CN101912618A - 携带nk4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种携带NK4基因骨髓间充质干细胞的制备方法及其在治疗胃癌药物中的应用，它是从HGF质粒中调取了NK4基因后，采用In-Fusion技术，将其定向克隆至慢病毒表达载体质粒中，构建了NK4-EGFP融合基因重组慢病毒载体质粒(pGC-FU-NK4)后与pHelper1.0载体和pHelper2.0载体三质粒共转染293T细胞，包装生产NK4过表达慢病毒颗粒(Lenti-NK4)。将携带NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)转染骨髓间充质干细胞，建立了体外稳定表达NK4基因的骨髓间充质干细胞。Balb/C裸鼠动物实验证明BMSCs为载体的NK4基因治疗可明显抑制胃癌皮下移植瘤的生长，抑瘤率高，是一种良好的胃癌基因治疗方法。
Description
技术领域
本发明涉及医学发明领域，尤其是涉及一种携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法及其携带NK4基因的骨髓间充质干细胞在治疗胃癌药物中的应用。
背景技术
我国胃癌年患病率和死亡率为世界平均水平的2倍多，且多数患者确诊时已处于进展期。虽然早期胃癌的治疗效果较为乐观，但对进展期胃癌而言，大多有淋巴和血行转移，相当一部分患者确诊时已失去手术时机，化疗及综合治疗策略虽使其疗效有所改善，但整体疗效欠佳。因此，有必要探索新的治疗方法。
肿瘤基因治疗是目前肿瘤新技术的重要研究热点，基因治疗成功的关键之一在于有效基因载体的选择。目前常用的肿瘤基因治疗导入载体系统有病毒(腺病毒、逆转录病毒、慢病毒等)和非病毒(脂质体、裸露DNA等)两种。它们各有优点及不足之处，其共同的缺点之一就是缺乏靶向性，载体的非特异性分布使肿瘤组织内的药物浓度不高，难以达到满意疗效。因此，寻找高效具有靶向性的基因治疗载体系统是目前亟待解决的问题。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)，它是来源于中胚层的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。早期研究显示MSCs在机体内可主动募集至炎症或受损部位以修复受损组织，随着研究深入，MSCs在体内可趋向肿瘤病灶处，因此提出MSCs可作为载体携带治疗药物至肿瘤处。骨髓间充质干细胞(Bone-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)具有易获得、易培养、低免疫原性、能在宿主体内长期存活、易于外源基因转染和长期表达等优点。目前多数MSCs基因治疗的研究是以腺病毒为载体将目的基因导入，转染率较低。有报道指出这是因为MSCs表面低表达柯萨奇腺病毒受体，使腺病毒为载体时转染率最高仅20％左右。
NK4基因具有阻断HGF/c-met信号通路抑制HGF诱导的肿瘤细胞侵袭转移及抑制肿瘤血管生成的双重作用。有研究显示NK4基因治疗可明显抑制腹腔种植转移及皮下移植瘤生长，但上述实验均以腺病毒为载体，是瘤体、腹腔局部给药。而临床上进展期胃癌患者多已发生局部或远处转移，瘤体局部给药难度大；静脉系统给药病毒将直接暴露于血循环中，通常被大量粘附在血管内皮细胞和血细胞表面或直接被血液中的抗体中和，再者病毒侵入非肿瘤组织细胞造成病毒被大量损耗而难以到达肿瘤组织。因此，以病毒为载体的局部及静脉给药方式的NK4基因治疗可能难以达到预期效果。
目前尚未见以慢病毒介导NK4基因转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)靶向治疗胃癌的研究。
发明内容
本发明的第一个目的是建立构建NK4-增强型绿色荧光蛋白(enhancedGreen fluorescent protein，EGFP)融合基因重组慢病毒表达载体的方法，它是从肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)质粒中克隆NK4基因后，采用In-Fusion技术，将其定向克隆至慢病毒表达载体质粒中，构建了NK4-EGFP融合基因重组慢病毒载体质粒(pGC-FU-NK4)，确定正常表达后，将构建的重组的NK4-EGFP慢病毒表达质粒及pHelper1.0载体和pHelper2.0载体三质粒共转染293T细胞，包装生产NK4过表达慢病毒颗粒(Lenti-NK4)。它解决了以腺病毒为载体将NK4基因导入间充质干细胞转染率较低的问题。
本发明的第二个目的是建立能在体外持续稳定表达NK4基因的骨髓间充质干细胞，即携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法，它是通过慢病毒介导将NK4基因转染入骨髓间充质干细胞，并确定NK4表达正常。
本发明的第三个目的是携带NK4基因的骨髓间充质干细胞在治疗胃癌药物中的应用，它是将携带NK4的骨髓间充质干细胞通过尾静脉注射入裸鼠体内，治疗裸鼠胃癌皮下移植瘤，该方法利用了间充质干细胞对肿瘤的趋向性，因此使提高可NK4基因治疗的靶向性，治疗效果明显，抑瘤率高，实施方法简单，解决了目前NK4基因治疗靶向性差、仅能局部注射给药等缺点。
本发明的第一个目的是这样实现的：
1、目的基因的获取
1.1NK4基因片段a
以HGFcDNA为模板，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增NK4基因片段a(521bp)。
(1)引物名称及序列：
NK4-Age I-F：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGA CCA AACTCC
NK4-mut-R：CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG
(2)PCR反应体系：
| 上游引物NK4-Age I-F | 0.4ul |
| 下游引物NK4-mut-R | 0.4ul |
| 10×buffer | 2ul |
| MgCl2 | 0.5ul |
| DNTPs(2.5mM) | 0.8ul |
| pfu polymerase | 0.2ul |
| Template(10ng/μl) | 1ul |
| ddH2O | 补至20ul |
(3)循环条件：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min。
1.2NK4基因片段b
(1)引物名称及序列：以HGFcDNA为模板，PCR扩增NK4基因片段b(976bp)。
NK4-mut-F：CACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACC
NK4-Age I-R：TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC
(2)PCR反应体系：
| 上游引物NK4-mut-F | 0.4ul |
| 下游引物NK4-AgeI-R | 0.4ul |
| 10×buffer | 2ul |
| MgCl2 | 0.5ul |
| DNTPs(2.5mM) | 0.8ul |
| pfu polymerase | 0.2ul |
| Template(10ng/μl) | 1ul |
| ddH2O | 补至20ul |
(3)循环条件同前：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min。
1.3以a+b为模板PCR扩增NK4基因片段c
(1)引物名称及序列：
NK4-Age I-F：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACCAA ACTCC
NK4-Age I-R：TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC
(2)PCR反应体系：
| 上游引物NK4-AgeI-F | 0.4ul |
| 下游引物NK4-AgeI-R | 0.4ul |
| 10×buffer | 2u l |
| MgCl2 | 0.5ul |
| DNTPs(2.5mM) | 0.8ul |
| pfu polymerase | 0.2ul |
| Template(10ng/μl) | 1ul |
| ddH2O | 补至20ul |
(3)循环条件同前：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min。
2.PCR产物回收
取10μl PCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下将PCR产物的琼脂糖凝胶切下，以胶回收试剂盒回收获得人NK4 cDNA溶液。
3.pGC-FU慢病毒表达载体的酶切
限制性内切酶AgeI进行酶切，使其线性化。
酶切反应体系：
| 纯化的DNA质粒(1ug/μl) | 2μl |
| 10×buffer | 5μl |
| 100×BSA | 0.5μl |
| Age I(10U/μl) | 1μl |
| dd H20 | 补至50μl |
反应条件为37℃，1h；酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，并溶于50μl灭菌双蒸水中，准备用于构建重组质粒。
4.目的基因重组慢病毒质粒的构建
用In-Fusion酶将上述处理过的PCR产物与线性化载体进行交换反应重组质粒。反应条件为23℃，15min，再42℃，15min。
交换反应体系：
对照1 对照2 连接组
酶切回收的载体DNA(100ng/μl) 2μl - 2μl
回收的PCR产物(100ng/μl) - 2μl 2μl
10×In-Fusio交换酶缓冲液 2μl 2μl 1μl
In-Fusio交换酶酶 0.5μl 0.5μl 0.5μl
dd H2O 补至20μl 补至20μl 补至20μl
5.感受态细胞制备
采用CaCl2法制备E.coliDH5a感受态细胞。
(1)从37℃培养16h的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100mlLB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3h(旋转摇床，300转/min)；
(2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；
(3)于4℃，4000转/min离心10min，回收细胞；
(4)倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽；
(5)用10ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上；
(6)4℃，4000转/min离心10min，回收细胞；
(7)倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽；
(8)每50ml初始培养物用2ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀；
(9)将细胞分装成小份，放于-70℃冻存。
6.转化
(1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min；
(2)将管放到42℃的循环水浴中的试管架上，放置90s，勿摇动试管；
(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min；
(4)每管加800μlLB培养基，水浴加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min；
(5)将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和AMP抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上；
(6)将平板置于室温直至液体被吸收；
(7)倒置平皿，于37℃培养16h；
(8)长出的克隆进行后续PCR鉴定和测序。
7.阳性克隆的PCR鉴定及测序
(1)质粒DNA的提取：用碱裂解法，按质粒小量抽提试剂盒说明书操作；
(2)以获取的质粒DNA为模版，进行PCR扩增反应。
①引物名称及序列：
EGFP-N-R：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
NK4-mut-R：CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG
②反应体系：阴性对照：ddH2O及空载体自连对照组；阳性对照：GAPDH③循环条件为：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环；结束前72℃延伸6min。
(3)接种阳性转化子，37℃培养16小时后保存为甘油菌，分装200μl送测序，以确保所筛选克隆碱基序列完全正确。
8.质粒表达检测
pGC-FU-NK4转染293T细胞，转染24小时后荧光显微镜下观察荧光表达情况观察；
9.质粒大量抽提
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取pGC-FU-NK4表达载体、p-Helper1.0和p-Helper2.0的质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。
10.重组慢病毒包装
A、细胞转染：
(1)转染前24h，用0.25％胰酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％FBS的高糖DMEM细胞培养基调整细胞密度为1.2×107细胞/20ml，接种于15cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养。待细胞密度达70％～80％转染；
(2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基；
(3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-FU载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg)，与Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5min；
(4)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100μl Lipofectamine2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min；
(5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡；
(6)室温孵育20min，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物；
(7)将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
(8)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，以洗涤残余的转染混和物，弃去；
(9)每瓶细胞中加入含10％FBS的高糖DMEM细胞培养基25ml，于37℃，5％CO2培养箱内继续培养48h。
B、病毒的收集与浓缩
(1)收集转染后48h的293T细胞上清液；
(2)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
(3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；
(4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中，盖上盖子；将过滤杯插到滤过液收集管中；
(5)4000g离心10-15min，至需要的病毒浓缩体积；
(6)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开；
(7)将过滤杯倒扣在样品收集杯上；
(8)转速低于1000g，离心2min。把过滤杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液；
(9)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80℃保存；取其中一支进行病毒生物学滴度测定。所得病毒为携带NK4-EGFP融合基因的重组慢病毒。
本发明的第二个目的是这样实现的：
将携带NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)转染BMSCs，通过观察荧光及流式细胞仪检测转染率确定最佳感染复数(Multiplicity ofinfection，MOI)；采用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)及Western blot检测Lenti-NK4转染BMSCs后NK4表达。具体步骤如下：
1.Lenti-NK4转染BMSCs，确定最佳感染MOI
(1)用0.125％胰酶+0.02％EDTA消化对数生长期的BMSCs，以含10％FBS的L-DMEM培养基调整细胞密度为以8×103/cm2，种植于96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养箱内培养；
(2)24h后吸去培养液，磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS)洗涤细胞一次，按MOI值为0、1、10、20、50、100加入相应体积的重组慢病毒颗粒(Lenti-NK4)，同时补充5μg/ml的Polybrane及完全培养基至总量为500μl；
(3)置37℃、5％CO2培养箱内培养10h后，换为正常培养基继续培养，病毒感染24～120小时及传代后用激光共聚焦显微镜观察GFP表达；感染72h时分别收集各MOI值的BMSCs的培养上清液，离心后-80℃保存，ELISA法检测培养液中NK4含量。收集细胞Western blot检测NK4蛋白表达。
2.流式细胞仪检测转染率
(1)转染Lenti-NK4的BMSCs长满约85％时，0.125％胰酶+0.02％EDTA消化，显微镜下控制消化时间；
(2)弃去消化液，以10％FBS的L-DMEM培养基终止消化，轻轻吹打培养瓶；
(3)液体移至离心管，1000rpm，离心5min；
(4)弃去培养基，加入PBS重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1×106/ml；
(5)用同时培养的未转染Lenti-NK4的BMSCs设为阴性对照，上机检测转染率。
采用最佳MOI的Lenti-NK4转入骨髓间充质干细胞，从而获得了能在体外持续、稳定表达NK4基因的骨髓间充质干细胞。
本发明的第三个目的是这样实现的：
1.慢病毒转染BMSCs
(1)用0.125％胰酶+0.02％EDTA消化对数生长期的BMSCs，以含10％FBS的L-DMEM培养基调整细胞密度为以8×103/cm2，种植于细胞培养板中，37℃、5％CO2培养箱内培养；
(2)24h后吸去培养液，PBS洗涤细胞一次，按MOI为50加入相应体积的Lenti-NK4同时补充5μg/ml的Polybrane及完全培养基；同时设置转染Lenti-GFP(MOI 50)为阴性对照，未转染BMSCs做为空白对照；
(3)置37℃、5％CO2培养箱内培养10h后，换为正常培养基继续培养至细胞长满80％，收集细胞备用；
2.BMSCs-NK4治疗裸鼠胃癌皮下移植瘤
(1)取32只BALB/C(nu/nu)裸鼠，雌雄各半，6～8W，体重15～23g，用胃癌皮下移植瘤瘤组织块接种至裸鼠右侧腋窝中部外侧皮下；
(2)当皮下移植瘤长径约1.5cm时，随机分为4组，分别在分组后0、7、14、21天给药；具体分组如下：
治疗A组：尾静脉注射BMSCs-NK4，6×105个/只，0.2ml细胞悬液；
治疗B组：尾静脉注射Lenti-NK4，3×107TU/只，0.2ml病毒液；
对照C组：尾静脉注射BMSCs-GFP，6×105个/只，0.2ml细胞悬液；
对照D组：尾静脉注射PBS，0.2ml/只
(3)取对数期生长期的BMSCs-NK4、BMSCs-GFP经0.125％胰酶+0.02％EDTA消化，PBS重悬细胞沉淀，制备单细胞悬液；
每天观察精神状态、活动及饮食、饮水情况；3-4天称重一次，并用游标卡尺测量皮下移植瘤的长径(a)、与之相垂直的短径(b)及厚度(c)，瘤体体积(mm3)＝πabc/6计算皮下移植瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，计算抑瘤率，抑瘤率(％)＝(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100％。28天处死裸鼠，取出瘤体称重。
结果发现：
1、构建的NK4-EGFP融合基因的重组慢病毒表达载体转入293T细胞后可正常表达；重组慢病毒(Lenti-NK4)滴度为2×108TU/ml；
2、Lenti-NK4转染BMSCs后荧光表达随着时间延长及MOI值增加而增强、增多；携带NK4基因的BMSCs(BMSCs-NK4)NK4表达正常，NK4分泌量随着MOI值增加而增加，同时也随感染时间延长而增加，最佳MOI值为50；MOI为50时，Lenti-NK4转染BMSCs的转染率达87.8％，Lenti-GFP转染BMSCs的转染率为96.5％。提示携带NK4的慢病毒能安全、有效地转染BMSCs，转染后NK4基因可持续稳定表达。
3、以BMSCs为载体的NK4基因治疗对胃癌治疗效果：(1)BMSCs-NK4对皮下移植瘤治疗结果显示BMSCs-NK4治疗组瘤体体积均明显小于BMSCs-GFP及PBS组(P＜0.05)；BMSCs-NK4治疗组抑瘤率达52.2％(2)BMSCs-NK4组瘤重1.94±0.67g，明显低于BMSCs-GFP组及PBS组(P＜0.05)；(3)BMSCs-NK4组坏死评分3.63±0.47，明显低于两对照组(P＜0.05)。BMSCs为载体的NK4基因治疗使肿瘤组织坏死增加，抑制胃癌皮下移植瘤的生长。
从以上实验可得知：Balb/C裸鼠动物实验证明BMSCs为载体的NK4基因治疗可明显抑制胃癌皮下移植瘤的生长，抑瘤率高，实施方法简单，解决了目前NK4基因治疗靶向性差、仅能局部注射给药等缺点，是一种良好的胃癌基因治疗新方法。
具体实施方式
下面结合实施例作进一步详细说明本发明，但应理解本发明的范围并非仅限于这些实施例的范围。
一种制备NK4-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体的方法：
1、目的基因的获取
1.1NK4基因片段a
以HGFcDNA为模板，聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增NK4基因片段a(521bp)。
(1)引物名称及序列：
NK4-Age I-F：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACC AAACTCC
NK4-mu t-R：CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG
(2)PCR反应体系：
| 上游引物NK4-Age I-F | 0.4u l |
| 下游引物NK4-mut-R | 0.4ul |
| 10×buffer | 2ul |
| MgCl2 | 0.5ul |
| DNTPs(2.5mM) | 0.8ul |
| pfu polymerase | 0.2ul |
| Template(10ng/μl) | 1ul |
| ddH2O | 补至20ul |
(3)循环条件：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min。
1.2NK4基因片段b
(1)引物名称及序列：以HGFcDNA为模板，PCR扩增NK4基因片段b(976bp)。
NK4-mut-F：CACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACC
NK4-AgeI-R：TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTA TC
(2)PCR反应体系：
| 上游引物NK4-mut-F | 0.4ul |
| 下游引物NK4-AgeI-R | 0.4ul |
| 10×buffer | 2ul |
| MgCl2 | 0.5ul |
| DNTPs(2.5mM) | 0.8ul |
| pfu polymerase | 0.2ul |
| Template(10ng/μl) | 1u l |
| ddH2O | 补至20ul |
(3)循环条件同前：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min。
1.3以a+b为模板PCR扩增NK4基因片段c
(1)引物名称及序列：
NK4-AgeI-F：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACCAA ACTCC
NK4-AgeI-R：TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC
(2)PCR反应体系：
| 上游引物NK4-AgeI-F | 0.4ul |
| 下游引物NK4-AgeI-R | 0.4ul |
| 10×buffer | 2ul |
| MgCl2 | 0.5ul |
| DNTPs(2.5mM) | 0.8ul |
| pfu polymerase | 0.2ul |
| Template(10ng/μl) | 1ul |
| ddH2O | 补至20ul |
(3)循环条件同前：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min。
2.PCR产物回收
取10μl PCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下将PCR产物的琼脂糖凝胶切下，以胶回收试剂盒回收获得人NK4cDNA溶液。
3.pGC-FU慢病毒表达载体的酶切
限制性内切酶AgeI进行酶切，使其线性化。
酶切反应体系：
| 纯化的DNA质粒(1ug/μl) | 2μl |
| 10×buffer | 5μl |
| 100×BSA | 0.5μl |
| Age I(10U/μl) | 1μl |
| ddH2O | 补至50μl |
反应条件为37℃，1h；酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，并溶于50μl灭菌双蒸水中，准备用于构建重组质粒。
4.目的基因重组慢病毒质粒的构建
用In-Fusion酶将上述处理过的PCR产物与线性化载体进行交换反应重组质粒。反应条件为23℃，15min，再42℃，15min。
交换反应体系：
对照1 对照2 连接组
酶切回收的载体DNA(100ng/μl) 2μl - 2μl
回收的PCR产物(100ng/μl) - 2μl 2μl
10×In-Fusio交换酶缓冲液 2μl 2μl 1μl
In-Fusio交换酶酶 0.5μl 0.5μl 0.5μl
ddH2O 补至20μl 补至20μl 补至20μl
5.感受态细胞制备
采用CaCl2法制备E.coliDH5a感受态细胞。
(1)从37℃培养16h的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100mlLB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3h(旋转摇床，300转/min)；
(2)在无菌条件下将细菌转移到一个无菌用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；
(3)于4℃，4000转/min离心10min，回收细胞；
(4)倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽；
(5)用10ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上；
(6)4℃，4000转/min离心10min，回收细胞；
(7)倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽；
(8)每50ml初始培养物用2ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀；
(9)将细胞分装成小份，放于-70℃冻存。
6.转化
(1)用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min；
(2)将管放到42℃的循环水浴中的试管架上，放置90s，勿摇动试管；
(3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min；
(4)每管加800μlLB培养基，水浴加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min；
(5)将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和AMP抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上；
(6)将平板置于室温直至液体被吸收；
(7)倒置平皿，于37℃培养16h；
(8)长出的克隆进行后续PCR鉴定和测序。
7.阳性克隆的PCR鉴定及测序
(1)质粒DNA的提取：用碱裂解法，按质粒小量抽提试剂盒说明书操作；
(2)以获取的质粒DNA为模版，进行PCR扩增反应。
①引物名称及序列：
EGFP-N-R：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
NK4-mut-R：CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG
②反应体系：阴性对照：ddH2O及空载体自连对照组；阳性对照：GAPDH③循环条件为：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环；结束前72℃延伸6min。
(3)接种阳性转化子，37℃培养16小时后保存为甘油菌，分装200μl送测序，以确保所筛选克隆碱基序列完全正确。
8.质粒表达检测
pGC-FU-NK4转染293T细胞，转染24小时后荧光显微镜下观察荧光表达情况观察；
9.质粒大量抽提
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取pGC-FU-NK4表达载体、p-Helper1.0和p-Helper2.0的质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。
10.重组慢病毒包装
A、细胞转染：
(1)转染前24h，用0.25％胰酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％FBS的高糖DMEM细胞培养基调整细胞密度为1.2×107细胞/20ml，接种于15cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养。待细胞密度达70％～80％转染；
(2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基；
(3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-FU载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg)，与Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5min；
(4)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100μl Lipofectamine2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min；
(5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡；
(6)室温孵育20min，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物；
(7)将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
(8)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，以洗涤残余的转染混和物，弃去；
(9)每瓶细胞中加入含10％FBS的H-DMEM细胞培养基25ml，于37℃，5％CO2培养箱内继续培养48h。
B、病毒的收集与浓缩
(1)收集转染后48h的293T细胞上清液；
(2)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
(3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；
(4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中，盖上盖子；将过滤杯插到滤过液收集管中；
(5)4000g离心10-15min，至需要的病毒浓缩体积；
(6)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开；
(7)将过滤杯倒扣在样品收集杯上；
(8)转速低于1000g，离心2min。把过滤杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液；
(9)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80℃保存；取其中一支进行病毒生物学滴度测定。所得病毒为携带NK4-EGFP融合基因的重组慢病毒。
一种携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法：
将携带NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)转染BMSCs，通过观察荧光及流式细胞仪检测转染率确定最佳感染复数(Multiplicity ofinfection，MOI)；采用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)及Western blot检测Lenti-NK4转染BMSCs后NK4表达。具体步骤如下：
1.Lenti-NK4转染BMSCs，确定最佳感染MOI
(1)用0.125％胰酶+0.02％EDTA消化对数生长期的BMSCs，以含10％FBS的L-DMEM培养基调整细胞密度为以8×103/cm2，种植于96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养箱内培养；
(2)24h后吸去培养液，PBS洗涤细胞一次，按MOI值为0、1、10、20、50、100加入相应体积的重组慢病毒颗粒(Lenti-NK4)，同时补充5μg/ml的Polybrane及完全培养基至总量为500μl；
(3)置37℃、5％CO2培养箱内培养10h后，换为正常培养基继续培养，病毒感染24～120小时及传代后用激光共聚焦显微镜观察GFP表达；感染72h时分别收集各MOI值的BMSCs的培养上清液，离心后-80℃保存，ELISA法检测培养液中NK4含量。收集细胞Western blot检测NK4蛋白表达。
2.流式细胞仪检测转染率
(1)转染Lenti-NK4的BMSCs长满约85％时，0.125％胰酶+0.02％EDTA消化，显微镜下控制消化时间；
(2)弃去消化液，以10％FBS的L-DMEM培养基终止消化，轻轻吹打培养瓶；
(3)液体移至离心管，1000rpm，离心5min；
(4)弃去培养基，加入PBS重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1×106/ml；
(5)用同时培养的未转染Lenti-NK4的BMSCs设为阴性对照，上机检测转染率。
采用最佳MOI的Lenti-NK4转入骨髓间充质干细胞，从而获得了能在体外持续、稳定表达NK4基因的骨髓间充质干细胞。
实施例1：
用本技术领域公知的方法，以携带NK4基因的骨髓间充质干细胞为原料制成氯化钠注射溶液，用于靶向治疗胃癌。
实施例2：
用本技术领域公知的方法，以携带NK4基因的骨髓间充质干细胞为原料制成磷酸盐缓冲液，用于靶向治疗胃癌。
Claims (3)
1.携带NK4基因的骨髓间充质干细胞在治疗胃癌药物中的应用。
2.一种建立构建NK4-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体的方法，其特征在于：
2.1目的基因的获取
A NK4基因片段a
以HGFcDNA为模板，聚合酶链反应扩增NK4基因片段a：521bp；
a引物名称及序列：
NK4-Age I-F：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGACCA AACTCC
NK4-mut-R：CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG
b PCR反应体系：
c循环条件：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min；
B NK4基因片段b
a引物名称及序列：以HGFcDNA为模板，PCR扩增NK4基因片段b：976bp；
NK4-mut-F：CACAGCTTTTTGCCTTCGAGCTATCGGGGTAAAGACC
NK4-Age I-R：TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGT ATC
b PCR反应体系：
c循环条件同前：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min；
C以a+b为模板PCR扩增NK4基因片段c
a引物名称及序列：
NK4-AgeI-F：GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTGGGTGAC CAAACTCC
NK4-AgeI-R：TCACCATGGTGGCGACCGGGACTATTGTAGGTGTGGTATC
b PCR反应体系：
c循环条件同前：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸60s，共30个循环，72℃延伸10min；
2.2PCR产物回收
取10μl PCR扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下将PCR产物的琼脂糖凝胶切下，以胶回收试剂盒回收获得人NK4cDNA溶液；
2.3pGC-FU慢病毒表达载体的酶切
限制性内切酶AgeI进行酶切，使其线性化；
酶切反应体系：
反应条件为37℃，1h；酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，并溶于50μl灭菌双蒸水中，准备用于构建重组质粒；
2.4目的基因重组慢病毒质粒的构建
用In-Fusion酶将上述处理过的PCR产物与线性化载体进行交换反应重组质粒，反应条件为23℃，15min，再42℃，15min；
交换反应体系：
对照1 对照2 连接组
酶切回收的载体DNA(100ng/μl) 2μl - 2μl
回收的PCR产物(100ng/μl) - 2μl 2μl
10×In-Fusio交换酶缓冲液 2μl 2μl 1μl
In-Fusio交换酶酶 0.5μl 0.5μl 0.5μl
ddH2O 补至20μl 补至20μl 补至20μl
2.5感受态细胞制备
采用CaCl2法制备E.coliDH5a感受态细胞：
A从37℃培养16h的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100mlLB培养基的1L烧瓶中，于37℃剧烈振摇培养3h，旋转摇床，300转/min；
B在无菌条件下将细菌转移到一个无菌用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃；
C于4℃，4000转/min离心10min，回收细胞；
D倒出培养液，将管倒置1分钟，使最后残留的痕量培养液流尽；
E用10ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上；
F 4℃，4000转/min离心10min，回收细胞；
G倒出培养液，将管倒置1min，使最后残留的痕量培养液流尽；
H每50ml初始培养物用2ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份细胞沉淀；
I将细胞分装成小份，放于-70℃冻存；
2.6转化
A用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min；
B将管放到42℃的循环水浴中的试管架上，放置90s，勿摇动试管；
C快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min；
D每管加800μlLB培养基，水浴加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min；
E将150μl已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和AMP抗性：100ug/ml的LB琼脂培养基上；
F将平板置于室温直至液体被吸收；
G倒置平皿，于37℃培养16h；
H长出的克隆进行后续PCR鉴定和测序；
2.7阳性克隆的PCR鉴定及测序
A质粒DNA的提取：用碱裂解法，按质粒小量抽提试剂盒说明书操作；
B以获取的质粒DNA为模版，进行PCR扩增反应；
a引物名称及序列：
EGFP-N-R：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
NK4-mu t-R：CGAAGGCAAAAAGCTGTGTTCGTGTGGTATCATGG
b反应体系：阴性对照：ddH2O及空载体自连对照组；阳性对照：GAPDH
c循环条件为：反应先94℃预变性30s，加入聚合酶；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环；结束前72℃延伸6min；
C接种阳性转化子，37℃培养16小时后保存为甘油菌，分装200μl送测序，以确保所筛选克隆碱基序列完全正确；
2.8质粒表达检测
pGC-FU-NK4转染293T细胞，转染24小时后荧光显微镜下观察荧光表达情况观察；
2.9质粒大量抽提
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取pGC-FU-NK4表达载体、p-Helper1.0和p-Helper2.0的质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间；
2.10重组慢病毒包装
A、细胞转染：
a转染前24h，用0.25％胰酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％FBS的高糖DMEM细胞培养基调整细胞密度为1.2×107细胞/20ml，接种于15cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养，待细胞密度达70％～80％转染；
b转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基；
c向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液：pGC-FU载体20μg，pHelper1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg，与Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5ml，在室温下温育5min；
d将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100μl Lipofectamine2000试剂在另一管中与2.4ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min；
e把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡；
f室温孵育20min，以便形成DNA与Lipofectamine2000稀释液的转染复合物；
g将DNA与Lipofectamine2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
h培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20ml的PBS液，以洗涤残余的转染混和物，弃去；
i每瓶细胞中加入含10％FBS的H-DMEM细胞培养基25ml，于37℃，5％CO2培养箱内继续培养48h；
B、病毒的收集与浓缩
a收集转染后48h的293T细胞上清液；
b4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；
c以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；
d把病毒粗提液样品加入到过滤杯中，盖上盖子；将过滤杯插到滤过液收集管中；
e4000g离心10-15min，至需要的病毒浓缩体积；
f离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开；
g将过滤杯倒扣在样品收集杯上；
h转速低于1000g，离心2min，把过滤杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液；
i将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80℃保存；取其中一支进行病毒生物学滴度测定，所得病毒为携带NK4-EGFP融合基因的重组慢病毒。
3.一种携带NK4基因的骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于：
将携带NK4-EGFP融合基因的慢病毒(Lenti-NK4)转染BMSCs，通过观察荧光及流式细胞仪检测转染率确定最佳感染复数；采用酶联免疫吸附试验及Western blot检测Lenti-NK4转染BMSCs后NK4表达，具体步骤如下：
3.1Lenti-NK4转染BMSCs，确定最佳感染MOI
A用0.125％胰酶+0.02％EDTA消化对数生长期的BMSCs，以含10％FBS的L-DMEM培养基调整细胞密度为以8×103/cm2，种植于96孔细胞培养板中，37℃、5％CO2培养箱内培养；
B 24h后吸去培养液，PBS洗涤细胞一次，按MOI值为0、1、10、20、50、100加入相应体积的重组慢病毒颗粒(Lenti-NK4)，同时补充5μg/ml的Polybrane及完全培养基至总量为500μl；
C置37℃、5％CO2培养箱内培养10h后，换为正常培养基继续培养，病毒感染24～120小时及传代后用激光共聚焦显微镜观察GFP表达；感染72h时分别收集各MOI值的BMSCs的培养上清液，离心后-80℃保存，ELISA法检测培养液中NK4含量；收集细胞Western blot检测NK4蛋白表达；
3.2流式细胞仪检测转染率
A转染Lenti-NK4的BMSCs长满约85％时，0.125％胰酶+0.02％EDTA消化，显微镜下控制消化时间；
B弃去消化液，以10％FBS的L-DMEM培养基终止消化，轻轻吹打培养瓶；
C液体移至离心管，1000rpm，离心5min；
D弃去培养基，加入PBS重悬细胞沉淀，调整细胞密度为1×106/ml；
E用同时培养的未转染Lenti-NK4的BMSCs设为阴性对照，上机检测转染率；
采用最佳MOI的Lenti-NK4转入骨髓间充质干细胞，从而获得了能在体外持续、稳定表达NK4基因的骨髓间充质干细胞。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20101215 |