CN104140968B - 一种放射治疗靶向增敏剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种放射治疗靶向增敏剂，所述增敏剂由下列7种miRNAs构成：hsa‑miR‑138‑2‑3p模拟物；hsa‑miR‑208b‑3p模拟物；hsa‑miR‑197‑3p抑制物；hsa‑miR‑20b‑3p抑制物；hsa‑let‑7a‑5p抑制物；hsa‑miR‑16‑1‑3p抑制物；hsa‑miR‑21‑5p抑制物；本发明提供了一种增加放疗敏感性且毒副作用较轻的新型放疗靶向增敏剂，特别应用于各期喉癌患者，具有重大的应用前景；本发明所提供的新型放射治疗靶向增敏剂，预期在提高放疗敏感性并进一步增加其疗效方面，发挥较大的优势，产生良好的经济和社会效益。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种放射治疗靶向增敏剂，特别涉及一种具有针对放射治疗靶向增敏作用的miRNAs组合物及其应用。
(二)背景技术
肿瘤干细胞是肿瘤中少数具有自我更新、无限增殖及多向分化潜能的细胞，且固有放射抵抗能力，一般认为肿瘤干细胞是肿瘤发生发展和放射抵抗的根源。近年来，人们已经成功分离鉴定近十种肿瘤干细胞；较为认可的“标志”细胞是流式细胞仪检测的侧群细胞(肿瘤干细胞样细胞)和CD133+CD44+肿瘤细胞。
目前有些研究已经深入到肿瘤干细胞的关键基因的调控。其中最为引人瞩目的是肿瘤干细胞的微小RNA(microRNA，miRNAs)的研究。研究发现，miRNAs是肿瘤细胞内的最重要的基因调控分子之一，而肿瘤干细胞的miRNA特异性改变，可以从其对肿瘤干细胞靶基因的调控作用上体现出来。特异性miRNAs在肿瘤干细胞的特性方面起独特而重要的调控作用，包括对生物学特性方面，如对放射抵抗基因的调控作用。可以推断，放射特异的miRNAs在肿瘤干细胞放射抵抗中起到调控作用。miRNA已成为近年肿瘤学的研究热点。
喉癌是喉部最常见的恶性肿瘤，也是呼吸道仅次于肺癌的第二位高发癌，多见于中老年男性。近年来，我国喉癌发病率呈上升趋势。喉癌的治疗以手术和放疗为主，放疗适用于有手术禁忌症的患者、广泛病变的术前控制、手术切缘不充分的补充治疗等。对部分早期喉癌及低分化、未分化癌可作为首选治疗措施。目前，对于肿瘤细胞放疗增敏制剂已有一定的研究和临床应用，如使用靶向药物、化疗药物、中药联合放疗，具有一定的增敏作用。但是，肿瘤细胞的放疗抵抗仍然是严重困扰其放疗效果的难题。目前，喉癌细胞尤其是喉癌干细胞中放疗抵抗相关miRNAs调控的研究，国内外均未见报道。基于喉癌干细胞来源的具有高效增强喉癌放疗敏感性的miRNAs组合制剂的开发研究具有前沿性和创新性。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种在放射治疗中具有明显增强放疗敏感性和提高疗效的miRNAs组合物(即放射治疗靶向增敏剂，特别是针对喉癌放射治疗靶向增敏剂)及其应用，较目前其他放疗增敏制剂，其特异性和靶向性更强，作用机制更为广泛，制剂的毒副作用更小。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种放射治疗靶向增敏剂，特别是针对喉癌放射治疗靶向增敏剂，所述增敏剂由下列7种miRNAs构成：
(1)hsa-miR-138-2-3p mimic：5’-GCUAUUUCACGACACCAGGGUU-3’、
(2)hsa-miR-208b-3p mimic：5’-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU-3’、
(3)hsa-miR-197-3p inhibitor：5’-GCUGGGUGGAGAAGGUGGUGAA-3’、
(4)hsa-miR-20b-3p inhibitor：5’-CUGGAAGUGCCCAUACUACAGU-3’、
(5)hsa-let-7a-5p inhibitor：5’-AACUAUACAACCUACUACCUCA-3’、
(6)hsa-miR-16-1-3p inhibitor5’-UCAGCAGCACAGUUAAUACUGG-3’
(7)hsa-miR-21-5p inhibitor：5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’(mimic指模拟物，inhibitor指抑制物)。
进一步，本发明所述增敏剂由hsa-miR-138-2-3p模拟物、hsa-miR-208b-3p模拟物、hsa-miR-197-3p抑制物、hsa-miR-20b-3p抑制物、hsa-let-7a-5p抑制物、hsa-miR-16-1-3p抑制物和hsa-miR-21-5p抑制物以质量比1:1:1:1:1:1:1混合制成。
本发明还涉及一种所述放射治疗靶向增敏剂在制备增癌放射治疗敏感性药物中的应用。
本发明所述放射治疗靶向增敏剂通常以转染入目标细胞发挥作用，具体在体外将放射治疗靶向增敏剂转染入喉癌细胞，培养喉癌细胞放疗增敏作用的方法为：人工合成hsa-miR-138-2-3p模拟物、hsa-miR-208b-3p模拟物、hsa-miR-197-3p抑制物、hsa-miR-20b-3p抑制物、hsa-let-7a-5p抑制物、hsa-miR-16-1-3p抑制物和hsa-miR-21-5p抑制物，以24孔细胞培养板为例，(1)将上述人工合成的寡核苷酸以质量比1:1:1:1:1:1:1混合后，总质量为0.33μg、0.67μg、1μg，用DEPC水2.1μl、4.2μl、6.3μl溶解，分别加入22.9μl、20.8μl、18.7μl的RPMI1640培养液，制成总体积为25μl的RNA稀释液；(2)将2μl的Entranstr-R与23μl的RPMI1640培养液混合，制成总体积为25μl的Entranstr-R稀释液；将(1)、(2)制备的液体混合，制成50μl转染复合物，加入含有5×105个喉癌细胞的450μl含有体积比为10％胎牛血清的RPMI1640培养基中；即制备成含放射治疗靶向增敏剂总物质的量的浓度为50nM、100nM、150nM的转染体系，优选所述转染体系中增敏剂总物质的量的浓度100nM。
本发明所述喉癌放射治疗靶向增敏剂在不同容器中培养的用量：
(a)细胞培养容器，(b)每孔可获细胞数，(c)每孔增敏剂总质量，(d)每孔DEPC水体积，(e)每孔RNA稀释液总体积，(f)每孔Entranstr-R体积，(g)Entranstr-R稀释液总体积，(h)每孔细胞培养基总体积。
注：每孔组合物增敏剂总物质的量的浓度为100nM。
本发明所述具有靶向调控喉癌放射治疗敏感性的增敏剂为含两种具有上调喉癌放疗敏感性的寡核苷酸模拟物(hsa-miR-138-2-3p模拟物、hsa-miR-208b-3p模拟物)和五种具有下调喉癌放射抵抗性寡核苷酸抑制物(hsa-miR-197-3p抑制物、hsa-miR-20b-3p抑制物、hsa-let-7a-5p抑制物、hsa-miR-16-1-3p抑制物、hsa-miR-21-5p抑制物)的混合制剂。本发明要点在于培养喉癌干细胞，通过临床常用剂量放射治疗后，筛选出具有2倍以上差异的miRNAs，具有2倍上调表达的miRNAs认为是可能具有增加放射抵抗性的miRNAs，具有2倍下调表达的miRNAs认为是可能具有增加放疗敏感性的miRNAs，并结合miRBase等数据库，筛选出可能性较大的具有调节喉癌放疗效应的2种具有2倍下调表达的miRNAs和5种具有2倍上调表达的miRNAs，并明确其核苷酸序列。合成具有2倍下调表达miRNAs的模拟物和具有2倍上调表达miRNAs的抑制物。将上述7种合成的寡核苷酸按等质量比组成miRNAs靶向放疗增敏剂，同时设立无义miRNA组、PBS组、空白组作为对照，应用纳米聚合物转染制剂将上述增敏剂、无义miRNA、PBS高效转染至体外培养的喉癌细胞内。将增敏剂组、无义miRNA组、PBS组、空白组喉癌细胞按临床常用剂量进行放射治疗，观察放疗后，转染增敏剂组的喉癌细胞较对照组在喉癌增殖、侵袭、凋亡等生物学行为的差异，以验证喉癌放疗靶向增敏剂的疗效及毒副作用。本领域技术人员，可通过培养喉癌干细胞、筛选调节放疗敏感性miRNAs、体外合成寡核苷酸、转染入细胞，观察放疗疗效，方便地制备喉癌放疗靶向增敏制剂。
本发明喉癌放射治疗方案为6MV-X线垂直照射，总剂量为400cGy，剂量率为200cGy/min，单次剂量为200cGy，照射野为20cm×20cm，照射时于培养板表面覆盖1.5cm组织等效填充物，源皮距(SSD)100cm。间隔48小时照射一次，共照射两次。200cGy/次为临床治疗喉癌最常用的单次照射剂量，间隔48小时再照射，而并非间隔24小时，是考虑到最大程度诱导喉癌放疗抗拒或增敏miRNAs的差异表达且尽可能减少因照射直接导致细胞的凋亡和坏死。
本发明所述喉癌放疗靶向增敏剂为多种具有不同抗肿瘤作用机制的miRNAs混合制剂。miRNA通过其5’端的2～8个核苷酸的种子区与靶基因信使RNA(messenger RNA，mRNA)3’UTR(非翻译区)配对结合，形成RNA诱导沉默复合体(RISC)，引起靶mRNA降解、稳定性下降或使其翻译受到抑制，从而调节基因转录后的表达。miRNAs与靶基因以一对多或多对一的方式进行呈网络状的复杂调控。目前现有miRNA与肿瘤细胞的研究，仅是研究一种或两种miRNAs对某肿瘤细胞的发生发展、侵袭转移或放化疗抵抗等方面的调控作用，而本发明应用多种具有调控肿瘤放疗增敏机制miRNAs组合物，较单一miRNA制剂，可能作用机制更为广泛，使用剂量更小，毒副作用更轻。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种增加放疗敏感性且毒副作用较轻的新型放疗靶向增敏剂，特别应用于各期喉癌患者，具有重大的应用前景。通过转染放疗靶向增敏剂至癌细胞并接受放疗以验证其增敏作用，特别是将喉癌放疗靶向增敏剂转染至喉癌细胞，并接受临床常规喉癌放疗剂量，通过体外喉癌细胞增殖、凋亡、侵袭实验验证了本发明放疗靶向增敏剂具有放疗增敏且毒性低的优点，较目前临床上使用化疗药物、靶向药物、中药等放疗增敏剂，本发明凸显靶向增敏的优势。本发明所提供的新型放射治疗靶向增敏剂，预期在提高放疗敏感性，特别是喉癌放疗敏感性并进一步增加其疗效方面，发挥较大的优势，产生良好的经济和社会效益。
(四)附图说明
图1流式细胞仪进行对照组的检测图，A为圈定无荧光P1区域，B为检测的荧光P2区域，C为结果分析图。
图2流式细胞仪进行实验组的检测图，A为圈定无荧光P1区域，B为检测的荧光P2区域，C为结果分析图。
图3为放疗后Hep-2细胞增殖情况比较图，A为放疗后0h，B为放疗后24h，C为放疗后48h，D为放疗后72h。
图4为放疗24h后各组Hep-2细胞凋亡率的比较图，A为细胞早期凋亡率的比较，B为细胞晚期凋亡率的比较，C为细胞总凋亡率的比较。
图5为放疗后24hHep-2细胞迁移情况比较图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
主要仪器、材料：
CO2培养箱(Thermos公司)、人喉癌上皮细胞Hep-2细胞株(南京凯基生物公司)、DEPC水(鼎国TER011-1)、RPMI1640培养液(吉诺生物GNM31800-S)、Entranstr-R(英格恩生物No.18668-06)、胎牛血清(HyClone SV30087.01)、DEME/F12培养液(吉诺生物GNM12800-S)、PBS缓冲液(1×)(吉诺生物GNM20012)、胰酶(吉诺生物GNM27250)、考马斯亮蓝、40％多聚甲醛(杭师大附属医院病理科惠赠)、人表皮生长因子(EGF)(北京德博生物AF-100-15)、人成纤维生长因子(bFGF)(西安融智生物PHG0024)、25cm2细胞培养瓶(美国Corning)、24孔板细胞培养板(美国Corning)、Transwell小室(美国Corning)、1.5ml离心管(Axygen)、抗人CD44(Abcam)、CD133抗体(Abcam)、FITC(北京中杉金桥)、Cy3荧光抗体(北京中杉金桥)、微阵列差异miRNA筛选(上海康成生物)、寡核苷酸制备(上海invitrogen)、FAM阴性对照RNA(上海invitrogen)、CCK-8试剂盒(碧云天生物)、酶标仪I Maker(美国Bio-Rad)、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物)、高速低温离心机(Beckman)、流式细胞仪(美国BD)、Transwell(美国Corning)。
实施例1放疗差异miRNAs的筛选
1.1Hep-2干细胞的培养
配制无血清培养基(SFM)：即在DMEM/F12培养液5ml中以体积比1000:1加入EGF、bFGF各5μl。
取处于生长对数期的人喉癌上皮细胞Hep-2，以SFM培养基重悬制成细胞数量为103个/ml的细胞悬液，在25cm2细胞培养瓶中常规培养，即将培养瓶竖直放入含有5％CO2的细胞培养箱中，37℃培养，每日摇数次。显微镜下观察微球形成，超净台中，每2d半量换液，即弃去一半SFM培养基，加入等量新鲜SFM培养基，每6d传代，以细胞数1:3传代，传代时将培养瓶中的培养基加入1.5ml离心管，以4℃、1000g、4分钟离心收集微球体，胰酶消化并用移液器吹打成单细胞，用PBS缓冲液洗涤后在新鲜SFM培养基中传代培养。重复半量换液及传代数次，直至扩增和富集数量为107个Hep-2微球体单细胞。
取富集得到的Hep-2微球体单细胞107个，重悬于1ml的PBS缓冲液，洗涤1遍，以4℃，1000g，4分钟离心收集细胞。将Hep-2细胞加入抗人CD44抗体溶液34μl(抗人CD44抗体与PBS缓冲液体积比为1:30混合而成)及PBS缓冲液966μl，轻轻混匀，室温放置40分钟孵育。40分钟后以4℃，1000g，离心4分钟，弃上清，加入1ml PBS缓冲液洗涤后、离心，重复洗涤、离心2遍；避光以Cy3荧光二抗标记CD44一抗，即向抗人CD44抗体标记的Hep-2细胞中加入2μl的Cy3溶液(Cy3与PBS缓冲液体积比为1：500混合而成)及PBS缓冲液998μl，轻轻混匀，避光室温放置40分钟孵育。40分钟后以4℃，1000g，离心4分钟，弃上清，加入PBS缓冲液洗涤、离心，重复洗涤离心2遍；再加入抗人CD133抗体10μg(以1μg/106细胞比例)及PBS缓冲液980μl，轻轻混匀，避光室温放置40分钟孵育。40分钟后以4℃，1000g，离心4分钟，弃上清，加入PBS缓冲液洗涤离心，重复洗涤离心2遍；避光以FITC荧光二抗标记CD133一抗，即加入FITC溶液40μl(FITC与PBS缓冲液体积比为1：25混合而成)及PBS缓冲液960μl，轻轻混匀，避光室温放置40分钟孵育。40分钟后以4℃，1000g，离心4分钟，弃上清，加入PBS缓冲液洗涤离心，重复洗涤离心2遍，后重悬于1000μl的PBS缓冲液，立即进行流式细胞仪分选，分选具有CD44和CD133双阳性的Hep-2细胞即为Hep-2干细胞，共计筛选出6×106个双阳性Hep-2干细胞。
1.2Hep-2干细胞的放射治疗
将分选得到的Hep-2干细胞分成两组，一组为实验组，接受放射治疗，另一组为对照组，不接受放射治疗。将6×106个Hep-2干细胞以SFM培养基重悬，调整细胞浓度至1.5×106个/5ml，接种于25cm2细胞培养瓶中。共计接种4瓶，实验组与对照组各2瓶。待喉癌干细胞生长状态稳定后，用临床上常用的喉癌放射治疗方案，即6MV-X线垂直照射，总剂量为400cGy，剂量率为200cGy/min，单次剂量为200cGy，照射野为20cm×20cm，照射时于培养板表面覆盖1.5cm组织等效填充物，源皮距(SSD)100cm。间隔48小时照射一次，共照射两次。同时将对照组放置于放疗照射野外。
1.3筛选差异表达miRNA的与合成寡核苷酸
委托上海康成生物公司，筛选放疗后Hep-2干细胞差异表达的miRNAs，大致方案为：使用RNA抽提试剂盒抽提放射治疗后的两组喉癌干细胞的总RNA。使用miRNA分离试剂盒富集和纯化miRNA：总RNA和相当于其5倍体积的裂解/结合缓冲液相混合，加入与上述混合物体积比为1/10的miRNA匀浆添加剂，冰上孵育，加入1/3体积的无水乙醇，混匀后通过滤管。收集液体加入2/3体积的无水乙醇，混匀后95℃预热后二次过滤。用牛肠碱性磷酸酯酶制备标记反应物，用T4连接酶进行荧光标记miRNA并过柱纯化。在荧光miRNA样本中加入10×GE阻断剂和2×HiRPM杂交缓冲液，并用杂交仪及其旋转烘箱进行miRNA芯片(丹麦Exiqon公司)杂交。结束后分别将芯片在GE缓冲液清洗、Agilent芯片扫描仪扫描读取杂交信号，挑选接受放疗的Hep-2干细胞与未接受放疗的Hep-2干细胞之间，具有2倍差异上调/下调表达的miRNA，并结合miRBase，筛选意义较大的7种miRNA并明确其核苷酸序列。
筛选出的7种miRNAs及具体寡核苷酸序列如下：
具有2倍下调表达的miRNA
(1)hsa-miR-138-2-3p
5’-GCUAUUUCACGACACCAGGGUU-3’
(2)hsa-miR-208b-3p
5’-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU-3’
具有2倍上调表达的miRNA
(1)hsa-miR-197-3p
5’-AAGUGGUGGAAGAGGUGGGUCG-3’
(2)hsa-miR-20b-3p
5’-UGACAUCAUACCCGUGAAGGUC-3’
(3)hsa-let-7a-5p
5’-ACUCCAUCAUCCAACAUAUCAA-3’
(4)hsa-miR-16-1-3p
5’-GGUCAUAAUUGACACGACGACU-3’
(5)hsa-miR-21-5p
5’-AUCGAAUAGUCUGACUACAACU-3’
委托上海invitrogen公司合成筛选出的7种所需miRNA：2种具有2倍上调表达的miRNA，合成其寡核苷酸模拟物；5种具有2倍下调表达的miRNA，合成其寡核苷酸抑制物。合成的7种寡核苷酸序列分别为：hsa-miR-138-2-3p mimic：5’-GCUAUUUCACGACACCAGGGUU-3’、hsa-miR-208b-3p mimic：5’-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU-3’、hsa-miR-197-3pinhibitor：5’-GCUGGGUGGAGAAGGUGGUGAA-3’、hsa-miR-20b-3p inhibitor：5’-CUGGAAGUGCCCAUACUACAGU-3’、hsa-let-7a-5p inhibitor：5’-AACUAUACAACCUACUACCUCA-3’、hsa-miR-16-1-3p inhibitor：5’-UCAGCAGCACAGUUAAUACUGG-3’、hsa-miR-21-5pinhibitor：5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’。
同时合成无义RNA，其序列为：5’-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGU-3’，FAM阴性对照物，其序列为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。
实施例2Hep-2细胞转染和转染率测定
2.1Hep-2细胞miRNA的转染
2.1.1放疗靶向增敏组制剂：以24孔细胞培养板为例，(1)将实施例1中合成的7种寡核苷酸以质量比1:1:1:1:1:1:1混合后，制成总质量分别为0.33μg、0.67μg、1μg的样品，依次用DEPC水2.1μl、4.2μl、6.3μl溶解，然后分别加入22.9μl、20.8μl、18.7μl的RPMI1640培养液，制成终体积为25μl的RNA稀释液，室温静置5分钟；(2)将2μl的Entranstr-R与23μl的RPMI1640培养液混合，制成终体积为25μl的Entranstr-R稀释液，室温静置5分钟；将(1)和(2)制备的RNA稀释液和Entranstr-R稀释液等体积混合，制成50μl增敏剂转染复合物，室温静置30分钟。增敏剂转染复合物中样品的物质的量的终浓度分别为50nM、100nM、150nM(所述终浓度指将增敏剂转染复合物加入2.1.3制备的含有体积比为10％胎牛血清的RPMI1640培养基0.45ml构成的转染体系中的浓度)。
2.1.2对照组制剂：无义序列对照：(1)取实施例1中合成的无义miRNA0.67μg，用DEPC水4.2μl溶解，加入20.8μl的RPMI1640培养液，制成终体积为25μl的RNA稀释液，室温静置5分钟；(2)将2μl的Entranstr-R与23μl的RPMI1640培养液混合，制成终体积为25μl的Entranstr-R稀释液，室温静置5分钟；将(1)、(2)制备的RNA稀释液和Entranstr-R稀释液等体积混合，制成50μl无义miRNA转染复合物，室温静置30分钟，其中无义miRNA终物质的量的浓度为100nM(所述终浓度指将无义miRNA转染复合物加入2.1.3制备的含有体积比为10％胎牛血清的RPMI1640培养基0.45ml构成的转染体系中的浓度)。
PBS对照：(1)取PBS缓冲液4.2μl，加入20.8μl的RPMI1640培养液，制成终体积为25μl的RNA稀释液，室温静置5分钟；(2)将2μl的Entranstr-R与23μl的RPMI1640培养液混合，制成终体积为25μl的Entranstr-R稀释液，室温静置5分钟；将(1)、(2)制备的RNA稀释液与Entranstr-R稀释液等体积混合，制成50μl的PBS转染复合物，室温静置30分钟。
2.1.3待转染的Hep-2细胞：将1.5×105个Hep-2细胞种植在含有体积比为10％胎牛血清的RPMI1640培养基的24孔板中，放入含有5％CO2的细胞培养箱中，37℃培养，培养24h，至细胞贴壁生长，生长状态稳定。待Hep-2细胞汇合度为30％且生长状态稳定时，吸去孔板中的培养液，加入含有体积比为10％胎牛血清的RPMI1640培养基0.45ml。准备转染。
2.1.4Hep-2细胞转染：将待转染的Hep-2细胞分为6组，组1为转染50nM增敏剂组、组2为转染100nM增敏剂组、组3为转染150nM增敏剂组、组4为转染无义miNA组、组5为转染PBS组、组6为不转染空白组。其中组1、组2、组3为实验组，组4、组5、组6为对照组。
将2.1.1所述分别为50nM、100nM、150nM的增敏剂转染复合物与2.1.2所述100nM无义miRNA转染复合物、50μl的PBS转染复合物分别加入2.1.3所述体积为0.45ml含有体积比为10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，前后移动培养皿，混合均匀。即为转染50nM增敏剂组、转染100nM增敏剂组、转染150nM增敏剂组、转染无义miNA组、转染PBS组。不转染空白组则不进行转染。将6组Hep-2细胞放入含有5％CO2的细胞培养箱中，37℃继续培养。
2.2Hep-2细胞转染率的测定
取实施例1中合成的FAM阴性对照寡核苷酸0.67μg，用DEPC水4.2μl溶解，加入20.8μl的RPMI1640培养液，制成终体积为25μl的RNA稀释液，室温静置5分钟；(2)将2μl的Entranstr-R与23μl的RPMI1640培养液混合，制成终体积为25μl的Entranstr-R稀释液，室温静置5分钟；将(1)、(2)制备的RNA稀释液与Entranstr-R稀释液等体积混合，制成50μl的FAM阴性对照寡核苷酸转染复合物，室温静置30分钟，FAM阴性对照寡核苷酸终物质的量的浓度为100nM。同时将转染100nM增敏剂组设为对照。放入37℃、5％CO2培养箱中避光培养6小时，待细胞状态稳定，避光状态下，用胰酶消化上述两组细胞并计数，取106个Hep-2细胞加入1.5ml离心管，同时加入1ml的PBS缓冲液，避光放置。随即使用流式细胞仪测定Hep-2细胞转染率，见图1、图2。
图1为转染无荧光标记的100nM放疗增敏剂的Hep-2细胞组，即对照组，图1中A的P1区域认为是无荧光标记的Hep-2细胞所在的区域，区域外为Hep-2细胞的细胞碎片；B中的P2区域为发出荧光的Hep-2细胞所在的区域，因对照组转染无荧光标记的100nM放疗增敏剂，故为空白，C为流式细胞仪检测结果分析。
图2为转染FAM阴性寡核苷酸的Hep-2细胞组，即实验组，图2中A的P1区域为由对照组所圈定的无荧光标记的Hep-2细胞所在的区域，即未转染入FAM阴性寡核苷酸的Hep-2细胞，B中的P2区域为发出荧光的Hep-2细胞所在的区域，即转染入FAM阴性寡核苷酸的Hep-2细胞，此区域所占的比例即代表转染试剂对增敏剂、无义miRNA和PBS的转染效率；C中根据流式细胞仪检测的结果可得，增敏剂、无义miRNA和PBS的转染效率为44.5％。
实施例3放疗后Hep-2细胞生物学特性分析
3.1转染后Hep-2细胞的放疗
将实施例2中6组Hep-2细胞(组1为转染50nM增敏剂组、组2为转染100nM增敏剂组、组3为转染150nM增敏剂组、组4为转染无义miNA组、组5为转染PBS组、组6为不转染空白组)立即进行放疗，条件为6MV-X线垂直照射，总剂量为400cGy，剂量率为200cGy/min，单次剂量为200cGy，照射野为20cm×20cm，照射时于培养板表面覆盖1.5cm组织等效填充物，源皮距(SSD)100cm。间隔48小时照射一次，共照射两次。
3.2放疗后Hep-2细胞增殖实验
将放疗后的6组Hep-2用胰酶消化并细胞计数，取5×103个Hep-2细胞/孔种植于96孔板中，每组细胞取4个复孔，同时加入100μl含有体积比为10％胎牛血清的RPMI1640培养基。于放疗结束后0小时、24小时、48小时、72小时的4个时间节点，分别于6组的4个复孔中加入10μl的CCK-8溶液，于37℃、5％CO2培养箱中孵育2小时。孵育结束后，使用酶标仪，在450nm处测定6组4个复孔的吸光度。若细胞增殖越多，则吸光值越大。放疗后0h、24h、48h、72h各组Hep-2细胞增殖情况及比较(见表1-表12、图3)。
表1放疗后0h各组Hep-2细胞增殖情况
表2放疗后24h各组Hep-2细胞增殖情况
表3放疗后48h各组Hep-2细胞增殖情况
表4放疗后72h各组Hep-2细胞增殖情况
表5放疗后0h各组增殖情况的方差分析表
表6放疗后0h各组增殖情况的比较
表7放疗后24h各组增殖情况的方差分析表
表8放疗后24h各组增殖情况的比较
表9放疗后48h各组增殖情况的方差分析表
表10放疗后48h各组增殖情况的比较
表11放疗后72h各组增殖情况的方差分析表
表12放疗后72h各组增殖情况的比较
结论：CCK-8实验结果显示，放疗前，将50nM、100nM、150nM增敏剂、无义miRNA、PBS转染至Hep-2细胞，不转染空白组则不进行转染。放疗后将6组Hep-2细胞增殖情况进行比较：
放疗后0h，转染100nM增敏剂组较转染50nM增敏剂组Hep-2细胞增殖数目明显降低(P<0.01)，而转染50nM增敏剂、100nM增敏剂、150nM增敏剂、无义miRNA、PBS较不转染空白组，Hep-2细胞增殖数目降低，其P值分别<0.05、0.001、0.01、0.01、0.01。
放疗后24h，转染50nM、100nM、无义miRNA较PBS，Hep-2细胞增殖数目明显降低，其P值分别<0.01、0.01、0.05。
放疗后48h，转染50nM、100nM、150nM、无义miRNA组较PBS组Hep-2细胞增值数目明显降低，其P值分别<0.05、0.01、0.01、0.05。不转染空白组较转染PBS组，其Hep-2细胞增殖数目也降低，其P值<0.05。
放疗后72h，各组Hep-2细胞增殖数目无明显差异，P值均>0.05。
根据上述不同时间节点各组Hep-2细胞增殖情况，可以推论出100nM增敏剂组较50nM增敏剂、150nM增敏剂组，抑制Hep-2细胞增殖，发挥作用最快，持续时间更长。尚不能推论出转染PBS组与不转染空白组抑制Hep-2细胞增殖的作用存在差异，不能推论出转染试剂对Hep-2细胞存在明显毒性。
3.3Hep-2细胞凋亡检测实验
将放疗后24h的6组喉癌细胞(组1为转染50nM增敏剂组、组2为转染100nM增敏剂组、组3为转染150nM增敏剂组、组4为转染无义miNA组、组5为转染PBS组、组6为不转染空白组)的细胞培养液吸出，加入1.5ml离心管内，PBS洗涤贴壁的Hep-2细胞一次，加入适量胰酶消化至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶消化液。将吹打下来的细胞加入有吸出细胞培养液的离心管内，4℃，1000g，离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS缓冲液1ml重悬并计数105个细胞，4℃，1000g离心5分钟，弃上清。
使用Annexin-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测6组细胞凋亡情况，加入195μl的Annexin V-FITC结合液至收集到各组的105个Hep-2细胞中，轻轻重悬细胞。加入5μlAnnexin V-FITC，轻轻混匀，室温避光孵育10分钟。孵育结束后，4℃，1000g，离心5分钟，弃上清。再加入190μl的Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入10μl的PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。随即进行流式细胞仪检测。放疗后24h各组细胞早、晚期凋亡率及总凋亡率的比较(表13、图4)。
表13放疗后24h各组Hep-2细胞早、晚期凋亡率及总凋亡率的比较
结论：流式细胞仪检测结果显示，放疗前，将Hep-2细胞转染入50nM、100nM、150nM增敏剂、PBS及无义miRNA，不转染空白组则进行不转染。放疗后24h，转染50nM、100nM、150nM增敏剂组Hep-2细胞较PBS组，凋亡率出现明显增加。
早期凋亡情况：转染50nM增敏剂组、转染100nM增敏剂组、转染无义miRNA组较转染PBS组，凋亡率具有显著差异，其P值分别<0.001、0.001、0.01。
晚期凋亡情况：转染100nM增敏剂组、转染150nM增敏剂组、转染无义miRNA组、不转染空白组较转染PBS组，凋亡率具有显著差异，其P值分别<0.001。
总凋亡情况：转染50nM增敏剂组、转染100nM增敏剂组、转染150nM增敏剂组、转染无义miRNA组、不转染空白组较转染PBS组，凋亡率具有显著差异，其P值分别<0.001、0.001、0.01、0.001、0.001。
结合各期凋亡率及总凋亡率，可推论出100nM增敏剂较50nM、150nM，促进Hep-2细胞凋亡的作用更强，对早期凋亡和晚期凋亡均发挥作用。尚不能推论出转染无义miRNA较转染PBS，促进Hep-2细胞凋亡的具有统计学差异。尚不能推论出转染试剂对Hep-2细胞具有明显毒性。
3.4喉癌细胞侵袭性实验
Transwell小室具有直径为8μm的微孔滤膜，体外培养的肿瘤细胞在趋化物质(如FBS)的作用下可以穿过微孔滤膜，计数穿膜细胞数作为反映喉癌细胞浸润转移能力。在放疗结束后，立即将6组喉癌细胞(组1为转染50nM增敏剂组、组2为转染100nM增敏剂组、组3为转染150nM增敏剂组、组4为转染无义miNA组、组5为转染PBS组、组6为不转染空白组)Hep-2细胞用胰酶消化后，用RPMI1640培养液重悬细胞并细胞计数105/孔接种于Transwell小室的上室，下室为含有体积比为10％胎牛血清的RPMI1640培养液600μl，使液面微微隆起以覆盖分隔上下小室的膜。置于含有5％CO2的细胞培养箱中，37℃继续孵育24h。孵育结束后，用PBS缓冲液清洗小室，用棉签拭去上室滤膜内侧面贴壁细胞，体积比为40％多聚甲醛固定上室滤膜背面10分钟，每孔加入600μl考马斯亮蓝，室温放置15分钟，染色结束后，用PBS缓冲液清洗后，将上室自然风干。置倒置显微镜下计数滤膜背面迁移的细胞数，以目镜10X、物镜40X，共计放大400X下计数每张滤膜中央部分及周围随机5个视野，计算平均值。放疗后24h各组Hep-2细胞迁移情况的比较(表14-表16，图5)。
表14放疗后24h各组Hep-2细胞迁移细胞数
表15放疗后24h各组迁移情况的方差分析表
表16放疗后24h各组迁移情况的比较
结论：400X显微镜下计数滤膜背面Hep-2细胞迁移数目结果显示，放疗前，将Hep-2细胞转染50nM、100nM、150nM放疗增敏剂、PBS及无义miRNA，不转染空白组则不进行转染。放疗后24h，转染50nM、100nM、150nM放疗增敏剂组Hep-2细胞迁移数目较转染无义miRNA、PBS、不转染空白组明显减少，具有显著性差异(P＜0.01)。
根据各组Hep-2细胞迁移数目的比较，可推论出50nM、100nM、150nM增敏剂较对照组，抑制Hep-2细胞迁移的作用更强，差异具有统计学意义，P值均<0.01。尚不能推论出无义miRNA较PBS、不转染空白组抑制Hep-2细胞的作用的差异具有统计学意义。
Claims (2)
1.一种放射治疗靶向增敏剂，其特征在于所述增敏剂由下列7种miRNAs构成：
(1)hsa-miR-138-2-3p模拟物：5’-GCUAUUUCACGACACCAGGGUU-3’、
(2)hsa-miR-208b-3p模拟物：5’-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU-3’、
(3)hsa-miR-197-3p抑制物：5’-GCUGGGUGGAGAAGGUGGUGAA-3’、
(4)hsa-miR-20b-3p抑制物：5’-CUGGAAGUGCCCAUACUACAGU-3’、
(5)hsa-let-7a-5p抑制物：5’-AACUAUACAACCUACUACCUCA-3’、
(6)hsa-miR-16-1-3p抑制物：5’-UCAGCAGCACAGUUAAUACUGG-3’
(7)hsa-miR-21-5p抑制物：5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’；
所述增敏剂由hsa-miR-138-2-3p模拟物、hsa-miR-208b-3p模拟物、hsa-miR-197-3p抑制物、hsa-miR-20b-3p抑制物、hsa-let-7a-5p抑制物、hsa-miR-16-1-3p抑制物和hsa-miR-21-5p抑制物以质量比1:1:1:1:1:1:1混合制成。
2.一种权利要求1所述放射治疗靶向增敏剂在制备喉癌增强放射治疗敏感性药物中的应用。
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