CN106011264A - miR-489-3p在制备诊断和治疗人骨质疏松症药物中的应用 - Google Patents

miR-489-3p在制备诊断和治疗人骨质疏松症药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106011264A
CN106011264A CN201610504743.1A CN201610504743A CN106011264A CN 106011264 A CN106011264 A CN 106011264A CN 201610504743 A CN201610504743 A CN 201610504743A CN 106011264 A CN106011264 A CN 106011264A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
osteoporosis
detection
people
antagonist
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610504743.1A
Other languages
English (en)
Inventor
骞爱荣
胡丽芳
印崇
张琰
马剑华
赵帆
陈志浩
李迪杰
李思宇
马小莉
仇伍霞
杨超飞
王牌
苏佩红
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwestern Polytechnical University
Original Assignee
Northwestern Polytechnical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwestern Polytechnical University filed Critical Northwestern Polytechnical University
Priority to CN201610504743.1A priority Critical patent/CN106011264A/zh
Publication of CN106011264A publication Critical patent/CN106011264A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种miR‑489‑3p在制备诊断和治疗人骨质疏松症药物中的应用。技术方案是检测老龄骨质疏松症患者股骨组织样本，发现miR‑489‑3p在人骨质疏松骨组织样本中低表达，可作为诊断骨质疏松症的标志基因。通过设计制备miR‑489‑3p的模拟物及拮抗剂，转染到小鼠前成骨细胞MC3T3‑E1中，进行矿化‑茜素红s染色实验、ALP染色实验，经qPCR和Western blot技术检测发现：miR‑489‑3p促进成骨细胞分化，且miR‑489‑3p靶向调控非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶6(PTPN6)分子。表明miR‑489‑3p可调控PTPN6分子作为治疗骨质疏松等骨骼系统疾病药物作用的靶点。

Description

miR-489-3p在制备诊断和治疗人骨质疏松症药物中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学及医学领域，特别涉及一种miR-489-3p在制备诊断和治疗人骨质疏松症药物中的应用。
背景技术
MicroRNA(miRNAs)是一类长约22～25个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子，可通过碱基互补配对的方式结合靶基因的3’非编码区(3’UTR)，从而抑制翻译或降解靶基因。MicroRNA在进化过程中高度保守，在生物体内分布广泛，并参与许多复杂的生物学过程，如胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢、骨形成等。但只有一小部分miRNAs的生物学功能得到阐明。而成骨细胞是骨形成的主要功能细胞。随着人年龄的增长，骨的发育也发生着动态的变化，其中由成骨细胞引导的骨形成和由破骨细胞引导的骨吸收构成了骨重建的动态平衡。当成骨细胞分化异常时，会导致相应骨代谢疾病的发生，如骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯等。其中，骨质疏松症是一种由骨骼矿物质流失造成的骨量减少现象，骨组织的微结构退化导致骨骼内空隙增大，骨骼结构疏松变脆致使骨折易发。
有研究表明：miRNAs通过调控成骨分化相关基因表达在骨形成中起关键作用，如miR-216促进人脂肪组织来源的间充质干细胞向成骨分化、miR-494通过调节Runx2的表达抑制成骨细胞分化等，但大多数研究仅限于细胞水平。
中国解放军第二军医大学肖建如等发明了“Hsa-miR-489-3p在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用”，选取10例原发性/转移性肺癌患者(经免疫组化检测出4个Brachyury阳性患者和6个Brachyury阴性患者)外周血血浆标本进行qPCR扩增，与标准品比较后，发现miR-489-3p在Brachyury阳性的肺癌患者外周血中高表达，未见动物水平上的研究(肖建如，陈素，周振华.Hsa-miR-489-3p在制备早期筛查或诊断Brachyury阳性肿瘤试剂或试剂盒中的应用[P].上海：CN104878013A，20150902.)。
miR-489-3p作为一种microRNA，文献“Yogin Patel.A novel double-negativefeedback loop between miR-489-3p and the HER2-SHP2-MAPK signaling axisregulates breast cancer cell proliferation and tumor growth,Oncotarget.2016(7)：18295-18308”报道了miR-489-3p通过靶向人表皮生长因子受体2(HER2)分子，减弱HER2的下游信号的传导，进而调节乳腺癌细胞增殖和肿瘤生长。该文献仅限于对miR-489-3p的一个靶分子的研究，未提及miR-489-3p的其它靶分子。
非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶6(PTPN6)是蛋白酪氨酸磷酸酶家族成员，其家族作为信号分子在调节细胞生长、细胞分化、有丝分裂周期等方面发挥重要作用。本发明利用生物信息学软件分析、qPCR及Western blot实验发现并验证了PTPN6是miR-489-3p的靶分子之一，并通过临床骨质疏松样本检测、体内动物水平实验、体外细胞水平实验，发现miR-489-3p通过靶向PTPN6分子在制备人骨质疏松症的诊断和治疗药物中的应用。
发明内容
本发明目的之一在于提供miR-489-3p(SEQ ID No.1)的特异性引物(SEQ IDNo.2、3和4)作为人骨质疏松症等骨骼系统相关疾病的一个新的诊断工具。本发明另一目的在于提供miR-489-3p模拟物(SEQ ID No.5和6)和拮抗剂(SEQ ID No.7)用于制备诊断和治疗骨骼系统疾病的药物及药物组合物。
为实现上述第一个目的，本发明采用技术方案如下：
(1)设计miR-489-3p特异性引物序列，并合成制备以获得miR-489-3p特异性引物；
(2)miR-489-3p特异性引物应用：收集骨质疏松患者骨组织样本、建立老龄小鼠骨质疏松模型、后肢去负荷骨质疏松小鼠模型检测miR-489-3p在骨组织中表达量，证实miR-489-3p不仅在小鼠骨质疏松骨组织样本中显著低表达，在人骨质疏松患者骨组织样本中也低表达。
获得的miR-489-3p特异性引物可作为诊断人骨质疏松症等骨骼系统相关疾病的标志基因，可应用于制备检测骨组织中miR-489-3p表达水平的人骨骼系统疾病相关的检测试剂盒、试纸、芯片、RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、高通量测序平台等。
为实现本发明的另一目的，本发明采用技术方案如下：
(1)设计、制备、并进行化学修饰，获得miR-489-3p模拟物和拮抗剂即agomir-489(SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)和antagomir-489(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)；为提高miR-489-3p模拟物和拮抗剂在体内生物学效用，对其进行化学修饰是本发明的关键技术之一，包括产物进行全链2’甲基化、前后2’-4’位点硫代磷酸化骨架修饰、5’两个硫代磷酸位点修饰、3’四个硫代磷酸位点修饰、以及3’末端胆固醇标记；
(2)miR-489-3p模拟物和拮抗剂应用：利用体外转染技术将其转染到小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中，进行ALP染色实验、矿化-茜素红s染色实验。经qPCR和Western Blot技术检测，证实本发明所述的miR-489-3p通过靶向PTPN6调节成骨细胞分化。
获得的miR-489-3p模拟物和拮抗剂可用于制备诊断和治疗骨骼系统疾病的药物及药物组合物，包括人骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变、脊柱侧弯以及其它骨骼系统疾病。上述药物及药物组合物包括药学上可接受的一种或多种载体，包括但不限于稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂、崩解剂等；并可用不同添加剂制备药物组合物，包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、PH控制剂及表面活性剂等。
本发明的有益效果是：本发明设计制备的miR-489-3p特异性引物可作为人骨质疏松症等骨骼系统疾病的一个方便快捷的诊断工具。本发明设计制备、并进行化学修饰获得的miR-489-3p模拟物和拮抗剂，经多种技术手段检测表明其能对人骨质疏松症等骨骼系统疾病产生治疗效果，最终确定miR-489-3p通过靶向PTPN6分子在制备药物中的应用，特别是针对诊断和治疗人骨质疏松症等骨骼系统疾病。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
附图说明
图1是本发明利用人miRNA表达谱芯片和qPCR技术检测miR-489-3p在老年性骨质疏松患者骨组织样本中低表达的结果图。
图2是本发明利用qPCR技术检测miR-489-3p在老龄小鼠骨质疏松模型的骨组织中低表达的结果图。(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，***P<0.001)
图3是本发明利用qPCR技术检测miR-489-3p在HLU后肢去负荷骨质疏松小鼠模型骨组织中低表达的结果图。(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，***P<0.001)
图4是本发明应用agomir-489可有效促进miR-489-3p在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的表达结果图。(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，***P<0.001)
图5是本发明利用qPCR技术检测agomir-489可有效促进成骨分化标志基因ALP、Runx2和OCN表达结果图。(数值以“均值±标准差”表示，两组间的显著性采用students't检验，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)
图6是本发明利用ALP染色技术检测转染agomir-489以及agomir-489对小鼠前成骨细胞MC3T3-E1矿化结节形成的促进结果图。
图7是本发明利用生物信息学预测PTPN6是miR-489-3p的靶分子之一。
图8是本发明应用antagomir-489发现miR-489-3p与PTPN6有靶向作用关系，并且antagomir-489促进PTPN6表达的结果图。
具体实施方式
以下实施例参照图1-8。
实施例1：利用人miRNA表达谱芯片和qPCR技术检测miR-489-3p在老年性骨质疏松患者骨组织样本中低表达。
(1)设计并制备特异性引物hsa-miR-489-3p，序列见表1；
(2)老年性骨质疏松患者骨组织样本收集：
收集老年性骨质疏松患者骨组织样本111例，立即于RNA保护剂中保存，并于-80℃冰箱内冻存。结合患者既往病史、治疗史等信息，筛选获得未患其他严重慢性疾病患者骨组织样本，分为90岁组和65岁组。
(3)提取老年性骨质疏松患者骨组织样本RNA：
取骨组织样品，将肌肉剥离干净，用液氮研磨骨组织，待研磨充分后，转移到1.5mlEP管，加入1ml TRIzol(Invitrogen公司)，之后震荡仪混匀。4℃，12000g离心20min。取上清，转移到新的1.5ml EP管。每1ml TRIzol加入200μl的氯仿，用手上下震荡15s，室温放置2-3min。4℃，12000g离心15min。取出EP管，样品分为三层，将上层的水相转移到新的1.5mlEP管中。加入4℃预冷的异丙醇(500μL/1mL TRIzol)，轻轻吹打混匀，沉淀RNA。-20℃冰箱静置30min，沉淀RNA。4℃，12000g离心10min。去除上清，缓慢沿管壁加入1mL 75％乙醇，小心地吹打混匀。4℃，7500g离心10min。去除上清，室温干燥沉淀10-20min，但不可完全干燥。加入50μl RNase-free的水，吹打混匀，溶解RNA。(可放置在-80℃冰箱保存)用紫外分光光度计检测RNA在260nm和280nm处的吸光值。根据A260/A280比值检测所得RNA的纯度，纯RNA的A260/A280比值在2.0左右(一般实验中，这一比值最好控制在1.7以上，2.1以下)。电泳，凝胶成像仪上观察结果：28S条带与18S条带之比应接近2:1，5S条带不亮。
(4)人miRNA表达谱芯片检测miR-489-3p在骨组织样本中的表达趋势。
(5)利用qPCR技术检测miR-489-3p在老年性骨质疏松患者骨组织样本中的表达变化：
使用TAKARA反转录试剂盒，先将提取的RNA反转录为cDNA。反转录条件为：37℃15min；85℃ 15s。取各组的cDNA为模板，以U6为内参，采用qPCR检测miR-489-3p基因在老年性骨质疏松患者骨组织样本中的表达量。qPCR反应条件为：95℃30s，变性；95℃10s；60℃30s，44个循环。所用has-miR-489-3p与U6引物序列如下：
表1 hsa-miR-489-3p和U6引物序列
参照图1，结果表明miR-489-3p在老年性骨质疏松患者骨组织样本中低表达，miR-489-3p可作为诊断骨质疏松等骨骼系统相关疾病的标志基因。
实施例2：利用qPCR技术检测miR-489-3p在老龄骨质疏松小鼠模型骨组织中低表达。
(1)设计并制备特异性引物mmu-miR-489-3p，序列见表2；
(2)建立老龄骨质疏松小鼠模型：
选用C57BL/6实验小鼠，饲养至15月龄、17月龄、21月龄，处死小鼠，收集胫骨样本，-80℃冰箱冻存。
(3)提取小鼠胫骨样本RNA，利用qPCR技术检测miR-489-3p在小鼠模型骨组织中的表达量(步骤同上)。所用mmu-miR-489-3p引物序列如下：
表2小鼠miR-489-3p引物序列
参照图2，结果表明miR-489-3p在老龄骨质疏松小鼠模型骨组织中低表达，进一步说明miR-489-3p可作为诊断骨质疏松等骨骼系统相关疾病的标志基因。
实施例3：利用qPCR技术检测miR-489-3p在HLU后肢去负荷骨质疏松小鼠模型骨组织中低表达。
(1)建立HLU后肢去负荷骨质疏松小鼠模型：
选用C57BL/6实验小鼠，用回形针将小鼠悬挂于尾悬吊装置吊环上，小鼠脊柱与地面呈30°进行尾悬吊后肢去负荷。实验期间动物自由进食、饮水，28天后处死小鼠。
(2)提取小鼠胫骨样本RNA，利用qPCR技术检测miR-489-3p在HLU后肢去负荷骨质疏松小鼠模型骨组织中的表达量(步骤同上)。
参照图3，结果表明miR-489-3p在HLU后肢去负荷骨质疏松小鼠模型的骨组织中低表达，充分说明miR-489-3p可作为诊断骨质疏松等骨骼系统相关疾病的标志基因。
实施例4：agomir-489可有效促进miR-489-3p在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的表达。
(1)制备miR-489-3p模拟物agomir-489及其对照agomir-NC：
从miRBase获得miR-489-3p的核苷酸序列，根据miR-489-3p的核苷酸序列合成寡核苷酸单链以及互补的双链，经高效液相色谱法纯化，并进行全链甲基化、前后2’-4’位点硫代磷酸化骨架修饰、以及3’末端胆固醇标记，最终获得miR-489-3p模拟物agomir-489。接着，合成阴性对照agomir-NC。使用RNase free水将合成的寡核苷酸稀释为20uM的存储液，分装后于-80℃冻存。agomir-489及agomir-NC序列如下所示：
表3 agomir-489及agomir-NC序列
(2)用agomir-489转染小鼠前成骨细胞MC3T3-E1：
实验分组：转染模拟物组：转染agomir-489；模拟物对照组：转染agomir-489-NC。每孔的配置，取小鼠前成骨细胞MC3T3-E1，以1×106/孔的细胞数接种于6孔板中，2mL含10％FBS、100μg/ml链霉素与100μg/ml青霉素10％FBS，1％L-谷氨酰胺的α-MEM细胞培养基；24小时内细胞汇合达到70-90％；在250μl的α-MEM无血清培养基加入20pmol antagomir5ul柔和混匀；用250μl无血清的α-MEM稀释5μl lipofectamin 2000试剂，轻轻混匀，室温放置5分钟；用250μl无血清的α-MEM稀释agomir，轻轻混匀，室温放置5分钟；将稀释好的agomir和lipofectamin 2000试剂混合，轻柔混匀，室温放置20分钟，以便形成agomir/lipofectamin 2000复合物；将500μl复合物加到含有细胞的培养板孔内，补加1.5ml的α-MEM无血清培养基，来回轻柔摇晃细胞培养板。将细胞在CO2培养箱中37℃孵育6小时后，更换培养基，继续孵育。待48h后，进行转染后的其它检测步骤。
(3)提取转染后小鼠MC3T3-E1细胞的RNA：
在含有转染细胞的培养板每孔中加入TRIzol(Invitrogen公司)，待细胞充分裂解后，转移到新的1.5ml EP管，其余提取步骤同上。
(4)qPCR检测miR-489-3p表达量(步骤同上)，所用序列同表2所示。
参照图4，结果表明agomir-489可有效促进miR-489-3p在小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中的表达。
实施例5：利用qPCR技术检测agomir-489可有效促进小鼠成骨分化标志基因ALP、Runx2和OCN的表达。
转染及RNA提取参照实施例1，接着取各组的cDNA为模板，以GAPDH作为内参，采用qPCR检测成骨分化标志基因ALP、Runx2和Ocn的表达。所用ALP、Runx2、Ocn与GAPDH引物序列如下：
表4小鼠成骨标志基因及内参引物序列
参照图5，结果表明agomir-489可有效促进小鼠成骨分化标志基因ALP、Runx2和OCN的表达，说明miR-489-3p可促进小鼠成骨细胞分化。
实施例6：转染agomir-489进行ALP染色和矿化-茜素红S染色实验。
(1)ALP染色实验：
取小鼠前成骨细胞MC3T3-E1，以5×104/孔的细胞数接种于24孔板中，每组设3个复孔，转染48h后(步骤同上)，用PBS洗涤3次，每次5分钟。采用10％中性甲醛固定细胞，室温15min，用PBS洗涤3次，每次5分钟；去除洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品；室温避光孵育24小时；去除BCIP/NBT染色工作液，用三蒸水洗涤1-2次即可终止显色反应，对染色结果进行扫描，观察。
(2)矿化-茜素红S染色实验：
取小鼠前成骨细胞MC3T3-E1，以5×104/孔的细胞数接种于24孔板中，每组设3个复孔，转染48h后(步骤同上)，将细胞培养基更换为诱导成骨分化培养基(α-MEM添加10％FBS、50μg/ml维生素C与10mMβ甘油磷酸钠，20pmol agomir每孔1ul)诱导细胞成骨分化，每2d更换培养基，诱导分化21d时取出细胞，PBS清洗细胞，采用10％中性甲醛固定细胞，室温15min，PBS清洗细胞1次，加入0.5％茜素红S染液(pH4.2)，室温染色15min，使用自来水对细胞震荡清洗4次，5min/次，扫描仪对着色矿化结节进行扫描获取图片分析。
参照图6，结果表明转染agomir-489可有效提高ALP活性，以及促进成骨细胞矿化结节的形成，说明miR-489-3p可促进成骨细胞分化，提示miR-489-3p可作为治疗骨质疏松等骨骼系统相关疾病药物作用的靶点。
实施例7：利用生物信息学预测PTPN6是miR-489-3p的靶分子。
利用生物信息学，通过miRBase和miranda数据库分析(http:// www.microrna.org/microrna/getMrna.do？gene＝15170&utr＝4748&organism＝10090& matureName＝mmu-miR-489#)，预测得到miR-489-3p与靶基因PTPN6的结合位点。
参照图7，利用生物信息学预测得到PTPN6是miR-489-3p的靶分子之一。
实施例8：利用qPCR和Western blot技术检测转染antagomir-489对PTPN6表达的影响。
(1)制备miR-489-3p拮抗剂antagomir-489序列：
从miRBase获得miR-489-3p成熟体的核苷酸序列，根据核苷酸序列合成寡核苷酸单链，经高效液相色谱法纯化，并进行全链2’甲基化、5’两个硫代磷酸位点修饰、3’四个硫代磷酸位点修饰、以及3’末端胆固醇标记，获得miR-489-3p拮抗剂antagomir-489，序列为：GCUGCCAUAUAUGUGGUGUCAUU。
(2)设计并制备PTPN6引物，序列见表5；
(3)qPCR检测PTPN6的表达(以GAPDH为内参)：实验分组：转染拮抗剂组：转染antagomir-489；拮抗剂对照组：转染antagomir-NC。所用PTPN6引物序列如下：
表5 mmu-PTPN6引物序列
(4)Western blot检测：
取小鼠前成骨细胞MC3T3-E1，以5×104/孔的细胞数接种于24孔板中，每组设3个复孔，转染72h后(步骤同上)，采用细胞裂解液裂解细胞、提取蛋白质。采用BCA法检测蛋白浓度，之后加上样缓冲液，105℃加热处理15min，冰上放置2min，使蛋白变性；采用SDS-PAGE分离蛋白，其中5％浓缩胶，12％分离胶；将蛋白转移至NC膜上，130V，2h；5％脱脂奶粉封闭20min；分别加入相应一抗，4℃孵育过夜；TBST洗膜3次，15min/次；加入二抗，室温孵育2h；TBST洗膜3次，15min/次；然后进行化学发光检测，并对X光片曝光，经显影定影处理后，进行成像分析。
参照图8，实验结果表明miR-489-3p靶向PTPN6，并抑制PTPN6的表达。

Claims (2)

1.一种miR-489-3p在制备诊断和治疗人骨质疏松症药物中的应用，其特征在于包括以下步骤：
(1)设计miR-489-3p特异性引物序列，并合成制备miR-489-3p特异性引物；
(2)miR-489-3p特异性引物应用：收集骨质疏松患者骨组织样本、建立老龄小鼠骨质疏松模型、后肢去负荷骨质疏松小鼠模型检测miR-489-3p在骨组织中表达量，证实miR-489-3p不仅在小鼠骨质疏松骨组织样本中显著低表达，在人骨质疏松患者骨组织样本中也低表达；
获得的miR-489-3p特异性引物能够作为诊断人骨质疏松症等骨骼系统相关疾病的标志基因，能够应用于制备检测骨组织中miR-489-3p表达水平的人骨骼系统疾病相关的检测试剂盒、试纸、芯片、RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交以及高通量测序平台。
2.一种miR-489-3p在制备诊断和治疗人骨质疏松症药物中的应用，其特征在于包括以下步骤：
(1)设计、制备并进行化学修饰，获得miR-489-3p模拟物和拮抗剂即agomir-489(SEQID No.2和SEQ ID No.3)和antagomir-489(SEQ ID No.4和SEQ ID No.5)；为提高miR-489-3p模拟物和拮抗剂在体内生物学效用，对其进行化学修饰，包括产物进行全链2’甲基化、前后2’-4’位点硫代磷酸化骨架修饰、5’两个硫代磷酸位点修饰、3’四个硫代磷酸位点修饰以及3’末端胆固醇标记；
(2)miR-489-3p模拟物和拮抗剂应用：利用体外转染技术将其转染到小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中，进行ALP染色实验、矿化-茜素红s染色实验；经qPCR和Western Blot技术检测，证实miR-489-3p通过靶向PTPN6调节成骨细胞分化；
获得的miR-489-3p模拟物和拮抗剂能够用于制备诊断和治疗骨骼系统疾病的药物及药物组合物，包括人骨质疏松、股骨头坏死、关节退行性变以及脊柱侧弯类骨骼系统疾病；上述药物及药物组合物包括药学上可接受的一种或多种载体，包括但不限于稀释剂、粘合剂、吸附载体、填充剂以及崩解剂；并能够用不同添加剂制备药物组合物，包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、PH控制剂及表面活性剂。
CN201610504743.1A 2016-06-30 2016-06-30 miR-489-3p在制备诊断和治疗人骨质疏松症药物中的应用 Pending CN106011264A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610504743.1A CN106011264A (zh) 2016-06-30 2016-06-30 miR-489-3p在制备诊断和治疗人骨质疏松症药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610504743.1A CN106011264A (zh) 2016-06-30 2016-06-30 miR-489-3p在制备诊断和治疗人骨质疏松症药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106011264A true CN106011264A (zh) 2016-10-12

Family

ID=57105359

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610504743.1A Pending CN106011264A (zh) 2016-06-30 2016-06-30 miR-489-3p在制备诊断和治疗人骨质疏松症药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106011264A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106676177A (zh) * 2017-01-18 2017-05-17 西北工业大学 长链非编码RNA lnc‑DIF的应用
CN106701922A (zh) * 2016-12-05 2017-05-24 边焱焱 MicroRNA在预防或治疗糖皮质激素引起的股骨头坏死中的应用
CN107326076A (zh) * 2017-07-12 2017-11-07 北京赛尔维康生物医学科技有限公司 一种脊柱侧弯早期辅助检测试剂盒及其应用
CN108048551A (zh) * 2017-12-20 2018-05-18 中国人民解放军第四军医大学 miR-139-3p及其拮抗剂在诊断和治疗骨骼系统疾病中的应用
CN111304200A (zh) * 2020-02-11 2020-06-19 山东大学 一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络及其应用
CN114085902A (zh) * 2022-01-19 2022-02-25 中南大学湘雅二医院 检测人血清外泌体中miR-671-5p试剂的应用及骨质疏松检测试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANGELA SCHOOLMEESTERS 等: "Functional Profiling Reveals Critical Role for miRNA in Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells", 《PLOS ONE》 *
QIANG ZHOU 等: "Ibandronate promotes osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells by regulating the expression of microRNAs", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 *
YASIR ARFAT 等: "Role of microRNAs in Osteoblasts Differentiation and Bone Disorders", 《CURRENT MEDICINAL CHEMISTRY》 *
赵奕: "老年性骨质疏松症与骨源性碱性磷酸酶的相关性探讨", 《基层医学论坛》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106701922A (zh) * 2016-12-05 2017-05-24 边焱焱 MicroRNA在预防或治疗糖皮质激素引起的股骨头坏死中的应用
CN106676177A (zh) * 2017-01-18 2017-05-17 西北工业大学 长链非编码RNA lnc‑DIF的应用
CN107326076A (zh) * 2017-07-12 2017-11-07 北京赛尔维康生物医学科技有限公司 一种脊柱侧弯早期辅助检测试剂盒及其应用
CN108048551A (zh) * 2017-12-20 2018-05-18 中国人民解放军第四军医大学 miR-139-3p及其拮抗剂在诊断和治疗骨骼系统疾病中的应用
CN111304200A (zh) * 2020-02-11 2020-06-19 山东大学 一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络及其应用
CN111304200B (zh) * 2020-02-11 2022-04-15 山东大学 一种调控高脂血症大鼠种植体周围骨整合的ceRNA调控网络及其应用
CN114085902A (zh) * 2022-01-19 2022-02-25 中南大学湘雅二医院 检测人血清外泌体中miR-671-5p试剂的应用及骨质疏松检测试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106011264A (zh) miR-489-3p在制备诊断和治疗人骨质疏松症药物中的应用
Chen et al. Baicalein enhances the osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells by activating the Wnt/β-catenin signaling pathway
Chen et al. Long non‑coding RNA XIST promotes osteoporosis through inhibiting bone marrow mesenchymal stem cell differentiation
Zhang et al. The effects of lactate and acid on articular chondrocytes function: Implications for polymeric cartilage scaffold design
Shi et al. Adipose-derived stem cells cocultured with chondrocytes promote the proliferation of chondrocytes
CN106676177A (zh) 长链非编码RNA lnc‑DIF的应用
Li et al. MicroRNA-21 promotes wound healing via the Smad7-Smad2/3-Elastin pathway
Lee et al. Stimulation of osteoblastic differentiation and mineralization in MC3T3-E1 cells by antler and fermented antler using Cordyceps militaris
Xiong et al. The lncRNA Rhno1/miR-6979-5p/BMP2 axis modulates osteoblast differentiation
Zhai et al. Effects of focused extracorporeal shock waves on bone marrow mesenchymal stem cells in patients with avascular necrosis of the femoral head
Li LncRNA metastasis‐associated lung adenocarcinoma transcript‐1 promotes osteogenic differentiation of bone marrow stem cells and inhibits osteoclastic differentiation of Mø in osteoporosis via the miR‐124‐3p/IGF2BP1/Wnt/β‐catenin axis
Wu et al. Astragalus saponin IV promotes osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells via miR-21/NGF/BMP2/Runx2 pathway
US20210123101A1 (en) Mirna marker and kit associated with postmenopausal osteoporosis
You et al. Ortho-silicic acid enhances osteogenesis of osteoblasts through the upregulation of miR-130b which directly targets PTEN
Ji et al. Effect of low intensity pulsed ultrasound on expression of TIMP-2 in serum and expression of mmp-13 in articular cartilage of rabbits with knee osteoarthritis
Dong et al. The influence of MicroRNA‐150 in Osteoblast Matrix Mineralization
Yin et al. The effects of a pulsed electromagnetic field on the proliferation and osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells
Jin et al. Silencing of miR-330-5p stimulates osteogenesis in bone marrow mesenchymal stem cells and inhibits bone loss in osteoporosis by activating Bgn-mediated BMP/Smad pathway
Wu et al. Morinda officinalis polysaccharide regulates rat bone mesenchymal stem cell osteogenic–adipogenic differentiation in osteoporosis by upregulating miR‐21 and activating the PI3K/AKT pathway
CN106701922A (zh) MicroRNA在预防或治疗糖皮质激素引起的股骨头坏死中的应用
Wu et al. Enhancement of osteogenesis of rabbit bone marrow derived mesenchymal stem cells by transfection of human BMP‑2 and EGFP recombinant adenovirus via Wnt signaling pathway
CN111714510A (zh) 长链非编码rna snhg12抑制剂在制备对抗骨质疏松药物中的应用
Liu et al. Myoblast sensitivity and fibroblast insensitivity to osteogenic conversion by BMP-2 correlates with the expression of Bmpr-1a
Kulyar et al. Chlorogenic acid suppresses miR-460a in the regulation of Bcl-2, causing interleukin-1β reduction in thiram exposed chondrocytes via caspase-3/caspase-7 pathway
Durgam et al. Insulin enhances the in vitro osteogenic capacity of flexor tendon-derived progenitor cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20161012

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication