CN109536495B - 抑制RTL1基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抑制RTL1基因表达的siRNA及其应用，所述siRNA为以下三条siRNA中的至少一种：RTL1‑siRNA1，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；RTL1‑siRNA2，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；RTL1‑siRNA3，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述siRNA干扰小鼠RTL1基因，转录水平上的干扰效率达到87％；该siRNA可应用于制备预防和/或治疗肌肉肥大症产品。

Description

抑制RTL1基因表达的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及抑制RTL1基因表达的siRNA及其应用。
背景技术
RTL1基因(反转录转座子1基因，retrotransposon-like-1)，又名父本表达基因11(paternally expressed gene 11,Peg11),在人和小鼠中为父本表达的印记基因，没有内含子序列。RTL1基因在胚胎和胎盘组织中表达量很高，对母体胎盘与胎儿的营养传递起着重要作用，敲除该基因的小鼠表现为胎儿死亡率升高、新生儿生长停滞、胎盘尺寸偏小；与人的胎儿发育和新生儿的生长也有密切关系。该基因位于DLK1-DIO3印记区域，此区域基因对肌肉发育有一定的影响，在转基因小鼠中异位表达RTL1基因，会导致肌肉肥大；此外，该基因与callipyge绵羊的肌肉肥大相关，双肌臀的绵羊中RTL1基因的表达量是正常绵羊中的12倍。
C2C12细胞是由小鼠骨骼肌卫星细胞永生化而来的细胞株，保持着一定的增殖和分化能力，且细胞形态和特性均一，可无限代培养，体外培养的C2C12成肌细胞能在低血清诱导条件下分化为多核的肌管，并表达Myogenin和Myosin等成熟骨骼肌的各种标志蛋白，因此C2C12细胞通常成为体外研究成肌细胞增殖和分化能力的首选模型。
RNA干扰是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。该技术主要是采用与靶基因同源的20-15nt的siRNA(Small interfering RNA,siRNA),诱导靶基因mRNA特异性的降解，从而抑制基因的表达。由于其干扰效率高、操作简便，常被用于基因功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了抑制RTL1基因表达的siRNA及其应用，该siRNA干扰小鼠RTL1基因，转录水平上的干扰效率能达到87％，干扰效率高、特异性好、操作简便、成本低廉，为研究RTL1基因的功能奠定了基础；本发明人发现RTL1基因能够显著抑制成肌细胞的增殖和分化，因而一方面，抑制RTL1基因表达的siRNA能为研究肌肉发育的表达调控机制提供新思路，另一方面，抑制RTL1基因表达的siRNA可以应用于制备预防和/或治疗肌肉肥大症产品。
为实现上述目的，本发明是这样实现的：
本发明的目的之一在于提供了一种抑制RTL1基因表达的siRNA，其为以下三条siRNA中的至少一种：
RTL1-siRNA1，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
RTL1-siRNA2，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
RTL1-siRNA3，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选地，所述siRNA为RTL1-siRNA2。
具体地，所述RTL1-siRNA1、RTL1-siRNA2、RTL1-siRNA3序列的3’端均垂悬有dTdT。
本发明的目的之二在于提供了所述的siRNA在制备预防和/或治疗肌肉肥大症产品中的应用。
进一步地，所述预防和/或治疗肌肉肥大症通过抑制RTL1基因表达实现。
具体地，所述siRNA通过抑制RTL1基因的表达来实现抑制小鼠成肌细胞C2C12的增殖。
具体地，所述siRNA通过抑制RTL1基因的表达来实现抑制小鼠成肌细胞C2C12的分化。
本发明具有的有益效果是：
1、本发明提供的抑制RTL1基因表达的siRNA，干扰小鼠RTL1基因，转录水平上的干扰效率能达到87％，干扰效率高、特异性好、操作简便、成本低廉，为研究RTL1基因的功能奠定了基础。
2、本发明人在试验中发现RTL1基因能够显著抑制成肌细胞的增殖和分化，因而，一方面，抑制RTL1基因表达的siRNA能为研究肌肉发育的表达调控机制提供新思路，在家畜肉质性状方面发挥的调控作用打下了基础；
另一方面，RTL1基因是促进肌肉分化的，那么我们抑制它，就可以抑制肌肉过度肥大，因而对肉质性状的改良及肌肉发育相关疾病的治疗具有一定的意义，在猪的肉质改良上，不能过度追求瘦肉率，还要考虑到肉的风味，肥瘦相间的肉比较好吃，所以现在有的时候要控制瘦肉，增加一定量的脂肪；在疾病上来说，可以治愈一些肌肉肥大症，抑制RTL1基因表达的siRNA可以应用于制备预防和/或治疗肌肉肥大症产品，该产品的有效成分为本发明提供的抑制RTL1基因表达的siRNA。
附图说明
图1为转染siRNA后，荧光定量PCR检测对RTL1基因mRNA水平干扰效果图；
图2为转染siRNA后，western-blot检测对RTL1基因蛋白水平干扰效果图；
图3为siRNA干扰RTL1基因后抑制成肌细胞增殖的效果图；
图4为siRNA干扰RTL1基因后抑制成肌细胞分化的效果图；其中图(A)为荧光定量PCR检测成肌细胞分化标志性基因MyoG mRNA表达水平的变化图；(B)为为荧光定量PCR检测成肌细胞分化标志性基因MyHC mRNA表达水平的变化图；
图5为siRNA干扰RTL1基因后采用Western Blot从蛋白水平检测成肌细胞分化标志性基因MyoG和MyHC表达量变化图。
具体实施方式
实施例1抑制RTL1基因表达的siRNA的获得
1、siRNA的设计、合成
根据Genbank中小鼠RTL1基因序列(Gene ID:353326)，利用BLOCK-iT RNAiDesigner软件(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do)，针对RTL1基因不同靶位点设计3条siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)，并设计siRNA阴性对照(NC)，序列由广州锐博生物科技有限公司合成。
2、RTL1-siRNA1，正义链：5′-GGAGGAAUCAAGUGAUGAU-3′(SEQ ID NO.1)，反义链：5′-AUCAUCACUUGAUUCCUCC-3′(SEQ ID NO.2)；
RTL1-siRNA2，正义链：5′-GCAUCGCACUAGAGACAUA-3′(SEQ ID NO.3)，反义链：5′-UAUGUCUCUAGUGCGAUGC-3′(SEQ ID NO.4)；
RTL1-siRNA3，正义链：5′-GCCCAAGAACUCUCCAGAA-3′(SEQ ID NO.5)，反义链：5′-UUCUGGAGAGUUCUUGGGC-3′(SEQ ID NO.6)。
实施例2抑制RTL1基因表达的siRNA的干扰效果检测
1、抑制RTL1基因表达的siRNA的转染
分别转染小鼠成肌细胞C2C12，转染试剂为锐博公司的riboFECTTM CP，转染步骤如下：
(1)转染前一天，将细胞按照1×105个细胞/孔的密度接种于6孔细胞培养板中；
(2)用120μl 1×riboFECTTM CP Buffer稀释5μl 20μM siRNA，轻轻混匀；
(3)向上述(2)中加入12μl riboFECTTM CP Reagent，轻轻吹打混匀，室温放置15min；
(4)用PBS将6孔板中的细胞清洗3次，去掉PBS，将(3)的混合液接种至细胞板，再加入完全培养基，补充至每个孔终体积为2ml。
2、荧光定量PCR检测siRNA对RTL1mRNA水平干扰效率
将干扰组(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)与阴性对照组(NC)分别转染C2C12细胞，转染24h后收集细胞，Trizo1提取总RNA，TaKaRa Primer Script RT反转录试剂盒进行反转录，采用Bio-Rad公司的SYBR Green荧光染料，Roche公司LightCycler480荧光定量PCR仪，以β-actin作为内参，进行荧光定量PCR实验，用2-ΔΔCt法计算每个基因的相对mRNA表达量，每组实验做3个平行，每个实验重复三次：反应体系为20μ1；反应条件：95℃预变性5min，95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃，15s循环40次。
其中用于荧光定量PCR检测RTL1基因的引物序列如下：
上游引物序列为：CTTTCCTGACCCTTACCA(SEQ ID NO.7)
下游引物序列为：GGTCCAAAAGATTTCGTG(SEQ ID NO.8)
结果表明：如图1所示，相比于阴性对照组(NC)siRNA-1～siRNA-3均有一定的干扰效果，其中siRNA-2的干扰效果最好，使RTL1基因mRNA水平的表达量下降了87％，达到了极显著水平(P<0.01)，因此本发明实施例选用siRNA-2进行后续试验。
3、WesternBlot检测siRNA对RTL1蛋白表达的抑制情况
将干扰组(siRNA-2)与阴性对照组(NC)分别转染C2C12细胞，转染48h后收集细胞，采用碧云天生物技术公司的RIPA裂解液(P0013B)提取蛋白，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度，具体方法参照试剂盒的说明书。将蛋白溶液按照4:1的比例加入5*蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15min，再调平上样量用SDS-聚丙稀铣胺凝胶电泳跑胶。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，200mA转膜1小时，之后抗体孵育，一抗孵育3小时，二抗孵育30分钟，显色曝光。
结果如图2所示，表明RTL1-siRNA-2能够限制抑制RTL1蛋白表达。
实施例3 RTL1-siRNA2对小鼠成肌细胞C2C12细胞增殖的影响
1、采用MTT法检测细胞增殖：将处于对数生长期的细胞用培养基制成单细胞悬液，按每孔2000个细胞，将细胞均匀的接种到96孔板中，每孔100μL，37℃、5％CO2饱和湿度条件过夜培养。转染前2个小时，换成无血清DMEM培养基饥饿处理。分别将siRNA-RTL1干扰组和阴性对照组NC转入细胞，细胞于37℃CO2培养箱中培养，4h后吸出混合液换入正常培养基，分别在培养24h、48h、72h，每孔加入10μLMTT，37℃培养4h，吸出培养基，加入150μL DMSO震荡10min，在酶标仪(美国Thermo公司生产，MULTISKAN MK3型)的490nm波长下测定吸光值。
2、结果如图3所示，干扰RTL1基因明显抑制小鼠成肌细胞C2C12的增殖。
实施例4 RTL1-siRNA2对小鼠成肌细胞C2C12细胞分化的影响
1、未分化的C2C12细胞以含有10％FBS的高糖DMEM培养基(生长培养基，growthmedium,GM)进行培养，将细胞按照1×105接种至6孔培养板，待细胞贴壁，密度达到70％，分别转染siRNA干扰组与阴性对照组，6个小时后换成分化培养基(含2％马血清的DMEM培养基，differentiation medium,DM)，对C2C12细胞进行诱导分化，分别在诱导分化的0d、2d和6d收集细胞，提取RNA和蛋白，利用荧光定量PCR和WesternBlot检测成肌分化标志基因MyoG和MyHC表达量的变化。
2、图4所示为采用荧光定量PCR检测成肌细胞分化标志性基因MyoG和MyHC mRNA表达水平的变化，发现干扰组基因表达量显著低于阴性对照组，说明siRNA通过干扰RTL1基因而抑制成肌细胞的分化。
3、图5所示为收集诱导分化第6d的细胞，提取蛋白，采用Western Blot从蛋白水平检测成肌细胞分化标志性基因MyoG和MyHC表达量变化，结果发现干扰组基因表达量显著降低，进一步说明转染siRNA抑制成肌细胞的分化。
由实施例3和实施例4可知，本发明人在试验中发现RTL1基因能够显著抑制成肌细胞的增殖和分化，因而，一方面，抑制RTL1基因表达的siRNA能为研究肌肉发育的表达调控机制提供新思路，在家畜肉质性状方面发挥的调控作用打下了基础；
另一方面，RTL1基因是促进肌肉分化的，那么我们抑制它，就可以抑制肌肉过度肥大，因而对肉质性状的改良及肌肉发育相关疾病的治疗具有一定的意义，在猪的肉质改良上，不能过度追求瘦肉率，还要考虑到肉的风味，肥瘦相间的肉比较好吃，所以现在有的时候要控制瘦肉，增加一定量的脂肪；在疾病上来说，可以治愈一些肌肉肥大症，抑制RTL1基因表达的siRNA可以应用于制备预防和/或治疗肌肉肥大症产品，该产品的有效成分为本发明提供的抑制RTL1基因表达的siRNA。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0001861512040000091
Figure BDA0001861512040000101
Figure BDA0001861512040000111
Figure BDA0001861512040000121
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 抑制RTL1基因表达的siRNA及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaggaauca agugaugau 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aucaucacuu gauuccucc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcaucgcacu agagacaua 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uaugucucua gugcgaugc 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcccaagaac ucuccagaa 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uucuggagag uucuugggc 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctttcctgac ccttacca 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtccaaaag atttcgtg 18

Claims (3)

1.一种抑制RTL1基因表达的siRNA在调控小鼠成肌细胞增殖和分化中的应用，其特征在于，所述siRNA为：
RTL1-siRNA2，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RTL1-siRNA2序列的3’端垂悬有dTdT。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小鼠成肌细胞为小鼠成肌细胞C2C12。
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