CN109536451B - Rtl1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，提供了RTL1基因以及RTL1基因超表达载体在调控成肌细胞增殖和分化中的应用，所述RTL1基因具有促进成肌细胞的增殖和分化的作用；本发明明确了RTL1基因具有促进成肌细胞的增殖和分化的作用，为今后进一步研究了RTL1在家畜肉质性状方面发挥的调控作用打下了基础。

Description

RTL1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及RTL1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的应用。
背景技术
RTL1基因(反转录转座子1基因，retrotransposon-like-1)，又名父本表达基因11(paternally expressed gene 11,Peg11),在人和小鼠中为父本表达的印记基因，没有内含子序列。RTL1基因在胚胎和胎盘组织中表达量很高，对母体胎盘与胎儿的营养传递起着重要作用，敲除该基因的小鼠表现为胎儿死亡率升高、新生儿生长停滞、胎盘尺寸偏小；与人的胎儿发育和新生儿的生长也有密切关系。
C2C12细胞是由小鼠骨骼肌卫星细胞永生化而来的细胞株，保持着一定的增殖和分化能力，且细胞形态和特性均一，可无限代培养，体外培养的C2C12成肌细胞能在低血清诱导条件下分化为多核的肌管，并表达Myogenin和Myosin等成熟骨骼肌的各种标志蛋白，因此C2C12细胞通常成为体外研究成肌细胞增殖和分化能力的首选模型。
目前只知道RTL1基因与人的胎儿发育有关，关于RTL1基因在C2C12细胞中具有什么作用尚不清楚。因此，明确RTL1基因在C2C12细胞中的作用，不仅能为研究肌肉发育的表达调控机制提供新思路，更为今后进一步研究RTL1基因在家畜肉质性状方面发挥的调控作用打下基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了RTL1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的新用途，明确了RTL1基因具有促进成肌细胞的增殖和分化的作用，为今后进一步研究了RTL1在家畜肉质性状方面发挥的调控作用打下了基础。
为实现上述目的，本发明是这样实现的：
本发明的目的之一在于提供RTL1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的应用。
具体地，所述RTL1基因具有促进成肌细胞的增殖的作用。
具体地，所述RTL1基因具有促进成肌细胞的分化的作用。
本发明的目的之二在于提供RTL1基因超表达载体在促进成肌细胞增殖、分化中的应用。
具体地，所述RTL1基因超表达载体为pcDNA3.1-RTL1，是将小鼠RTL1基因完整编码区序列插入到pcDNA3.1载体的EcoRV和XbaΙ两个酶切位点之间得到。
以上将小鼠RTL1基因分为上半部分和下半部分进行扩增，其中所述上半部分的引物对，RTL1-F：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，RTL1-CR:核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述下半部分的引物对，RTL1-CF：核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，RTL1-R:核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明具有的有益效果是：
1、实施例1中，利用荧光定量PCR检测C2C12细胞不同分化阶段分化相关标志基因(MyoG和MyHC)及RTL1基因mRNA水平的表达情况，证实，随着C2C12细胞的分化，RTL1基因的表达量显著升高，其表达量变化趋势与成肌分化标志性基因相一致，肌细胞的分化程度越高，RTL1基因mRNA水平的表达越高；利用Western Blot检测C2C12细胞不同分化阶段分化相关标志基因(MyoG和MyHC)及RTL1基因蛋白水平的表达情况证实随着C2C12细胞的分化，RTL1基因的表达量逐渐升高，与mRNA表达水平结果一致。
2、实验例2证明超表达载体pcDNA3.1-RTL1转染进细胞超表达RTL1后可以促进小鼠成肌细胞C2C12细胞的增殖与分化。
3、实验例3证明siRNA抑制RTL1表达后可以抑制小鼠成肌细胞C2C12细胞的增殖与分化。
4、本发明人通过以上正实验(实施例2过表达)、反实验(实施例3siRNA干扰实验)的结果证实，RTL1基因在成肌细胞增殖分化过程中具有重要调控作用：RTL1基因能够显著抑制成肌细胞的增殖和分化。此现象重复性强，结果可靠，为今后进一步研究RTL1在家畜肉质性状方面发挥的调控作用打下了基础。且RTL1基因是促进肌肉分化的，那么我们抑制它，就可以抑制肌肉过度肥大，因而对肉质性状的改良及肌肉发育相关疾病的治疗具有一定的意义，在猪的肉质改良上，不能过度追求瘦肉率，还要考虑到肉的风味，肥瘦相间的肉比较好吃，所以现在有的时候要控制瘦肉，增加一定量的脂肪，RTL1基因作为靶标，抑制RTL1基因的小分子抑制剂则可以控制瘦肉率；在疾病上来说，RTL1基因作为靶标，抑制RTL1基因的小分子抑制剂则可以治愈一些肌肉肥大症，可以应用于制备预防和/或治疗肌肉肥大症产品。
附图说明
图1为MyoG、MyHC、RTL1基因在小鼠成肌细胞C2C12分化前后表达量的变化图；其中1A为MyoG基因在小鼠成肌细胞C2C12分化前后表达量的变化图；1B为MyHC基因在小鼠成肌细胞C2C12分化前后表达量的变化图；1C为RTL1基因在小鼠成肌细胞C2C12分化前后表达量的变化图。
图2为C2C12细胞不同分化阶段分化相关标志基因(MyoG和MyHC)及RTL1基因蛋白水平的表达情况；
图3为超表达载体pcDNA3.1-RTL1的PCR扩增结果见图3，其中3A为上半部分扩增结果，其中M为Marker DL2000，3B为下半部分扩增结果，其中M为Marker DL5000；
图4为小鼠成肌细胞诱导分化后，成肌分化标志基因MyHC的免疫荧光染色图；其中上面一排为转染有超表达载体pcDNA3.1-RTL1的小鼠成肌细胞的免疫荧光染色图；下面一排为转染有空表达载体pcDNA3.1的小鼠成肌细胞的免疫荧光染色图；
图5为MTT法检测小鼠成肌细胞的增殖率；其中上面一排为转染有超表达载体pcDNA3.1-RTL1的小鼠成肌细胞的增殖率；下面一排为转染有空表达载体pcDNA3.1的小鼠成肌细胞的增殖率；
图6为siRNA干扰RTL1基因后抑制成肌细胞增殖的效果图；
图7为siRNA干扰RTL1基因后抑制成肌细胞分化的效果图；其中图(A)为荧光定量PCR检测成肌细胞分化标志性基因MyoG mRNA表达水平的变化图；(B)为为荧光定量PCR检测成肌细胞分化标志性基因MyHC mRNA表达水平的变化图；
图8为siRNA干扰RTL1基因后采用Western Blot从蛋白水平检测成肌细胞分化标志性基因MyoG和MyHC表达量变化图。
具体实施方式
实施例1 RTL1基因在小鼠成肌细胞C2C12分化前后表达量的变化
1、利用荧光定量PCR检测C2C12细胞不同分化阶段分化相关标志基因(MyoG和MyHC)及RTL1基因mRNA水平的表达情况
未分化的C2C12细胞以含有10％FBS的高糖DMEM培养基培养。当细胞长至60％–70％汇合度时，换成2％马血DMEM培养基诱导其成肌分化。分别在诱导分化的0d、2d和6d收集细胞。Trizo1提取总RNA，TaKaRa Primer Script RT反转录试剂盒进行反转录(具体操作过程见参照试剂盒使用说明)，采用Bio-Rad公司的SYBR Green荧光染料，Roche公司LightCycler 480荧光定量PCR仪，以β-actin作为内参，进行荧光定量PCR实验，用2-ΔΔCt法计算每个基因的相对mRNA表达量，每组实验做3个平行，每个实验重复三次：反应体系为20μ1；反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃，15s循环40次。
其中用于荧光定量PCR检测RTL1基因的引物序列如下：
上游引物序列为：CTTTCCTGACCCTTACCA(SEQ ID NO.5)
下游引物序列为：GGTCCAAAAGATTTCGTG(SEQ ID NO.6)
结果如图1所示，随着C2C12细胞的分化，RTL1基因的表达量显著升高，其表达量变化趋势与成肌分化标志性基因相一致，说明RTL1基因对肌细胞的分化有一定的作用。
2、利用Western Blot检测C2C12细胞不同分化阶段分化相关标志基因(MyoG和MyHC)及RTL1基因蛋白水平的表达情况
为了对上述结果进一步验证，对上述不同分化阶段的C2C12细胞(0d、2d和6d)进行蛋白提取，采用碧云天生物技术公司的RIPA裂解液(P0013B)提取蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度，具体方法参照试剂盒的说明书，用WesternBlot的方法检测蛋白的表达，具体操作步骤如下：
(1)蛋白变性：将蛋白溶液按照4:1的比例加入5*蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15min。
(2)制胶：将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。按实验安排配制分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。大约45min后可倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。按前面方法配5％的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入到浓缩胶中待胶凝集。
(3)SDS-PAGE凝胶电泳：将样品加入电泳孔中，电泳。浓缩胶电压75V，分离胶用120V。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。
(4)转膜：首先准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的0.22μm PVDF膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻棒，滤纸和经过活化的PVDF膜。然后将夹子打开使黑的一面保持水平。在垫子上垫海绵、三层滤纸。小心剥下分离胶盖于滤纸上，将膜盖于胶上，并用玻璃棒除去气泡。在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫。300mA转膜，转膜时间视目的蛋白的大小而定。
(5)免疫反应：将转好的膜于室温下置脱色摇床上用5％的脱脂牛奶(TBST配)，封闭1h。然后稀释一抗(TBS-T溶解的5％脱脂牛奶)，4℃过夜。次日用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。将二抗用TBST稀释3000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次10min。
(6)ECL化学发光检测：将A和B两种试剂在离心管中等体积混合，将膜蛋白面朝上与此混合液充分接触，1-2min后，去尽残液，用保鲜膜包好，放入GE ImageQuantLAS4000mini中成像分析。
结果如图2所示，在蛋白水平，随着C2C12细胞的分化，RTL1基因的表达量逐渐升高，与mRNA表达水平结果一致，进一步说明RTL1基因对肌细胞的分化有一定的作用。
实施例2超表达载体pcDNA3.1-RTL1超表达RTL1后促进小鼠成肌细胞C2C12细胞的增殖与分化
一、小鼠RTL1基因超表达载体的构建
小鼠RTL1基因超表达载体的构建，包括以下步骤：根据小鼠RTL1基因核苷酸序列和pcDNA3.1载体上的酶切位点，运用同源重组原理，设计带有同源重组臂、末端分别带有EcoRV和XbaΙ限制性内切酶位点的引物，PCR扩增获得小鼠RTL1基因完整编码区序列，将其构入pcDNA3.1载体的EcoRV和XbaΙ两个酶切位点之间，得到小鼠RTL1基因超表达载体pcDNA3.1-RTL1。
1、小鼠RTL1基因编码区序列的获得
利用Trizo1法从小鼠成肌细胞中提取总RNA，TaKaRa Primer Script RT反转录试剂盒进行反转录(具体操作方法参照试剂盒说明书)。因为小鼠RTL1基因编码区序列比较长(5235bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示)，设计两对引物进行PCR扩增，引物序列如下：
RTL1-F:CAGTGTGGTGGAATTCTGCAGATATCATGATAGAACCCTCTGAAGACTC(SEQ ID NO.1)
RTL1-CR:GGAATACTGGATACTGTATGACATGC(SEQ ID NO.2)
RTL1-CF:GGAATACTGGATACTGTATGACATGC(SEQ ID NO.3)
RTL1-R:CGGGTTTAAACGGGCCCTCTAGATCAGTCAAGTTCATCATCTGAGTC(SEQ ID NO.4)
其中RTL1-F和RTL1-CR扩增CDS上半部分(2698bp)，RTL1-CF和RTL1-R扩增CDS下半部分(2563bp)，两部分序列有26bp重叠，下划线部分表示酶切位点，框中部分表示同源臂序列，PCR扩增结果见图3，图3A为上半部分扩增结果，其中M为MarkerDL2000，图3B为下半部分扩增结果，其中M为MarkerDL5000。
PCR扩增体系：
Figure BDA0001861537180000081
PCR扩增程序：
Figure BDA0001861537180000082
Figure BDA0001861537180000091
2、pcDNA3.1-RTL1超表达载体的构建
用限制性内切酶EcoRV和XbaΙ对pcDNA3.1空载体进行双酶切，使载体线性化，用琼脂糖凝胶对线性化的载体进行回收、纯化。使用北京擎科新业生物技术有限公司的试剂盒TreliefSoSoo Cloning Kit，将上述(1)获得的小鼠RTL1基因编码区序列与线性化的载体进行连接，连接体系和程序如下：
同源重组无缝克隆连接体系：
Figure BDA0001861537180000092
连接程序：37℃ 10min
50℃ 10min
将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布加有抗生素(Amp)的平板，筛选阳性克隆，挑单克隆经菌液PCR鉴定为阳性之后，送测序公司进行测序验证，最终确定载体构建成功，命名为pcDNA3.1-RTL1。
二、RTL1基因超表达载体在小鼠成肌细胞分化中的作用
1、转染前一天，将细胞按照1×105接种至6孔培养板，培养至密度为80％，利用转染试剂LipofectamineTM2000Transfection Reagent将超表达载体pcDNA3.1-RTL1转入小鼠成肌细胞C2C12，以转染空载体pcDNA3.1的为对照，6小时后换成分化培养基(含2％马血清的DMEM培养基)，对细胞进行诱导分化，分化到第6天(6d)，对细胞进行免疫荧光染色，检测成肌分化标志基因MyHC的变化，细胞免疫荧光检测步骤如下：
(1)细胞固定：4％多聚甲醛固定30min。
(2)细胞通透：倒掉固定液，PBS洗3次，每次5min，加入0.1％TritonX-100，室温放置20min。
(3)细胞封闭：倒掉通透液，PBS洗3次，每次5min，加入封闭液(购自碧云天生物技术研究所)，室温1小时。
(4)孵一抗：倒掉封闭液，加入MyHC一抗(1:100稀释，Santa Cruz公司)，4℃孵育过夜。
(5)孵二抗：洗掉一抗，PBS洗3次，每次5min，加入带有Cy3标记的山羊抗小鼠IgG(1:200稀释，谷歌生物科技有限公司)，37℃避光孵育1.5h。
(6)染核：PBS洗3次，每次5min，吸干多余液体，加入200ul(1ug/ml)的DAPI，室温避光染核5min。
(7)封片：PBS洗3次，每次5min，吸干多余液体，加入封片液，在显微镜下观察采集图像。
2、免疫荧光结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，含有MyHC的细胞阳性表达为Cy3荧光素激发出的为红光。
3、结果如图4所示，转染了pcDNA3.1-RTL1的细胞中MyHC阳性细胞多于转染对照pcDNA3.1空载体的细胞，说明RTL1基因具有促进成肌细胞的分化的作用。
三、RTL1基因超表达载体在小鼠成肌细胞增殖中的作用
采用MTT法检测细胞增殖：将处于对数生长期的细胞用培养基制成单细胞悬液，按每孔2000个细胞，将细胞均匀的接种到96孔板中，每孔100μL，37℃、5％CO2饱和湿度条件过夜培养。转染前2个小时，换成无血清DMEM培养基饥饿处理。分别将pcDNA3.1-RTL1和对照组pcDNA3.1转入细胞，细胞于37℃CO2培养箱中培养，4h后吸出混合液换入正常培养基，分别在培养24h、48h、72h，每孔加入10μLMTT，37℃培养4h，吸出培养基，加入150μL DMSO震荡10min，在酶标仪(美国Thermo公司生产，MULTISKAN MK3型)的490nm波长下测定吸光值。
结果如图5所示，转染pcDNA3.1-RTL1组细胞增值率高于对照组，说明pcDNA3.1-RTL1能够促进小鼠成肌细胞C2C12的增殖。
实施例3siRNA抑制RTL1表达后抑制小鼠成肌细胞C2C12细胞的增殖与分化
一、siRNA的设计、合成
根据Genbank中小鼠RTL1基因序列(Gene ID:353326)，利用BLOCK-iT RNAiDesigner软件(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do)，针对RTL1基因不同靶位点设计3条siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)，并设计siRNA阴性对照(NC)，序列由广州锐博生物科技有限公司合成。
RTL1-siRNA1，正义链：5′-GGAGGAAUCAAGUGAUGAU-3′(SEQ ID NO.7)，反义链：5′-AUCAUCACUUGAUUCCUCC-3′(SEQ ID NO.8)；
RTL1-siRNA2，正义链：5′-GCAUCGCACUAGAGACAUA-3′(SEQ ID NO.9)，反义链：5′-UAUGUCUCUAGUGCGAUGC-3′(SEQ ID NO.10)；
RTL1-siRNA3，正义链：5′-GCCCAAGAACUCUCCAGAA-3′(SEQ ID NO.11)，反义链：5′-UUCUGGAGAGUUCUUGGGC-3′(SEQ ID NO.12)。
二、siRNA干扰RTL1表达后抑制小鼠成肌细胞C2C12细胞的增殖
1、采用MTT法检测细胞增殖：将处于对数生长期的细胞用培养基制成单细胞悬液，按每孔2000个细胞，将细胞均匀的接种到96孔板中，每孔100μL，37℃、5％CO2饱和湿度条件过夜培养。转染前2个小时，换成无血清DMEM培养基饥饿处理。分别将siRNA-RTL1干扰组和阴性对照组NC转入细胞，细胞于37℃CO2培养箱中培养，4h后吸出混合液换入正常培养基，分别在培养24h、48h、72h，每孔加入10μLMTT，37℃培养4h，吸出培养基，加入150μL DMSO震荡10min，在酶标仪(美国Thermo公司生产，MULTISKAN MK3型)的490nm波长下测定吸光值。
2、结果如图6所示，干扰RTL1基因明显抑制小鼠成肌细胞C2C12的增殖。
三、siRNA干扰RTL1表达后抑制小鼠成肌细胞C2C12细胞的分化
1、未分化的C2C12细胞以含有10％FBS的高糖DMEM培养基(生长培养基，growthmedium,GM)进行培养，将细胞按照1×105接种至6孔培养板，待细胞贴壁，密度达到70％，分别转染siRNA干扰组与阴性对照组，6个小时后换成分化培养基(含2％马血清的DMEM培养基，differentiation medium,DM)，对C2C12细胞进行诱导分化，分别在诱导分化的0d、2d和6d收集细胞，提取RNA和蛋白，利用荧光定量PCR和WesternBlot检测成肌分化标志基因MyoG和MyHC表达量的变化。
2、图7所示为采用荧光定量PCR检测成肌细胞分化标志性基因MyoG和MyHC mRNA表达水平的变化，发现干扰组基因表达量显著低于阴性对照组，说明siRNA通过干扰RTL1基因而抑制成肌细胞的分化。
3、图8所示为收集诱导分化第6d的细胞，提取蛋白，采用Western Blot从蛋白水平检测成肌细胞分化标志性基因MyoG和MyHC表达量变化，结果发现干扰组基因表达量显著降低，进一步说明转染siRNA通过干扰RTL1基因抑制成肌细胞的分化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0001861537180000141
Figure BDA0001861537180000151
Figure BDA0001861537180000161
Figure BDA0001861537180000171
Figure BDA0001861537180000181
Figure BDA0001861537180000191
Figure BDA0001861537180000201
Figure BDA0001861537180000211
Figure BDA0001861537180000221
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> RTL1基因在调控成肌细胞增殖和分化中的应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagtgtggtg gaattctgca gatatcatga tagaaccctc tgaagactc 49
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaatactgg atactgtatg acatgc 26
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgggtttaaa cgggccctct agatcagtca agttcatcat ctgagtc 47
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctttcctgac ccttacca 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtccaaaag atttcgtg 18
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaggaauca agugaugau 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aucaucacuu gauuccucc 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcaucgcacu agagacaua 19
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
uaugucucua gugcgaugc 19
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcccaagaac ucuccagaa 19
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
uucuggagag uucuugggc 19
<210> 13
<211> 5235
<212> DNA
<213> 小鼠(Mouse )
<400> 13
atgatagaac cctctgaaga ctcatttgag acgatgatgg agcttaagaa tccatcatca 60
aaacaaatgg agtcctccga gggctcatcc aacaccgttg aagagacacc aggcagcagt 120
ggagcccagg cgggggccca ggcaggggcc caggcggagg cccaggcgga gacccaggtg 180
gaggcccagg cggaggctca ggctgaagcc caggttgagg cccaggttga ggcccaggcg 240
ggctcagata gtggcccagc ccaggaagaa aaggagccac ccagtggccc cctcaaggaa 300
atgcaagagc tgcccactaa tctactccaa gaagtggagg agccatccag tggcccccac 360
caggaaatgc aagagctgcc cactgatcta ctccaagaag tggaggagcc atccagtggc 420
ccccaccagg aaatgcaaga gctacccact gatctactcc gggaagtgga ggagccatcc 480
agtggcccct accaggaaat gcaagagcta cccactgatc tactccggga agtggaggag 540
ccatccagtg gcccctacca ggaaatgcaa gagctaccca ctgatctact ccgggaagtg 600
gaggagccat ccagtggccc ctaccaggaa atgcaagagc tacccactga tctactccgg 660
gaagtggagg agccatccag tggcccctac caggaaatgc aagagctacc cactgatcta 720
ctccgggaag tggaggagcc atccagcgac ccctgtgagg catcatctaa cgatctaccc 780
caagacatgg aggaatcaag tgatgatggt tcgaaccagg agtcgagtga tggttcaaac 840
cacgaattaa gtaatggttc aaaccatgag tcgagctttg gttcaaaccc agagtcgagc 900
gatgtttcca acctggagtc aagcggtggt tcaaaccagg agtccagcga tggttcacaa 960
aaggagtcaa gctatgattc aaacccggag ttaagtgata attcaaacca ggagttaagc 1020
gataattcga accaggagtc aagcgacagt tcaaaccagt caagtgatat ttcaaaccag 1080
gaagggtcgg aaccactcag tgaggcatcc gattatagca tggatgaaac aatcaactca 1140
tccgagaccc agtcagacca agatgatact gacctgggag atgacgagga agaggaggaa 1200
gaggaaggtg gtgaagagga aggtcagccc aagaactctc cagaagaagt cgtggccacc 1260
atggggaacg tcatctcgct gttcctccgg atgcaagacc taaaagaaca acagagagtg 1320
gcagaaaggc tcatgatgca ggctatcaac gaaggtcgcc tgccctccct caggcccttc 1380
tctggagatc gcagagacta ccatgagttt gtcgtgctct gccagatgac aatgcagaac 1440
tacccaagta tgctatacaa tgatgagctg cgggtgaaat tcgtcatccg ccacctgact 1500
gacctagcct tggaatgggc caacgacctc gtagagcaga acagcccagt gataaacaac 1560
ttctcagcct tcctggaggc catgtcagaa aagtttgagt atcggcagac cctgcgtgtg 1620
gcggaagacg ccatgttcaa catcaggcag gggaaccgct gtgcggccga ttacatcaat 1680
gagttccggg gtctgatacc caccttaggc tggccagatg aagtcctgca ggcccacctg 1740
tgccaggggc tcaacgaaga gatcaggcac tatctgttcc ggatccctca gccgaattcc 1800
ctagacaacc tgattgtact tgtcctgcaa cttgaagaaa agctggcaga gagaagagca 1860
ttactcaggc tgccacctga gtcgcgccca agaagcgtag cctggatgga tgctcccgcc 1920
ccagagaagt ggagggtaag cagctggctg cccaatgagt tccacccaga cattgatcgc 1980
gatcacctct tcttactgct cttggtgaga gtggacccct accacagtgt cgcagtgcgg 2040
gccctggtgg actcaggagc agaagggaac tacatggatg agaggtttgc ccaggaacac 2100
tatgtggaac tctatgagaa gccttatcca cagataatcc aaggtgtgga tggcatccca 2160
attggcaatg aacccgtctg gctgtgcacc gagcccctgg tatgtgtcca ccagaagcat 2220
tatgagtaca tcgaatttga catcttacct tcgcccaact tctccatcgt cttaggcatg 2280
aagtggctcc gaacccatgc ccctgaagtc gactggatga gaggccggtg taccttccac 2340
tctccctact gtctgcggaa ttgcttcacc ccacctccac catgcatcgc actagagaca 2400
tacagcataa gcctactgcc cggattgcca cacacatact cagacctggc cgacgtgttt 2460
aacccgaggg aggcagatga tgagacttcc gaccagccaa gctcagacgg atccgatgat 2520
ctttctgaat cagagccctc tgagcttcag caggctggag acagtgatca aagcggcgtc 2580
ttttacgagt ctggggcccg agagactttg gaacctgtga gcgccaggat gcaagagaaa 2640
gccaggcagc aagagaaagc cagggagcaa gaggaatact ggatactgta tgacatgctg 2700
actgacagac aagactacac gcagatggta ccagagctat tcgaccagct acatggagcg 2760
gcatggttca caaaactgga gctgcttggg attaaggaaa gtgagatgag gcacacggtc 2820
acacacacgg aagacacttg gagagcatcg ttcggtttcg gccttcacca gatgagatgc 2880
taccggccct tcacaatgaa ctcatactct gacgaaggga acaacattgt tcacttcatc 2940
ctaaaagaca tcctagggtt gtttgtgatt tgccatggca gagaggtcct ggtctactca 3000
atgagccagg aggaacactc ccagcatgtc cgccaagtcc tggtccgctt tcggtatcac 3060
aacatctact gttcactgga caaaactcag ttccatcgcc agaccgctga aatcttgggc 3120
ttcaacatat cccccaaagg ggtgaaactg aacaagaacc ttatgaacct catcgtgggg 3180
tgccctgtcc ctggcagcag gaggtgtctt caaagtgtga ttgaccttgt ctatccctat 3240
cgccacttcg tggagaactt cgctgtcatc gcagcacccc tagtgagaca actgctgagt 3300
tcagagccct actactgggg agaagaggag caggaggcct tggaatccct gaagagggct 3360
ttccgcaagt cgcccgttct ctatcaccct aagcctcaga acccattcta cttggaaaca 3420
gacatcactg ggtcattcct gtctgcctcc ctggtccaaa ccgacgacga aactggcaag 3480
aaatctacct gtgctttcta ttcaagaccc ctctctacaa tggaggtgga gtaccctcga 3540
gtggagatga ggatccttcc aatccgggct gccttcatgg tgtggtgccg ctacctggag 3600
aacaccgagg agcccatcat gatccttctc aacacagagg atctagcctc tctgaataat 3660
gacaggctca ccgtacttct ccccgggcat tgggtcttct tcttctcaca cttcaatttt 3720
ggtgttatgg agatgccagc tgaaggtgac acacaagcac tcttccgcag atgttggaac 3780
cagagaggct tcagagcaag gtttctgcgc ccactgctgc ttatgtccat tagggcaaat 3840
ctaaggtact ttgacagatc ctctgagact gaggataaag aggatgatga agaagaggag 3900
gaggaagatg gtgaagaaga agaaggggag gaggaggaag atggtgaaga agaagaaggg 3960
gaggaggagg aagatggtga agaagaagag gaggaggagg aagatgatga agaagaagaa 4020
ggggaggagg aggaagatgg tgaagaagaa gaaggggagg aggaggaaga tggtgaagaa 4080
gaagaagggg aggaggagga agatggtgaa gaagaagaag gggaggagga gggagaggag 4140
gaggaagaag gagaggagga agaggaggaa gaagaggatg aggaggaaga ggaggaggaa 4200
gaggaagagg aggaagaaga ggaggaagaa gaggaggagg aggaagagga ggaagaagag 4260
gaggaggaag atgaggaaga agaggatgag gaggaagaag atgaggaggt gcccagcatg 4320
gtgcgggagc tactggctgc catcccgatg gaccatatcc tcaatggctt actggctcac 4380
ttcagtgtgg cccagatccg ggccgttgtc ctaaacttct tccgtggcct gctctactgg 4440
aagagtctcc tgggtgtggc agctgtcctg gtgatgttga gagcaaggca gcccctctcc 4500
ccagtgcctg cccctaattt ggaagtggcc aggcctcagc accggcacac actccgactc 4560
atcctggact cgaccctcat tgcgagtagt ggcatggcca cagccatcgc tcagttgctc 4620
agccagatgc cccctctagt gggtgccaac accctcccag ctcgagagct ggctgagctt 4680
ttcctgggcc caaggtgctg gcatcggaat gctctgcatt cccagcctcc acgggggatg 4740
cgcttcaccc ctgggttctg gttgaccctg tgtgagttct ttggggtcag agtcaaccct 4800
gaggatgacg tctttcctga cccttaccag caccggtact tggaactgca cgtcgttggg 4860
gatgaagatg tcgtcttgcg agaagccctg caagacgacc tgcaacgtta ccgtcagtgt 4920
ggcctgcatg acggcctgca agacacctcg caggacgcgc aggacaacga cgtgcaagag 4980
gacctgtttg gcgaccagga agcggtcacc ttcagaccac gaaatctttt ggacccagag 5040
gtcctagatt tcctcaacaa ccggctactc tacaccctgg gcaccgatgg ccgccttact 5100
ctgcttagca gagatcaggt ggcccaggcc ctcacacgat tcctggccat ggcctccaga 5160
atggcgctgc cttccccagc cagggaacag gcaaggctag aagagctatc agactcagat 5220
gatgaacttg actga 5235

Claims (3)

1.RTL1基因在调控小鼠成肌细胞增殖和分化中的应用，其特征在于，所述RTL1基因具有促进小鼠成肌细胞的增殖和分化的作用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RTL1基因对小鼠成肌细胞的增殖和分化的促进作用是通过下述方法验证的：
将小鼠RTL1基因完整编码区序列插入到pcDNA3.1载体的EcoRV和XbaΙ两个酶切位点之间得到RTL1基因的超表达载体pcDNA3.1-RTL1；
将超表达载体pcDNA3.1-RTL1转入小鼠成肌细胞C2C12，对细胞进行诱导分化；
再对细胞进行免疫荧光染色，检测成肌分化标志基因MyHC的变化；
若转染了pcDNA3.1-RTL1的细胞中MyHC阳性细胞多于转染对照pcDNA3.1空载体的细胞，则RTL1基因具有促进成肌细胞的分化的作用；
若转染了pcDNA3.1-RTL1组细胞增值率高于对照pcDNA3.1空载体的细胞，则RTL1能够促进小鼠成肌细胞C2C12的增殖。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，小鼠RTL1基因超表达载体的构建具体包括小鼠RTL1基因编码区序列的扩增及其与载体的连接的步骤；
扩增步骤中，小鼠RTL1基因分为上半部分和下半部分进行扩增，其中所述上半部分的引物对，RTL1-F：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，RTL1-CR:核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述下半部分的引物对，RTL1-CF：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，RTL1-R:核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
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