸序列如下所示：

AGGCTCAGGGCAAGAAGAGAAAATGGGCCTTTGACCGCTCGCCCGTCGGTCGGGTCAGCCGCCCCAAATAGCGCTTGTTTCCTCTCCTGGATTCAAATTGAGGGCAGGTGGATGTAGGGAATCTGGATTCTGGCTTTTCTTTTTTTCCCCTTTAAACCTTGATAAAAACACCTACTGTGTGCCAGAGACATGCGCATACATGACTCGATTCCACATCGGAATTTTTGCTCACTTTTCCCTTTCCCCTCTCTGGGCCGCTTCCAGGCAGCGTTCTCCCCCGCTCTGAGCTGTCGAGGAGATCCTGGCATCAGTTCCCCACCCCTCCTAAAAGCTCCGCGTTGCTCAGACTGCCCCCCTTGTTCRTGGGGGTTCAGGAACTTGAGACATTTGGCCTRAGTTCCGCCTGTGCAGGCATGTTTACCCGCCCCTGCAGTCTTTCCAAGGTGGGCCCGATCTCTTGGTTCTTTAGTGGACACCCCTTCTCTGGAGCTGGTTTGATTCCCCCGCCAGCATGGGTAGAGCTGGGATGTTCAGTAGGGGGAGAGGGTGTGCAGAGGGCAGGAGGTGACGGTGACCTCTGACTGCCTTGGCATGGGTGGCGTTCGTGGGTAGGATTCACAGAGCTGTTTTGGTTGGGGTTATTTGCGTGCTGCTTCTGCTCATCCACTCTGAGCTCTGCACATCCTGCTCTGCACGCATGTAGCCCTTTGGGTTCCTTCTCAGTTTTCTTTTTAGCCACTGGGCCAAGCTATTAAAAAAAAAAAAAAAATCCCATGCGTAAAACTCCTCACTGGCTAAAATCCAAACTTCCCAACACGCGAC

上述序列中的第363bp处的R是T或G，第395bp处的R是T或C，由于没有引起酶切位点的改变，所以我们采用直接测序的方法进行检测。

申请人设计了扩增上述猪RTL1基因片段的引物对（该引物对也是检测本发明的分子标记的引物对），其DNA序列如下所示：

正向引物：5’AGGCTCAGGGCAAGAAGA3’，

反向引物：5’GTCGCGTGTTGGGAAGTT3’。

本发明建立了一种制备与猪胴体和肉质性状相关的分子标记的方法，其具体步骤如下：

提取猪基因组DNA，根据NCBI中公布的猪RTL1基因序列信息，设计PCR扩增引物对（该引物对的DNA列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示），进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序，获得如序列表SEQ ID NO：1和图1所示的核苷酸序列（在图1的序列中的R显示碱基突变位置，363bp处的R是T或G，395bp处的R是T或C）。

本发明的分子标记可以应用于猪胴体和肉质性状检测中。设计的引物对也可应用于猪胴体和肉质性状检测中。

更详细的技术方案如《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是克隆的中国地方猪品种“梅山猪”的核苷酸序列。序列长度为822bp，其中在该序列的第363bp处存在一个T/G替换，在第395bp出存在一个T/C替换。（在序列表SEQ ID NO：1中显示的结果是已经替换的碱基）。

序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3是本发明设计的引物对的DNA序列。

序列表SEQ ID NO：4是克隆的国外猪种“大白猪”的核苷酸序列。序列长度为822bp，其中在该序列的第363bp处存在一个G/T替换，第395bp处存在一个C/T替换（该序列表SEQ IDNO：4中显示的结果是已经替换的碱基）。

图1：分别是大白猪、长白猪、梅山猪和清平猪RTL1序列比对结果，图中加粗的英文字母代表SNP位点。

图2：是猪RTL1基因5’侧翼启动子区的扩增结果。

琼脂糖浓度为1.5%；图中标记：泳道Ｍ：DL2000Marker；泳道1－4分别为大白猪、长白猪、梅山猪和清平猪中的扩增片段，片段大小为822bp。

图3：本发明中检测RTL1基因5’侧翼启动子序列突变位点的测序图谱。

图4：是本发明克隆的分子标记的核苷酸序列直观图（与上述序列表SEQ ID NO：1所示的序列相对应，图示序列中的R是等位基因突变，突变位置分别位于第363位和第395位）。

具体实施方式

实施例1猪RTL1基因5’侧翼序列的获得及多态性检测方法的建立

1、猪基因组DNA的提取

本发明的试验猪品种为国外猪种大白猪、长白猪，中国地方猪品种梅山猪和清平猪，样本均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，为中国常用品种。猪基因组DNA的提取采用北京百泰克生物技术有限公司生产的基因组DNA试剂盒（按该试剂盒说明书进行操作）提取，具体步骤如下所述：

（1）采取猪的耳组织，放入2ml的离心管中，加入200μl裂解液TL，用枪头吹打均匀。

（2）加入20μl蛋白酶K（20mg/ml），剧烈颠倒充分混匀，55℃水浴锅中消化过夜。

（3）加入200μl结合液CB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。

（4）冷却后加入100μl异丙醇，剧烈颠倒充分混匀。

（5）用1mL的枪头吸取上述混合物，加入吸附柱AC中，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。

（6）加入500uL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。

（7）加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，倒掉废液。

（8）重复操作步骤7。

（9）将吸附柱AC放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量去除漂洗液，以免残留的乙醇抑制下游反应。

（10）取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rpm离心1min，将溶液收集到离心管中。

（11）对提取出的DNA的浓度及质量进行检测后置于-20℃下保存备用。

2、猪RTL1基因5’侧翼序列的获得

(1)PCR扩增

根据RTL1基因的基因组序列(GenBank登陆号：CU928466.2，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CU928466.2)设计以下引物对：

正向引物：5’AGGCTCAGGGCAAGAAGA3’，

反向引物：5’GTCGCGTGTTGGGAAGTT3’。

利用上述引物在大白猪、长白猪、梅山猪和清平猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR反应体系50μL,体系中各组分的浓度为100ng模板DNA、10×buffer(含Mg²⁺)4μL、上述正反向引物各0.5μM、2.5μM dNTPs、1U TaqDNA聚合酶，PCR的运行程序如下：预变性94℃4min；然后94℃40s，56℃40s，72℃50s，35个循环；最后72℃继续延伸10min，PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检。

（2）PCR产物纯化

上述PCR产物用上海生工生物工程有限公司的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，具体步骤如下：首先从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管，加入400μL溶胶液，50-60℃水浴至胶彻底融化，加热融胶时，每2min混匀一次，冷却至室温；将离心柱放入收集管中，把混合液移至离心柱，室温放置2min；12000r/min离心1min，此时DNA被吸附到柱上；倒掉收集管中废液，将离心柱放入同一个收集管中，加入700μL洗脱液，12000r/min离心1min；倒掉收集管中的废液，12000r/min离心1min；将离心柱放入一预先准备好的灭菌1.5mL离心管中，加入40μL洗脱液或双蒸水(pH＞7.0)，室温或37℃放置2-3min(提高洗脱温度至55-80℃有利于提高DNA的洗脱效率，可洗脱两次。)；12000r/min离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。

3、利用PCR产物直接测序法检测分子标记

将上述获得的PCR产物直接送到北京奥科公司进行测序，直接从测序色谱图(见图3)上进行基因型分析。

实施例2本发明的分子标记在不同猪群中的多态性分布检测验证

在两个中国地方猪品种（梅山猪、清平猪）和两个国外猪种（大白猪、长白猪）检测猪RTL1基因5’侧翼启动子区两处多态性分布频率，检测结果如表1所示：在第363bp处的T363-G363多态性分布，在中国地方猪品种中G等位基因占主要优势，而在国外猪种中T等位基因占主要优势，中、外猪品种中存在显著差异。同时我们也检测到：在第395bp处的T395-C395多态性分布，在中国地方猪品种中C等位基因占主要优势，而在国外猪种中T等位基因占主要优势。中、外猪品种中也存在显著差异。

表1RTL1基因5，侧翼启动子区T363-G363和T395-C395多态在不同品种中的分布结果

实施例3本发明克隆的分子标记与猪生产性状的关联分析及应用

1、单体型的构建

将上述利用PCR-直接测序法得到的所有的个体的两个多态位点的基因型数据输入Haploview软件（一种自由下载软件），可以计算得到各个体的单倍型，同时计算位点之间的成对连锁不平衡程度，用标准化的连锁不平衡系数D’表示。结果发现两个位点间连锁不平衡系数D’等于1，即为完全连锁不平衡。两种单体型GC和TT占所有等位基因的频率分别为57.3％和42.7％，构成3种单体型组合GC/GC，GC/TT，TT/TT。

2、单体型组合与猪生产性状的关联分析

用于关联分析的试验猪群为348头大白×梅山F₂代资源群体（血样委托华中农业大学猪遗传育种农业部重点实验室采集），采用实施例1所建立的PCR-直接测序法进行多态性检测，用SAS统计软件(SAS Institute Inc,Version8.0)GLM程序进行方差分析，分析猪RTL1基因3种不同单体型组合与猪胴体和肉质性状的相关关系，所采用模型为：

Y_ijk=μ+G_i+S_j+Y_k(+b_ijkX_ijk)+e_ijk

Yijk为性状表型值，μ为平均值，G_i为基因型效应，S_j、Y_k为固定效应，分别为性别、年度效应，b_ijk为屠宰体重或屠宰日龄的回归系数，胴体性状以屠宰体重为协变量，肉质性状以屠宰日龄为协变量，e_ijk为残差效应。结果列于表2。

由表2可以看出：基因型不同时，内脂率、6-7腰椎间膘厚、臀部膘厚、眼肌宽、眼肌面积、背最长肌pH、背最长肌肌肉色值和股二头肌肌肉色值等性状存在显著差异（P<0.05），花油重性状存在极显著差异（P<0.01）。

表2猪RTL1基因5，侧翼启动子区单体型组合与胴体和肉质性状的统计分析表

注：（1）、以上数值为最小二乘均值±标准误；同行含有相同字母表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著（P<0.05），不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。

（2）、上述指标中花油重、内脂率、6-7腰椎间膘厚、臀部膘厚、眼肌宽和眼肌面积为胴体性状；背最长肌pH、背最长肌肌肉色值和股二头肌肌肉色值为肉质性状。（本发明统计分析了所有胴体性状和肉质性状，只列出了差异显著的性状）。

主要参考文献

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Fleming-Waddell JN,Olbricht GR,Taxis TM,White JD,Vuocolo T,Craig BA,Tellam RL,Neary MK,CockettNE,Bidwell CA.Effect of DLK1and RTL1but not MEG3or MEG8on muscle gene expression in Callipygelambs.PLoS One,2009,4(10):1–15.

Kagami M,Sekita Y,Nishimura G,Irie M,Kato F,Okada M,Yamamori S,Kishimoto H,Nakayama M,TanakaY,Matsuoka K,Takahashi T,and12others.Deletions and epimutations affecting the human14q32.2imprintedregion in individuals with paternal and maternal upd(14)-like phenotypes.Nature Genet,2008,40:237-242.

Sekita Y,Wagatsuma H,Nakamura K,Ono R,Kagami M,Wakisaka N,Hino T,Suzuki-Migishima R,Kohda T,Ogura A,Ogata T,Yokoyama M,Kaneko-Ishino T,Ishino F.Role of retrotransposon-derived imprinted gene,Rtl1,in the feto-maternal interface of mouse placenta.Nature Genet,2008,40:243-248.

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 SEQUENCE LISTING

<110>湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>与猪胴体和肉质性状相关的SNP分子标记及应用

<130>

<141>2014-03-10

<160>4

<170>PatentIn version3.1

<210>1

<211>822

<212>DNA

<213>猪（Sus scrofa）

<220>

<221>gene

<222>(1)..(822)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(395)..(395)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(363)..(363)

<223>

<400>1

aggctcaggg caagaagaga aaatgggcct ttgaccgctc gcccgtcggt cgggtcagcc  60

gccccaaata gcgcttgttt cctctcctgg attcaaattg agggcaggtg gatgtaggga  120

atctggattc tggcttttct ttttttcccc tttaaacctt gataaaaaca cctactgtgt  180

gccagagaca tgcgcataca tgactcgatt ccacatcgga atttttgctc acttttccct  240

ttcccctctc tgggccgctt ccaggcagcg ttctcccccg ctctgagctg tcgaggagat  300

cctggcatca gttccccacc cctcctaaaa gctccgcgtt gctcagactg ccccccttgt  360

tcgtgggggt tcaggaactt gagacatttg gcctcagttc cgcctgtgca ggcatgttta  420

cccgcccctg cagtctttcc aaggtgggcc cgatctcttg gttctttagt ggacacccct  480

tctctggagc tggtttgatt cccccgccag catgggtaga gctgggatgt tcagtagggg  540

gagagggtgt gcagagggca ggaggtgacg gtgacctctg actgccttgg catgggtggc  600

gttcgtgggt aggattcaca gagctgtttt ggttggggtt atttgcgtgc tgcttctgct  660

catccactct gagctctgca catcctgctc tgcacgcatg tagccctttg ggttccttct  720

cagttttctt tttagccact gggccaagct attaaaaaaa aaaaaaaaat cccatgcgta  780

aaactcctca ctggctaaaa tccaaacttc ccaacacgcg ac  822

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(18)

<223>

<400>2

aggctcaggg caagaaga     18

<210>3

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<211>822

<212>DNA

<213>猪（Sus scrofa）

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<223>

<220>

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<222>(395)..(395)

<223>

<220>

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<223>

<400>4

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ttcccctctc tgggccgctt ccaggcagcg ttctcccccg ctctgagctg tcgaggagat  300

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tcttgggggt tcaggaactt gagacatttg gccttagttc cgcctgtgca ggcatgttta  420

cccgcccctg cagtctttcc aaggtgggcc cgatctcttg gttctttagt ggacacccct  480

tctctggagc tggtttgatt cccccgccag catgggtaga gctgggatgt tcagtagggg  540

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aaactcctca ctggctaaaa tccaaacttc ccaacacgcg ac      822

Claims (5)

1.一种与猪胴体和肉质性状相关的SNP分子标记，其核苷酸序列如下所示：

AGGCTCAGGGCAAGAAGAGAAAATGGGCCTTTGACCGCTCGCCCGTCGGTCGGGTCAGCCGCCCCAAATAGCGCTTGTTTCCTCTCCTGGATTCAAATTGAGGGCAGGTGGATGTAGGGAATCTGGATTCTGGCTTTTCTTTTTTTCCCCTTTAAACCTTGATAAAAACACCTACTGTGTGCCAGAGACATGCGCATACATGACTCGATTCCACATCGGAATTTTTGCTCACTTTTCCCTTTCCCCTCTCTGGGCCGCTTCCAGGCAGCGTTCTCCCCCGCTCTGAGCTGTCGAGGAGATCCTGGCATCAGTTCCCCACCCCTCCTAAAAGCTCCGCGTTGCTCAGACTGCCCCCCTTGTTCRTGGGGGTTCAGGAACTTGAGACATTTGGCCTRAGTTCCGCCTGTGCAGGCATGTTTACCCGCCCCTGCAGTCTTTCCAAGGTGGGCCCGATCTCTTGGTTCTTTAGTGGACACCCCTTCTCTGGAGCTGGTTTGATTCCCCCGCCAGCATGGGTAGAGCTGGGATGTTCAGTAGGGGGAGAGGGTGTGCAGAGGGCAGGAGGTGACGGTGACCTCTGACTGCCTTGGCATGGGTGGCGTTCGTGGGTAGGATTCACAGAGCTGTTTTGGTTGGGGTTATTTGCGTGCTGCTTCTGCTCATCCACTCTGAGCTCTGCACATCCTGCTCTGCACGCATGTAGCCCTTTGGGTTCCTTCTCAGTTTTCTTTTTAGCCACTGGGCCAAGCTATTAAAAAAAAAAAAAAAATCCCATGCGTAAAACTCCTCACTGGCTAAAATCCAAACTTCCCAACACGCGAC

上述序列中第363bp处的R是T或G，第395bp处的R是T或C。

2.一种扩增如权利要求1所述的分子标记的引物对，其DNA序列如下所示：

正向引物：AGGCTCAGGGCAAGAAGA，

反向引物：GTCGCGTGTTGGGAAGTT。

3.一种制备与猪胴体和肉质性状相关的SNP分子标记的方法，其特征在于以下步骤：

从猪血液中提取基因组DNA，根据猪RTL1基因序列设计引物对，其DNA序列如序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，用序列表SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物对在猪基因组DNA中进行PCR扩增，PCR产物纯化、测序，获得如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的分子标记在猪胴体和肉质性状检测中的应用。

5.权利要求2所述的引物对在猪胴体和肉质性状检测中的应用。

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