CN107964536A - 一种实现人的诱导多能干细胞来源的造血干祖细胞强效体内移植的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种实现人的诱导多能干细胞来源的造血干祖细胞强效体内移植的方法，所述的方法通过MLL‑AF4单因子诱导。其优点表现在：本发明的方法简便、高效，能够诱导人的iPS细胞成为具有强效体内移植并重建多系造血的HSC，突破了该领域的诸多难点，并主要包括如下优点：(1)单个因子诱导，极大地减少了需要添加的因子数目，进而能显著地简化实验操作、提高实验效率；(2)采取质粒介导的诱导方法，避免了慢病毒介导时的基因组插入继而可能诱发基因突变的风险；(3)体内移植效率高达20％以上；(4)纠正了iPSC‑HSPC在体内的髓系偏倚现象，能在体内全面地重建髓系、淋系和红系。

Description

一种实现人的诱导多能干细胞来源的造血干祖细胞强效体内 移植的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种实现人的诱导多能干细胞来源的造血干祖细胞强效体内移植的方法。

背景技术

诱导多能干细胞(iPSC)技术是将已分化的体细胞重编程为多能干细胞，而多能干细胞能分化为所有器官、组织，因而是再生医学领域的一项重要变革，并于2012年获得了诺贝尔生理医学奖。造血干细胞(HSC)是唯一能够分化为全部血液细胞的成体干细胞，HSC在临床上有重要的应用和巨大的需求。然而HSC的来源却十分有限，主要包括骨髓的捐赠，但一方面，这种方法获得的HSC远远无法满足临床的需求，另一方面，骨髓配型的限制使得许多患者无法获得能够用于移植的HSC供体。自从2007年，人的iPSC能够在体外制备以来，利用iPSC在体外分化为可以重建体内造血的人的HSC成为了近10年来的研究热点，但同样是研究难点。

到目前为止，只有两篇报道成功地获得了人iPSC来源的具有体内移植能力的HSC，前者利用了五个由慢病毒介导的转录因子(ERG,HOXA9,RORA,SOX4,MYB)进行HSC分化的诱导，但是得到的HSC的移植能力低下，且在体内存在严重的髓系分化偏倚，几乎无法重建淋系造血，也无法维持到长程造血；后者则利用了七个转录因子(ERG,HOXA5,HOXA9,HOXA10,LCOR,RUNX1,SPI1)，同样由慢病毒介导，但是转染的目的细胞是经由iPSC体外分化得到的造血内皮细胞，因此该方法的效率十分低下。

目前，将人的iPSC分化为具有移植能力的HSC主要有如下瓶颈：(1)体外分化得到的造血细胞很难具有体内的重建全系造血能力；(2)iPSC来源的人的HSC在体内的造血常具有髓系分化偏倚，而淋系造血能力匮乏；(3)目前诱导人的iPSC分化为可移植的HSC的方法效率均十分低下，在受体(主要是免疫缺陷小鼠)体内几乎很难获得数量显著的人的血液细胞；(4)诱导造血分化的因子多为慢病毒载体所介导，且因子数目常多于或等于5个，使得病毒的转染量也相应增大，加大了病毒插入基因组导致基因突变的风险。

发明内容

本发明的第一个目的是，针对现有技术中的不足，提供MLL-AF4的新用途。

本发明的第二个目的是，提供一种制备造血干祖细胞的方法。

本发明的第三个目的是，提供一种人工造血干祖细胞。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：MLL-AF4基因或蛋白在制备造血干祖细胞中的应用。

MLL-AF4基因或蛋白作为唯一转录因子在制备造血干祖细胞中的应用。

包含MLL-AF4基因或其片段的质粒在制备造血干祖细胞中的应用。

包含MLL-AF4基因或其片段的质粒的构建方法为：用肽段T2A进行MLL-AF4与EGFP的连接，通过PCR克隆出MLL-AF4-EGFP的片段，然后将MLL-AF4-T2A-EGFP片段插入到pTRE-Tight质粒中的TRE启动子下游，进而构建得到。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：一种由诱导多能干细胞制备造血干祖细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)诱导多能干细胞体外诱导分化为包含了造血干祖细胞的血液细胞；

(2)步骤(1)得到的血液细胞经过包含MLL-AF4基因的质粒的体外诱导。

所述的诱导多能干细胞来自哺乳动物。

所述的诱导多能干细胞来自人。

所述的诱导多能干细胞由人外周血经动员的CD34⁺造血干祖细胞或人外周血单个核细胞进行重编程得到。

所述的诱导多能干细胞由人外周血经动员的CD34⁺造血干祖细胞或人外周血单个核细胞通过含有OCT4、SOX2、KLF4和cMYC这四个重编程因子的仙台病毒载体进行重编程得到。

步骤(1)为单层培养法在体外将诱导多能干细胞诱导分化为血液细胞。

包含MLL-AF4基因的质粒通过如下方法制得：用肽段T2A进行MLL-AF4与EGFP的连接，通过PCR克隆出MLL-AF4-EGFP的片段，然后将MLL-AF4-T2A-EGFP片段插入到pTRE-Tight质粒中的TRE启动子下游，进而构建得到。

步骤(2)为：步骤(1)得到血液细胞在培养液中培养，包含MLL-AF4基因的质粒和CAG-rtTA质粒按照3：1的比例，进行电转，转染后的细胞继续在培养液中培养，同时添加2ug/ml的多西环素，维持48～72小时，然后利用FACS流式分选，将GFP+、GFP-的细胞分选出来，分别在含有2ug/ml多西环素的培液中继续诱导培养5～7天，然后再收集细胞进行一轮和二轮克隆形成试验。

所述的培养液由以下组分组成：StemSpan SFEM、100ng/ml SCF、100ng/mlTPO、100ng/ml FLT3、20ng/ml IL-6、0.75μM SR1。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：前述方法制备得到的造血干祖细胞。

本发明优点在于：

1、本发明开发了一种简便、高效的方法，能够诱导人的iPS细胞成为具有强效体内移植并重建多系造血的HSC，突破了该领域的诸多难点，并主要包括如下优点：(1)单个因子诱导，极大地减少了需要添加的因子数目，进而能显著地简化实验操作、提高实验效率；(2)采取质粒介导的诱导方法，避免了慢病毒介导时的基因组插入继而可能诱发基因突变的风险；(3)iPSC-HSPC的体内移植效率高达20％以上，是目前已知的报道中最为强效的促进iPSC-HSPC体内移植的方法；(4)纠正了iPSC-HSPC在体内的髓系偏倚现象，能在体内全面地重建髓系、淋系和红系。

2、本方法克服了iPSC-HSPC不能良好地体内移植的障碍，因而可以在体内有效地研究iPSC-HSPC，因而能极大地提高我们研究血液系统疾病的能力。只要在体外将病人的血液细胞重编程为iPSC，再利用本发明中使用的方法，获得具有体内移植能力的iPSC-HSPC，我们就能在体内研究疾病的转归，同时克服病人原始样本不足、无法体内移植等障碍。而一旦能在体内进行疾病的研究，不仅利于更深地探究疾病的发生和转变规律，也能促使我们进一步筛选有效的药物靶标和开发新的治疗药物，从而在疾病治疗层面也获得突破。此外，本发明同样对造血干细胞的移植提供了新的思路。因此，本发明有望推动多种血液疾病的研究并开发新型的治疗方法，具有积极的社会和经济效果。

附图说明

附图1：pTRE-MLL-AF4-EGFP质粒结构图。

附图2～附图6：CD34-iPSC和MN-iPSC细胞系的构建及多能性鉴定。

附图2：利用仙台病毒介导的体细胞重编程为iPS细胞的方法步骤。

附图3：重编程得到的iPS细胞进行克隆挑选并培养5代后的形态及多能干性标志TRA1-60的表达情况。

附图4：重编程得到的iPS细胞经免疫荧光鉴定多能干性相关的标志。

附图5：重编程得到的iPS细胞的核型鉴定。

附图6：重编程得到的iPS细胞经体内畸胎瘤形成试验后，分离出畸胎瘤并检测其三个胚层的组成情况。

附图7：iPS细胞在体外诱导分化为血液细胞。A.单层诱导法的步骤；B.诱导期间细胞形态的变化；C.诱导后得到的血液细胞的体外克隆形成情况；D.诱导后得到的血液细胞，通过流式细胞术分析其与造血相关的标志物的表达情况。

附图8～附图12：iPSC体外诱导分化为血液细胞时进行MLL-AF4的诱导。

附图8：构建Doxycycline诱导调控的MLL-AF4质粒表达系统。

附图9：在iPS细胞分化得到的血液细胞内导入MLL-AF4，并在体外诱导MLL-AF4的表达以及后续的分析策略。

附图10：含有MLL-AF4的GFP+细胞以及对照细胞，在体外培养期间的细胞数变化。

附图11：含有MLL-AF4的GFP+细胞以及对照细胞，在体外的二次克隆形成试验。

附图12：iPS细胞来源的血液细胞经过体外的MLL-AF4诱导后，通过流式细胞术检测其造血相关的标志物的表达情况。

附图13～附图17：iPSC-HSPC的幼鼠移植并进行MLL-AF4的体内诱导。

附图13：体内移植和诱导MLL-AF4的策略。

附图14：经MLL-AF4体内诱导后的实验组小鼠和其他对照组小鼠，在移植后第8～12周时，骨髓中人的血液细胞的嵌合率。

附图15：经MLL-AF4体内诱导后的实验组小鼠，移植后第8～12周时，骨髓中人的血液细胞的各系分布情况。

附图16：经MLL-AF4体内诱导后的实验组小鼠，移植后第8～12周时，骨髓、脾脏和外周血中人的血液细胞的各系分布情况(E,Erythroid lineage,红系；M，Myeloidlineage,髓系；B，B细胞；T，T细胞)。

附图17：经MLL-AF4体内诱导后的实验组小鼠和其他对照组小鼠，在移植后第8～12周时，骨髓、脾脏和外周血中人的血液细胞的嵌合率(NT,Non-transfected,未转染组；LV，Lentivirus，慢病毒感染组)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明构建了TRE调控的MLL-AF4质粒，经与CAG-rtTA质粒共同转染到人的iPSC体外分化所得到的血液细胞内，经体外3天的Dox诱导后，移植到免疫缺陷幼鼠(出生第二天)体内，进一步在体内进行为期两周的Dox诱导，并在此后检测小鼠体内的人的血液细胞的造血重建情况。

Doc，Doxycycline，多西环素

TPO，血小板生成素

TRE，Tetracycline element四环素反应元件

GFP，绿色荧光蛋白

SCF，干细胞因子

HSPC，造血干祖细胞

PB，外周血

BM，骨髓

MN，单个核细胞

PBMNC，外周血单个核细胞

SFEM，无血清液体培养基

MLL-AF4的序列如SEQ ID NO:1所示，T2A的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明所涉及到的主要实验方法、材料和结果如下：

实施例1：MLL-AF4质粒构建

首先利用肽段T2A进行MLL-AF4与EGFP的连接，通过PCR克隆出MLL-AF4-EGFP的片段。3’-MLL-AF4-5’-T2A片段的PCR扩增模板是pCI-MLL-AF4质粒，扩增的引物为：MLL-AF4-Klf 1-F(5’-CGTAGGGTCCCAGTCAAGTGCT-3’,SEQ ID NO:3)以及MLL-AF4-3’-T2A5’-R(5’-GCAGGGATCCTCTGCCCTCAGGTGTTTTGGTTAATTCTTGT-3’,SEQ ID NO:4)。

3’-T2A-5-EGFP片段的PCR扩增模板是pEGFP-N3质粒，扩增的引物为T2A-3’-EGFP-5’-F

(5’-CAGAGGATCCCTGCTAACATGTGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC-3’,SEQ ID NO:5)和EGFP-3’-R(5’-GAGATATCGGCCGCTTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’,SEQ ID NO:6)。然后，将上述MLL-AF4-T2A-EGFP片段插入到pTRE-Tight质粒中的TRE启动子下游，进而构建得到pTRE-tight-MLL-AF4-EGFP质粒(图1)。

实施例2：人的iPSC细胞系的构建

我们选取了两种不同来源的体细胞进行iPSC的重编程，分别是：人外周血经动员的CD34⁺造血干祖细胞，以及人外周血单个核细胞(MNCs)。含有OCT4,SOX2,KLF4和cMYC这四个重编程因子的仙台病毒载体(DNAVEC,CytoTune-iPS Reprogramming Kit)按照20Multiplicity ofInfection(MOI)的滴度感染2×10⁵的体细胞。第2天，将培液更换以去除仙台病毒。第3天，被感染的细胞全部转移到用Vitronectin XF^TM(StemCellTechnologies)进行了处理的六孔板内。第4天至第8天，每天都在每个孔内加入1mlReproTeSR(StemCell Technologies)以及0.25μM丁酸钠。第9天至22天，每天更换新鲜的ReproTeSR，同时在显微镜下观测iPSC克隆的形成。第23天至31天，培液更换为TeSR-E8(StemCell Technologies),当iPSC克隆形成并包含有100个细胞以上时，进行TRA1-60的活细胞染色，并将TRA1-60阳性的克隆挑选至新的六孔板上以进行后续的传代和扩增。

用上述方法，我们成功地获得了由人外周血经动员的CD34⁺造血干祖细胞来源的iPSC(CD34-iPSC)以及由人外周血单个核细胞来源的iPSC(MN-iPSC)。我们通过核型分析、免疫荧光分析、畸胎瘤形成等多种实验手段，检测了iPSC的多能性(图2～6)，并因此确定建系成功。

实施例3：iPSC体外诱导分化为血液细胞

我们采用了单层培养法(Mono-layer culture)在体外将iPSC诱导分化为血液细胞。具体来说，24孔培养板预先经Vitronectin XF^TM(StemCellTechnologies)处理，随后将iPS细胞按照5×10⁴每孔的量铺入孔板内，并用TeSR-E8培液进行培养。次日(定义为第1天)，培液更换为STEMdiffAPEL(StemCell Technologies)，并以此培液作为后续的全程培养基，同时，添加BMP4(50ng/ml)到STEMDiffAPEL内。第3天，更换为新鲜的培液，同时添加VEGF(50ng/ml)和bFGF(50ng/ml)至培液内。第5天，更换为新鲜的培液，同时添加VEGF(50ng/ml)、bFGF(50ng/ml)和SB431542(20μM)至培液内。从第7天起，培液每两天更新一半，保留一半，同时添加如下细胞因子：SCF(50ng/ml)、IL3(50ng/ml)和TPO(50ng/ml)，如若观测到大量的悬浮细胞，在更换培液时，将收集的培液(包含悬浮的细胞)进行1000r.p.m,10分钟的离心，弃上清，并将细胞沉淀放回至原培养孔内继续培养。

在此过程中，全程进行显微镜拍照观测细胞形态的转变，并将第12天～14天收集到的悬浮血液细胞进行收集，进行血液细胞相关标志物(干细胞标志：CD34；祖细胞标志：CD43；髓系标志：CD33；淋系标志：CD10)的流式检测和克隆形成试验(图7)，进一步确定了该种单层培养法能够在体外诱导iPSC为血液细胞。

实施例4：MLL-AF4的体外诱导

将上述经iPSC诱导分化得到的包含了造血干祖细胞的血液细胞(以下简称为iPSC-HSPC)在诱导的第12天进行收集，并在以下培液中进行培养：StemSpan SFEM(StemCell Technologies),SCF(100ng/ml),TPO(100ng/ml),FLT3(100ng/ml),IL-6(20ng/ml),和SR1(0.75μM,StemCell Technologies).pTRE-tight-MLL-AF4-EGFP质粒和CAG-rtTA质粒按照3：1的比例，用Nucleofector II(Lonza)进行电转。一般来说，5×10⁵iPSC-HSPC的质粒转染量为5μg,其中pTRE-tight-MLL-AF4-EGFP质粒3.75μg,CAG-rtTA质粒1.25μg。转染后的细胞继续在培液中培养，同时添加doxycycline(2ug/ml),维持48～72小时。然后，利用FACS流式分选，将GFP+、GFP-的细胞分选出来，分别在含有doxycycline(2ug/ml)的培液中继续诱导培养5～7天，然后再收集细胞进行一轮和二轮克隆形成试验，以及通过流式细胞术检测细胞表面标志的表达情况(干细胞标志：CD34；祖细胞标志：CD43；髓系标志：CD33；淋系标志：CD10)。

通过上述实验，我们观察到经MLL-AF4体外诱导的iPSC-HSPC，其髓系偏倚情况得到一定程度的纠正，从MLL-AF4诱导前的无CD10的表达，变为CD10+的细胞群体占到10％左右，同时，CD34⁺和CD43⁺的干、祖细胞群体比例也显著增加(图8～12)。另一方面，经MLL-AF4诱导过的iPSC-HSPC的自我更新能力也显著提高，克隆形成试验显示GFP⁺(含MLL-AF4)的iPSC-HSPC较GFP^-的(不含MLL-AF4)的对照组能够形成更多的二次克隆(图8～12)。

实施例5：MLL-AF4的体内诱导

更进一步，我们将MLL-AF4诱导的iPSC-HSPC移植到免疫缺陷NSG小鼠的幼鼠中。出生2天的NSG幼鼠预先经过150rad的辐照处理，5个小时后，将20μl经PBS重悬的3×10⁵细胞数的iPSC-HSPC(MLL-AF4已在体外诱导48～72小时)注入到NSG幼鼠的头部浅静脉。我们同步比较了前人报道的5个转录因子(ERG,HOXA9,RORA,SOX4,MYB)在iPSC-HSPC细胞内，经体外诱导后，按照上述同样的方法移植到NSG幼鼠内，以作为对照组别。接受移植的幼鼠随即放入原来的笼内，接受母鼠的哺乳，并在母鼠的饮用水内添加Doxycycline(2mg/ml),隔日更换，维持两周的Doxycycline的添加。这样，能使Doxycycline通过母鼠的乳汁喂养进入被移植的幼鼠体内，进而诱导MLL-AF4或5个转录因子(ERG,HOXA9,RORA,SOX4,MYB，以下简称EARSM)的表达。自移植后6周起，采集移植幼鼠的外周血、脾脏细胞和骨髓细胞进行流式细胞术分析，以检测人的造血细胞在小鼠体内的重建情况。

实验结果表明，单转MLL-AF4的组别，能够获得强效的体内移植，骨髓内的嵌合率在20％以上，而EARSM组别的体内移植率较低下，骨髓内的嵌合率在1％以下(图13～17)。此外，我们进一步检测到，单转MLL-AF4的小鼠，移植物能重建全系造血，即人的髓系、淋系及红系均有造血重建，因而髓系偏倚现象得到了纠正(图13～17)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院

<120> 一种实现人的诱导多能干细胞来源的造血干祖细胞强效体内移植的方法

<130> /

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6951

<212> DNA

<213> 智人（Homo Sapiens）

<400> 1

ggcaattccg cgaacatggc gcacagctgt cggtggcgct tccccgcccg acccgggacc 60

accgggggcg gcggcggcgg ggggcgccgg ggcctagggg gcgccccgcg gcaacgcgtc 120

ccggccctgc tgcttccccc cgggcccccg gtcggcggtg gcggccccgg ggcgcccccc 180

tcccccccgg ctgtggcggc cgcggcggcg gcggcgggaa gcagcggggc tggggttcca 240

gggggagcgg ccgccgcctc agcagcctcc tcgtcgtccg cctcgtcttc gtcttcgtca 300

tcgtcctcag cctcttcagg gccggccctg ctccgggtgg gcccgggctt cgacgcggcg 360

ctgcaggtct cggccgccat cggcaccaac ctgcgccggt tccgggccgt gtttggggag 420

agcggcgggg gaggcggcag cggagaggat gagcaattct taggttttgg ctcagatgaa 480

gaagtcagag tgcgaagtcc cacaaggtct ccttcagtta aaactagtcc tcgaaaacct 540

cgtgggagac ctagaagtgg ctctgaccga aattcagcta tcctctcaga tccatctgtg 600

ttttcccctc taaataaatc agagaccaaa tctggagata agatcaagaa gaaagattct 660

aaaagtatag aaaagaagag aggaagacct cccaccttcc ctggagtaaa aatcaaaata 720

acacatggaa aggacatttc agagttacca aagggaaaca aagaagatag cctgaaaaaa 780

attaaaagga caccttctgc tacgtttcag caagccacaa agattaaaaa attaagagca 840

ggtaaactct ctcctctcaa gtctaagttt aagacaggga agcttcaaat aggaaggaag 900

ggggtacaaa ttgtacgacg gagaggaagg cctccatcaa cagaaaggat aaagacccct 960

tcgggtctcc tcattaattc tgaactggaa aagccccaga aagtccggaa agacaaggaa 1020

ggaacacctc cacttacaaa agaagataag acagttgtca gacaaagccc tcgaaggatt 1080

aagccagtta ggattattcc ttcttcaaaa aggacagatg caaccattgc taagcaactc 1140

ttacagaggg caaaaaaggg ggctcaaaag aaaattgaaa aagaagcagc tcagctgcag 1200

ggaagaaagg tgaagacaca ggtcaaaaat attcgacagt tcatcatgcc tgttgtcagt 1260

gctatctcct cgcggatcat taagacccct cggcggttta tagaggatga ggattatgac 1320

cctccaatta aaattgcccg attagagtct acaccgaata gtagattcag tgccccgtcc 1380

tgtggatctt ctgaaaaatc aagtgcagct tctcagcact cctctcaaat gtcttcagac 1440

tcctctcgat ctagtagccc cagtgttgat acctccacag actctcaggc ttctgaggag 1500

attcaggtac ttcctgagga gcggagcgat acccctgaag ttcatcctcc actgcccatt 1560

tcccagtccc cagaaaatga gagtaatgat aggagaagca gaaggtattc agtgtcggag 1620

agaagttttg gatctagaac gacgaaaaaa ttatcaactc tacaaagtgc cccccagcag 1680

cagacctcct cgtctccacc tccacctctg ctgactccac cgccaccact gcagccagcc 1740

tccagtatct ctgaccacac accttggctt atgcctccaa caatcccctt agcatcacca 1800

tttttgcctg cttccactgc tcctatgcaa gggaagcgaa aatctatttt gcgagaaccg 1860

acatttaggt ggacttcttt aaagcattct aggtcagagc cacaatactt ttcctcagca 1920

aagtatgcca aagaaggtct tattcgcaaa ccaatatttg ataatttccg accccctcca 1980

ctaactcccg aggacgttgg ctttgcatct ggtttttctg catctggtac cgctgcttca 2040

gcccgattgt tttcgccact ccattctgga acaaggtttg atatgcacaa aaggagccct 2100

cttctgagag ctccaagatt tactccaagt gaggctcact ctagaatatt tgagtctgta 2160

accttgccta gtaatcgaac ttctgctgga acatcttctt caggagtatc caatagaaaa 2220

aggaaaagaa aagtgtttag tcctattcga tctgaaccaa gatctccttc tcactccatg 2280

aggacaagaa gtggaaggct tagtagttct gagctctcac ctctcacccc cccgtcttct 2340

gtctcttcct cgttaagcat ttctgttagt cctcttgcca ctagtgcctt aaacccaact 2400

tttacttttc cttctcattc cctgactcag tctggggaat ctgcagagaa aaatcagaga 2460

ccaaggaagc agactagtgc tccggcagag ccattttcat caagtagtcc tactcctctc 2520

ttcccttggt ttaccccagg ctctcagact gaaagaggga gaaataaaga caaggccccc 2580

gaggagctgt ccaaagatcg agatgctgac aagagcgtgg agaaggacaa gagtagagag 2640

agagaccggg agagagaaaa ggagaataag cgggagtcaa ggaaagagaa aaggaaaaag 2700

ggatcagaaa ttcagagtag ttctgctttg tatcctgtgg gtagggtttc caaagagaag 2760

gttgttggtg aagatgttgc cacttcatct tctgccaaaa aagcaacagg gcggaagaag 2820

tcttcatcac atgattctgg gactgatatt acttctgtga ctcttgggga tacaacagct 2880

gtcaaaacca aaatacttat aaagaaaggg agaggaaatc tggaaaaaac caacttggac 2940

ctcggcccaa ctgccccatc cctggagaag gagaaaaccc tctgcctttc cactccttca 3000

tctagcactg ttaaacattc cacttcctcc ataggctcca tgttggctca ggcagacaag 3060

cttccaatga ctgacaagag ggttgccagc ctcctaaaaa aggccaaagc tcagctctgc 3120

aagattgaga agagtaagag tcttaaacaa accgaccagc ccaaagcaca gggtcaagaa 3180

agtgactcat cagagacctc tgtgcgagga ccccggatta aacatgtctg cagaagagca 3240

gctgttgccc ttggccgaaa acgagctgtg tttcctgatg acatgcccac cctgagtgcc 3300

ttaccatggg aagaacgaga aaagattttg tcttccatgg ggaatgatga caagtcatca 3360

attgctggct cagaagatgc tgaacctctt gctccaccca tcaaaccaat taaacctgtc 3420

actagaaaca aggcacccca ggaacctcca gtaaagaaag gacgtcgatc gaggcggtgt 3480

gggcagtgtc ccggctgcca ggtgcctgag gactgtggtg tttgtactaa ttgcttagat 3540

aagcccaagt ttggtggtcg caatataaag aagcagtgct gcaagatgag aaaatgtcag 3600

aatctacaat ggatgccttc caaagcctac ctgcagaagc aagctaaagc tgtgaaaaag 3660

aaagagaaaa agtctaagac cagtgaaaag aaagacagca aagagagcag tgttgtgaag 3720

aacgtggtgg actctagtca gaaacctacc ccatcagcaa gagaggatcc tgccccaaag 3780

aaaagcagta gtgagcctcc tccacgaaag cccgtcgagg aaaagagtga agaagggaat 3840

gtctcggccc ctgggcctga atccaaacag gccaccactc cagcttccag gaagtcaagc 3900

aagcaggtct cccagccagc actggtcatc ccgcctcagc cacctactac aggaccgcca 3960

agaaaagaag ttcccaaaac cactcctagt gagcccaaga aaaagcagcc tccaccacca 4020

gaatcaggtc cagagcagag caaacagaaa aaagtggctc cccgcccaag tatccctgta 4080

aaacaaaaac caaaagaaaa ggaaaaacca cctccggtca ataagcagga gaatgcaggc 4140

actttgaaca tcctcagcac tctctccaat ggcaatagtt ctaagcaaaa aattccagca 4200

gatggagtcc acaggatcag agtggacttt aaggaggatt gtgaagcaga aaatgtgtgg 4260

gagatgggag gcttaggaat cttgacttct gttcctataa cacccagggt ggtttgcttt 4320

ctctgtgcca gtagtgggca tgtagagttt ctagagcaga cctactccaa tgaagtccat 4380

tgtgttgaag agattctgaa ggaaatgacc cattcatggc cgcctccttt gacagcaata 4440

catacgccta gtacagctga gccatccaag tttcctttcc ctacaaagga ctctcagcat 4500

gtcagttctg taacccaaaa ccaaaaacaa tatgatacat cttcaaaaac tcactcaaat 4560

tctcagcaag gaacgtcatc catgctcgaa gacgaccttc agctcagtga cagtgaggac 4620

agtgacagtg aacaaacccc agagaagcct ccctcctcat ctgcacctcc aagtgctcca 4680

cagtcccttc cagaaccagt ggcatcagca cattccagca gtgcagagtc agaaagcacc 4740

agtgactcag acagttcctc agactcagag agcgagagca gttcaagtga cagcgaagaa 4800

aatgagcccc tagaaacccc agctccggag cctgagcctc caacaacaaa caaatggcag 4860

ctggacaact ggctgaccaa agtcagccag ccagctgcgc caccagaggg ccccaggagc 4920

acagagcccc cacggcggca cccagagagt aagggcagca gcgacagtgc cacgagtcag 4980

gagcattctg aatccaaaga tcctccccct aaaagctcca gcaaagcccc ccgggcccca 5040

cccgaagccc cccaccccgg aaagaggagc tgtcagaagt ctccggcaca gcaggagccc 5100

ccacaaaggc aaaccgttgg aaccaaacaa cccaaaaaac ctgtcaaggc ctctgcccgg 5160

gcaggttcac ggaccagcct gcagggggaa agggagccag ggcttcttcc ctatggctcc 5220

cgagaccaga cttccaaaga caagcccaag gtgaagacga aaggacggcc ccgggccgca 5280

gcaagcaacg aacccaagcc agcagtgccc ccctccagtg agaagaagaa gcacaagagc 5340

tccctccctg ccccctctaa ggctctctca ggcccagaac ccgcgaagga caatgtggag 5400

gacaggaccc ctgagcactt tgctcttgtt cccctgactg agagccaggg cccaccccac 5460

agtggcagcg gcagcaggac tagtggctgc cgccaagccg tggtggtcca ggaggacagc 5520

cgcaaagaca gactcccatt gcctttgaga gacaccaagc tgctctcacc gctcagggac 5580

actcctcccc cacaaagctt gatggtgaag atcaccctag acctgctctc tcggataccc 5640

cagcctcccg ggaaggggag ccgccagagg aaagcagaag ataaacagcc gcccgcaggg 5700

aagaagcaca gctctgagaa gaggagctca gacagctcaa gcaagttggc caaaaagaga 5760

aagggtgaag cagaaagaga ctgtgataac aagaaaatca gactggagaa ggaaatcaaa 5820

tcacagtcat cttcatcttc atcctcccac aaagaatctt ctaaaacaaa gccctccagg 5880

ccctcctcac agtcctcaaa gaaggaaatg ctccccccgc cacccgtgtc ctcgtcctcc 5940

cagaagccag ccaagcctgc acttaagagg tcaaggcggg aagcagacac ctgtggccag 6000

gaccctccca aaagtgccag cagtaccaag agcaaccaca aagactcttc cattcccaag 6060

cagagaagag tagaggggaa gggctccaga agctcctcgg agcacaaggg ttcttccgga 6120

gatactgcaa atccttttcc agtgccttct ttgccaaatg gtaactctaa accagggaag 6180

cctcaagtga agtttgacaa acaacaagca gaccttcaca tgagggaggc aaaaaagatg 6240

aagcagaaag cagagttaat gacggacagg gttggaaagg cttttaagta cctggaagcc 6300

gtcttgtcct tcattgagtg cggaattgcc acagagtctg aaagccagtc atccaagtca 6360

gcttactctg tctactcaga aactgtagat ctcattaaat tcataatgtc attaaaatcc 6420

ttctcagatg ccacagcgcc aacacaagag aaaatatttg ctgttttatg catgcgttgc 6480

cagtccattt tgaacatggc gatgtttcgt tgtaaaaaag acatagcaat aaagtattct 6540

cgtactctta ataaacactt cgagagttct tccaaagtcg cccaggcacc ttctccatgc 6600

attgcaagca caggcacacc atcccctctt tccccaatgc cttctcctgc cagctccgta 6660

gggtcccagt caagtgctgg cagtgtgggg agcagtgggg tggctgccac tatcagcacc 6720

ccagtcacca tccagaatat gacatcttcc tatgtcacca tcacatccca tgttcttacc 6780

gcctttgacc tttgggaaca ggccgaggcc ctcacgagga agaataaaga attctttgct 6840

cggctcagca caaatgtgtg caccttggcc ctcaacagca gtttggtgga cctggtgcac 6900

tatacacgac agggttttca gcagctacaa gaattaacca aaacacctta a 6951

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggcagagga tccctgctaa catgtggtga cgtcgaggag aatcctggcc ca 52

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgtagggtcc cagtcaagtg ct 22

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcagggatcc tctgccctca ggtgttttgg ttaattcttg t 41

<210> 5

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cagaggatcc ctgctaacat gtggtgacgt cgaggagaat cctggcccaa tggtgagcaa 60

gggcgaggag ctgttc 76

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagatatcgg ccgctttact tgtacagctc gtcc 34

Claims (10)

1.MLL-AF4基因或蛋白在制备造血干祖细胞中的应用。

2.MLL-AF4基因或蛋白作为唯一转录因子在制备造血干祖细胞中的应用。

3.包含MLL-AF4基因或其片段的质粒在制备造血干祖细胞中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包含MLL-AF4基因或其片段的质粒的构建方法为：用肽段T2A进行MLL-AF4与EGFP的连接，通过PCR克隆出MLL-AF4-EGFP的片段，然后将MLL-AF4-T2A-EGFP片段插入到pTRE-Tight质粒中的TRE启动子下游，进而构建得到。

5.一种由诱导多能干细胞制备造血干祖细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

(1)诱导多能干细胞体外诱导分化为包含了造血干祖细胞的血液细胞；

(2)步骤(1)得到的血液细胞经过包含MLL-AF4基因的质粒的体外诱导。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)为单层培养法在体外将诱导多能干细胞诱导分化为血液细胞。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包含MLL-AF4基因的质粒通过如下方法制得：用肽段T2A进行MLL-AF4与EGFP的连接，通过PCR克隆出MLL-AF4-EGFP的片段，然后将MLL-AF4-T2A-EGFP片段插入到pTRE-Tight质粒中的TRE启动子下游，进而构建得到。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)为：步骤(1)得到血液细胞在培养液中培养，包含MLL-AF4基因的质粒和CAG-rtTA质粒按照3：1的比例，进行电转，转染后的细胞继续在培养液中培养，同时添加2ug/ml的多西环素，维持48～72小时，然后利用FACS流式分选，将GFP+、GFP-的细胞分选出来，分别在含有2ug/ml多西环素的培液中继续诱导培养5～7天，然后再收集细胞进行一轮和二轮克隆形成试验。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的培养液由以下组分组成：StemSpanSFEM、100ng/ml SCF、100ng/ml TPO、100ng/ml FLT3、20ng/ml IL-6、0.75μM SR1。

10.根据权利要求5～9任一所述的方法制备的造血干祖细胞。