CN110522767A

CN110522767A - 一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂

Info

Publication number: CN110522767A
Application number: CN201810609783.1A
Authority: CN
Inventors: 沈君; 毛家骥; 曹明慧
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-06-13
Filing date: 2018-06-13
Publication date: 2019-12-03

Abstract

本发明属于基因工程与生物医学工程技术领域，具体公开了一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂，包括一种能同时分泌IFNβ与MR成像的骨髓间充质干细胞。所述骨髓间充质干细胞由IFNβ和FerritinH基因联合修饰，能通过分泌免疫调节因子IFNβ调节肿瘤免疫微环境，对胶质瘤生长发挥抑制作用；同时可通过FerritinH报告基因MR成像，在活体水平实现对移植后干细胞实时、动态、无创、系统地监测，为促进干细胞治疗临床转化提供实验依据，为深入阐明干细胞作用机制提供新的手段，在胶质瘤的干细胞治疗及转基因治疗方面均具有重要的科学意义和临床应用前景。

Description

一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂

技术领域

本发明涉及基因工程与生物医学工程技术领域，具体地，涉及一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂。

背景技术

胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，是严重危害人类健康的重大难治性疾病。我国胶质瘤的发病率、致残率及致死率均较高，给个人、家庭及社会带来沉重负担。尽管近年来胶质瘤的精准手术治疗及放、化疗技术取得了一定进展，但恶性胶质瘤的预后仍非常不理想，5年生存率不足10％，中位生存时间仅为12～15个月。免疫治疗通过调动机体自身免疫系统来抑制或杀伤肿瘤细胞，是目前肿瘤治疗领域的研究热点，也是最有前景的肿瘤治疗方法。干扰素β(Interferon-β,IFNβ)是连接机体固有免疫和适应性免疫的桥梁，能够启动自发性抗肿瘤T细胞应答，诱导抗肿瘤免疫，有望在胶质瘤治疗中发挥重要作用。然而，IFNβ半衰期短，在血液中很容易被分解，若通过全身给药需要高剂量才能在局部产生治疗效果，对人体毒性很大，很大程度上制约了IFNβ的临床应用。此外，常规的给药途径很难将IFNβ有效地递送入肿瘤内部，限制了其治疗效果。

干细胞治疗作为一种新治疗模式，不仅在再生医学领域具有重要应用，在恶性肿瘤的治疗中也展现出极大应用前景。相对于其他干细胞，间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)来源丰富、取材方便，可在体外培养后进行自体移植，也可通过商业途径购买，不存在伦理学问题；同时具备低免疫原性、易于进行基因修饰等多种优势。更为重要的是，MSCs具备向胶质瘤趋化的特性，能主动通过血脑屏障到达胶质瘤实体。因此，MSCs被认为是胶质瘤靶向治疗药物的理想载体。

然而，以往干细胞治疗胶质瘤的研究多采用组织病理学手段评估治疗效果及移植后干细胞的命运，缺乏活体、动态的可视化评价，因此在干细胞能否发挥治疗效果及移植后干细胞命运上存在很多争议。采用分子影像学手段在活体水平对移植干细胞的迁移、归巢、存活、分布等生物学过程进行实时、无创、纵向、连续、定性、定量、系统的观察，有助于准确评估干细胞治疗的有效性与安全性，指导制定及筛选最佳治疗模式，阐明干细胞与肿瘤的相互作用及潜在机制，是干细胞治疗临床转化的关键。在诸多分子影像学手段中，磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)具备无创、无电离辐射、能够多方位及多参数成像、软组织分辨率高等优点，能够在清晰地显示组织器官解剖结构及功能信息的同时，对干细胞在深部组织的分布进行精准的评估，是目前干细胞活体示踪中最安全有效、运用最广泛的手段。以往研究多采用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO)纳米颗粒直接标记MSCs进行MRI活体示踪。然而，SPIO等直接标记示踪法示踪时间短，或被巨噬细胞吞噬后产生“假阳性”信号，无法真实反映移植细胞的存活情况。间接标记法通过MR报告基因的持续表达产生特异性信号而达到示踪目的，可以弥补外源性对比剂直接标记法的不足。铁蛋白重链(FerritinH,FTH)基因通过增加细胞内铁的储存，形成更多的氧化铁颗粒，缩短细胞局部横向弛豫时间，从而在MRI的T2WI和T2*WI序列上产生对比信号，是目前应用最为成熟的MR报告基因。

目前尚未见有将IFNβ基因和铁蛋白重链(FerritinH)基因同时整入间充质干细胞基因组内，用于治疗颅内胶质瘤的相关报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂，包括一种能同时分泌IFNβ与MR成像的骨髓间充质干细胞。所述骨髓间充质干细胞在体内移植后，在通过FerritinH报告基因被MRI活体示踪实现干细胞实时定位的同时，还能通过分泌IFNβ调节肿瘤免疫微环境，对胶质瘤生长发挥抑制作用，在临床上具有广阔的应用前景。

本发明的另一目的在于提供一种用于治疗胶质瘤的试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂，包括一种能同时分泌IFNβ与MR成像的骨髓间充质干细胞。

优选地，所述的骨髓间充质干细胞由FerritinH和IFNβ基因联合修饰，能同时表达分泌蛋白IFNβ和胞质蛋白FerritinH。

优选地，所述的胶质瘤为颅内原位胶质瘤。

更优选地，所述的胶质瘤为C6胶质瘤细胞。

本发明通过对MSCs进行IFNβ与FerritinH联合基因修饰，促进其分泌IFNβ，利用MSCs主动趋向胶质瘤的特性，实现胶质瘤内IFNβ精准输送，调节肿瘤免疫微环境；同时通过FerritinH报告基因成像监测MSCs移植后的生物学行为及肿瘤治疗效果。

所述骨髓间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：

S1.构建FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体；

S2.采用S1所得FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞。

本发明人综合考虑了基因表达载体，尤其是病毒载体可容纳的外源性基因片段长度有限，对载体的设计策略进行优化，根据目的基因的种类、数目、靶细胞的类型，以及目的蛋白功能选择了自剪切多肽2A(self-cleaving 2A peptide)中的T2A元件连接两个目的基因。T2A元件可以将多个目的基因连接成一条开放阅读框，再通过高效的“剪切”作用，将翻译后初级产物瞬时断裂为多个独立的蛋白，从而使各个目的基因均能有长期、稳定、高效地表达。T2A元件具有结构短小，表达效率高(85％～100％)，上、下游基因等比例表达，以及多个2A结构间不存在干扰等多种优势。

优选地，S1所述构建FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体的具体步骤为：获取大鼠FerritinH与IFNβ序列，设计特异性引物对，PCR扩增FerritinH-T2A-IFNβ；将PCR产物连接入GV367转移载体，构建重组质粒，采用阳性克隆基因测序及目的基因表达检测验证；用重组质粒、包装质粒及包膜质粒共转染293T细胞，制备慢病毒颗粒，即得FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体。

经阳性克隆基因测序及目的基因表达检测验证，结果表明慢病毒载体构建成功；制备慢病毒颗粒后测定病毒滴度，结果表明病毒滴度为2×10⁸TU/mL。

优选地，S2所述转染的具体步骤为：采用感染复数为10，转染时间为10h转染骨髓间充质干细胞，经2μg/mL嘌呤霉素筛选7d后再采用含1μg/mL嘌呤霉素的完全培养基连续培养，即得稳定表达抗性基因的FerritinH-T2A-IFNβ-MSCs。

结合实施例相关实验，结果表明，FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体能成功地对MSCs进行基因修饰获得基因工程化干细胞FerritinH-IFNβ-MSCs，基因工程化MSCs既能分泌免疫调节因子IFNβ，又能通过FerritinH报告基因被临床MR设备活体示踪，同时保持了MSCs的干性、活性及分化能力。活体移植的FerritinH-IFNβ-MSCs能够通过分泌IFNβ有效治疗Wistar大鼠颅内原位C6胶质瘤。

本发明还请求保护一种用于治疗胶质瘤的试剂盒，包括上述骨髓间充质干细胞，包含有FerritinH-T2A-IFNβ基因的重组质粒，FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体。

优选地，所述FerritinH-T2A-IFNβ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，所述的FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体为慢病毒载体GV367。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明所提供的一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂，包括一种能同时分泌IFNβ与MR成像的骨髓间充质干细胞。本发明通过对MSCs进行IFNβ与FerritinH联合基因修饰，促进其分泌IFNβ，利用MSCs主动趋向胶质瘤的特性，实现胶质瘤内IFNβ精准输送，调节肿瘤免疫微环境，对胶质瘤生长发挥抑制作用；同时通过FerritinH报告基因成像监测MSCs移植后的生物学行为及肿瘤治疗效果，在临床治疗胶质瘤上具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为慢病毒载体GV367及辅助质粒示意图；其中，a为GV367转移载体图谱；b为pHelper1.0载体图谱；c为pHelper2.0载体图谱。

图2为实施例1中FerritinH-T2A-IFNβ目的质粒的荧光显微镜照片；其中，a为白光；b为荧光显微镜(100×)。

图3为实施例2中FerritinH-T2A-IFNβ慢病毒转染MSCs的荧光表达情况；其中，a、b为MSCs经FerritinH-IFNβ-MSCs慢病毒转染后，分别用相差显微镜(a)和倒置荧光显微镜(b)观察的结果，细胞表达绿色荧光(标尺＝100μm)；c为在转染后第3d，流式细胞仪检测细胞荧光表达率达56.58±0.40％(绿色波峰)，经嘌呤霉素抗性基因筛选，在转染后第10d，荧光表达率达73.59±0.28％(红色波峰)。

图4为实施例2中FerritinH-IRES-IFNβ慢病毒转染MSCs经嘌呤霉素抗性基因筛选后的荧光表达率。

图5为实施例2中FerritinH-T2A-IFNβ慢病毒转染MSCs的目的基因表达情况；其中，a为Real-time PCR结果；b为Western blots结果；c为ELISA检测结果。

图6为实施例3中FerritinH-T2A-IFNβ慢病毒转染MSCs的铁摄取情况；其中，a为普鲁士蓝染色结果(标尺＝100μm)；b为透射电镜扫描结果。

图7为实施例3中FerritinH-IFNβ-MSCs的MRI及原子吸收光谱检测结果；其中，a～b为WT-MSCs组、eGFP-MSCs组、FerritinH-IFNβ-MSCs组及WT-MSCs+Fc组、eGFP-MSCs+Fc组、FerritinH-IFNβ-MSCs+Fc组在MRI T2WI、T1WI、T2*WI及T2-mapping序列上的信号对比；c为细胞内铁含量(*:P<0.05)。

图8为实施例4中FerritinH-T2A-IFNβ慢病毒转染MSCs的增殖、凋亡及ROS水平检测；其中，a为FerritinH-IFNβ-MSCs、eGFP-MSCs、WT-MSCs三组细胞增殖活力；b为FerritinH-IFNβ-MSCs、eGFP-MSCs、WT-MSCs三组细胞凋亡率；c为FerritinH-IFNβ-MSCs、eGFP-MSCs、WT-MSCs三组细胞ROS水平；d为在细胞外铁增加的环境中，WT-MSCs、WT-MSCs+FC、eGFP-MSCs、eGFP-MSCs+FC、FerritinH-IFNβ-MSCs、FerritinH-IFNβ-MSCs+FC六组细胞ROS水平(*:P<0.05)。

图9为实施例4中FerritinH-IFNβ-MSCs的表面标记物检测结果。

图10为实施例4中FerritinH-IFNβ-MSCs的多向分化能力验证结果。

图11为实施例5中Transwell实验验证FerritinH-IFNβ-MSCs的趋瘤迁移能力结果。

图12为实施例5中FerritinH-IFNβ-MSCs治疗大鼠颅内胶质瘤的MRI成像。

图13为实施例5中移植干细胞对胶质瘤生长速率的影响。

图14为实施例6中FerritinH-IFNβ-MSCs与eGFP-MSCs移植后在胶质瘤内存活情况；其中，a为FerritinH免疫组化和普鲁士蓝共染色结果(标尺＝100μm)；b为eGFP免疫荧光染色结果(标尺＝25μm)。

图15为实施例6中FerritinH-IFNβ-MSCs移植后IFNβ的ELISA检测结果(*:P<0.05)。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

一、材料

1、慢病毒包装细胞株、菌株及病毒载体

(2)细胞株

采用293T作为慢病毒的包装细胞。293T为贴壁依赖型成上皮样细胞，采用含10％FBS的DMEM作为生长培养基。

(2)菌株

大肠杆菌菌株DH5α，用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。

(3)病毒载体

慢病毒包装系统，包括三个质粒：①携带目的基因的工具载体质粒：GV367，元件顺序：Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin，克隆位点：AgeI/NheI；②病毒包装辅助质粒(Helper 1.0)；③病毒包膜辅助质粒(Helper 2.0)，均由上海吉凯公司提供，载体图谱见图1

2、Wistar大鼠骨髓间充质干细胞

Wistar大鼠MSCs购自赛业生物科技有限公司。细胞取自Wistar大鼠的骨髓，具有成脂、成骨分化能力。流式检测鉴定细胞表达CD90(90.24％)、CD44(99.52％)、CD29(99.89％)，CD11b(0.32％)、CD45(0.05％)、CD34(0.38％)，符合当前国际公认的MSCs的定义。

二、统计学分析

计量资料采用均数±标准差表示。采用两独立样本的t检验或方差分析对比不同组间的FerritinH及IFNβ的mRNA及蛋白水平、T2值、铁含量、增殖活力、凋亡率、ROS水平、跨膜细胞数、脑组织IFNβ分泌量的差异，采用Bonferroni检验比较组间差异。采用重复测量的方差分析对比不同组的肿瘤生长速率。统计学分析使用SPSS 22.0软件，P<0.05认为差异有统计学意义。

实施例1 FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体的构建及鉴定

1、目的基因获取

根据GenBank中大鼠FerritinH(NM_012848)基因与IFNβ(NM_019127)基因序列，采用全基因化学合成法合成FerritinH-T2A-IFNβ序列。设计特异性引物如下：

FerritinH-T2A-IFNβ上游引物(SEQ ID NO:2)：fusion gene(21000-2)-P1

5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGACCACCGCGTCTCCCTCGCAAG-3’

FerritinH-T2A-IFNβ下游引物(SEQ ID NO:3)：fusion gene(21000-2)-P2

5’-CACACATTCCACAGGCTAGTCAGTTCTGGAAGTTTCTATTAAG-3’.

引物用于PCR扩增FerritinH-T2A-IFNβ序列。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳后，切下分子量约1210bp的目的条带备后用。

2、重组质粒构建及测序

回收PCR产物交换连接入酶切慢病毒表达载体(GV367载体，AgeI/NheI酶切，元件顺序Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin)，连接后转化新鲜的大肠杆菌感受态细胞，对生长出的阳性克隆行PCR鉴定，琼脂糖凝胶电泳中显示目的条带位于1～1.5kb之间，而目的基因FerritinH-T2A-IFNβ阳性转化子PCR产物大小1127bp，符合目的基因酶切产物的大小。随后，提取连接产物质粒FerritinH-T2A-IFNβ-LV，使用ABI 3730xl自动测序仪进行测序，Chromas测序结果读取软件进行读取分析。

所述重组质粒DNA的Chromas测序结果：重组质粒中插入的目的基因FerritinH-T2A-IFNβ的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。与Genbank中FerritinH(NM_012848)与IFNβ(NM_019127)基因序列比较，与目标序列基本一致(GAA同义突变为GAG，CAG同义突变为CAA)，提示序列已正确插入质粒中，FerritinH-T2A-IFNβ慢病毒载体构建成功。此外，还采用类似的方法构建FerritinH-IRES-IFNβ慢病毒载体，并采用Chromas测序验证其构建成功。

3、FerritinH-T2A-IFNβ重组质粒表达检测

将处于对数生长期的293T细胞胰酶消化制成细胞悬液，5×10⁴个293T细胞接种于24孔培养板。在细胞恒温培养箱内培养至细胞汇合率约70％～80％时，根据InvitrogenLipofectamine 3000转染试剂使用说明书，采用质粒DNA和Lipofectamine 3000共转染293T细胞，培养6h后，更换成新鲜的完全培养基(含10％血清)。转染24h后荧光显微镜观察质粒eGFP表达情况以判断感染效率，随后再加0.5mL完全培养基，转染36h后收集细胞，采用Real time PCR检测目的基因表达。

结果表明：目的质粒FerritinH-T2A-IFNβ转染293T细胞24h后，荧光显微镜下293T细胞内可观察到明显的荧光(如图2所示)，说明目的质粒转染正常、目的质粒荧光标记基因表达正常。经Real time PCR检测，目的质粒转染后293T细胞中的FerritinH表达丰度是对照组的807796.697倍，IFNβ表达丰度是对照组的952247.332倍，差异均有显著统计学意义(P<0.05)。

4、慢病毒包装、收获、浓缩及滴度测定

将293T细胞接种于10cm²细胞培养皿，于细胞恒温培养箱内培养。待细胞密度达70％～80％时采用pLV-FerritinH-T2A-IFNβ-eGFP载体质粒、包装质粒pHelper 1.0载体、包膜质粒pHelper 2.0载体与Lipofectamine 3000对293T细胞进行共转染。培养6h更换为完全培养基(含10％血清)。继续培养48h～72h，收集富含慢病毒颗粒的293T细胞上清液，对其过滤、离心、浓缩后获得高滴度病毒浓缩液，分装于50μL病毒管中，-80℃保存。使用ELISA法、荧光法及药筛法测定病毒滴度。结果表明，病毒滴度为2×10⁸TU/mL。

此外，采用同样的方法对FerritinH-IRES-IFNβ慢病毒载体进行包装、收获、浓缩，并进行病毒滴度测定，结果FerritinH-IRES-IFNβ病毒的滴度较低，为5×10⁷TU/mL，是FerritinH-T2A-IFNβ病毒的1/4。

实施例2 FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒转染MSCs及转染效率测定

1、Wistar大鼠MSCs的培养及传代

Wistar大鼠MSCs复苏后，采用DMEM/F12完全培养基(含10％FBS+1％青霉素-链霉素混合液+1％L-谷氨酰胺)置于细胞恒温培养箱内培养，每2～3d换液。待细胞融合度达70％左右按1:3比例进行消化传代培养。

2、FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒转染MSCs

取处于对数生长期的5代以内MSCs，以1×10⁵个细胞/孔种于12孔培养板中，每孔加入1mL完全培养基。当细胞融合度约50％时移除培养基，再用PBS洗涤后转染。为了确定最佳MOI及转染时间，MOI(MOI＝病毒液体积×病毒滴度/转染细胞数)设置为1、10、50，每孔相应加入1μL、10μL、50μL病毒液，以及0.5uL polybrene，再加入新鲜的完全培养基使每孔最终液体量为1mL。置于恒温细胞培养箱内培养，转染时间设置为8h、12h、16h，达到预定时间后，观察细胞状态，更换新鲜的完全培养基继续培养。待12孔板内细胞融合度达70％以上(约为转染后第3d)，采用荧光显微镜观察细胞荧光强度及荧光表达率。

通过对比转染细胞荧光强度及荧光表达率，确定FerritinH-T2A-IFNβ慢病毒转染MSCs的最佳转染条件为：MOI＝10，转染时间为10h。采用10cm²大培养皿，按照上述同样步骤进行转染，待大皿内细胞融合度达70％，采用胰酶消化，离心，弃上清，使用完全培养基重悬细胞沉淀，进行传代。采用含嘌呤酶素(2μg/mL)的完全培养基进行筛选7d，每2d换液一次。随后始终以含1μg/mL嘌呤霉素的完全培养基培养，获得稳定表达抗性基因的FerritinH-T2A-IFNβ-MSCs。采用携带eGFP基因的空病毒以同样步骤转染MSCs获得稳转的eGFP-MSCs，培养、传代作为后续实验的阴性对照组。

3、FerritinH-IFNβ-MSCs转染效率的检测

(1)流式细胞仪检测FerritinH-IFNβ-MSCs荧光表达率

MSCs按2×10⁵细胞/孔接种于6孔板，按上述步骤进行慢病毒转染。分别于转染后第3d、第10d(即嘌呤霉素全量筛选7d后)，移除培养基，PBS洗涤，胰酶消化，吹打成细胞悬液、计数。取5×10⁵个FerritinH-IFNβ-MSCs后采用流式细胞仪检测转染后细胞eGFP的表达率。设置野生型MSCs(wild-type MSCs,WT-MSCs)为空白对照组。实验组与对照组每组均设置3个复孔，本实验重复3次。同样步骤检测eGFP-MSCs的荧光表达率。

结果表明，流式细胞仪检测转染细胞的荧光表达率达56.58±0.40％。经嘌呤霉素全量筛选7d后，荧光强度增加且荧光表达率增高，测荧光表达率达73.59±0.28％(如图3所示)，较筛选前增加，差异有显著统计学意义(P<0.05)；再继续通过嘌呤霉素筛选，荧光表达率不再提高。

此外，还采用类似的方法利用FerritinH-IRES-IFNβ慢病毒转染MSCs，流式细胞仪检测转染细胞的荧光表达率为50.21±0.39％。经嘌呤霉素全量筛选7d后，测荧光表达率达61.06±0.48％(如图4所示)，较FerritinH-T2A-IFNβ慢病毒转染MSCs低。

(2)Real-time PCR检测转染后FerritinH与IFNβ的mRNA水平

MSCs按2×10⁵细胞/孔接种于6孔板，按上述步骤进行慢病毒转染。于转染后第10d(即嘌呤霉素全量筛选7d后)，移除培养基，采用常规方法提取RNA样品。取1μL RNA样品50倍稀释，测定OD值，OD260/OD280＞1.8，说明提取的RNA较纯，无蛋白质污染。取RNA样品1μL，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA、18s rRNA和28srRNA条带，三条条带均完整，证明总RNA抽提比较完整。

逆转录cDNA合成采用TaKaRa公司的逆转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit，总反应体系20μL。

PCR引物设计采用Primer 5.0软件，选取β-actin作为内参。引物序列如下：

FerritinH-F：5’-TGAGCCCTTTGCAACTTC-3’；

FerritinH-R：5’-CCCGGTCAAAATAACAAGAC-3’；

IFNβ-F：5’-GAATGGAAGGCTCAACCTCA-3’；

IFNβ-R：5’-ACCCAAGTCAATCTTTCCTC-3’；

β-actin-F：5’-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’；

β-actin-R：5’-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3’。

按Real-time PCR试剂盒(SYBR Green qPCR SuperMix)说明书配制反应体系，反应在ABI7500型实时定量PCR仪进行。以FerritinH-IFNβ-MSCs作为实验组，采用相似步骤空病毒转染MSCs获得eGFP-MSCs作为阴性对照组，以WT-MSCs作为空白对照组，所有实验重复3次。采用2^-ΔΔCT法进行数据分析，分别计算ΔCt值。

Real-time PCR结果表明(如图5a所示)：FerritinH-IFNβ-MSCs组的FerritinHmRNA及IFNβmRNA水平明显高于eGFP-MSCs组及WT-MSCs组，差异有显著统计学意义(P<0.05)；eGFP-MSCs组及WT-MSCs组的FerritinH mRNA及IFNβmRNA水平的差异无统计学意义(P>0.05)。

(3)Western Blot检测转染后FerritinH蛋白表达

采用Western Blot检测胞质蛋白FerritinH，1×10⁶个MSCs细胞接种于25cm²培养瓶，按上述步骤进行FerritinH-T2A-IFNβ慢病毒转染。于转染后第10d(即嘌呤霉素全量筛选7d后)，将小培养瓶置于冰上，移除培养基，提取蛋白并采用BCA法测定总蛋白浓度。取20μg总蛋白用SDS-PAGE电泳将其分离，并转移至PVDF膜上。5％脱脂牛奶封闭后，以GAPDH作为内参，加入相应一抗4℃孵育过夜，再加入二抗37℃孵育1h。采用的一抗分别为：兔抗大鼠FerritinH一抗(1:1000)，小鼠抗大鼠GAPDH抗体(1:10000)。TBST洗膜后，用HRP标记羊抗兔和羊抗小鼠IgG二抗(1:10000)染色。目的蛋白和抗体的复合物用化学发光法检测试剂检测。设置eGFP-MSCs作为阴性对照组，WT-MSCs作为空白对照组，所有实验重复三次。

Western blot结果表明(如图5b所示)：FerritinH-IFNβ-MSCs组的FerritinH蛋白表达水平高于eGFP-MSCs组及WT-MSCs组，差异有显著统计学意义(P<0.05)；eGFP-MSCs组及WT-MSCs组的FerritinH蛋白表达水平的差异无统计学意义(P<0.05)。

(4)ELISA检测转染后IFNβ蛋白表达

采用ELISA法检测分泌蛋白IFNβ。按上述同样步骤采用FerritinH-T2A-IFNβ慢病毒转染MSCs，于转染后第10d(即嘌呤霉素全量筛选7d后)，取1×10⁶个FerritinH-IFNβ-MSCs分别接种于3个25cm²培养瓶，分别在接种24h、48h、72h后收集各瓶细胞的培养基。1000rpm离心20min，小心吸取上清移至标记好的EP管待用。采用Elabscience公司的大鼠β干扰素(IFN-β)酶联免疫吸附测定试剂盒进行ELISA检测。设置eGFP-MSCs为阴性对照组，WT-MSCs为空白对照组，本实验重复3次。

ELISA结果表明(如图5c所示)：FerritinH-IFNβ-MSCs的IFNβ蛋白分泌量随接种时间延长逐渐增加(P<0.05)；在接种48h及72h后，FerritinH-IFNβ-MSCs组的IFNβ蛋白分泌量明显多于eGFP-MSCs组及WT-MSCs组，差异有显著统计学意义(P<0.05)。eGFP-MSCs组与WT-MSCs组的IFNβ蛋白分泌量的差异始终无统计学意义(P>0.05)。

以上实验证实FerritinH-T2A-IFNβ慢病毒转染的MSCs，经嘌呤霉素筛选后，在mRNA和蛋白水平均能有效过表达FerritinH与IFNβ。

实施例3 FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒转染MSCs的体外有效性检测

为验证FerritinH过表达及补充细胞外铁对细胞内铁含量的影响，采用普鲁士蓝染色、透射电子显微镜、体外MR扫描及原子吸收光谱对细胞内铁含量进行定性、定量检测。

1、普鲁士蓝染色

按2×10⁵个细胞/孔将FerritinH-IFNβ-MSCs与WT-MSCs接种于六孔板，每组细胞各种2孔，待贴壁后，一孔加入含有350μM枸橼酸亚铁(ferric citrate,FC)的完全培养基孵育60h，另一孔仅加入完全培养基孵育相同时间。PBS洗涤1次，4％多聚甲醛固定20min，再用PBS洗涤3次，每次5min。每孔加入Perl’s反应液2mL(10％亚铁氰化钾溶液+20％盐酸等体积混合)作用30min，PBS洗涤3次，每次5min。显微镜下观察细胞蓝染情况，检测FerritinH过表达及补铁对细胞内铁含量的影响。

普鲁士蓝染色结果显示(如图6a所示)：FerritinH-IFNβ-MSCs经过补充枸橼酸铁后，细胞质轻微蓝染，胞核见丰富蓝染；未补充细胞外铁的FerritinH-IFNβ-MSCs未见明显散在蓝染颗粒。无论是否添加细胞外铁，对照组WT-MSCs均未见蓝染颗粒。

2、透射电镜观察

将1×10⁶个FerritinH-IFNβ-MSCs种于25cm²细胞培养瓶，再加入350μM枸橼酸亚铁的完全培养基培养60h后，PBS洗涤3次，胰酶消化后移至离心管中，2500rpm离心10min。向细胞沉淀内加入前固定液(2％戊二醛、2.5％多聚甲醛)4℃过夜。随后使用0.01mol/L的二甲胂酸钠缓冲液洗涤，1％锇酸4℃固定1h；丙酮梯度脱水，环氧树脂Epon812包埋、修块后，制备50nm的超薄切片，采用饱和醋酸铀、柠檬酸铅双染色。设置WT-MSCs作为空白对照组。电镜下观察FerritinH-IFNβ-MSCs细胞内含铁颗粒的存在与分布情况。

透射电镜扫描结果显示(如图6b所示)：对比WT-MSCs，FerritinH-T2A-IFNβ慢病毒转染后，细胞超微结构未见明显变化。FerritinH-IFNβ-MSCs胞质内见较多圆形致密黑色颗粒，而WT-MSCs未见此结构。

3、细胞MRI扫描

按4×10⁵个细胞/孔将FerritinH-IFNβ-MSCs、eGFP-MSCs、WT-MSCs接种于六孔板，每组细胞各种2孔，待贴壁后，一孔加入含有350μM枸橼酸亚铁的完全培养基孵育60h，另一孔仅加入完全培养基孵育相同时间。各孔PBS洗涤3次，胰酶消化、离心、去上清，使用200μL0.5％琼脂糖溶液分别重悬各组细胞沉淀，种于96孔板，每组设置5个复孔。待琼脂糖凝固后，采用3.0T MRI进行细胞MRI扫描，成像序列包括：FSE序列T2WI、T1WI、T2*WI及T2-map序列。成像主要参数见表1。在Philip 3T工作站，采用IDL及ImageJ软件，观察各组细胞在不同序列的信号强度，利用感兴趣区技术测量细胞的T2驰豫时间。

表1 细胞MRI检查序列及参数

MRI检测结果显示(如图7a所示)：经过含Fc的培养基孵育60h，T2WI及T2*WI上FerritinH-IFNβ-MSCs+FC组细胞的信号明显减低，T2-map上测得的T2值明显低于未补充Fc的FerritinH-IFNβ-MSCs组、WT-MSCs组、eGFP-MSCs组以及补充Fc的WT-MSCs+Fc组、eGFP-MSCs+Fc组，差异均有显著统计学意义(P<0.05)；其余各组间T2值的差异无统计学意义(P>0.05)(如图7b所示)。

4、原子吸收光谱

按4×10⁵个细胞/孔将FerritinH-IFNβ-MSCs、eGFP-MSCs、WT-MSCs接种于六孔板，每组细胞各种2孔，待贴壁后，一孔加入含有350μM枸橼酸亚铁的完全培养基孵育60h，另一孔仅加入完全培养基孵育相同时间。各孔PBS洗涤3次，胰酶消化、离心、去上清，再分别加入PBS重悬细胞沉淀并计数。取悬液200μL加至1.4mL浓盐酸中，放置2～3d后移至容量瓶，去离子水定容摇匀。采用标准曲线法，用火焰原子吸收光谱法测定各组细胞的平均铁含量，计算出单个细胞内铁含量。本实验重复3次。

结果表明(如图7c所示)：原子吸收光谱测得FerritinH-IFNβ-MSCs+FC组单个细胞铁含量平均为3.14pg±0.29pg，明显高于FerritinH-IFNβ-MSCs组(0.48pg±0.07pg)、WT-MSCs组(0.36pg±0.11pg)、eGFP-MSCs组(0.41pg±0.12pg)以及WT-MSCs+Fc组(0.37pg±0.04pg)、eGFP-MSCs+Fc组(0.31pg±0.09pg)，差异均有显著统计学意义(P<0.05)，其余各组间单个细胞铁含量的差异无统计学意义(P>0.05)。

实施例4 FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒转染MSCs的体外安全性检测

为验证慢病毒转染及FerritinH与IFNβ过表达对干细胞表型、存活、凋亡及分化能力的影响，分别对细胞活力、凋亡率、细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平、干细胞表面标记物及多向分化能力等进行测定。

1、CCK8测定细胞活力

WT-MSCs、eGFP-MSCs及FerritinH-IFNβ-MSCs按1×10⁴细胞/孔种于96孔板内，采用完全培养基配平，每孔总液体量为200μL。恒温细胞培养箱培养24h后，每孔加入10μL的CCK8液细胞培养箱孵育2h，用酶标仪在450nm波长测定各孔OD值。根据如下公式：细胞活力(％)＝OD(FerritinH-IFNβ-MSCs/eGFP-MSCs)-OD(空白)/OD(WT-MSCs)-OD(空白)，计算细胞的增殖活力。每组设5个复孔，本实验重复3次。

2、流式检测细胞凋亡率

WT-MSCs、eGFP-MSCs及FerritinH-IFNβ-MSCs各收取1×10⁶个细胞，离心后细胞沉淀用PBS洗涤1次。采用试剂盒专用Binding Buffer 400μL重悬细胞，加入AnnexinV-APC5μL，混匀后避光反应15min，再加入PI试剂10μL，轻柔混匀，于流式细胞仪上检测各组细胞凋亡率。每组设置3个复孔，本实验重复3次。

3、细胞内活性氧簇检测

按4×10⁵个细胞/孔将FerritinH-IFNβ-MSCs、eGFP-MSCs、WT-MSCs种于六孔板中。完全培养基培养48h～72h。移去培养基，清理液洗涤3次。消化、离心、去上清，每管加入1mL含有染色液和稀释液的工作液(二者比例为1:1000)，混匀后直立置于37℃恒温水槽避光孵育。20min后，离心、去上清，向细胞沉淀加入预冷的保存液1mL，混匀后置于冰槽内。使用流式细胞仪定量检测荧光强度值(激发波长540nm，散发波长590nm)，波峰右移，说明ROS含量增高。每次每组设3个复孔，本实验重复3次。

采用CCK8法和流式细胞仪分别检测转染细胞增殖活力、凋亡率和ROS水平，结果显示(如图8a～8c所示)：FerritinH-IFNβ-MSCs、eGFP-MSCs、WT-MSCs三组细胞的增殖活力、凋亡率及ROS水平的差异无统计学意义(P>0.05)。经含枸橼酸亚铁的完全培养基孵育的WT-MSCs+FC组、eGFP-MSCs+FC组ROS水平较WT-MSCs组、eGFP-MSCs组明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；而FerritinH-IFNβ-MSCs+FC组的ROS水平与FerritinH-IFNβ-MSCs组相比，差异无统计学意义(P>0.05)(如图8d所示)。

4、流式检测FerritinH-IFNβ-MSCs表面标记物

5×10⁵个FerritinH-IFNβ-MSCs经胰酶消化、离心、去上清，细胞沉淀PBS洗涤1次，各管中依次加入单克隆抗体CD29、CD90、CD45，每管同时设立同型阴性对照。避光孵育30minPBS洗涤一次、离心、去上清，200μL PBS重悬细胞，流式细胞仪上检测分析FerritinH-IFNβ-MSCs表面标记物。本实验就不同转染批次的细胞重复3次。

流式结果表明(如图9所示)：FerritinH-IFNβ-MSCs阳性表达CD90(99.89％)、CD29(98.75％)，不表达CD45(1.37％)，表明FerritinH-IFNβ-MSCs慢病毒转染对MSCs的表型特征无明显影响。

5、干细胞多向分化能力鉴定

(1)成骨诱导分化及鉴定

采用购自赛业生物科技有限公司的成骨诱导分化培养基试剂盒。按4×10⁵个细胞/孔将FerritinH-IFNβ-MSCs、eGFP-MSCs、WT-MSCs种于已包被0.1％明胶的六孔板，每孔加入2mL完全培养基；待细胞融合度达到70％左右，更换成成骨诱导分化完全培养基培养。3～4周后，移去成骨诱导分化完全培养基，PBS洗涤2次。4％多聚甲醛溶液固定30min，PBS洗涤3次。每孔加入1mL茜素红染液，3min后吸去染液，PBS洗涤3次。显微镜下观察钙结节染色情况并拍照。

(2)成脂诱导分化及鉴定

采用购自赛业生物科技有限公司成脂诱导分化培养基试剂盒。按4×10⁵个细胞/孔将FerritinH-IFNβ-MSCs、eGFP-MSCs、WT-MSCs种于六孔板，每孔加入2mL完全培养基，待细胞融合度达到100％左右，移去完全培养基，加入2mL成骨诱导分化完全培养基A液，3天后移去A液，加入2mL成脂诱导分化培养基B液。24h后移去B液，换回A液，A液与B液交替孵育5次(共约20天)，直至脂滴足够大且圆。B液维持培养期间，每2～3天更换新鲜的B液。成脂诱导分化结束后，移去成脂诱导分化培养基，PBS洗涤2次。加入4％多聚甲醛溶液固定30min。PBS洗涤2次，每孔中加入1mL油红O工作液染色30min，PBS洗涤1次，显微镜下观察脂滴形成情况并拍照。

MSCs具有分化成骨及成脂肪的能力。结果如图10所示，经成骨诱导培养(Osteogenesis)后，茜素红染色显示，WT-MSCs组、eGFP-MSCs组及FerritinH-IFNβ-MSCs组均可见大量团片状红染钙结节形成。经成脂诱导培养(Adipogenesis)后，油红O染色显示，三组细胞内均见大量的深红染脂滴出现。

实施例5 活体MRI监测

1、C6胶质瘤细胞培养及传代

C6胶质瘤细胞(购自赛业生物科技有限公司)复苏后，采用含10％FBS+1％青霉素-链霉素混合液的高糖DMEM完全培养基置于细胞恒温培养箱内培养，每2～3d换液。待细胞融合度达70％左右按1:3～1:4比例进行消化传代培养。

2、Transwell迁移实验

采用Transwell迁移实验监测FerritinH-IFNβ-MSCs对胶质瘤的体外趋化能力。将C6细胞按1×10⁶个/孔种于六孔板，待其贴壁后，更换为不含血清的培养基培养48h，收集条件培养基(conditioned media)移至离心管。分为FerritinH-IFNβ-MSCs、eGFP-MSCs及WT-MSCs三组，各组取2×10⁵个细胞离心、弃上清，加入200μL无血清培养基(含有0.1％BSA)重悬细胞沉淀，种于Transwell上层小室，在下层小室内加入600μL的条件培养基，置于恒温细胞培养箱8h。阴性对照组Transwell上层小室种2×10⁵个WT-MSCs，下层小室内加入600μL不含血清的培养基。8h后，取出Transwell上层小室，PBS清洗3次，棉签擦去膜上室面的细胞，用4％多聚甲醛固定30min，再用0.1％结晶紫溶液染色15min，显微镜下观察膜下室面的细胞，随机选取5个40倍视野对跨膜细胞进行计数并拍照。本实验重复3次。

Transwell结果表明(如图11所示)，FerritinH-IFNβ-MSCs、eGFP-MSCs及WT-MSCs对C6条件培养基均表现明显趋化能力，跨膜细胞数无统计学差异(P>0.05)。采用无血清培养基(SFM)的阴性对照组仅有少量跨膜细胞，显著少于三个实验组，差异均有统计学意义(P<0.05)。表明FerritinH-IFNβ-MSCs对C6条件培养基的趋化能力未因基因修饰发生明显改变。

3、Wistar大鼠颅内胶质瘤模型建立

Wistar大鼠采用1％戊巴比妥钠按5mL/kg剂量腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于立体定位仪，头部剃毛、碘伏消毒，沿正中线纵向剪开头皮，逐层剥离皮下筋膜、暴露前囟。钻头在立体定位仪引导下，于前囟中心前方1mm，左侧3mm钻一骨孔。用25μL微量注射针抽取2.5μL含有5×10⁵个C6细胞悬液。在立体定位仪引导下，经骨孔垂直于颅骨外板进针6mm，再回退1mm，定位于Wistar大鼠左侧纹状体区。按1μL/min将细胞悬液缓慢推注，推注完留针5min使细胞充分沉淀，缓慢退针。拔针后骨蜡封闭钻孔，缝合皮肤切口，完成模型制作。

4、干细胞移植

胶质瘤模型制作后第4～6d对大鼠行头颅MRI扫描，确认大鼠左侧纹状体区形成肿瘤，并测量胶质瘤体积，选择肿瘤体积达3±2mm³时的胶质瘤模型动物，当日记为基线时间(baseline time)，于次日(记为D01)进行干细胞移植。50只荷瘤大鼠随机分为FerritinH-IFNβ-MSCs组18只、eGFP-MSCs组18只及肿瘤自然生长组14只。FerritinH-IFNβ-MSCs组，采用含350μM枸橼酸亚铁的完全培养基培养FerritinH-IFNβ-MSCs 60h后，将大鼠麻醉、固定，在立体定位仪引导下，于建模时骨孔左侧1mm钻一骨孔。用25μL微量注射针抽取2.5μL含有2×10⁶个FerritinH-IFNβ-MSCs悬液。参考MRI图像胶质瘤位置，在立体定位仪引导下，使注射针头位于胶质瘤外侧，进行FerritinH-IFNβ-MSCs注射。eGFP-MSCs组采用同样方法移植2×10⁶个eGFP-MSCs。肿瘤自然生长组不作任何处理作为空白对照。

5、大鼠活体MRI检测及图像分析

MSCs移植前进行基线MRI扫描(Baseline)，在MSCs注射当天(D01)、MSCs注射后第3天(D03)、第5天(D05)、第7天(D07)、第11天(D11)五个时间点，从以上三组大鼠中随机抽出5只进行脑部MRI检测。大鼠采用1％戊巴比妥钠按5mL/kg剂量腹腔麻醉后，俯卧位，采用3.0TMRI成像仪及大鼠专用线圈扫描成像。成像的序列及主要参数如下：横断位及冠状位T2WI：TR/TE＝1200/60ms，层厚/层距＝1.0/0mm，FOV＝60×60mm，矩阵＝336×336，NSA＝3；冠状位FFE-T2*WI：TR/TE＝500/20ms，翻转角＝20°，层厚/层距＝1.0/0mm，FOV＝60×60mm，矩阵＝336×336，NSA＝3。

在基线时间、D01、D03、D05、D07及D11六个时间点，对FerritinH-IFNβ-MSCs组、eGFP-MSCs组及肿瘤自然生长组进行系列活体MRI成像(结果如图12所示)。在基线时间，T2WI上均可见沿针道生长、稍高信号的瘤体形成。各组MRI表现分述如下：(1)FerritinH-IFNβ-MSCs组：FerritinH-IFNβ-MSCs低信号始终分布于肿瘤外周区，未见向肿瘤内部迁徙趋势，信号强度变化不显著。基线时间至D03胶质瘤体积逐渐增大，随后肿瘤体积逐渐减小。(2)eGFP-MSCs组：D01时在T2WI上在肿瘤外侧见线状稍高信号针道影，未见明确低信号影。从基线时间至D11，肿瘤体积逐渐增大。(3)肿瘤自然生长组：从基线时间至D11，肿瘤体积逐渐增大。

扫描结束后，MRI图像传入后处理工作站，在T2WI、T2*WI序列上观察低信号的FerritinH-IFNβ-MSCs存在及分布的演变；在T2WI序列观察肿瘤大小、形态、信号随时间的改变。采用感兴趣区(Region of interest,ROI)技术，在T2WI序列各层面上勾画肿瘤边缘得出各层面肿瘤面积，叠加后乘以图像层厚(1mm)得出肿瘤体积。

T2WI上测量三组各时间点的肿瘤体积情况见表2。对比不同治疗模式下胶质瘤生长速率(见图13)，FerritinH-IFNβ-MSCs组肿瘤生长速率明显低于其余两组，差异有显著统计学意义(P<0.05)，其他两组间肿瘤生长速率的差异无统计学意义(P>0.05)。以上结果表明FerritinH-IFNβ-MSCs对胶质瘤有明显治疗效果，eGFP-MSCs对胶质瘤无治疗效果。

表2 三组各时间点的肿瘤体积(mm³)测量结果

实施例6 组织病理学检测

1、FerritinH免疫组化与普鲁士蓝共染

在MSCs注射后第5天及第11天，分别从FerritinH-IFNβ-MSCs组、eGFP-MSCs组各抽取2只大鼠，采用10％水合氯醛按4mL/kg剂量腹腔注射深度麻醉后，左心室灌注生理盐水及4％多聚甲醛溶液。小心完整分离出大鼠端脑，多聚甲醛固定48h，再用15％、30％蔗糖溶液梯度脱水，OCT包埋后，冰冻切片机制作层厚10μm的连续冠状位冰冻切片。进行FerritinH免疫组化染色和普鲁士蓝共染色明确FerritinH⁺细胞与铁颗粒的关系，及FerritinH-IFNβ-MSCs随时间变化趋势。具体操作步骤如下：冰冻切片复温后，PBS漂洗3次，3％过氧化氢封闭液避光孵育15min，Triton X-100破膜30min，PBS再漂洗3次，山羊血清封闭液封闭30min，加入FerritinH一抗(rabbit anti rat FerritinH,1:200)，4℃孵育过夜。PBS漂洗3次，加入相应二抗IgG(goat anti rabbit,1：200)，37℃孵育1h。PBS漂洗3次，DAB显色2min，蒸馏水终止并洗3次。加入Perl’s反应液(10％亚铁氰化钾溶液、20％盐酸等体积混合)作用20min，蒸馏水漂洗3次。随后，滴加核固红染核5min，蒸馏水漂洗3次，室温干燥后中性树脂封片，显微镜下观察并拍片。阴性对照组以PBS代替一抗，其余操作步骤相同。

FerritinH免疫组化和普鲁士蓝共染色结果表明(如图14a所示)：FerritinH-IFNβ-MSCs注射后第5天及第11天，肿瘤外周区见大量FerritinH⁺细胞及丰富的蓝染颗粒，两者位置基本吻合，但随时间有减少趋势。eGFP-MSCs注射后两个时间点均未见FerritinH⁺细胞或蓝染颗粒。

2、eGFP免疫荧光染色

采用eGFP免疫荧光染色观察eGFP⁺细胞随时间变化趋势。具体操作步骤如下：取免疫组化临近脑组织切片，待冰冻切片复温后，PBS漂洗3次，0.3％Triton X-100破膜30min，PBS再漂洗3次，山羊血清封闭液封闭30min，加入eGFP一抗(mouse anti rat eGFP,1:200)，4℃孵育过夜。PBS漂洗3次，加入相应488标记荧光二抗IgG(1:200)，37℃孵育1h。以下操作均在暗室避光条件下完成，PBS漂洗3次，DAPI染核(1:1000)约5min，PBS漂洗3次后防荧光猝灭剂封片，避光保存。正置荧光显微镜观察并拍片。

eGFP免疫荧光染色结果表明(如图14b所示)：FerritinH-IFNβ-MSCs组与eGFP-MSCs组的eGFP⁺细胞变化趋势相似，均随时间减少。

3、移植FerritinH-IFNβ-MSCs后IFNβ的ELISA检测

在MSCs注射后当天、第5天及第11天，分别从FerritinH-IFNβ-MSCs组、eGFP-MSCs组及肿瘤自然生长组随机各抽取3只大鼠，采用10％水合氯醛按4mL/kg剂量腹腔注射深度麻醉后，完整分离出大鼠端脑，用于IFNβ的ELISA检测。采用Elabscience公司的大鼠IFN-β酶联免疫吸附测定试剂盒进行实验。各组均设置3个复孔，本实验重复3次。

ELISA结果表明(如图15所示)：FerritinH-IFNβ-MSCs组在注射后当天、注射后第5天及第11天的IFNβ分泌量逐渐增加；注射后当天，FerritinH-IFNβ-MSCs组的IFNβ分泌量与eGFP-MSCs组及肿瘤自然生长组的差异均无显著统计学意义(P>0.05)；注射后第5天及第11天，FerritinH-IFNβ-MSCs组的IFNβ分泌量高于eGFP-MSCs组及肿瘤自然生长组，差异有显著统计学意义(P<0.05)。eGFP-MSCs组及肿瘤自然生长组三个时间点IFNβ分泌量的差异均无统计学意义(P>0.05)。以上结果表明移植FerritinH-IFNβ-MSCs后，脑组织IFNβ的分泌量随时间逐渐增多，并在移植后第5天及第11天IFNβ的分泌量显著多于对照组。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1457

<212> DNA

<213> 大鼠(mouse)

<400> 1

gtttttggct tttttgttag acgaagcttg ggctgcaggt cgactctaga ggatccccgg 60

gtaccggtcg ccaccatgac caccgcgtct ccctcgcaag tgcgccagaa ctaccaccag 120

gactcggagg ctgccatcaa ccgccagatc aacctggagt tgtatgcctc ctacgtctat 180

ctgtccatgt cttgttattt tgaccgggat gatgtggccc tgaagaactt tgccaaatac 240

tttctccatc aatctcatga agagagggag catgctgaga aactgatgaa gctgcagaac 300

cagcgaggtg gacgaatctt cctgcaggat ataaagaaac ctgaccgtga tgactgggag 360

agcgggctga atgcaatgga gtgtgcactg cacttggaaa agagtgtgaa tcaatcacta 420

ctggaacttc acaaactggc tactgacaag aatgatcccc acttatgtga cttcattgag 480

acgcattacc tgaatgagca ggtgaaatcc attaaagaac tgggtgacca cgtgaccaac 540

ttacgcaaga tgggagcccc tgaatctggc atggcagaat atctctttga caagcacacc 600

ctgggacacg gtgatgagag cggcagcggc gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt 660

gacgtggagg agaatcccgg ccctatggcc aacaggtgga ccctccacat tgcgttcctg 720

ctgtgcttct ccaccactgc cctctccatc gactacaagc agctccagtt ccgacaaagc 780

actagcattc ggacatgtca gaagctcctg aggcagctga atggaaggct caacctcagc 840

tacaggacgg acttcaagat ccctatggag gtgatgcacc cgtcacagat ggagaagagt 900

tacactgcct ttgccattca agtgatgctc cagaatgtct ttcttgtctt cagaagcaat 960

ttctccagca ctgggtggaa tgagactatt gttgaaagtc tcttggatga actacatcag 1020

cagacagagc ttctggagat aatactaaag gaaaagcaag aggaaagatt gacttgggtg 1080

acatccacga ctactttagg cttgaagagc tattactgga gggtacaaag gtaccttaaa 1140

gacaagaagt acaacagcta tgcctggatg gtggtccgag cagaagtctt caggaacttt 1200

tccattattc taagacttaa tagaaacttc cagaactgac tagcctgtgg aatgtgtgtc 1260

agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 1320

tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc 1380

aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc 1440

ccctaactcc gcccagt 1457

Claims

1.一种用于胶质瘤免疫治疗同时可磁共振示踪的间充质干细胞制剂，其特征在于，包括一种能同时分泌IFNβ与MR成像的骨髓间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞制剂，其特征在于，所述的骨髓间充质干细胞由FerritinH和IFNβ基因联合修饰，能同时表达分泌蛋白IFNβ和胞质蛋白FerritinH。

3.根据权利要求1所述的间充质干细胞制剂，其特征在于，所述的胶质瘤为颅内原位胶质瘤。

4.根据权利要求3所述的间充质干细胞制剂，其特征在于，所述的胶质瘤为C6胶质瘤细胞。

5.一种用于治疗胶质瘤的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项中所述的骨髓间充质干细胞、包含有FerritinH-T2A-IFNβ基因的重组质粒或FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体。

6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述FerritinH-T2A-IFNβ基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的FerritinH-T2A-IFNβ过表达慢病毒载体为慢病毒载体GV367。