CN114231495A - 多模态示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

多模态示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多模态示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用，该多模态示踪脐带间充质干细胞过表达FTH1蛋白和SR39TK蛋白，其制备方法包括：1)提供脐带间充质干细胞；2)构建多模态慢病毒表达载体；3)慢病毒包装；4)用重组慢病毒转染脐带间充质干细胞，构建得到多模态示踪脐带间充质干细胞细胞系。本发明的脐带间充质干细胞能过表达FTH1、SR39TK、EGFP，结合该种脐带间充质干细胞可以同时实现核磁成像、PET成像和荧光成像，可提供干细胞移植后的存活、分布和迁徙的动态分布情况的示踪分析，从而为干细胞治疗的疗效评估带来很大便利，为间充质干细胞的实验研究及临床应用提供更为有力的研究基础和科学依据。

Description

多模态示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种多模态示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用。
背景技术
近些年来，随着人们生活水平的不断提高，饮食种类方面丰富多样，伴随着这些变化而衍生出了一些新型疾病，这就给医学和生命科学研究带来了巨大挑战。对于当下的某些疾病来说传统治疗手段或已显得力不从心。但是，近几年来新发展的以间充质干细胞为核心的干细胞疗法为当前的医学及生物学研究注入了新鲜的血液。干细胞疗法，又称为再生医疗技术，是指通过体外分离培养干细胞，并对其进行一定的基因修饰，或定向诱导，然后通过移植以实现对临床疾病的治疗。
间充质干细胞是一类起源于早期中胚层，并且能够自我更新和具有多向分化潜能的成体干细胞，其来源丰富，可从脐带、脂肪、骨髓、牙髓中分离提取。而脐带中的干细胞含量较丰富，也最容易获得，脐带间充质干细胞来源于产妇产后的脐带组织，通常情况下是作为医疗废物丢弃的，从脐带组织中分离提取干细胞不存在伦理道德争议。间充质干细胞作为一种新型的疾病治疗手段，具有极好的临床应用前景，但是在实际应用中尚存这许多亟待解决的问题，比如，如何在活体条件监测并获得移植的干细胞的生存，增殖，表达，转移等情况；如何评价干细胞治疗效果等[潘昱,张一帆.核素报告基因显像在基因治疗监测中的应用[[J].上海交通大学学报(医学版),2012,32(11):1512-1516.]。这就需要用到示踪显像技术。
核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)是利用生物体内的特定原子核在特定外加磁场的作用下，核自旋空间取向由无序向有序过渡，逐渐按磁力线方向重新排列，并在特定频率的射频脉冲中释放纵向及横向弛豫信号，经重建后进行成像的一种影像学技术。
正电子发射型计算机断层显像(Positron Emission Computed Tomography，PET)成像是用携带短寿命放射性核素的药物，在生理条件下检测标记药物及其代谢物在活体内的空间分布、数量及其时间变化，从而在分子水平上反映活体内病灶或目标区域结构的成像技术。
荧光蛋白标记示踪法：绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是由Shimomura等[Shimomura O，Johnson FH，Saiga Y.Extraction，purification andproperties of aequorin，a bioluminescent protein from the luminoushydromedusan，Aequorea[J].J Cell Comp Physiol，1962，59 223-239.]在1962年从一种学名为Aequorea victoria的水母中发现的由238个氨基酸组成的单体蛋白质。随后相继发现了30余种波长不同的荧光蛋白，常见的有GFP和其衍生物黄色荧光蛋白(yellowfluorescent protein，YFP)、蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein，BFP)以及红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)等。荧光蛋白示踪的原理是通过腺病毒、慢病毒、质粒等载体将荧光蛋白基因与目的基因整合并在宿主细胞内表达，经激发光照射下发出荧光。
目前关于大动物活体示踪的方法并不完善，大多都是单模态示踪，如EGFP、iRFP、Fluc；各种单模态成像均有各自的优缺点，如MRI能获得原生的三维断面成像，有良好的软组织分辨能力，但是检测耗时长，对检测对象要求较高；PET的灵敏度，特异性更高，还能进行定量分析，但是在临床解剖学意义上无法与MRI比较。所以，单模态示踪已经难以满足应用需求，先有必要提供一种能实现多模态示踪的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种多模态示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：提供一种多模态示踪脐带间充质干细胞，所述多模态示踪脐带间充质干细胞过表达FTH1蛋白和SR39TK蛋白。
优选的是，所述多模态示踪脐带间充质干细胞中还修饰有EGFP报告基因。
本发明还提供一种如上所述的多模态示踪脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)提供脐带间充质干细胞；
2)将rFTH1-T2A基因连接到载体pLVX-EGFP上，得到载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP；然后将P2A-SR39RK基因连接到载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP上，构建得到多模态慢病毒表达载体pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP；
3)慢病毒包装，获得含有FTH1、SR39TK、EGFP基因的重组慢病毒；
4)用重组慢病毒转染脐带间充质干细胞，构建得到修饰有FTH1、SR39TK、EGFP基因的多模态示踪脐带间充质干细胞细胞系。
优选的是，所述步骤1)包括：
1-1)脐带处理：洗净脐带，在PBS溶液中分离去除脐动脉、脐静脉以及脐带表面的外膜，再切割成组织块，然后将组织块平铺在培养皿中，加入培养基；以上操作于冰台上进行；
1-2)将培养基置于37℃下培养；
1-3)消化传代：
1-3-1)细胞培养至80％-90％融合率时，进行消化传代；
1-3-2)向含有组织块的培养皿中加入PBS缓冲液使多数组织块自然飘起，吸除旧的培养基及漂浮的组织块，并用PBS溶液清洗；
1-3-3)加入0.25％的Trypsin，于37℃恒温箱中消化1-2min；
1-3-4)吸去Trypsin，加培养基终止消化并将细胞吹打均匀；
1-3-5)将细胞悬液转移到离心管中，离心，吸去上清，留沉淀；
1-3-6)向沉淀中加入培养基使沉淀重悬，在新的培养皿中加入新鲜培养基，并将细胞悬液均匀滴入，晃匀，37℃培养箱中培养。
优选的是，所述步骤2)具体包括：
2-1)扩增rFTH1-T2A基因片段：以含有rFTH1-T2A基因的质粒作为模板，用如下引物对通过PCR扩增出rFTH1-T2A基因片段，并在rFTH1-T2A基因片段两端分别引入XbaI和AgeI酶切位点；
PRTE-F：
5’-CGGTGAATTCCTCGAGACTAGTTCTAGAGCCACCATGACCACCGCGTCT-3’；
PRTE-R：
5’-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATGATACCGGTAGGGCCGGGATTCTCCTCCA-3’；
2-2)以pLVX-EGFP质粒为载体，使用XbaI和BamHI酶切后备用；
2-3)同源重组连接：步骤2-1)得到的rFTH1-T2A基因片段与步骤2-2)得到的载体在同源重组酶的作用下连接，得到载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP；
2-4)在P2A-SR39RK基因片段两端分别添加5'BamHI和3'BamHI，然后克隆至步骤2-3)得到的载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP中，得到多模态慢病毒表达载体pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP。
优选的是，所述步骤3)具体包括：
3-1)将293T细胞铺到培养皿中培养；
3-2)分别配置质粒转染体系A、体系B：
体系A包括OPTI和PEI，体系B包括OPTI和混合质粒，所述混合质粒包括PMDL、REV、VSVG以及步骤2)得到的pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP；
3-3)将体系A、体系B配置好后分别静置，然后把B体系逐滴加到A体系中，吹吸数次，静置孵育得到AB混合液；
3-4)弃去293T细胞上方的培养基，然后将AB混合液沿着培养皿侧壁加入，培养；
3-5)弃去293T细胞上方的AB混合液，然后沿着侧壁加入完全培养基，培养；
3-6)收集病毒上清；
3-7)将收集的病毒上清放入离心机中，离心去沉淀，留下上清；
3-8)按照病毒上清：病毒浓缩液的体积比为3:1，向病毒上清中加入病毒浓缩液，然后混匀，孵育过夜；
3-9)将病毒上清与病毒浓缩液的混合液放入离心机中，离心弃去上清，留下病毒沉淀，然后用PBS重悬得到病毒溶液，存储备用。
优选的是，所述步骤3)具体包括：
3-1)将293T细胞铺到10厘米的培养皿中培养，至细胞融合度在75-85％时进行慢病毒包装；
3-2)分别配置质粒转染体系A、B：
体系A包括2mL OPTI和50μL PEI，体系B包括2mL OPTI和混合质粒，所述混合质粒包括6.5μg PMDL、3.5μg REV、2.5μg VSVG以及10μg步骤2)得到的pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP；
3-3)体系A、体系B配置好后分别静置5分钟，然后把B体系逐滴加到A体系中，吹吸数次，静置孵育10分钟得到AB混合液；
3-4)弃去293T细胞上方培养基，然后将AB混合液沿着培养皿侧壁加入，培养；
3-5)8小时后弃去293T细胞上方AB混合液，然后沿着侧壁加入完全培养基，培养；
3-6)40个小时后收集病毒上清；
3-7)将收集的病毒上清放入离心机中，4℃下，1000g离心10分钟去沉淀，留下上清；
3-8)按照病毒上清：病毒浓缩液的体积比为3:1，向病毒上清中加入病毒浓缩液，然后混匀，4℃下孵育过夜；
3-9)将病毒上清与病毒浓缩液的混合液放入离心机中，4℃下，1500g离心45分钟弃去上清，留下病毒沉淀，然后用100μL PBS重悬得到重组慢病毒溶液，-80℃下存储备用。
优选的是，所述步骤4)具体包括：
4-1)重组慢病毒转染：先将所述步骤1)得到的脐带间充质干细胞铺板，然后加入步骤3)得到的重组慢病毒溶液，于37℃恒温培养箱中孵育；
4-2)将重组慢病毒感染后的脐带间充质干细胞用0.25％的Trypsin培养，于37℃恒温箱中消化1-2min；
4-3)吸去Trypsin，加培养基终止消化并将细胞吹打均匀成细胞悬液；
4-4)将细胞悬液转移到离心管中，离心，弃上清，留沉淀；
4-5)向沉淀中加入培养基，用移液枪吹打使沉淀重悬；
4-6)向培养皿中添加培养基和步骤4-5)得到的细胞悬液，混匀后放入37℃恒温培养箱中培养；
4-7)于荧光显微镜下挑选出全部表达绿色荧光的细胞团，用移液枪枪头挑出至新的培养皿中进行扩增培养，最终得到多模态示踪脐带间充质干细胞细胞系。
优选的是，所述步骤4)具体包括：
4-1)重组慢病毒转染：转染前18-24h将所述步骤1)得到的脐带间充质干细胞铺板，然后加入步骤3)得到的重组慢病毒溶液，于37℃恒温培养箱中孵育，转染时细胞密度控制在70％～90％；
4-2)48h后将重组慢病毒感染后的脐带间充质干细胞用2ml 0.25％的Trypsin于10cm的培养皿中培养，于37℃恒温箱中消化1-2min；
4-3)吸去Trypsin，加2ml培养基终止消化并将细胞吹打均匀成细胞悬液；
4-4)将细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min下离心5min，弃上清，留沉淀；
4-5)向沉淀中加入1ml培养基，用移液枪吹打使沉淀重悬，用细胞计数板或细胞计数器检测细胞密度，添加培养基重悬，调整细胞密度为1x104/ml；
4-6)向10cm的培养皿中添加10ml培养基和10ul步骤4-5)得到的细胞悬液，混匀后放入37℃恒温培养箱中培养8～12天；
4-7)于荧光显微镜下挑选出全部表达绿色荧光的细胞团，用移液枪枪头挑出至新的培养皿中进行扩增培养，最终得到多模态示踪脐带间充质干细胞细胞系。
本发明还提供根据以上所述的多模态示踪脐带间充质干细胞或以上所述的方法制得的多模态示踪脐带间充质干细胞在制备可示试剂方面的应用。
本发明的有益效果是：
本发明中通过基因工程技术改造后获得的脐带间充质干细胞能过表达铁蛋白重肽链(FTH1)、胸苷激酶(SR39TK)以及(增强型绿色荧光蛋白)EGFP，结合该种脐带间充质干细胞可以同时实现核磁成像，PET成像和荧光成像，能到达多模态示踪的目的，可提供干细胞移植后的存活、分布和迁徙的动态分布情况的示踪分析，从而为干细胞治疗的疗效评估带来很大便利，为间充质干细胞的实验研究及临床应用提供更为有力的研究基础和科学依据。
附图说明
图1为本发明中对分离培养得到的脐带间充质干细胞进行多系分化潜能鉴定的结果；
图2为本发明中多模态慢病毒表达载体酶切鉴定结果；
图3为本发明中的重组慢病毒包装质粒转染效果；
图4为本发明中的重组慢病毒转染脐带间充质干细胞的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1脐带间充质干细胞分离培养
1、取材：
选择足月妊娠剖宫产孕妇，孕妇及新生胎儿身体健康，无妊娠合并症。在手术台上将脐带中的血液及杂物用生理盐水冲洗干净，随后剪成约两厘米的小段，完全浸泡于“PBS+双抗”保存液中，4℃保存运输。
2、脐带处理：
1)实验前准备：准备冰台，高压灭菌的手术器械等物品，以下过程全程冰上操作；
2)取出一段脐带，其余立即放回4℃保存液中；用PBS+双抗溶液冲洗脐带表面的消毒液及血液，至少三次；
3)在冰台上已预冷的PBS溶液中分离脐动脉，脐静脉以及脐带表面的外膜(分离过程中分离时间尽可能短，PBS缓冲液尽可能多，勿使脐带组织干掉)；
4)取出脐带中全部的华通氏胶，并将华通氏胶剪切成2-4mm3大小的组织小块；
5)将切好的组织块均匀的平铺在10cm培养皿中，加入约4ml培养基(DMEM+10％澳洲FBS，原代培养无需添加双抗)；具体的量以无法使组织块移动为宜，封口膜封住培养皿约3/4的周长，置于37℃恒温培养箱中培养；
6)第二日酌情加入2～3ml培养基，封口膜封闭3/4周长后置于37℃恒温培养箱中培养；
7)第七天时换液，吸去旧的培养基，加入8-10ml新鲜培养基，此后每三天换一次液。
3、消化传代：
1)细胞长至80％-90％融合率时进行消化传代；
2)向含有组织块的培养皿中加入PBS缓冲液使多数组织块自然的飘起，吸除旧的培养基及漂浮的组织块，PBS溶液清洗两次；
3)加入2ml 0.25％的Trypsin于10cm培养皿中，于37℃恒温箱中消化1-2min,具体时间以看到细胞突触消失为宜；
4)吸去Trypsin，加2ml培养基终止消化并将细胞吹打均匀成细胞悬液；
5)将细胞悬液转移到10ml离心管中，1000r/min条件下离心5min，吸弃上清，留沉淀；
6)向沉淀中加入1ml培养基，用移液枪轻柔吹打使沉淀重悬，在新的培养皿中加入8-10ml新鲜培养基，并将细胞悬液均匀滴入，轻轻晃匀，于37℃恒温培养箱中培养，得到脐带间充质干细胞，备用。
对分离培养得到的脐带间充质干细胞进行多系分化潜能鉴定，MSC属于多能干细胞，具有多系分化潜能，通常指成骨、成脂和成软骨分化，称为MSC的三系分化。间充质干细胞成脂分化有两个阶段，先是MSC分化为脂肪前体细胞，接着在特定的细胞刺激影响下(如C/EBPs和PPAR-γ)最终分化为脂肪细胞，出现脂肪细胞中显著的标志物(脂肪滴)，脂肪滴经油红O染色后在显微镜下呈现显著的红色，未分化细胞则无明显颜色。间充质干细胞成骨分化经历骨原细胞(osteoprogenitor cells)、成骨前体细胞(pre-osteoblasts)、成熟的骨细胞(osteoblasts)和终末阶段的骨细胞(osteocytes)的一个复杂的过程，长时间的成骨诱导会使钙离子以钙盐方式沉淀下来，形成“骨结节”。骨结节可通过茜素红染色(茜素红和钙发生显色反应，产生一种深红色化合物)，把外面沉积的钙结节染成深红色，通过着色物面积和深浅来表示成骨分化的强弱。参照图1为鉴定结果，
实施例2构建多模态慢病毒表达载体
1)扩增rFTH1-T2A基因片段：
以含有rFTH1-T2A基因的质粒作为模板，用如下引物对通过PCR扩增出rFTH1-T2A基因片段，并在rFTH1-T2A基因片段两端分别引入XbaI和AgeI酶切位点；
PRTE-F：
5’-CGGTGAATTCCTCGAGACTAGTTCTAGAGCCACCATGACCACCGCGTCT-3’；
PRTE-R：
5’-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATGATACCGGTAGGGCCGGGATTCTCCTCCA-3’；
2)以pLVX-EGFP质粒为载体，使用XbaI和BamHI酶切后备用；
3)同源重组连接：
步骤1)得到的rFTH1-T2A基因片段与步骤2)得到的载体在同源重组酶的作用下连接，得到载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP；
4)合成基因P2A-SR39RK片段(本实施例中通过金唯智生物科技有限公司合成)，在P2A-SR39RK基因片段两端分别添加5'(BamHI)和3'(BamHI)，然后克隆至步骤2-3)得到的载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP中，得到多模态慢病毒表达载体pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP。
参照图2，为多模态慢病毒表达载体酶切鉴定结果，pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP质粒大小在7000bp左右，酶切后的片段大小分别是5000bp和2000bp，与实验结果相符，说明pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP质粒构建成功。
本实施例中，rFTH1-T2A基因序列如SEQ ID No.1所示，P2A-SR39RK基因序列如SEQID No.2所示。
实施例3慢病毒包装
1)在病毒包装前一天将293T细胞铺到10厘米的培养皿中培养，至细胞融合度在80％左右时进行慢病毒包装；
2)分别配置质粒转染体系A、B：
体系A包括2mL OPTI和50μL PEI，体系B包括2mL OPTI和混合质粒，所述混合质粒包括6.5μg PMDL、3.5μg REV、2.5μg VSVG以及10μg步骤2)得到的pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP；
3-3)体系A、体系B配置好后分别静置5分钟，然后把B体系匀速滴加到A体系中，吹吸数次，静置孵育10分钟得到AB混合液；
3-4)弃去293T细胞上方培养基，然后将AB混合液沿着培养皿侧壁缓缓加入，培养；
3-5)8小时后弃去293T细胞上方AB混合液，然后沿着侧壁缓缓加入完全培养基，培养；
3-6)40个小时后收集病毒上清；
3-7)将收集的病毒上清放入离心机中，4℃下，1000g离心10分钟去沉淀，留下上清；
3-8)按照病毒上清：病毒浓缩液的体积比为3:1，向病毒上清中加入病毒浓缩液，然后混匀，4℃下孵育过夜；
3-9)将病毒上清与病毒浓缩液的混合液放入离心机中，4℃下，1500g离心45分钟弃去上清，留下病毒沉淀，然后用100μL PBS重悬得到重组慢病毒溶液，根据需求分装，-80℃下存储备用。
参照图3，为重组慢病毒质粒转染效果，在荧光显微镜下可见绿色荧光，说明重组慢病毒质粒中的EGFP成功表达。图中从左至右的3列依次为荧光图像、明场图像和融合图像。
实施例4建立多模态示踪间充质干细胞细胞系
1)重组慢病毒转染：转染前18-24h将实施例1得到的脐带间充质干细胞铺板，然后加入实施例3得到的重组慢病毒溶液，于37℃恒温培养箱中孵育，转染时细胞密度控制在70％～90％；
2)挑单克隆：48h后将重组慢病毒感染后的脐带间充质干细胞用2ml0.25％的Trypsin于10cm的培养皿中培养，于37℃恒温箱中消化1-2min，具体时间以看到细胞突触消失为参照；
3)吸去Trypsin，加2ml培养基终止消化并将细胞吹打均匀成细胞悬液；
4)将细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min下离心5min，弃上清，留沉淀；
5)向沉淀中加入1ml培养基，用移液枪轻柔吹打使沉淀重悬，用细胞计数板或细胞计数器检测细胞密度，添加培养基重悬，调整细胞密度为1x104/ml；
6)向10cm的培养皿中添加10ml培养基和10ul步骤4-5)得到的细胞悬液，混匀后放入37℃恒温培养箱中培养8～12天；
7)于荧光显微镜下挑选出全部表达绿色荧光的细胞团，用移液枪枪头挑出至新的培养皿中进行扩增培养，最终得到多模态示踪脐带间充质干细胞细胞系。
参照图4，为重组慢病毒转染脐带间充质干细胞的结果，转染后EGFP、FTH1、SR39TK成功在间充质干细胞中表达，说明多模态示踪间充质干细胞构建成功。图中从左至右的3列依次为荧光图像、明场图像和融合图像。
目前关于大动物活体示踪的方法并不完善，大多都是单模态示踪，如EGFP,iRFP,Fluc等等。各种单模态成像均有各自的优缺点，如生物发光成像灵敏度高，特异性强，但是信号较弱，检测耗时；生物荧光成像信号强度大，成像速度快，但是空间分辨率差，对成像厚度要求高。本发明提供的多模态示踪脐带间充质干细胞细胞系能够用于实现多模态成像，本发明中通过基因工程技术改造后获得的脐带间充质干细胞能过表达铁蛋白重肽链(FTH1)、胸苷激酶(SR39TK)以及(增强型绿色荧光蛋白)EGFP，结合该种脐带间充质干细胞可以同时实现核磁成像，PET成像和荧光成像，能到达多模态示踪的目的，可提供干细胞移植后的存活、分布和迁徙的动态分布情况的示踪分析，从而为干细胞治疗的疗效评估带来很大便利，为间充质干细胞的实验研究及临床应用提供更为有力的研究基础和科学依据。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
序列表
<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
<120> 多模态示踪脐带间充质干细胞及其制备方法与应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
cggtgaattc ctcgagacta gttctagagc caccatgacc accgcgtct 49
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ctcctcgccc ttgctcacca tgataccggt agggccggga ttctcctcca 50
<210> 3
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
atgaccaccg cgtctccctc gcaagtgcgc cagaactacc accaggactc ggaggctgcc 60
atcaaccgcc agatcaacct ggagttgtat gcctcctacg tctatctgtc catgtcttgt 120
tattttgacc gggatgatgt ggccctgaag aactttgcca aatactttct ccatcaatct 180
catgaagaga gggaacatgc tgagaaactg atgaagctgc agaaccagcg aggtggacga 240
atcttcctgc aggatataaa gaaacctgac cgtgatgact gggagagcgg gctgaatgca 300
atggagtgtg cactgcactt ggaaaagagt gtgaatcagt cactactgga acttcacaaa 360
ctggctactg acaagaatga tccccactta tgtgacttca ttgagacgca ttacctgaat 420
gagcaggtga aatccattaa agaactgggt gaccacgtga ccaacttacg caagatggga 480
gcccctgaat ctggcatggc agaatatctc tttgacaagc acaccctggg acacggtgat 540
gagagcggat ccgcggccgc tgagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag 600
gagaatcccg gccct 615
<210> 4
<211> 1197
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
ggatccgcca caaacttttc cctattgaag caagcaggag atgttgagga aaatccagga 60
ccccctagga tggcttcgta cccctgccat caacacgcgt ctgcgttcga ccaggctgcg 120
cgttctcgcg gccatagcaa ccgacgtacg gcgttgcgcc ctcgccggca gcaagaagcc 180
acggaagtcc gcctggagca gaaaatgccc acgctactgc gggtttatat agacggtcct 240
cacgggatgg ggaaaaccac caccacgcaa ctgctggtgg ccctgggttc gcgcgacgat 300
atcgtctacg tacccgagcc gatgacttac tggcaggtgc tgggggcttc cgagacaatc 360
gcgaacatct acaccacaca acaccgcctc gaccagggtg agatatcggc cggggacgcg 420
gcggtggtaa tgacaagcgc ccagataaca atgggcatgc cttatgccgt gaccgacgcc 480
gttctggctc ctcatatcgg gggggaggct gggagctcac atgccccgcc cccggccctc 540
accatcttcc tcgaccgcca tcccatcgcc ttcatgctgt gctacccggc cgcgcgatac 600
cttatgggca gcatgacccc ccaggccgtg ctggcgttcg tggccctcat cccgccgacc 660
ttgcccggca caaacatcgt gttgggggcc cttccggagg acagacacat cgaccgcctg 720
gccaaacgcc agcgccccgg cgagcggctt gacctggcta tgctggccgc gattcgccgc 780
gtttacgggc tgcttgccaa tacggtgcgg tatctgcagg gcggcgggtc gtggcgggag 840
gattggggac agctttcggg gacggccgtg ccgccccagg gtgccgagcc ccagagcaac 900
gcgggcccac gaccccatat cggggacacg ttatttaccc tgtttcgggc ccccgagttg 960
ctggccccca acggcgacct gtacaacgtg tttgcctggg ccttggacgt cttggccaaa 1020
cgcctccgtc ccatgcacgt ctttatcctg gattacgacc aatcgcccgc cggctgccgg 1080
gacgccctgc tgcaacttac ctccgggatg gtccagaccc acgtcaccac ccccggctcc 1140
ataccgacga tctgcgacct ggcgcgcacg tttgcccggg agatggggga ggctaac 1197

Claims (10)

1.一种多模态示踪脐带间充质干细胞，其特征在于，所述多模态示踪脐带间充质干细胞过表达FTH1蛋白和SR39TK蛋白。
2.根据权利要求1所述的多模态示踪脐带间充质干细胞，其特征在于，所述多模态示踪脐带间充质干细胞中还修饰有EGFP报告基因。
3.一种如权利要求2所述的多模态示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提供脐带间充质干细胞；
2)将rFTH1-T2A基因连接到载体pLVX-EGFP上，得到载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP；然后将P2A-SR39RK基因连接到载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP上，构建得到多模态慢病毒表达载体pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP；
3)慢病毒包装，获得含有FTH1、SR39TK、EGFP基因的重组慢病毒；
4)用重组慢病毒转染脐带间充质干细胞，构建得到修饰有FTH1、SR39TK、EGFP基因的多模态示踪脐带间充质干细胞细胞系。
4.根据权利要求3所述的多模态示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤1)包括：
1-1)脐带处理：洗净脐带，在PBS溶液中分离去除脐动脉、脐静脉以及脐带表面的外膜，再切割成组织块，然后将组织块平铺在培养皿中，加入培养基；以上操作于冰台上进行；
1-2)将培养基置于37℃下培养；
1-3)消化传代：
1-3-1)细胞培养至80％-90％融合率时，进行消化传代；
1-3-2)向含有组织块的培养皿中加入PBS缓冲液使多数组织块自然飘起，吸除旧的培养基及漂浮的组织块，并用PBS溶液清洗；
1-3-3)加入0.25％的Trypsin，于37℃恒温箱中消化1-2min；
1-3-4)吸去Trypsin，加培养基终止消化并将细胞吹打均匀；
1-3-5)将细胞悬液转移到离心管中，离心，吸去上清，留沉淀；
1-3-6)向沉淀中加入培养基使沉淀重悬，在新的培养皿中加入新鲜培养基，并将细胞悬液均匀滴入，晃匀，37℃培养箱中培养。
5.根据权利要求4所述的多模态示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括：
2-1)扩增rFTH1-T2A基因片段：以含有rFTH1-T2A基因的质粒作为模板，用如下引物对通过PCR扩增出rFTH1-T2A基因片段，并在rFTH1-T2A基因片段两端分别引入XbaI和AgeI酶切位点；
PRTE-F：
5’-CGGTGAATTCCTCGAGACTAGTTCTAGAGCCACCATGACCACCGCGTCT-3’；
PRTE-R：
5’-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATGATACCGGTAGGGCCGGGATTCTCCTCCA-3’；
2-2)以pLVX-EGFP质粒为载体，使用XbaI和BamHI酶切后备用；
2-3)同源重组连接：步骤2-1)得到的rFTH1-T2A基因片段与步骤2-2)得到的载体在同源重组酶的作用下连接，得到载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP；
2-4)在P2A-SR39RK基因片段两端分别添加5'BamHI和3'BamHI，然后克隆至步骤2-3)得到的载体pLVX-rFTH1-T2A-EGFP中，得到多模态慢病毒表达载体pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP。
6.根据权利要求5所述的多模态示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括：
3-1)将293T细胞铺到培养皿中培养；
3-2)分别配置质粒转染体系A、体系B：
体系A包括OPTI和PEI，体系B包括OPTI和混合质粒，所述混合质粒包括PMDL、REV、VSVG以及步骤2)得到的pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP；
3-3)将体系A、体系B配置好后分别静置，然后把B体系逐滴加到A体系中，吹吸数次，静置孵育得到AB混合液；
3-4)弃去293T细胞上方的培养基，然后将AB混合液沿着培养皿侧壁加入，培养；
3-5)弃去293T细胞上方的AB混合液，然后沿着侧壁加入完全培养基，培养；
3-6)收集病毒上清；
3-7)将收集的病毒上清放入离心机中，离心去沉淀，留下上清；
3-8)按照病毒上清：病毒浓缩液的体积比为3:1，向病毒上清中加入病毒浓缩液，然后混匀，孵育过夜；
3-9)将病毒上清与病毒浓缩液的混合液放入离心机中，离心弃去上清，留下病毒沉淀，然后用PBS重悬得到病毒溶液，存储备用。
7.根据权利要求6所述的多模态示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体包括：
3-1)将293T细胞铺到10厘米的培养皿中培养，至细胞融合度在75-85％时进行慢病毒包装；
3-2)分别配置质粒转染体系A、B：
体系A包括2mL OPTI和50μL PEI，体系B包括2mL OPTI和混合质粒，所述混合质粒包括6.5μg PMDL、3.5μg REV、2.5μg VSVG以及10μg步骤2)得到的pLVX-rFTH1-P2A-SR39TK-T2A-EGFP；
3-3)体系A、体系B配置好后分别静置5分钟，然后把B体系逐滴加到A体系中，吹吸数次，静置孵育10分钟得到AB混合液；
3-4)弃去293T细胞上方培养基，然后将AB混合液沿着培养皿侧壁加入，培养；
3-5)8小时后弃去293T细胞上方AB混合液，然后沿着侧壁加入完全培养基，培养；
3-6)40个小时后收集病毒上清；
3-7)将收集的病毒上清放入离心机中，4℃下，1000g离心10分钟去沉淀，留下上清；
3-8)按照病毒上清：病毒浓缩液的体积比为3:1，向病毒上清中加入病毒浓缩液，然后混匀，4℃下孵育过夜；
3-9)将病毒上清与病毒浓缩液的混合液放入离心机中，4℃下，1500g离心45分钟弃去上清，留下病毒沉淀，然后用100μL PBS重悬得到重组慢病毒溶液，-80℃下存储备用。
8.根据权利要求6或7所述的多模态示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤4)具体包括：
4-1)重组慢病毒转染：先将所述步骤1)得到的脐带间充质干细胞铺板，然后加入步骤3)得到的重组慢病毒溶液，于37℃恒温培养箱中孵育；
4-2)将重组慢病毒感染后的脐带间充质干细胞用0.25％的Trypsin培养，于37℃恒温箱中消化1-2min；
4-3)吸去Trypsin，加培养基终止消化并将细胞吹打均匀成细胞悬液；
4-4)将细胞悬液转移到离心管中，离心，弃上清，留沉淀；
4-5)向沉淀中加入培养基，用移液枪吹打使沉淀重悬；
4-6)向培养皿中添加培养基和步骤4-5)得到的细胞悬液，混匀后放入37℃恒温培养箱中培养；
4-7)于荧光显微镜下挑选出全部表达绿色荧光的细胞团，用移液枪枪头挑出至新的培养皿中进行扩增培养，最终得到多模态示踪脐带间充质干细胞细胞系。
9.根据权利要求8所述的多模态示踪脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤4)具体包括：
4-1)重组慢病毒转染：转染前18-24h将所述步骤1)得到的脐带间充质干细胞铺板，然后加入步骤3)得到的重组慢病毒溶液，于37℃恒温培养箱中孵育，转染时细胞密度控制在70％～90％；
4-2)48h后将重组慢病毒感染后的脐带间充质干细胞用2ml 0.25％的Trypsin于10cm的培养皿中培养，于37℃恒温箱中消化1-2min；
4-3)吸去Trypsin，加2ml培养基终止消化并将细胞吹打均匀成细胞悬液；
4-4)将细胞悬液转移到10ml的离心管中，1000r/min下离心5min，弃上清，留沉淀；
4-5)向沉淀中加入1ml培养基，用移液枪吹打使沉淀重悬，用细胞计数板或细胞计数器检测细胞密度，添加培养基重悬，调整细胞密度为1x104/ml；
4-6)向10cm的培养皿中添加10ml培养基和10ul步骤4-5)得到的细胞悬液，混匀后放入37℃恒温培养箱中培养8～12天；
4-7)于荧光显微镜下挑选出全部表达绿色荧光的细胞团，用移液枪枪头挑出至新的培养皿中进行扩增培养，最终得到多模态示踪脐带间充质干细胞细胞系。
10.根据权利要求1或2所述的多模态示踪脐带间充质干细胞或权利要求3-9中任意一项所述的方法制得的多模态示踪脐带间充质干细胞在制备可示试剂方面的应用。
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李晔等: "间充质干细胞活体示踪：如何实现分布和存活的同时示踪", 《CHINESE JOURNAL OF TISSUE ENGINEERING RESEARCH》, vol. 25, no. 31, 6 January 2021 (2021-01-06), pages 5029 *

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118222634A (zh) * 2024-04-16 2024-06-21 南开大学 一种可示踪诱导性多能干细胞的构建方法及其应用

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