CN104673831A - 一种维持和恢复人毛乳头细胞原始性的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了JAM-A的3'UTR的新用途，本发明成功构建JAM-A的3'UTR的表达质粒，将该质粒转染人毛乳头细胞(DPC)，获得JAM-A3'UTR^oeDPC。JAM-A3'UTR^oe DPC较DPC，可在体外较长时间维持毛乳头的原始性，更多代数的其凝聚样生长，更高水平的表达DPC的特异性标记分子如versican和ALPL。将各组细胞移植到3周龄裸鼠皮肤组织，发现该质粒转染后的DPC，可显著地促进裸鼠毛发的生长并且使得新生毛发较对照组增粗。本发明为人毛乳头细胞体外培养、维持以及恢复DPC细胞的原始性提供了新的思路和方式。本发明也为DPC移植诱导毛发再生提高了新的思路和方法。

Description

一种维持和恢复人毛乳头细胞原始性的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及—种维持和恢复人毛乳头细胞原始性的方法及其应用。

背景技术

毛发有重要的生理和社会功能，但现在随生活压力增大节奏加快，脱发的问题越来越严重。在毛发的再生和周期性更替过程中，毛乳头细胞(dermal papilla cell，DPC)起到非常重要的作用(参见文献:Enshell-Seijffers D,Lindon C,Kashiwagi M,Morgan BA.beta-catenin activity in the dermal papilla regulates morphogenesis and regeneration of hair.Dev Cell.2010Apr 20；18(4):633-42)。DPC是一群比较特殊的中胚层来源的间质样细胞，可发出信号启动毛囊发育和毛发的周期性更替。其中，毛发的周期性更替即毛囊周期是毛囊在成体哺乳动物中经历一系列的周期活动，可分为生长期、退行期和停滞期。毛囊周期紊乱会引起脱发。男女脱发都表现为进行性毛囊微型化，导致毛发生长周期缩短。由于生长期缩短，毛发变稀疏、变短到根本不生长的程度。由于大部分脱发是逐渐发展的，所以治疗开始得越早疗效越好。

体外培养条件下，代数较低的比较原始的DPC呈聚集状生长，表达蛋白聚糖Versican、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALPL)和a-平滑肌肌动蛋白(a-Smooth muscle actin，a-SMA)等DPC特有的标记分子。其中，Versican，也可以作为毛乳头细胞毛发诱导能力的评价指标，有报道在雄激素源性脱发患者缩小的毛囊内，毛乳头表达的versican的水平下降(参见文献:Iida M,Ihara S,Matsuzaki T.Hair cycle-dependent changes of alkalinephosphatase activity in the mesenchyme and epithelium in mouse vibrissal follicles.Dev Growth Differ.2007Apr；49(3):185-95)。随传代次数增加，versican，ALPL和a-SMA的表达降低，DPC的原始性和诱导毛发发育及再生的能力或逐渐丢失。

DPC的原始性的维持需要多种因素的参与，这一过程受多种因素影响，有些因素可以减缓甚至扭转这一进程，使细胞的多能性增强。

链接粘附分子JAM-A(GENBANK No:NM_016946)是一个跨膜分子，属于免疫球蛋白超家族，也称之为JAM-1。本申请人前期实验发现，JAM-A修饰后的干细胞可促进裸鼠毛发再生(参见文献:Wu M,Guo X,Yang L,Wang Y,Tang Y,Yang Y,Liu H.Mesenchymal stem cells with modification of junctional adhesion molecule a induce hair formation.Stem Cells Transl Med.2014Apr；3(4):481-8.)。本申请人也就JAM-A相关研究成果申请了中国专利，专利申请号为CN201210532533.5，公开号为CN103031278A，发明名称为“JAM1基因修饰间充质干细胞的方法及其应用”。

随着研究的深入，长链非编码基因(long noncoding RNA,lncRNA)在发育及干细胞原始性和多能性维持中的作用越来越受到大家重视(参见文献:Wang Y,Xu Z,Jiang J,Xu C,Kang J,Xiao L,Wu M,Liu H.Endogenous miRNA sponge lincRNA-RoR regulates Oct4,Nanog,and Sox2in human embryonic stem cell self-renewal.Dev Cell.2013Apr15；25(1):69-80.)。

这里，本发明人前期工作，经生物信息学软件预测发现JAM-A的3’UTR和versican的3’UTR均存在与在斑秃患者中高表达的microRNA结合的位点，versican的表达可维持DPC的凝聚样生长以及多能性(参见文献：Kishimoto J,Ehama R,Wu L,Jiang S,Jiang N,Burgeson RE.Selective activation of the versican promoter by epithelial-mesenchymal interactions during hair follicle development.Proc Natl Acad Sci U S A.1999Jun22；96(13):7336-41.)。

本发明人进一步设想JAM-A的3'UTR能否维持和促进DPC的原始性及多能性呢？

目前尚无文献报道有关JAM-A的3'UTR修饰毛乳头细胞，以维持和增强其原始性的研究及应用。

发明内容

本发明的目的在于提供JAM-A3'UTR的新用途，本发明的另一目的在于提供一种维持和恢复人毛乳头细胞原始性的方法，本发明的第三目的在于提供JAM-A3'UTR或者利用JAM-A3'UTR来维持和恢复人毛乳头细胞原 始性的方法在毛发再生及制备皮肤移植物中的应用。

本发明的第一方面，提供了链接粘附分子JAM-A基因的3'UTR端(JAM-A3'UTR)的新用途。 

本发明提供了JAM-A3'UTR在体外培养条件下维持和/或恢复人毛乳头细胞原始性中的应用，也即JAM-A的3'UTR在制备人毛乳头细胞体外培养试剂中的应用。

所述的JAM-A3'UTR，即链接粘附分子JAM-A基因的3'UTR端，其具体序列如SEQ ID NO:3所示。

所述的试剂，用于维持和/或恢复人毛乳头细胞的原始性。

本发明所述的维持和/或恢复人毛乳头细胞的原始性，是指人毛乳头细胞在体外培养条件下，随着传代次数增加，versican，ALPL和a-SMA的表达不会降低，即人毛乳头细胞诱导毛发发育及再生的能力不会逐渐丢失。

本发明所述的人毛乳头细胞，可以来源于妙通(上海)生物科技有限公司，也可以通过机械法结合酶消化法的方式获得原代细胞或传代细胞。

本发明的第二方面，提供了一种在体外培养条件下维持和/或恢复人毛乳头细胞原始性的方法，该方法包括以下步骤：

A、构建JAM-A3'UTR的重组质粒； 

B、将步骤A获得的重组质粒去转染人毛乳头细胞，获得JAM-A 3'UTR高表达的人毛乳头细胞。

所述的重组质粒，为pcDNA3.1-JAM-A3'UTR。

所述的步骤A，具体为：首先是根据JAM-A 3'UTR的基因结构，设计引物，以人表皮细胞总DNA为模板，通过RT-PCR调取目的片段，再构建重组人pcDNA3.1-JAM-A3'UTR真核表达载体。

本发明所述的重组人pcDNA3.1-JAM-A3'UTR真核表达载体，转染人毛乳头细胞，用表达的外源性JAM-A的3'UTR启动信号转导，获得JAM-A的3'UTR高表达的毛乳头细胞，称之为JAM-A3'UTR^oe-DPC。

在本发明的一个优选实施例中，一种在体外培养条件下维持和/或恢复人毛乳头细胞原始性的方法，该方法为：

A、构建pcDNA3.1-JAM-A3'UTR真核表达载体；

B、将步骤A获得的真核表达载体去转染人毛乳头细胞，获得JAM-A3'UTR高表达的人毛乳头细胞。

所述的步骤A具体如下： 

A、构建pcDNA3.1-JAM-A3'UTR真核表达载体

设计并合成引物如下：

P1：CCGCTCGAG GCCTGGTCGGCTCACCGCCTATC(SEQ ID NO:1)

P2：ATAAGAATGCGGCCGCTAAAGAATTGGATATTTTTTAATGCAAATTG(SEQ ID NO:2)；

以人表皮细胞总DNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAM-A 3'UTR(SEQ ID NO:3)。

其中的真核表达载体的构建方法为常规方法，可参见工具书(著[美]J.莎姆布鲁克，黄培堂译，《分子克隆实验指南》，科学出版社)。

较佳地，首先从人表皮细胞中提取总DNA，然后通过PCR反应调取目的片段，再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的pcDNA3.1载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的pcDNA3.1-JAM-A3'UTR表达载体。将脂质体和pcDNA3.1-JAM-A3'UTR表达载体按3:1的比例混合，转染到60-70％融合的DPC中。24小时后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基并通过G418筛选阳性克隆。

pcDNA-3.1转染组为对照组(CON-DPC)。

所述的步骤B具体如下： 

B、将pcDNA3.1-JAM-A3'UTR真核表达载体转染人毛乳头细胞，筛选阳性克隆，获得JAM-A 3'UTRoe DPC。

所述的转染步骤如下：

按脂质体(微升)：质粒(微克)＝3:1的比例对生长至60％融合的细胞进行转染，24小时后更换新的培养基并用G418筛选阳性克隆。分别标记为JAM-A 3'UTR^oe DPC和JAM-A^oe DPC，将对照用载体转染的毛乳头细胞称之为CON-DPC。)

在本发明一个优选实施例中，转染步骤具体为：

取97ulDMEM到1ml OD管中，加入3ul fugen-6到DMEM中，用加样枪混匀或拿手指轻轻弹动，之后室温放置5分钟。同时去1微克质粒加入到总体积100微升的DMEM中，轻轻混匀，静置5分钟。5分钟后，将两种液体用枪混匀，室温放置30分钟。30分钟后用100ul枪吸出反应液，均 匀的滴入12孔板中，轻轻拍打，放入培养箱。培养过夜后，第二天早上换正常培养基，继续培养并用G418筛选阳性克隆。分别标记为JAM-A3'UTR^OE DPC和JAM-A^OE DPC，将对照用载体转染的毛乳头细胞称之为CON-DPC。

本发明还提供了上述方法获得的JAM-A 3'UTR^oe-DPC，即JAM-A3'UTR高表达的人毛乳头细胞。

继续培养，观察JAM-A 3'UTR^oeDPC的生长状态，以及是否维持凝聚样生长，并记录其凝聚样生长可维持的代数。实验重复三次，均可发现JAM-A 3'UTR^oeDPC传代至9代仍可维持毛乳头细胞的典型的生长特点即凝聚样生长，并且同对照相比有较高的versican和ALPL的表达。本发明用免疫组化法测量各组细胞的原始性指标(ALPL和versican)；本发明通过裸鼠皮下注射法测量各组细胞促毛发再生的能力。

本发明的第三方面，提供JAM-A3'UTR、含有JAM-A3'UTR的重组载体在毛发再生或制备皮肤移植物中的应用。

较佳地，所述的含有JAM-A3'UTR的重组载体为重组人pcDNA3.1-JAM-A3'UTR真核表达载体。

进一步地，本发明还提供了根据上述的在体外培养条件下维持和/或恢复人毛乳头细胞原始性的方法获得的JAM-A 3'UTR^oe-DPC在毛发再生或制备皮肤移植物中的应用。

所述的应用，也指制备促毛发再生或毛发增粗材料或在制备皮肤移植。

本发明通过体外实验研究发现，转染后细胞形态无明显变化，均是成纤维状，凝聚样生长(见图1)。实时PCR结果表明JAM-A3'UTR表达量增加(见图2)。免疫组化鉴定发现，JAM-A 3'UTR^oe DPC较CON-DPC,versican和ALPL的表达量增加，细胞聚集样生长的代数增加(见图3)。以10⁴的细胞量接种于出生后21天的裸鼠背部皮肤下，14天后可JAM-A 3'UTR^oeDPC移植组有较多的毛发出现(见图4)，局部取材H.E染色可见JAM-A3'UTR^oe DPC移植组毛囊及毛乳头直径较对照组显著增粗(见图5)。

本发明为人毛乳头细胞体外培养、维持以及恢复DPC细胞的原始性提供了新的思路和方式。本发明也为DPC移植诱导毛发再生提高了新的思路和方法。

附图说明

图1为分离培养的人毛乳头细胞；其中A为JAM-A 3'UTR高表达的第5代DPC，B为空载体转染的第5代DPC，C为JAM-A 3'UTR高表达的第7代DPC，D为空载体转染的第7代DP，E为JAM-A 3'UTR高表达的第9代DPC，F为空载体转染的第9代DPCC，G为JAM-A 3'UTR高表达的第11代DPC，H为空载体转染的第11代。可见JAM-A 3'UTR ^oe DPC凝聚样生长的时间延长。

图2为实时PCR的检测结果，表明在第5代DPC中，JAM-A3'UTR表达量增加在JAM-A 3’UTR^oe DPC中较CON-DPC显著增加。

图3为免疫组化的鉴定结果。A为第5代JAM-A 3'UTR ^oe DPC中versican的组化结果，B为第5代CON-DPC中versican的组化结果，可见，JAM-A3'UTR过表达后，versican的表达量也增加。C为第5代JAM-A3'UTR^oe DPC中ALPL的组化结果，D为第5代CON-DPC中ALPL的组化结果，可见，JAM-A3'UTR过表达后，ALPL的表达量也增加.

图4为JAM-A 3'UTR ^oe DPC及CON-DPC移植后毛发再生情况；其中A为JAM-A 3'UTR^oe DPC移植组，B为CON-DPC移植组，C为同体积PBS移植组。可见A组移植处有较多的毛发生成。

图5为JAM-A 3'UTR^oe DPC及CON-DPC移植处皮肤显微结构的改变。A为JAM-A 3'UTR^oe DPC移植组，B为CON-DPC移植组，C为同体积PBS。可见A组移植皮肤显微结构中可见非常典型的毛囊样结构，毛乳头大而明显。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：构建真核表达载体pcDNA3.1-JAM-A3'UTR，感染人毛乳头细 胞(DPC)。

1、毛乳头细胞分离培养

成人体皮来自长海医院整形外科。原代培养得到毛乳头细胞。因随传代次数增加，毛乳头细胞的形态及一些标记分子的表达会发生变化，为保证实验的准确性和可靠性，我们所有的体外实验和体内实验均选择第5代毛乳头细胞。

2、制备人基因组DNA

用Promega的基因组DNA纯化试剂盒，方法如下：

[1].收集人的细胞至一干净的1.5ml OD管中；

[2].加入600微升核裂解液，用移液枪反复吹打以裂解组织，直到可见的组织块消失，65度静置20min；

[3].加入3微升RNA酶，颠倒2-5次，37度30min，然后冷却至室温。

[4].加入200微升蛋白沉淀液并使用涡旋振荡器高速剧烈振荡20sec，转移至冰上冷却5min；

[5].室温12000rpm离心4min，形成白色致密的蛋白沉淀；

[6].小心移取上清(含DNA)至一干净的1.5毫升OD管中，加入600微升异丙醇，移取上清的时候勿碰到沉淀；

[7].轻轻上下颠倒混匀溶液，直至白色线状DNA形成块状沉淀；

[8].室温12000rpm离心5min，此时可见白色DNA沉淀，小心弃去上清；

[9].加入600微升70％乙醇，轻轻颠倒OD管数次清洗DNA沉淀，室温12000rpm离心2min；

[10].小心弃去上清，并将OD管倒置于干净的吸水纸上，自然干燥10至15min；

[11].加入100微升ddH2O，60度烘箱中孵育1小时以溶解DNA；

[12].DNA样品保存于-20℃冰箱。

3、合成引物及构建pcDNA3.1-JAM-A 3'UTR真核表达载体

(1)设计引物

F11RXhoIF:

5'CCGCTCGAG GCCTGGTCGGCTCACCGCCTATC 3'(SEQ ID NO:1) 

F11RNotIR:

5'ATAAGAATGCGGCCGCTAAAGAATTGGATATTTTTTAATGCAAATTG 3'(SEQ ID NO:2) 

酶切位点为XhoI和NotI,分别加入引物的5’端，并加入酶切位点的保护碱基。

(2)PCR扩增目的片段 

在0.2mL EP管中配制以下体系，基因组DNA模板原液稀释20倍后取0.5μL扩增F11R：

取5μlPCR产物，做1％琼脂糖凝胶电泳(含EB 0.5μg/ml；电压：80V)

鉴定；其余用于回收、纯化目的片段。

(3)回收纯化目的片段

PCR产物经1％凝胶电泳后，在紫外灯下，用手术刀切取含目的基因片段的凝胶条带至干净1.5mlOD管中，称重后，按100mg凝胶对应100μL溶液BD的比例向离心管中加入溶液BD。60℃水浴10min至凝胶完全溶化，水浴期间振荡混合3次。将溶液转移至DNA纯化柱中，静置2min，室温12000rpm离心1min，弃滤液。向柱上加入500μL溶液PE，室温12000rpm离心1min，弃滤液。重复上一操作一次。室温空柱12000rpm离心1min以彻底去除纯化柱中残留的液体。将柱子置于新的1.5mL EP管上，向柱中央加入30μL 60℃预热的无菌水，13400g离心1min以洗脱出DNA。

(4)重组质粒的鉴定及保存

分别回收、纯化经XhoI和NotI双酶切后的载体片段和目的片段。所得DNA各自溶于30μl ddH₂O中，1％琼脂糖凝胶电泳(含EB 0.5μg/ml；电压：80V)鉴定，-20℃保存。

用T4DNA连接酶重组连接酶切后的载体片段和目的片段，形成pcDNA3.1–JAM-A 3'UTR重组质粒。用上述重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，扩增细菌并测序，测序正确如SEQ ID NO:3所示。

转化步骤如下：

用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，不要摇动EP管架。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2分钟。每管加800μl LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。将150μl已转化的感受态细胞转移到氨苄抗性(100ug/ml)的LB琼脂培养基上。

将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于37℃培养，16小时。长出的克隆进行后续PCR鉴定。

4、pcDNA3.1–JAM-A 3'UTR感染人毛乳头细胞。

实验前保证细胞的良好生长状态，实验前一天接种5×10⁴个目的细胞于12孔培养板中，所加培养基体积为0.5ml。待细胞生长至60-70％时准备进行pcDNA3.1-JAM-A 3'UTR和pcDNA3.1-AM-ACDS转染。

(pcDNA3.1-AM-ACDS是对JAM-A的CDS区进行的对比实验)

转染步骤如下：

取97ulDMEM到1ml OD管中，加入3ul fugen-6到DMEM中，用加样枪混匀或拿手指轻轻弹动，之后室温放置5分钟。同时去1微克质粒加入到总体积100微升的DMEM中，轻轻混匀，静置5分钟。5分钟后，将两种液体用枪混匀，室温放置30分钟。30分钟后用100ul枪吸出反应液，均匀的滴入12孔板中，轻轻拍打，放入培养箱。培养过夜后，第二天早上换正常培养基，继续培养并用G418筛选阳性克隆。分别标记为JAM-A3'UTR^OE DPC和JAM-A^OE DPC，将对照用载体转染的毛乳头细胞称之为CON-DPC。

实施例2：细胞实验(体外实验)

利用荧光显微镜拍照、免疫细胞化学等生物学实验方法，从细胞形态、蛋白表达等多方面分析毛乳头细胞的形态变化，目的基因表达及细胞表面 标志角蛋白的表达。

具体方法如下：

1)细胞生长状态的比较

用倒置显微镜观察感染的JAM-A 3'UTR^oe DPC，JAM-A^OE DPC和CON-DPC。JAM-A 3'UTR^oe DPC细胞可较长代数的维持凝聚样生长的形态，CON-DPC形态未见明显改变，如图1所示。JAM-A^OE DPC的凝聚样生长出现的代数并无明显提高，所以后续的实验我们主要聚焦在JAM-A^OE DPC。

2)实时PCR检测转染后JAM-A 3'UTR的表达情况

(1)抽提转染后不同时间点总RNA，逆转录为cDNA。

(2)设计引物，检测JAM-A表达水平。18S作为检测用内参。

引物序列如下：

18S的引物：

P1:GTAACCCGTTGAACCCCATT(SEQ ID NO:4)

P2:CCATCCAATCGGTAGTAGCG(SEQ ID NO:5)。

PCR产物：150bp。退火温度：55℃

JAM-A 3'UTR的引物如下：

P1:AGCTGAGGCAAGGGGATTTC(SEQ ID NO:6)

P2:CTGTCCGGCTCATTCCTGTT(SEQ ID NO:7)。

PCR产物：135bp。退火温度：55℃

体系如下： 

PCR反应步骤： 

4℃暂时保存 

PCR产物含量计算采用比较Ct值法进行相对定量。比较Ct值法前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环(Ct＝1)的不同相当于起始模板数2倍的差异。

定义：ΔCt＝Ct_目的基因-Ct_内标

ΔΔCt＝(Ct_目的基因-Ct_内标)_已处理-(Ct_目的基因-Ct_内标)_未处理

RQ＝2-ΔΔCt

利用EXCEL里面的统计分析工具，计算各组的平均值和标准差，两组之间用T检验，P<0.05认为有统计学意义，P<0.01认为差异显著。将第3天、5天和7天分别和第1天进行比较，进行T检验分析。可见JAM-A3'UTR^oeDPC较CON-DPC，JAM-A 3'UTR的表达量增加，如图2所示。

3)免疫细胞化学法检测特异性抗原

(1)接种JAM-A 3'UTR^oeDPC和CON-DPC的细胞爬片

(2)分为2组，一组为实验组，另一组为抗体对照组

(3)4％BSA封闭非特异性结合位点

(4)1：150的浓度加入一抗

(5)37度孵育半小时 

(6)PBS洗3遍

(7)1：500的浓度加入二抗

(8)PBS洗3遍

(9)DAB显色。

实验结果表明，JAM-A 3'UTR转染后，细胞表达versican和ALPL的水平增加，如图3所示。

实施例3：促毛发生成试验

实验所用裸鼠BALB/c Nu品系，SPF级。体重约15～25g，3周龄，购自上海实验动物中心。共9只裸鼠，分2组：JAM-A 3'UTR^oe DPC注射 组和CON-DPC注射组，PBS注射组。细胞量为5ⅹ10⁴，用1ml注射器抽取细胞悬液0.15ml注入裸鼠前肢背部皮下。SPF级条件下喂养、每日观察，移植后4周取材。

各组动物，经实验处理后，在大小、活性等方面无差异。JAM-A3'UTR^oeDPC移植部位附近可见明显毛发生成，如图4所示。

处死后各组裸鼠之间相比，H-E染色，肝、脾、肾等脏器无差异。

具体方法如下：

1)苏木精-伊红(HE)染色

方法同常规石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色。镜下可见细胞注射处皮肤结构完整。且可观察到JAM-A 3'UTR^oeDPC移植组毛囊较CON-DPC移植组显著增粗，如图5所示。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.链接粘附分子JAM-A基因的3'UTR端在制备人毛乳头细胞体外培养试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的链接粘附分子JAM-A基因的3'UTR端在制备人毛乳头细胞体外培养试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂在体外培养条件下维持或恢复人毛乳头细胞的原始性。

3.根据权利要求1所述的链接粘附分子JAM-A基因的3'UTR端在制备人毛乳头细胞体外培养试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂使人毛乳头细胞在体外培养条件下，随着传代次数增加，versican，ALPL和a-SMA的表达量不会降低。

4.一种在体外培养条件下维持或恢复人毛乳头细胞原始性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

A、构建JAM-A3'UTR的重组质粒；

B、将步骤A获得的重组质粒去转染人毛乳头细胞，获得JAM-A 3'UTR高表达的人毛乳头细胞。

5.根据权利要求4所述的在体外培养条件下维持或恢复人毛乳头细胞原始性的方法，其特征在于，步骤A构建的重组质粒为pcDNA3.1-JAM-A3'UTR。

6.根据权利要求4所述的在体外培养条件下维持或恢复人毛乳头细胞原始性的方法，其特征在于，所述的步骤A为：首先是根据JAM-A 3'UTR的基因结构，设计引物，以人表皮细胞总DNA为模板，通过RT-PCR调取目的片段，再构建重组人pcDNA3.1-JAM-A3'UTR真核表达载体。

7.根据权利要求4所述的在体外培养条件下维持或恢复人毛乳头细胞原始性的方法，其特征在于，所述的步骤A如下：

A、构建pcDNA3.1-JAM-A3'UTR真核表达载体

设计并合成引物如下：

P1：CCGCTCGAG GCCTGGTCGGCTCACCGCCTATC(SEQ ID NO:1)

P2：ATAAGAATGCGGCCGCTAAAGAATTGGATATTTTTTAATGCAAATTG(SEQ IDNO:2)；

以人表皮细胞总DNA为模板，通过RT-PCR扩增，合成JAM-A 3'UTR(SEQ ID NO:3)。

8.根据权利要求4所述的在体外培养条件下维持或恢复人毛乳头细胞原始性的方法，其特征在于，所述的步骤B如下：

B、将pcDNA3.1-JAM-A3'UTR真核表达载体转染人毛乳头细胞，筛选阳性克隆，获得JAM-A 3'UTRoe DPC；

所述的转染步骤为：按脂质体：质粒＝3:1(微升/微克)的比例对生长至60％融合的细胞进行转染，24小时后更换新的培养基并用G418筛选阳性克隆。

9.链接粘附分子JAM-A基因的3'UTR端在制备毛发再生、毛发增粗材料或制备皮肤移植物中的应用。

10.一种JAM-A 3'UTR高表达的人毛乳头细胞在制备毛发再生、毛发增粗材料或制备皮肤移植物中的应用。