CN107604002A - 通过miRNA let‑7b控制IGF2BP3基因表达的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过miRNA let‑7b控制IGF2BP3基因表达的方法，包括步骤：1)载体构建：使用如SEQ ID№1和2所述的扩增引物从鸡基因组中PCR扩增片段，通过酶切位点NotI与ApaI将扩增的片段连入真核表达载体pcDNA3.1，构建let‑7b过表达载体pcDNA‑EGFP‑pre‑let‑7b；2)成肌细胞的分离培养；3)转染。本发明提供的IGF2BP3基因表达的控制方法，通过将let‑7b过表达载体转染成肌细胞后，降低了IGF2BP3的蛋白质表达量，有效使得成肌细胞增殖数量呈现逐渐下降的趋势发展。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及通过miRNA let-7b控制IGF2BP3基因表达的方法。
背景技术
骨骼肌的生长发育过程涉及多信号途径、多基因表达及网络式调控，其过程很复杂。包括骨骼肌的细胞增殖、分化和凋亡等过程，受到多种细胞因子的调控。在不同的发育阶段，相关基因互相影响，借助于复杂的网络调控通路方式，共同维持肌肉的生长与分化。
目前对骨骼肌发育的研究主要集中在蛋白编码基因，其中包含MADS同源盒蛋白、锌指蛋白和Wnt家族成员、基于碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)蛋白质家族的Myf5、MyoD、Mrf4和Myogenin等生肌调节因子(Myogenic Regulatory Factors，MRFs)或肌源性分化因子(Myogenic Differentiation Factors，MDFs)等基因，这些基因的表达对肌细胞的构成、分化和肌组织形态的构建起着特殊的作用。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约为22nt(18～25nt)的非编码单链小分子RNA，在动物体内普遍存在并且参与其生长、发育、代谢、凋亡等生命过程。miRNA通过与靶基因mRNA的3'UTR相结合，在转录水平引起靶基因mRNA的降解或抑制其蛋白质合成，从而来调控靶基因的表达。
自从上个世纪末Lee等在秀丽新小杆线虫(c.elegans)中发现了一种调控胚胎后期发育的第一个miRNA——lin4后，有越来越多的miRNA被发现。本世纪初，Reinhart等在线虫中初次发现let-7，现已成为目前研究最为普遍的miRNA家族之一。let-7具有高度时空表达性、组织特异性、保守性等特点，普遍参加细胞的分化、增殖、凋亡和癌细胞的浸润。
发明内容
本发明提供一种通过miRNA let-7b控制IGF2BP3基因表达的方法。
通过miRNA let-7b控制IGF2BP3基因表达的方法，包括以下步骤：
1)载体构建：使用如SEQ ID№1和2所述的扩增引物从鸡基因组中PCR扩增片段，通过酶切位点NotI与ApaI将扩增的片段连入真核表达载体pcDNA3.1，构建let-7b过表达载体pcDNA-EGFP-pre-let-7b；
2)成肌细胞的分离培养：
2-1)取胚龄11E的鸡胚，用75％乙醇擦拭蛋壳消毒，镊子敲开气室，取出鸡胚；
2-2)用手术刀分离鸡胚腿部肌肉，放进含20％FBS的DMEM培养液中；
2-3)鸡胚腿部肌肉剔除血管、脂肪、结缔组织，用pH为7.4含有双抗的PBS清洗3次，随后用剪刀剪成肉糜状；
2-4)将肉糜状的肌肉组织转移到50mL离心管中，涡旋1min，静置等待肌肉组织沉至管底，加入0.1％的胶原酶Ⅰ37℃消化30min，再加入0.25％胰酶37℃消化1h，随后加入含20％FBS的DMEM培养基终止消化，上清液用200目过滤筛过滤后转移，向过滤后的清液添加新的DMEM培养液重悬肌肉组织，涡旋振荡1min，重复3～5次；
2-5)对过滤收集到的滤液进行1000r/min离心5min，弃上清；
2-6)加入含15％FBS的DMEM培养液重悬得到的细胞，转移到新的培养皿中，进入37℃，5％CO2细胞培育箱中培养，经过2次差速贴壁法纯化得到成肌细胞；
2-7)待成肌细胞贴壁生长至90％以上时，进行传代培养，先去除原培养液，用含双抗的无Mg2+、Ca2+PBS缓冲液清洗一遍，去除血清和死细胞，再加入2mL 0.25％胰酶消化液作用1min，在倒置显微镜下观察，待细胞膨胀变圆，轻敲瓶底使细胞脱离，加入含血清的全培养基终止消化，彻底吹打，使细胞成为单细胞悬液，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，加入含血清的全培养基，按1:3比例接种到新的培养瓶中继续培养；
3)转染：
3-1)50μL OPTI-MEM Ⅰ培养基稀释600ng pcDNA-EGFP-pre-let-7b，轻柔混匀室温孵育5min；
3-2)50μL OPTI-MEM Ⅰ培养基稀释2μL Lipofectamine 2000试剂后轻柔混匀室温孵育5min；
3-3)将3-1)和3-2)的培养液混合，室温孵育20min后直接加到含0.4mL OPTI-MEMⅠ培养基的细胞中，来回摇动培养板，轻轻混匀，于37℃，5％CO2培养箱中培养4～6h，后换0.5mL含10％FBS、不含抗生素的DMEM培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
本发明提供的IGF2BP3基因表达的控制方法，通过将let-7b过表达载体转染成肌细胞后，降低了IGF2BP3的蛋白质表达量，有效使得成肌细胞增殖数量呈现逐渐下降的趋势发展。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
通过miRNA let-7b控制IGF2BP3基因表达的方法，包括以下步骤：
1)载体构建：使用如SEQ ID№1和2所述的扩增引物从鸡基因组中PCR扩增片段，通过酶切位点NotI与ApaI将扩增的片段连入真核表达载体pcDNA3.1，构建let-7b过表达载体pcDNA-EGFP-pre-let-7b；
2)成肌细胞的分离培养：
2-1)取胚龄11E的鸡胚，用75％乙醇擦拭蛋壳消毒，镊子敲开气室，取出鸡胚；
2-2)用手术刀分离鸡胚腿部肌肉，放进含20％FBS的DMEM培养液中；
2-3)鸡胚腿部肌肉剔除血管、脂肪、结缔组织，用pH为7.4含有双抗的PBS清洗3次，随后用剪刀剪成肉糜状；
2-4)将肉糜状的肌肉组织转移到50mL离心管中，涡旋1min，静置等待肌肉组织沉至管底，加入0.1％的胶原酶Ⅰ37℃消化30min，再加入0.25％胰酶37℃消化1h，随后加入含20％FBS的DMEM培养基终止消化，上清液用200目过滤筛过滤后转移，向过滤后的清液添加新的DMEM培养液重悬肌肉组织，涡旋振荡1min，重复3～5次；
2-5)对过滤收集到的滤液进行1000r/min离心5min，弃上清；
2-6)加入含15％FBS的DMEM培养液重悬得到的细胞，转移到新的培养皿中，进入37℃，5％CO2细胞培育箱中培养，经过2次差速贴壁法纯化得到成肌细胞；
2-7)待成肌细胞贴壁生长至90％以上时，进行传代培养，先去除原培养液，用含双抗的无Mg2+、Ca2+PBS缓冲液清洗一遍，去除血清和死细胞，再加入2mL 0.25％胰酶消化液作用1min，在倒置显微镜下观察，待细胞膨胀变圆，轻敲瓶底使细胞脱离，加入含血清的全培养基终止消化，彻底吹打，使细胞成为单细胞悬液，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，加入含血清的全培养基，按1:3比例接种到新的培养瓶中继续培养；
3)转染：
3-1)50μL OPTI-MEM Ⅰ培养基稀释600ng pcDNA-EGFP-pre-let-7b，轻柔混匀室温孵育5min；
3-2)50μL OPTI-MEM Ⅰ培养基稀释2μL Lipofectamine 2000试剂后轻柔混匀室温孵育5min；
3-3)将3-1)和3-2)的培养液混合，室温孵育20min后直接加到含0.4mL OPTI-MEMⅠ培养基的细胞中，来回摇动培养板，轻轻混匀，于37℃，5％CO2培养箱中培养4～6h，后换0.5mL含10％FBS、不含抗生素的DMEM培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
步骤1)所述的扩增引物如下表所示：
下划线部分为保护碱基序列，斜体部分为酶切位点NotI与ApaI。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 通过miRNA let-7b控制IGF2BP3基因表达的方法
<130> 2017
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
attgcggccg ctgcctgtag agtcacccca cc 32
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggtgggcccc cagaaacaaa acaaatcaag aac 33
Claims (1)
1.通过miRNA let-7b控制IGF2BP3基因表达的方法，包括以下步骤：
1)载体构建：使用如SEQ ID №1和2所述的扩增引物从鸡基因组中PCR扩增片段，通过酶切位点NotI与ApaI将扩增的片段连入真核表达载体pcDNA3.1，构建let-7b过表达载体pcDNA-EGFP-pre-let-7b；
2)成肌细胞的分离培养：
2-1)取胚龄11E的鸡胚，用75％乙醇擦拭蛋壳消毒，镊子敲开气室，取出鸡胚；
2-2)用手术刀分离鸡胚腿部肌肉，放进含20％FBS的DMEM培养液中；
2-3)鸡胚腿部肌肉剔除血管、脂肪、结缔组织，用pH为7.4含有双抗的PBS清洗3次，随后用剪刀剪成肉糜状；
2-4)将肉糜状的肌肉组织转移到50mL离心管中，涡旋1min，静置等待肌肉组织沉至管底，加入0.1％的胶原酶Ⅰ37℃消化30min，再加入0.25％胰酶37℃消化1h，随后加入含20％FBS的DMEM培养基终止消化，上清液用200目过滤筛过滤后转移，向过滤后的清液添加新的DMEM培养液重悬肌肉组织，涡旋振荡1min，重复3～5次；
2-5)对过滤收集到的滤液进行1000r/min离心5min，弃上清；
2-6)加入含15％FBS的DMEM培养液重悬得到的细胞，转移到新的培养皿中，进入37℃，5％CO2细胞培育箱中培养，经过2次差速贴壁法纯化得到成肌细胞；
2-7)待成肌细胞贴壁生长至90％以上时，进行传代培养，先去除原培养液，用含双抗的无Mg2+、Ca2+PBS缓冲液清洗一遍，去除血清和死细胞，再加入2mL 0.25％胰酶消化液作用1min，在倒置显微镜下观察，待细胞膨胀变圆，轻敲瓶底使细胞脱离，加入含血清的全培养基终止消化，彻底吹打，使细胞成为单细胞悬液，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，加入含血清的全培养基，按1:3比例接种到新的培养瓶中继续培养；
3)转染：
3-1)50μL OPTI-MEM Ⅰ培养基稀释600ngpcDNA-EGFP-pre-let-7b，轻柔混匀室温孵育5min；
3-2)50μL OPTI-MEM Ⅰ培养基稀释2μL Lipofectamine 2000试剂后轻柔混匀室温孵育5min；
3-3)将3-1)和3-2)的培养液混合，室温孵育20min后直接加到含0.4mL OPTI-MEM Ⅰ培养基的细胞中，来回摇动培养板，轻轻混匀，于37℃，5％CO2培养箱中培养4～6h，后换0.5mL含10％FBS、不含抗生素的DMEM培养基，于37℃，5％CO2培养箱中培养。
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|---|---|
| CN (1) | CN107604002A (zh) |
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| CN109337926A (zh) * | 2018-10-17 | 2019-02-15 | 佛山科学技术学院 | 一种具有高let-7b成熟体表达量的单倍型鸡成肌细胞的构建方法 |
| WO2024152391A1 (zh) * | 2023-01-16 | 2024-07-25 | 重庆医科大学 | 一种靶向igf2bp3蛋白的单链寡核苷酸及其应用 |
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| CN105886458A (zh) * | 2016-06-07 | 2016-08-24 | 江苏省家禽科学研究所 | 一种机械法提取鸡胚成肌细胞 |
-
2017
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| CN109337926B (zh) * | 2018-10-17 | 2021-08-03 | 佛山科学技术学院 | 一种具有高let-7b成熟体表达量的单倍型鸡成肌细胞的构建方法 |
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