CN105288658A - miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用，所述miR-18a-5p抑制剂的核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。miR-18a-5p抑制剂通过下调miR-18a-5p的表达，解除miR-18a-5p对LXR-β基因表达的抑制，达到抑制破骨细胞分化的目的，进而实现骨质疏松的防治，因此，本发明为防治骨质疏松提供了新的研究方向。

Description

miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是由多种原因引起的，以单位体积内骨组织量减少、骨密度降低为标志的全身性、进行性、代谢性骨病。OP分为原发性和继发性两种，原发性OP又分为I型绝经后OP和II型老年性OP。在所有的OP患者中，均出现单位体积内骨组织量(BV/TV)降低，骨矿密度(BMD)降低，骨微结构破坏的现象。在老龄化不断加剧的中国社会，OP已经成为威胁老年人健康，降低生活质量的重要因素。

破骨细胞(Osteoclast,OC)由造血干细胞系髓系单核细胞分化而来，是人体骨骼系统中唯一具有吸收和重塑骨骼形态功能的生理性多核巨细胞。在OC的分化过程中，RANKL和M-CSF是最重要的两种细胞因子。在骨吸收过程中，OC能够酸化其细胞外的微环境至pH3.0-4.0。OC的活性和数量与人体正常生理稳态电解质平衡中的钙磷平衡及诸多内分泌疾病包括骨质疏松症密切相关。研究发现，OP患者中破骨细胞活性明显提高，噬骨活动增加，破骨细胞与成骨细胞耦连作用下降，最终导致骨吸收大于骨形成，骨生理稳态遭到破坏，骨密度下降。

微小RNA(microRNA，简称miRNA)是生物体内源长度约为15-22个核苷酸的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。目前只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明，这些miRNAs具有调节细胞生长，组织分化的功能，与生命过程中发育、疾病有关。近些年来越来越多的研究表明，miRNAs在骨骼的生长发育及骨稳态调控中发挥重要功能，部分miRNAs甚至可以作为骨相关疾病的生物学标志。

目前，关于miR-18a的研究主要集中在胃癌标志物，细胞的增殖与癌细胞的转移等方面，其在骨骼系统中的作用鲜有研究，尚未见关于miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松方面的任何报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用。

本发明采取的技术方案如下：

1、miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用。

优选的，miR-18a-5p抑制剂通过下调miR-18a-5p的表达，解除miR-18a-5p对LXR-β基因表达的抑制，进而实现防治骨质疏松的目的。

优选的，所述miR-18a-5p抑制剂包含如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列片段。

优选的，所述miR-18a-5p抑制剂为包含如SEQIDNO.2所示核苷酸序列的质粒或转化体。

优选的，所述转化体为腺病毒、慢病毒或噬菌体。

2、miR-18a-5p抑制剂在抑制破骨细胞分化中的应用。

优选的，所述miR-18a-5p抑制剂通过下调miR-18a-5p的表达，解除miR-18a-5p对LXR-β基因表达的抑制，进而抑制破骨细胞分化。

优选的，所述miR-18a-5p抑制剂包含如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列片段。

优选的，所述miR-18a-5p抑制剂为包含如SEQIDNO.2所示核苷酸序列的质粒或转化体。

优选的，所述转化体为腺病毒、慢病毒或噬菌体。

本发明采用小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞，在RANKL以及MCSF的刺激诱导下向破骨细胞分化，通过microarray检测miRNAs的表达情况，发现miR-18a-5p在破骨细胞分化中表达明显上调。为进一步验证，将原代小鼠骨髓单核细胞分离并通过RANKL以及MCSF的刺激诱导向破骨细胞分化，使用荧光实时定量PCR技术检测原代小鼠骨髓单核细胞向破骨细胞分化过程中miR-18a-5p的表达情况。结果提示诱导分化24h后miR-18a-5p表达显著上调。进一步研究发现在小鼠原代单核细胞破骨分化过程中施加pre-miR-18a-5p，人为上调miR-18a-5p的表达后，破骨细胞分化效果显著提升。提示miR-18a-5p能够促进破骨细胞分化成熟。

在此基础上，本发明将miR-18a-5p抑制剂转染入小鼠原代骨髓单核细胞后通过RANKL以及MCSF诱导破骨分化，通过TRAP染色以及检测破骨细胞分化的指标判断miR-18a-5p对细胞破骨分化的影响。研究发现，转染miR-18a-5p抑制剂实验组TRAP强度明显下降，同时标志破骨分化的CalcitoninReceptor等标志物表达均下调，融合分子DC-STAMP、ATP6v0d2等也有明显下调。

为了探讨miR-18a-5p抑制成骨细胞分化的可能分子机制，本发明通过Targetscan对miR-18a-5p的潜在靶基因进行了预测，并从预测结果中筛选出了可能与miR-18a-5p抑制破骨细胞分化功能相关的候选靶基因——LXR-beta。之后本发明设计了相应的实验来验证LXR-beta是否是miR-18a-5p的靶基因。转染miR-18a-5p模拟物后发现LXR-beta在mRNA水平变化不大，而在蛋白水平发生了显著降低，而转染miR-18a-5p抑制剂后，LXR-beta的表达水平有所升高，说明miR-18a-5p通过直接靶向并下调LXR-beta促进破骨细胞分化，而其抑制剂可以抑制破骨细胞分化、抑制骨钙丢失。

本发明的有益效果在于：本发明采用小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞，在RANKL以及MCSF的刺激诱导下向破骨细胞分化，通过检测miRNAs的表达情况发现miR-18a-5p在破骨细胞分化中表达明显上调；将miR-18a-5p抑制剂转染入小鼠原代骨髓单核细胞后通过RANKL以及MCSF诱导破骨分化，并通过TRAP染色以及检测破骨细胞分化的指标判断miR-18a-5p对细胞破骨分化的影响，结果发现，转染miR-18a-5p抑制剂实验组TRAP强度明显下降，同时标志破骨分化的CalcitoninReceptor等标志物表达均下调，融合分子DC-STAMP、ATP6v0d2等也有明显下调，这表明miR-18a-5p抑制剂可以抑制破骨细胞分化、抑制骨钙丢失，进而一定程度起到防治骨质疏松的作用。因此，本发明为防治骨质疏松提供了新的研究方向。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1microarray芯片检测RAW264.7细胞破骨分化过程中miRNAs表达情况，R(+)表示经过RANKL和M-CSF诱导，R(-)为对照组。

图2荧光实时定量PCR检测小鼠原代骨髓单核细胞破骨分化过程中miR-18a-5p的表达结果，其中，RANKL(+)表示经过RANKL和M-CSF诱导，RANKL(-)为对照组。

图3转染miR-18a-5p模拟物和miR-18a-5p抑制剂对于RAW264.7细胞破骨分化的影响，其中，RANKL(+)表示经过RANKL和M-CSF诱导，RANKL(-)为对照组，pre-miR-18a表示转染miR-18a-5p模拟物组，anti-miR-18a表示转染miR-18a-5p抑制剂组。

图4转染miR-18a-5p抑制剂抑制破骨细胞分化相关基因表达的荧光实时定量PCR检测结果。图A-F依次为基因c-FOS、Ctsk、DC-STAMP、NFATc1、TRAP和NFKB的表达结果。pre组表示miR-18a-5p模拟物组、anti组表示miR-18a-5p抑制剂组，preNC组和antiNC组分别为其各自的对照组(对照是无影响的碱基片段)。

图5双荧光报告系统检测LXR-beta是miR-18a-5p靶基因结果图，pre-miR-18a表示转染miR-18a-5p模拟物组，anti-miR-18a表示转染miR-18a-5p抑制剂组，NC组为对照组。其中，A图为对miR-18a与Nr1h2(LXR-β)的3’-UTR结合进行预测，B图为双荧光报告系统检测结果对预测结果的证实。

图6Westenblot验证LXR-beta是miR-18a-5p靶基因，pre组表示转染miR-18a-5p模拟物组，anti组表示转染miR-18a-5p抑制剂组，preNC组和antiNC组为对照组。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

小鼠原代骨髓单核细胞(BoneMarrowMonocytes,BMMs)由小鼠长骨骨髓细胞分离而来，在RANKL以及MCSF的刺激诱导下可以向破骨细胞分化，是研究破骨细胞分化，融合，成熟，噬骨等生物学行为的常用原代细胞模型。同时破骨细胞与成骨细胞、骨细胞、基质细胞等都有密切的关联和耦合作用，是体内骨稳态、电解质稳态以及促进骨形成的重要调控元素。骨质疏松往往由过多的骨吸收导致，是破骨细胞过度活化的结果。故选择小鼠骨髓单核细胞作为细胞模型进行相关研究。

本文所述miR-18a-5p模拟物为miR-18a-5p的替代品，其作用类似于miR-18a-5p。

1、破骨细胞分化过程中miRNA表达情况检测

首先体外诱导小鼠原代骨髓单核细胞破骨分化，操作步骤如下：

将小鼠原代骨髓单核细胞RAW264.7细胞以1×10³个/孔接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，同时分别以终浓度50ng/mL的RANKL和M-CSF诱导小鼠原代骨髓单核细胞向破骨细胞分化，以普通培养基(DMEM高糖培养液+10％胎牛血清+1％双抗)作为对照。诱导72h后即可见多核(核数量大于3)的破骨细胞形成。培养基成分优选为DMEM高糖培养液+10％胎牛血清+1％双抗(青链霉素)。

将上述获得的破骨细胞进行总RNA提取，步骤如下：

收获破骨细胞时，加入1mlTRIZOL裂解细胞并用吸管反复吹吸5min，然后将细胞转至1.5ml离心管中，并加入0.2ml氯仿，漩涡振荡器上用力震摇15s，然后室温放置3min，4℃、12,000×g离心15min，再将占总体积约60％的无色上层水相转移至新的1.5ml管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温作用10min，4℃、12,000×g离心10min，弃去上清，加入1ml体积分数75％的乙醇(DEPC水配置)洗涤沉淀，震荡，4℃、7,500×g离心5min，弃上清，将沉淀于37℃干燥5～10min，加入30μlDEPC水重新溶解，贮存于-70℃或直接使用。

RNA提取完毕后用microarray芯片检测破骨细胞分化过程中miRNA表达情况，检测由博奥生物(上海)完成，运用SangermiRBase数据库，共检测小鼠的1191种miRNA，其中，p值小于0.05，且变化倍数≥2的miRNA被认为是显著变化的miRNA，这其中便包括miR-18a-5p，其在破骨细胞分化的72h和192h与对照组相比均显著上调(图1)。

根据所得microarray芯片结果，使用Ambion公司的小RNA试剂盒(TaqmanMicroRNAAssay)，根据试剂盒操作手册的标准操作流程，使用荧光实时定量PCR技术检测小鼠原代单核细胞向破骨细胞分化不同时间点miR-18a-5p的表达丰度值(Ct)，用miR-18a-5p的表达丰度值减去18sRNA的表达丰度值得到标准化的表达丰度值(ΔCt)，之后使用GraphPadPrism统计制图软件绘制荧光实时定量PCR检测不同分化时间破骨细胞miR-18a-5p表达图(图2)，结果显示与图1一致，再次说明miR-18a-5p在破骨细胞分化中表达明显上调。

2、miR-18a-5p模拟物和miR-18a-5p抑制剂对破骨细胞分化的影响

首先用miR-18a-5p模拟物和miR-18a-5p抑制剂进行细胞转染实验，两者均由Ambion公司(ThermoScientific)合成，序列如下：

miR-18a-5p模拟物：5’-caaagugcuuacagugcagguag-3’，(SEQIDNO.1)；

miR-18a-5p抑制剂：5’-uaaggugcaucuagugcagauag-3’(SEQIDNO.2)。

实验步骤如下：

转染前24小时，将适量RAW264.7细胞接种于T25培养瓶或6孔、24孔、96孔培养板中，贴壁细胞在长满底面积70％时进行转染。转染时，将miR-18a(5ng/ml)溶于无血清培养液，同时将Lipofectamine2000分散于等体积无血清培养液，并轻轻震摇5分钟，两液相混，放置20分钟。吸去细胞原培养液，换新鲜培养液(含或不含10％小牛血清)，将转染液缓缓加至培养液中，37℃孵箱转染6-8小时。最后弃去转染液，加入完全培养液继续培养。

将转染后细胞以1×10³个/孔接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，分别以终浓度50ng/mL的RANKL和M-CSF破骨诱导培养72h后，进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，染色步骤为：弃置培养基后用PBS清洗3次，每次3min，然后用质量分数为4％的多聚甲醛固定20min，再用PBS清洗3次，每次3min，接着用抗酒石酸酸性磷酸酶染液(0.1mg/mlofnaphtholAS-MXphosphate，0.3mg/mlofFastRedVioletLB复染)避光染色1h，弃置染液，PBS漂洗3次后每孔加入100μLPBS观察，结果如图3所示，根据细胞核统计TRAP阳性细胞数，其中A图为TRAP染色结果，B图为各组相对TRAP强度。由图3中A图可见，光镜下TRAP阳性细胞被染成紫红色，同时，由B图可知，miR-18a-5p模拟物转染(pre-miR-18a组)明显增加了相对TRAP强度，而miR-18a-5p抑制剂转染(anti-miR-18a组)则明显降低了相对TRAP强度，这说明miR-18a-5p能够促进破骨细胞分化，而转染miR-18a-5p抑制剂后能够抑制破骨细胞分化。

3、破骨分化相关基因检测

将miR-18a-5p模拟物(pre组)、miR-18a-5p抑制剂(anti组)和其各自的对照NC(对照是无影响的碱基片段)转染入小鼠原代骨髓单核细胞后，分别以终浓度50ng/mL的RANKL和M-CSF诱导破骨分化72h，收取细胞，提取细胞总RNA，按常规操作流程反转录合成cDNA，设计并合成针对成骨细胞特异基因Ctsk等的Real-timePCR引物，通过荧光实时定量PCR检测破骨分化相关基因的表达丰度，每组做独立实验5复孔，并以GAPDH为内参。

破骨细胞特异基因各自引物序列如下：

Ctsk正向引物：5’-gcggcattaccaacat-3’(SEQIDNO.3)；

Ctsk反向引物：5'-ctggaagcaccaacga-3'(SEQIDNO.4)；

TRAP正向引物：5'-ttgcacattcagtgtttttgg-3'(SEQIDNO.5)；

TRAP反向引物：5'-tgcaagtgtcgtgccaag-3'(SEQIDNO.6)；

c-fos正向引物：5’-aggcagaaccctttga-3’(SEQIDNO.7)；

c-fos反向引物：5’-ggtgaccacgggagta-3’(SEQIDNO.8)；

Nfkb2正向引物：5'-agcctcagggccttacaga-3'(SEQIDNO.9)；

Nfkb2反向引物：5'-ccgtacaatgctcagatcca-3'(SEQIDNO.10)；

NFATc1正向引物：5'-gaggagttggctcagtg-3'(SEQIDNO.11)；

NFATc1反向引物：5'-tagcgttccgttcgtt-3'(SEQIDNO.12)；

DC-STAMP正向引物：5'-gacagagtacgtagccacacgtt-3'(SEQIDNO.13)；

DC-STAMP反向引物：5'-agcccacagaccaaatatcaa-3'(SEQIDNO.14)。

内参具体引物为：

GAPDH正向引物：5'-agatggagatttct-3'(SEQIDNO.15)；

GAPDH反向引物：5'-cttgcttagtttcttgtctggtgt-3'(SEQIDNO.16)。

检测结果表明，miR-18a-5p抑制剂能显著抑制破骨细胞分化相关基因的表达，说明miR-18a-5p抑制剂能抑制破骨细胞的分化和成熟(图4)。

4、双荧光报告基因系统检测miR-18a-5p靶基因

使用Targetscan对miR-18a-5p的潜在靶基因进行预测，筛选得到LXR-beta作为下一步验证实验的候选基因。

将RAW264.7细胞以5×10⁴个/孔的密度接种于48孔板，每个处理准备3个复孔，细胞贴壁后进行瞬时转染，方法按试剂说明进行。以终浓度均为50ng/mL的RANKL和M-CSF破骨诱导后，利用Promega公司PGL-3双荧光报告系统检测靶基因。将含有靶基因3’UTR的报告基因质粒转染细胞，每孔分别转染1μlRNA，0.05μg的报告基因质粒和0.05μg内参(pTKRL)质粒。转染24小时后吸弃每孔培养液，PBS洗涤1次，加入50μLPassiveLysisBuffer，室温裂解20min。分别收集每孔细胞样品。12,000rpm离心10分钟，TD20/20照度计检测报告基因相对活性。比较不同报告基因间的相对活性差别，结果见图5，含有LXR-beta3’UTR的报告基因与miR-18a-5p共转染后其报告荧光测量值显著下降，表明LXR-beta是miR-18a-5p的靶基因。

5、Westernblot蛋白水平检测miR-18a-5p靶基因

将转染了miR-18a-5p模拟物及对照NC48h的细胞消化收集，对细胞样品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用转移缓冲液平衡凝胶和硝酸纤维素膜15-30min之后，在100V电压下转移3h至硝酸纤维素膜上，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸，用TBST(10mMTris·HClpH7.5，150mMNaCl)轻轻摇动洗涤5min，清洗两次，将硝酸纤维素膜浸在封闭液中，4℃过夜或在37℃下缓慢摇动封闭1h，将硝酸纤维素膜室温下浸在TBST缓冲液中，洗膜5min×2次，加入封闭液稀释的小鼠抗LXR-beta一抗，4℃过夜或室温下放置2h后TBST洗膜5min×3次，加入封闭液稀释的抗小鼠二抗，室温下放置1h后TBST洗膜5min×3次，ECL化学发光试剂显色，显现目的条带后及时以X光片曝光、显影。Westernblot检测结果见图6，结果显示，转染miR-18a-5p模拟物后，LXR-beta蛋白表达水平显著下降。

上述研究表明miR-18a-5p能够通过抑制破骨细胞分化相关的重要转录因子LXR-beta基因，促进破骨细胞的分化，导致骨丢失和骨质疏松。miR-18a-5p的抑制剂能下调miR-18a-5p的表达，解除miR-18a-5p对破骨细胞的促进作用、抑制骨丢失，因而可将miR-18a-5p抑制剂用于制备促进骨生成、抗骨质丢失、抗骨质疏松制剂。

需要说明的是，本发明所述miR-18a-5p抑制剂可以为质粒或腺病毒、慢病毒、噬菌体等转化体，只要其包含SEQIDNO.2所示核苷酸序列片段即在本发明保护范围内。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用，其特征在于，miR-18a-5p抑制剂通过下调miR-18a-5p的表达，解除miR-18a-5p对LXR-β基因表达的抑制，进而实现防治骨质疏松的目的。

3.根据权利要求1所述的miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用，其特征在于，所述miR-18a-5p抑制剂包含如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列片段。

4.根据权利要求1所述的miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用，其特征在于，所述miR-18a-5p抑制剂为包含如SEQIDNO.2所示核苷酸序列的质粒或转化体。

5.根据权利要求4所述的miR-18a-5p抑制剂在制备防治骨质疏松药物中的应用，其特征在于，所述转化体为腺病毒、慢病毒或噬菌体。

6.miR-18a-5p抑制剂在抑制破骨细胞分化中的应用。

7.根据权利要求6所述的miR-18a-5p抑制剂在抑制破骨细胞分化中的应用，其特征在于，所述miR-18a-5p抑制剂通过下调miR-18a-5p的表达，解除miR-18a-5p对LXR-β基因表达的抑制，进而抑制破骨细胞分化。

8.根据权利要求6所述的miR-18a-5p抑制剂在抑制破骨细胞分化中的应用，其特征在于，所述miR-18a-5p抑制剂包含如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列片段。

9.根据权利要求6所述的miR-18a-5p抑制剂在抑制破骨细胞分化中的应用，其特征在于，所述miR-18a-5p抑制剂为包含如SEQIDNO.2所示核苷酸序列的质粒或转化体。

10.根据权利要求9所述的miR-18a-5p抑制剂在抑制破骨细胞分化中的应用，其特征在于，所述转化体为腺病毒、慢病毒或噬菌体。