CN106676177A - 长链非编码RNA lnc‑DIF的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种长链非编码RNA lnc‑DIF的应用，技术方案是首先检测老龄骨质疏松小鼠模型股骨样本和后肢去负荷骨质疏松小鼠模型股骨样本，发现长链非编码RNA lnc‑DIF在老龄和后肢去负荷骨质疏松小鼠的骨组织中高表达。进而设计制备长链非编码RNA lnc‑DIF的RNA干扰序列，进行成骨分化功能实验发现：长链非编码RNA lnc‑DIF抑制成骨细胞分化，并且lnc‑DIF能够特异性结合成骨相关miR‑489‑3p。这表明长链非编码RNA lnc‑DIF能够用于制备治疗各种因素引起的骨质疏松以及骨骼系统其他疾病的药物。

Description

长链非编码RNA lnc-DIF的应用
技术领域
本发明属于分子生物医学领域，特别涉及一种长链非编码RNA lnc-DIF的应用。
背景技术
非编码RNA(Non-coding RNA)是指不编码蛋白质的RNA。其中包括microRNA(miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,简称lncRNA)等。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录，但是不编码蛋白，在RNA水平上行使各自的生物学功能。其中lncRNA是一种长大于200nt的真核内源型RNA，广泛分布于真核生物体内，在细胞分化、器官发育和疾病发生等多种生理和病理过程中起重要的调控作用。而成骨细胞是骨形成的主要功能细胞。随着人年龄的增长，骨的发育也发生着动态的变化，其中由成骨细胞引导的骨形成和由破骨细胞引导的骨吸收构成了骨重建的动态平衡。当成骨细胞分化异常时，会导致相应骨代谢疾病的发生，如骨质增生、骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯等。
1ncRNA可在细胞分化，个体发育和疾病中发挥重要作用，如lnc-DC可以调控神经树突状细胞分化，lncRNA-DIGIT可以调控胚胎内胚层形成，lncRNA-CLMAT1可以诱导结直肠癌肝转移等；这些研究主要集中于神经、发育、肿瘤等领域，有关lncRNA参与骨质疏松症等骨代谢疾病的研究报道较少。
纽约大学西奈山医学院的DF Lee等人在李-佛美尼综合症(LFS)患者iPSC来源的成骨细胞中，发现lncRNA H19的表达降低，经进一步分析发现，在恢复成骨细胞中H19的表达后，能促进成骨细胞的分化，同时抑制骨肉瘤的成瘤能力。提示了lncRNA可以对成骨细胞分化发挥作用，也说明可以利用lncRNA来作为治疗骨质疏松等骨骼系统疾病的药物。但该研究仅局限于李-佛美尼综合症患者iPSC来源的成骨细胞中，未做对于正常非病理现象(如衰老，长期卧床等)情况下的成骨细胞研究(Lee DF,et al.Modeling familial cancerwith induced pluripotent stem cells,Cell.2015 Apr 9；161(2):240-254)。
lnc-DIF作为一种lncRNA，位于小鼠19号染色体chr19:38207571-38208896，Genebank ID AK138929.1，长1326bp，最早发现于1999年(Carninci,P.&Hayashizaki,Y.High-efficiency full-length cDNA cloning,JOURNAL Meth.Enzymol.1999(303),19-44)，对于其在成骨细胞分化和骨形成过程中的作用，以及其在人骨质疏松症等骨骼系统疾病的诊断和治疗中的作用能尚未见研究和报道。
miR-489-3p作为一种microRNA(一类长约22～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，可通过碱基互补配对的方式结合靶基因的3’非编码区，从而抑制翻译或降解靶基因)，在调控细胞增殖、分化中起重要作用。本发明利用生物信息学软件分析及qPCR实验发现并验证了lnc-DIF可以特异性结合miR-489-3p，并通过体内动物水平实验、体外细胞水平实验，发现lnc-DIF特异性结合miR-489-3p在制备人骨质疏松症的诊断和治疗药物中的应用。
发明内容
本发明提供一种长链非编码RNA lnc-DIF的应用。该应用首先检测老龄骨质疏松小鼠模型股骨样本和后肢去负荷骨质疏松小鼠模型股骨样本，发现长链非编码RNA lnc-DIF在老龄和后肢去负荷骨质疏松小鼠的骨组织中高表达。进而设计制备长链非编码RNAlnc-DIF的RNA干扰序列，进行成骨分化功能实验发现：长链非编码RNA lnc-DIF抑制成骨细胞分化，并且lnc-DIF能够特异性结合成骨相关miR-489-3p。这表明长链非编码RNA lnc-DIF能够用于制备治疗各种因素引起的骨质疏松以及骨骼系统其他疾病的药物。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案：一种长链非编码RNAlnc-DIF的应用，其特点是包括以下步骤：
首先设计lnc-DIF特异性引物序列，构建老龄小鼠骨质疏松模型和后肢去负荷骨质疏松小鼠模型；并检测lnc-DIF在骨组织中表达量，证实lnc-DIF在小鼠骨质疏松骨组织样本中高表达。
设计、制备并进行化学修饰，获得lnc-DIF的RNA干扰序列；利用体外转染方法将RNA干扰序列转染到小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中，进行qPCR检测，以及ALP染色实验、矿化-茜素红s染色实验，证明长链非编码RNA lnc-DIF通过特异性结合miR-489-3p抑制成骨细胞分化。
获得的lnc-DIF干扰序列能够用于制备治疗骨骼系统疾病的药物及药物组合物，骨骼系统疾病包括人骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯以及其它骨骼系统疾病。所述药物及药物组合物包括药学上能够接受的一种或多种载体，包括但不限于稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂和崩解剂；并能够用不同添加剂制备药物组合物，包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、PH控制剂及表面活性剂。
所述lnc-DIF特异性引物序列如下：
lnc-DIF上游引物：CCTGTGGAGGAAGGAAGATG。
lnc-DIF下游引物：TCAGAAGGCTGGAGAGATGG。
所述lnc-DIF的RNA干扰序列如下：
lnc-DIF siRNA：GGCAUGUAAUCUCUAGACATT。
UGUCUAGAGAUUACAUGCCTT。
本发明的有益效果是：该应用首先检测老龄骨质疏松小鼠模型股骨样本和后肢去负荷骨质疏松小鼠模型股骨样本，发现长链非编码RNA lnc-DIF在老龄和后肢去负荷骨质疏松小鼠的骨组织中高表达。进而设计制备长链非编码RNA lnc-DIF的RNA干扰序列，进行成骨分化功能实验发现：长链非编码RNA lnc-DIF抑制成骨细胞分化，并且lnc-DIF能够特异性结合成骨相关miR-489-3p。这表明长链非编码RNA lnc-DIF能够用于制备治疗各种因素引起的骨质疏松以及骨骼系统其他疾病的药物。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
附图说明
图1是本发明应用lnc-DIF的干扰序列可有效抑制lnc-DIF在前成骨细胞MC3T3-E1中的表达结果图；证明本发明设计的lnc-DIF干扰序列可以有效降低前成骨细胞中lnc-DIF表达水平。(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，***P<0.001)。
图2是本发明利用qPCR技术检测长链非编码RNA lnc-DIF在老龄骨质疏松小鼠模型和HLU后肢去负荷骨质疏松小鼠模型骨组织中低表达的结果图；证明lnc-DIF在骨组织中的表达量与骨质疏松具有相关性。(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，***P<0.001)。
图3是本发明利用qPCR技术检测lnc-DIF的干扰序列可有效促进成骨分化标志基因ALP和ColI表达结果图；证明在前成骨细胞中，当lnc-DIF的表达量下降时，其成骨分化标志因子的表达量降低。(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图4是本发明利用ALP染色和茜素红染色技术检测转染lnc-DIF的干扰序列对成骨细胞矿化结节形成的促进结果图；证明在前成骨细胞中，当lnc-DIF的表达量下降时，其成骨分化能力降低。
图5是本发明应用lnc-DIF的RNA干扰序列发现lnc-DIF与miR-489-3p有靶向作用关系，并且lnc-DIF的RNA干扰序列促进miR-489-3p表达的结果图；证明lnc-DIF对成骨细胞分化的调节机制，即通过特异性结合miR-489-3p抑制成骨细胞分化。
具体实施方式
参照图2：利用qPCR技术检测发现，lnc-DIF在老龄骨质疏松小鼠模型和HLU后肢去负荷骨质疏松小鼠模型的骨组织样品中高表达。
(1)设计并制备lnc-DIF的特异性引物，序列见表1；
(2)建立老龄骨质疏松小鼠模型：
选用C57BL/6实验小鼠，饲养至15月龄、18月龄，处死小鼠，收集胫骨样本。
(3)建立HLU后肢去负荷骨质疏松小鼠模型：
选用C57BL/6实验小鼠，用回形针将小鼠悬挂于尾悬吊装置吊环上，小鼠脊柱与地面呈30°进行尾悬吊后肢去负荷。实验期间动物自由进食、饮水，28天后处死小鼠，收集胫骨样本。
(4)提取小鼠骨组织样本RNA：
取骨组织样品，将肌肉剥离干净，用液氮研磨骨组织，待研磨充分后，转移到1.5mlEP管，加入1ml TRIzol(Invitrogen公司)，之后震荡仪混匀。4℃，12000g离心20min。取上清，转移到新的1.5ml EP管。每1ml TRIzol加入200μl的氯仿，用手上下震荡15s，室温放置2-3min。4℃，12000g离心15min。取出EP管，样品分为三层，将上层的水相转移到新的1.5mlEP管中。加入4℃预冷的异丙醇(500μL/1mL TRIzol)，轻轻吹打混匀，沉淀RNA。-20℃冰箱静置30min，沉淀RNA。4℃，12000g离心10min。去除上清，缓慢沿管壁加入1mL 75％乙醇，小心地吹打混匀。4℃，7500g离心10min。去除上清，室温干燥沉淀10-20min，但不可完全干燥。加入50μl RNase-free的水，吹打混匀，溶解RNA。(可放置在-80℃冰箱保存)用紫外分光光度计检测RNA在260nm和280nm处的吸光值。根据A260/A280比值检测所得RNA的纯度，纯RNA的A260/A280比值在2.0左右(一般实验中，这一比值最好控制在1.7以上，2.1以下)。电泳，凝胶成像仪上观察结果：28S条带与18S条带之比应接近2:1，5S条带不亮。
(5)利用qPCR技术检测lnc-DIF在老龄骨质疏松小鼠骨组织样本中的表达变化：
使用TAKARA反转录试剂盒，先将提取的RNA反转录为cDNA。反转录条件为：37℃15min；85℃ 15s。取各组的cDNA为模板，以GAPDH为内参，采用qPCR检测lnc-DIF基因在老龄骨质疏松小鼠骨组织样本中的表达量。qPCR反应条件为：95℃30s，变性；95℃10s；60℃30s，44个循环。所用lnc-DIF与GAPDH引物序列如下：
表1 引物序列
结果表明，lnc-DIF在老龄骨质疏松小鼠骨组织样本中高表达，说明lnc-DIF在骨组织中的表达量与骨质疏松相关。
参照图1：lnc-DIF的RNA干扰序列可有效抑制lnc-DIF在前成骨细胞MC3T3-E1中的表达。
(1)制备lnc-DIF的RNA干扰序列：
从NCBI数据库获得lnc-DIF的核苷酸序列，根据lnc-DIF的核苷酸序列合成寡核苷酸单链以及互补的双链，经高效液相色谱法纯化，并进行前后2’-4’位点硫代磷酸化骨架修饰以及3’末端胆固醇标记，最终获得lnc-DIF的RNA干扰序列si-lnc-DIF。接着，合成阴性对照干扰序列。使用RNase free水将合成的寡核苷酸稀释为20uM的存储液，分装后于-80℃冻存。lnc-DIF的RNA干扰序列如下：
表2 lnc-DIF的RNA干扰序列
(2)用lnc-DIF的RNA干扰序列转染前成骨细胞MC3T3-E1：
实验分组：转染干扰序列组：转染lnc-DIF siRNA；干扰序列对照组：转染siRNA-NC。每孔的配置，取前成骨细胞MC3T3-E1，以1×106/孔的细胞数接种于6孔板中，2mL含10％FBS、100μg/ml链霉素与100μg/ml青霉素10％FBS，1％L-谷氨酰胺的α-MEM细胞培养基；24小时内细胞汇合达到70-90％；在250μl的α-MEM无血清培养基加入20pmol siRNA 5ul柔和混匀；用250μl无血清的α-MEM稀释5μl lipofectamin 2000试剂，轻轻混匀，室温放置5分钟；将稀释好的siRNA和lipofectamin 2000试剂混合，轻柔混匀，室温放置20分钟，以便形成siRNA/lipofectamin复合物；将500μl复合物加到含有细胞的培养板孔内，补加1.5ml的α-MEM无血清培养基，来回轻柔摇晃细胞培养板。将细胞在CO2培养箱中37℃孵育6小时后，更换培养基，继续孵育。待48h后，进行转染后的其它检测步骤。
(3)提取转染后MC3T3-E1细胞的RNA：
在含有转染细胞的培养板每孔中加入TRIzol(Invitrogen公司)，待细胞充分裂解后，转移到新的1.5ml EP管，其余提取步骤同上。
(4)qPCR检测lnc-DIF表达量(步骤同上)，所用lnc-DIF与GAPDH引物序列同表1所示。
结果表明，在转染了干扰序列后，lnc-DIF的表达水平明显下降。说明设计制备的lnc-DIF干扰序列可有效抑制lnc-DIF在前成骨细胞MC3T3-E1中的表达。
参照图3：lnc-DIF干扰序列可有效促进前成骨细胞中成骨分化标志基因ALP和ColI的表达水平。
转染及RNA提取参照实施例3，接着取各组的cDNA为模板，以GAPDH作为内参，采用qPCR检测成骨分化标志基因ALP和ColI的表达。所用ALP、ColI引物序列如下：
表3 成骨标志基因及内参引物序列
结果表明，lnc-DIF干扰序列可有效促进成骨分化标志基因ALP和ColI的表达，说明lnc-DIF干扰序列可促进成骨细胞分化。
参照图4：lnc-DIF干扰序列可有效促进前成骨细胞ALP活性和矿化结节数量。
(1)ALP染色实验：
取前成骨细胞MC3T3-E1，以5×104/孔的细胞数接种于24孔板中，每组设3个复孔，转染48h后(步骤同上)，用PBS洗涤3次，每次5分钟。采用10％中性甲醛固定细胞，室温15min，用PBS洗涤3次，每次5分钟；去除洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品；室温避光孵育24小时；去除BCIP/NBT染色工作液，用三蒸水洗涤1-2次即可终止显色反应，对染色结果进行扫描，观察。
(2)矿化-茜素红S染色实验：
取前成骨细胞MC3T3-E1，以5×104/孔的细胞数接种于24孔板中，每组设3个复孔，转染48h后(步骤同上)，将细胞培养基更换为诱导成骨分化培养基(α-MEM添加10％FBS、50μg/ml维生素C与10mMβ甘油磷酸钠诱导细胞成骨分化，每2d更换培养基，诱导分化21d时取出细胞，PBS清洗细胞，采用10％中性甲醛固定细胞，室温15min，PBS清洗细胞1次，加入0.5％茜素红S染液(pH4.2)，室温染色15min，使用自来水对细胞震荡清洗4次，5min/次，扫描仪对着色矿化结节进行扫描获取图片分析。
结果表明，转染lnc-DIF干扰序列可有效提高ALP活性，以及促进成骨细胞矿化结节的形成，说明lnc-DIF可抑制成骨细胞分化，提示lnc-DIF可作为诊断和治疗骨质疏松等骨骼系统相关疾病药物作用的靶点。
参照图5：lnc-DIF可以特异性结合miR-489-3p。
(1)生物信息学验证
通过RNA22数据库分析(https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/)，预测得到的lnc-DIF与miR-489-3p的结合位点如下：
表4 通过RNA22预测得到的lnc-DIF与miR-489-3p的结合位点
(2)设计并制备miR-489-3p引物，序列见表5；
表5 小鼠miR-489-3p引物序列
(3)qPCR检测miR-489-3p的表达(以U6为内参)：实验分组：转染干扰序列组：转染lnc-DIF siRNA；干扰序列对照组：转染siRNA-NC。
结果表明，lnc-DIF可以特异性结合miR-489-3p，lnc-DIF的RNA干扰序列可以促进miR-489-3p表达，lnc-DIF是miR-489-3p的竞争性内源RNA。

Claims (3)

1.一种长链非编码RNA lnc-DIF的应用，其特征在于包括以下步骤：
首先设计lnc-DIF特异性引物序列，构建老龄小鼠骨质疏松模型和后肢去负荷骨质疏松小鼠模型；并检测lnc-DIF在骨组织中表达量，证实lnc-DIF在小鼠骨质疏松骨组织样本中高表达；
设计、制备并进行化学修饰，获得lnc-DIF的RNA干扰序列；利用体外转染方法将RNA干扰序列转染到小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中，进行qPCR检测，以及ALP染色实验、矿化-茜素红s染色实验，证明长链非编码RNA lnc-DIF通过特异性结合miR-489-3p抑制成骨细胞分化；
获得的lnc-DIF干扰序列能够用于制备治疗骨骼系统疾病的药物及药物组合物，骨骼系统疾病包括人骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯以及其它骨骼系统疾病；所述药物及药物组合物包括药学上能够接受的一种或多种载体，包括但不限于稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂和崩解剂；并能够用不同添加剂制备药物组合物，包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、PH控制剂及表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的长链非编码RNA lnc-DIF的应用，其特征在于：所述lnc-DIF特异性引物序列如下，
lnc-DIF上游引物：CCTGTGGAGGAAGGAAGATG；
lnc-DIF下游引物：TCAGAAGGCTGGAGAGATGG。
3.根据权利要求1所述的长链非编码RNA lnc-DIF的应用，其特征在于：所述lnc-DIF的RNA干扰序列如下，
lnc-DIF siRNA：GGCAUGUAAUCUCUAGACATT；
UGUCUAGAGAUUACAUGCCTT。
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