CN103194425A - 一种促进表皮细胞增殖的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞及基因工程技术领域。链接粘附分子JAM1（NM_016946）是一个跨膜分子，属于免疫球蛋白超家族。本发明提供了一种促进表皮细胞增殖的方法，是用链接粘附分子JAM1基因修饰和基因干扰表皮细胞；本发明还提供了一种链接粘附分子JAM1基因低表达的表皮细胞即JAM1^kd-EC，并检测了该表皮细胞的增殖能力及表皮细胞特性、生物安全性等。本发明还进一步提供上述的促进表皮细胞增殖的方法和JAM1^kd-EC在创面修复或制备皮肤移植物中的应用。

Description

一种促进表皮细胞增殖的方法及其应用

技术领域

本发明涉及干细胞及基因工程技术领域，具体涉及一种促进表皮细胞增殖的方法，及其将该方法应用于制备皮肤移植物。

背景技术

细胞具有一定的寿命，细胞的分裂能力也是有一定限度的，随着细胞分裂次数的增加，细胞增殖能力逐渐减弱，最终停止增殖。这也是细胞从干细胞经过短暂扩增细胞到终末分化细胞的过程。此过程受很多因素影响，有些因素可以减缓甚至扭转这一进程，使细胞重新获得分化、增殖能力。

目前，使细胞重新获得分化和增殖能力的策略有核移植（Wilmut I,Schnieke AE,McWhir J,Kind AJ,Campbell KH..Viable offspring derived fromfetal and adult mammalian cells.Nature.1997 Feb 27;385(6619):810-3.）、鸡尾酒基因修饰法（Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors Cell.2006 Aug 25;126(4):663-76.）、细胞裂解液（Taranger CK,Noer A,

AL,

AM,Boquest AC,Collas P.Induction of dedifferentiation,genomewide transcriptionalprogramming,and epigenetic reprogramming by extracts of carcinoma andembryonic stem cells.Mol Biol Cell.2005Dec;16(12):5719-35.）、端粒酶转染Comandini A,Naro C,Adamo R,Molecular mechanisms involved in HIV-1-Tatmediated inhibition of telomerase activity in human CD4(+)T lymphocytes.MolImmunol.2012 Dec 31;54(2):181-192.）、生长因子转染（Hu ZX,Geng JM,LiangDM,Luo M,Li ML.Hepatocyte growth factor protects human embryonic stem cellderived-neural progenitors from hydrogen peroxide-induced apoptosis.Eur JPharmacol.2010Oct25;645(1-3):23-31.）等。这些方法虽然可以让成体细胞恢复增殖能力，但存在致瘤性、细胞毒性及细胞基因型发生改变等问题。

组织工程对所需种子细胞的最基本要求就是扩增快，效率高。如何在保持原有细胞特性的基础上实现种子细胞如表皮细胞的快速、高效扩增已经成为组织工程急需解决的重点问题。

近年来的研究表明慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因修饰与治疗的效果。在美国已经开展了慢病毒介导的基因治疗的临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景（Dong A,Rivella S,Breda L.Genetherapy for hemoglobinopathies:progress and challenge.Transl Res.2013 Jan 18.pii:S1931-5244(12)00447-1.）。

链接粘附分子JAM1（GENBANK No:NM_016946）是一个跨膜分子，属于免疫球蛋白超家族。JAM1可以在同源二聚化之后形成多蛋白的大的复合体，这种复合体介导细胞由外到内的信号传递。此外，JAM1在细胞增殖、迁移，器官发育等方面也有重要作用（参见文献：(1)Nava P，Capaldo CT，Koch S,et.al.JAM-A regulates epithelial proliferation through Akt/β-catenin signalling.EMBORep.2011Apr;12(4):314-20.；(2)Severson EA,Lee WY，Capaldo C T,Nusrat A,Parkos CA.Junctional adhesion molecule A interacts with Afadin and PDZ-GEF2 toactivate Rap1A,regulate beta1integrin levels,and enhance cellmigration.Molecular Biology of the Cell Vol.20,1916–1925.）

基因修饰可调节细胞增殖。目前较为安全的基因修饰方法是慢病毒感染。慢病毒基因载体是由Ⅰ型人免疫缺陷病毒改造的新型病毒载体，作为一种高效的基因转染载体应用越来越广泛，经多次修饰改造其转导效率和安全性都得到了保证。

目前尚无文献报道有关JAM1基因修饰表皮细胞，以促进其快速增殖的研究及应用。

发明内容

本发明的目的在于一种促进表皮细胞增殖的方法，本发明的另一目的在于提供该方法在制备皮肤移植物中的应用。

申请人基于JAM1可调节上皮细胞增殖，促进间充质干细胞增殖等实验依据，构建含目的基因JAM1的慢病毒过表达载体和JAM1特定干扰序列的慢病毒干扰载体，将其转染表皮细胞，以便用表达的外源性JAM1启动信号转导，获得JAM1高表达和低表达的表皮细胞，称之为JAM1^ov-EC和JAM1^kd-EC。绘制生长曲线法测量各组细胞的增殖速度。免疫组化测量各组细胞的表皮细胞特性。裸鼠皮下注射法测量各组细胞有无致瘤性。

本发明的主要技术方案如下：首先是根据JAM1的基因结构，设计引物，以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAM1cDNA，再构建重组人peGFP-N1-JAM1真核表达载体，为提高转染效率，构建慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAM1-GFP，将慢病毒感染人表皮细胞。

设计并合成引物如下：

P1：CCTGAAGCTTATGGGGACAAAGGC（SEQ ID NO:1）

P2：ACCAGGATCCAACACCAGGAATGACGAGG（SEQ ID NO:2）；

以人表皮细胞总RNA为模板，通过RT-PCR扩增，制备JAM1cDNA（SEQID NO:3)。

其中的慢病毒载体的构建方法为常规方法，可参见工具书(耿运琪主编，慢病毒与泡沫病毒分子生物学文选，南开大学出版社)。也可以用以下的具体步骤：

（1）设计并合成引物如下：

JAM1-Age I-F如SEQ ID NO:4所示，

JAM1-Age I-R如SEQ ID NO:5所示，

Ubi-F如SEQ ID NO:6所示，

EGFP-N-R如序列SEQ ID NO:7所示；

（2）采用PCR方法从JAM1真核表达载体中钓取目的基因；

（3）使用Age I对获得的JAM1过表达质粒和病毒载体进行酶切以获取线性化模板；

（4）PCR产物交换进入线性化慢病毒载体制备慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAM1-GFP。

其次，通过查阅文献确定JAM1基因特定的干扰序列为：

AAAGAUGGGAUAGUGAUGCCU（SEQ ID NO:8）(Mandell KJ BB,Nusrat A,Parkos CA.(2005)Junctional adhesion molecule 1 regulates epithelialcell morphology through effects on beta1 integrins and Rap1activity.J Biol Chem280:11665-11674.)。构建JAM1RNA干扰的慢病毒载体为：pFU-GW-JAM1RNAi-GFP。将JAM1的干扰慢病毒感染人表皮细胞。

最后，本发明将pGC-FU-JAM1-GFP和pFU-GW-JAM1RNAi-GFP颗粒感染表皮干细胞（EC），获得JAM1高表达和低表达的表皮细胞，即JAM1^ov-EC和JAM1^kd-EC，构建方法为常规方法(Elbashir SM,Harborth J,LendeckelW，Yalcin A,Weber K,Tuschl T.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells.Nature.2001May24;411(6836):494-8.)。实验发现，JAM1下调后表皮细胞增殖明显加快。

本发明的第一方面，是提供了一种促进表皮细胞增殖的方法，是用链接粘附分子JAM1基因修饰和基因干扰表皮细胞，该方法包括：

A、构建JAM1RNA干扰的慢病毒；

B、将步骤A获得的慢病毒去感染表皮干细胞，获得JAM1低表达的表皮细胞。

具体的，该方法包括以下步骤：

A、构建JAM1RNA干扰的慢病毒：

JAM1基因干扰慢病毒质粒构建中合成片段如下：

pSCF4772-1如SEQ ID NO:9所示；

pSCF4772-2如SEQ ID NO:10所示；

退火成双链DNA并连接到酶切后的病毒载体pFU-GW-RNAi上，构建JAM1RNA干扰的慢病毒即pFU-GW-JAM1RNAi-GFP；

B、将pFU-GW-JAM1RNAi-GFP慢病毒颗粒感染表皮干细胞（EC），获得JAM1低表达的表皮细胞，即JAM1^kd-EC，表皮细胞增殖加快。

连续培养7天，JAM1^kd-EC的细胞量从1万个增加到平均60.5万个，而EC培养7天增加到45万个，JAM1^ov-EC增加到31.5万个。实验重复三次，均表现为JAM1^kd-EC增殖加快。

上述方法中，步骤A具体为：

首先合成含干扰序列的单链DNA oligo，然后退火配对产生双链DNAoligo，再通过其两端所含酶切位点直接连入酶切后的RNA干扰慢病毒载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落先进行PCR鉴定，PCR鉴定阳性菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰慢病毒载体。

（1）确定目的基因siRNA序列：

AAAGAUGGGAUAGUGAUGCCU(NM_016946)

（2）确定病毒载体：pFU-GW-RNAi

（3）病毒载体构建框架

(4)合成片段信息

PSCF4772-1:

TAAAGATGGGATAGTGATGCCTCTCGAGAGGCATCACTATCCCATCTTTTTTTTTC（SEQ ID NO:9）

PSCF4772-2:

TCGAGAAAAAAAAAGATGGGATAGTGATGCCTCTCGAGAGGCATCACTATCCCATCTTTA（SEQ ID NO:10）

引物退火形成带双链DNA。

(5)通过T4DNA连接酶将双酶切线性化的载体和DNA oligo在适当的buffer中进行连接反应，连接后的产物进行转化实验，挑选阳性克隆，测序。

上述方法中，步骤B具体为：

（1）先将10μL三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为5×10⁵TU，1×10⁵TU，1×10⁴TU，而细胞经过生长，此时细胞的数目大约为1×10⁴个，所以三个孔的MOI分别为50、10、1；

（2）每孔中加入10μL的Polybrene稀释液；

（3）在水平方向轻轻拍打培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培养箱孵育；

（4）培养8~12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基；

（5）感染3~4天后，观察荧光表达情况。对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的活性；

（6）通过细胞感染效果，确认MOI值为50可获得最佳感染效果。

本发明还提供了根据上述方法获得的链接粘附分子JAM1基因高表达和低表达的表皮细胞，即JAM1^ov-EC和JAM1^kd-EC。并检测了各组细胞的增殖能力及表皮细胞特性、生物安全性。

绘制细胞增殖曲线检测JAM1^ov-EC和JAM1^kd-EC的增殖能力，免疫组化检测表皮细胞特异性标记分子的表达，并将JAM1^ov-EC和JAM1^kd-EC皮下移植到裸鼠皮肤组织，观察各组细胞有无致瘤性。

通过体外实验研究发现，转染后细胞形态无明显变化，均是铺路石状（见图1）。绘制生长曲线测定细胞增殖速度，JAM1下调后表皮细胞增殖明显加快（见图2）。实时PCR结果显示J慢病毒转染成功，JAM1的表达发生显著变化（见图3）。western-blot结果显示转染后细胞JAM1分子的表达发生上调或下调（见图4）。免疫组化鉴定发现病毒感染后表皮细胞特性未发现改变，高表达角蛋白（见图5）。各组细胞致瘤实验均为阴性（见图6）。

本发明的另一方面，是提供上述的促进表皮细胞增殖的方法在创面修复或制备皮肤移植物中的应用。

以及，本发明构建的链接粘附分子JAM1基因低表达的表皮细胞在制备创面修复材料或皮肤移植物中的应用。

外创性皮肤损伤，特别是大面积的深度皮肤烧伤，仅靠创面自身难以实现皮肤的再生。可分离少量患者表皮细胞体外培养，本发明可提高患者表皮细胞的增殖速度，随后进行自体皮的培养并用于创面覆盖。此外，构建组织工程皮肤的前提条件是获得足够数量的种子细胞是，本发明可快速提供足够数量的表皮细胞作为种子细胞。

附图说明

图1为JAM1过表达慢病毒及空白对照感染后的人表皮细胞。

图2为绘制生长曲线测定慢病毒感染后人表皮的增殖能力。

图3为实时PCR鉴定转染后JAM1表达情况，

其中A为JAM1^kd-EC；B为JAM1^ov-EC。

图4为western-blot检测慢病毒感染后JAM1的表达，

其中1为JAM1^ov-EC；2为GFP-EC；3为JAM1^kd-EC。

图5免疫组化鉴定慢病毒感染后EC中特异性抗原的表达。

图6为大体观察和苏木精-伊红（HE）染色观察实验鼠和阴性对照鼠皮肤之间差异的试验结果，结果各组致瘤实验均为阴性，

其中A排为细胞移植鼠，从左向右依次是JAM1^ov-EC，GFP-EC和JAM1^kd-EC。图中箭头表示为细胞移植部位，大体观察未见异常；B排为苏木精-伊红（HE）染色结果，未见畸胎瘤形成。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

实施例1：构建慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAM1-GFP，感染人表皮细胞（hMSC）。

1、表皮细胞分离培养

成人体皮来自长海医院整形外科。原代培养得到表皮细胞。

2、制备人表皮细胞总RNA

用上海华舜生物工程有限公司总RNA抽提试剂盒，按常规的异硫氰酸胍法提取获得人表皮细胞总RNA。方法如下：

取一皿直径3.5cm的培养皿的单层生长的表皮细胞,直接弃去培养基，加入1ml的TRIzol溶解细胞，细胞充分溶解后，用移液管将细胞裂解物移出。将细胞裂解样品在15~30°C条件下孵育5分钟，使核蛋白体完全分解。每1ml TRIzol加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖后用手摇晃试管15秒并在30°C下孵育2~3分钟。在2~8°C条件下以不超过12,000×g的离心力冷冻离心15分钟。离心后的混合物可分成三层：下层为红色的苯酚-氯仿层，中间层和上层无色的水样层。RNA存在于上层水样层当中，其容量大约为所加TRIzol容量的60%。将水样层转移到一用DEPC处理过的，无RNase的试管中，通过跟异丙醇混合来沉淀RNA。每1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇。将混合的样品在15~30°C条件下孵育10分钟然后在2~8°C条件下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟。RNA沉淀在离心后可以形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。用75%的乙醇（用DEPC处理过的超纯水进行配制）洗涤RNA沉淀一次，每1ml的TRIzol至少加入1ml的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2~8°C条件下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。空气干燥5~10分钟RNA沉淀。不能让RNA沉淀完全干燥，会降低它的可溶性。用DEPC处理过的超纯水溶解RNA样品。

3、合成引物及构建peGFP-N1-JAM1真核表达载体

（1）设计引物

上游引物：CCTGAAGCTTATGGGGACAAAGGC

HindⅢ

下游引物：ACCAGGATCCAACACCAGGAATGACGAGG

BamHⅠ

酶切位点为HindⅢ和BamHⅠ,分别加入引物的5’端，并加入酶切位点的保护碱基。

（2）RT-PCR扩增目的片段

总RNA                 5ul

Oligo dT(15)Primer    1ul

70℃10m,立即置入冰浴中5m，后加入

以逆转录得到的cDNA为模板，钓取目的基因片段。方法如下：

总体系50μl.取5μlPCR产物，做1%琼脂糖凝胶电泳（含EB0.5μg/ml；电压：80V）鉴定；其余用于回收、纯化目的片段。

（3）回收纯化目的片段

45μl PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳（含EB0.5μg/ml；电压：50V）分离出目的条带，在紫外灯上切下含目的条带的凝胶，用中科英达3S DNA GelPurification Kit回收、纯化目的片段，操作方法见说明书，最后用50μl ddH2O溶解目的DNA。取5μl做1%琼脂糖凝胶电泳（含EB0.5μg/ml；电压：80V）鉴定；其余放-20℃保存。电泳见片段大小符合要求，准备酶切、连接。

（4）重组质粒的鉴定及保存

分别回收、纯化经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后的载体片段和目的片段。所得DNA各自溶于30μl ddH2O中，1%琼脂糖凝胶电泳（含EB0.5μg/ml；电压：80V）鉴定，-20℃保存。

用T4 DNA连接酶重组连接酶切后的载体片段和目的片段，形成pEGFP–JAM1重组质粒。用上述重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，扩增细菌并测序。

4、慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAM1-GFP

设计引物采用PCR方法从JAM1真核表达载体中钓取目的基因，方法如下：反应体系：Primer(+)0.4μL，Primer(-)0.4μL，10×缓冲液2.0μL，MgCl2 0.5μL，dNTPs(2.5mmol/L)0.8μL，Taq多聚酶0.2μL，质粒1μL(阴性对照组不加)，由ddH2O配置为20μL。PCR反应条件：94℃热启动30s→94℃变性30s→60℃复性30s→72℃延伸30s，30个循环，最后72℃聚合6min。挑选阳性克隆送Invitrogen公司进行测序鉴定。

引物序列如下：

JAM1-Age I-F：

GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGGACAAAGGCGCAAG（SEQ ID NO:4）

JAM1-Age I-R：

TCACCATGGTGGCGACCGGCACCAGGAATGACGAGGTC（SEQ ID NO:5）

Ubi-F：

GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG（SEQ ID NO:6）

EGFP-N-R：

CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG（SEQ ID NO:7）

使用Age I对获得的JAM1过表达质粒和病毒载体进行酶切以获取线性化模板：

酶切反应体系：

37℃反应2小时。

PCR产物交换进入线性化慢病毒载体制备慢病毒过表达质粒pGC-FU-JAM1-GFP

于25℃反应30分钟,再于42℃反应15分钟制备交换液，准备转化。

转化步骤如下：

用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加10μl连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，不要摇动EP管架。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟。每管加800μl LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏。将150μl已转化的感受态细胞转移到AMP抗性（100ug/ml）的LB琼脂培养基上。

将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于37℃培养，16小时。长出的克隆进行后续PCR鉴定。

5、合成引物及构建pFU-GW-JAM1RNAi-GFP干扰慢病毒

（1）确定干扰序列：AAAGATGGGATAGTGATGCCT

（2）合成单链DNA oligo：

pSCF4772-1:TAAAGATGGGATAGTGATGCCTCTCGAGAGGCATCACTATCCCATCTTTTTTTTTC；

pSCF4772-2:TCGAGAAAAAAAAAGATGGGATAGTGATGCCTCTCGAGAGGCATCACTATCCCATCTTTA。

退火形成双链DNA oligo。

（3）Hpa I和Xho I双酶切pFU-GW-RNAi载体制备线性化的载体。

（4）T4DNA连接酶将双酶切线性化的载体和DNA oligo连接。

（5）鉴定及测序。用上述重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，扩增细菌并测序。

(6)慢病毒包装及滴度鉴定。

6、pGC-FU-JAM1-GFP和pFU-GW-JAM1RNAi-GFP感染人表皮细胞。

实验前保证细胞的良好生长状态，实验前一天接种3~5×10³个目的细胞于96孔培养板中，所加培养基体积为90μL。实验时，一般不用96孔板边上的孔。因为Lentivirus表达时间较慢，所以一般在三到四天后观察荧光，故在进行感染实验时细胞接种不宜过密（细胞的融合率约为30～50%左右）。

（1）先将10μL三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中。加入的病毒量分别为5×10⁵TU，1×10⁵TU，1×10⁴TU，而细胞经过生长，此时细胞的数目大约为1×10⁴个，所以三个孔的为感染复数（MOI）分别为50、10、1。

（2）每孔中加入10μL的Polybrene稀释液。

（3）在水平方向轻轻拍打培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培养箱孵育。

（4）培养8~12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基。

（5）感染3~4天后，观察荧光表达情况。对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的活性。

（6）通过细胞感染效果，确认MOI值为50可获得最佳感染效果。

（7）将JAM1过表达和干扰及对照用病毒载体感染后的表皮细胞分别称之为JAM1^ov-EC，JAM1^kd-EC和GFP-EC。

实施例2：细胞实验（体外实验）

利用荧光显微镜拍照、绘制生长曲线、免疫细胞化学、western-blot等生物学实验方法，从细胞形态、蛋白表达等多方面方面分析细胞形态变化，目的基因表达及细胞表面标志角蛋白的表达。

具体方法如下：

1）细胞生长状态的比较

用倒置荧光显微镜观察慢病毒感染的JAM1^ov-EC，JAM1^kd-EC和GFP-EC。细胞形态未见明显改变，如图1所示。

2）绘制生长曲线检测细胞增殖

将JAM1^ov-EC、JAM1^kd-EC和GFP-EC以每孔10000个细胞接种于24孔板，培养7天，每天对胰酶消化成单细胞悬液，借助细胞计数板和显微镜进行细胞计数实验，每个时间点每种细胞做3复孔，实验重复3次。结果发现JAM1^kd-MSC组细胞增殖能力强于GFP-EC。如图2所示。

3）实时PCR检测转染后JAM1表达情况

（1）抽提转染后不同时间点总RNA，逆转录为cDNA。

（2）设计引物，检测JAM1表达水平。18S作为检测用内参。

引物序列如下：

18S的引物：

P1:GTAACCCGTTGAACCCCATT

P2:CCATCCAATCGGTAGTAGCG。PCR产物：150bp。退火温度：55℃

JAM1的引物如下：

P1:CCCTCTTGGCTTGATTTTGC

P2:TGACCTTGACTGATGGCTTC。PCR产物：115bp。退火温度：55℃

体系如下：

PCR反应步骤：

PCR产物含量计算采用比较Ct值法进行相对定量。比较Ct值法前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环（Ct=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。

定义：ΔCt＝Ct_目的基因-Ct_内标

ΔΔCt＝（Ct_目的基因-Ct_内标）_已处理-（Ct_目的基因-Ct_内标）_未处理

RQ=2-ΔΔCt

利用EXCEL里面的统计分析工具，计算各组的平均值和标准差，两组之间用T检验，P<0.05认为有统计学意义，P<0.01认为差异显著。将第3天、5天和7天分别和第1天进行比较，进行T检验分析。

4）western-blot检测JAM1的表达

（1）去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍

（2）于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。

（3）用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min.

（4）将EP管置于0℃后再14000～16000g离心2min，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。

（5）待样品恢复到室温后上样。

（6）电泳、转膜。

（7）浸没于5%BSA封闭液中室温缓慢摇荡一小时。一抗室温下轻摇孵育一小时。

（8）根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择辣根过氧化物酶

（HRP）标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。

（9）洗涤，使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法。结果可见，和GFP-EC相比，JAM1^ov-EC组JAM1的表达量显著增加,JAM1^kd-EC组JAM1的表达量显著下降。如图4所示。

5）免疫细胞化学法检测特异性抗原

（1）接种JAM1^ov-EC、JAM1^kd-EC和GFP-EC的细胞爬片

（2）分为2组，一组为实验组，另一组为抗体对照组

（3）4%BSA封闭非特异性结合位点

（4）1：200的浓度加入一抗

（5）37度孵育半小时

（6）PBS洗3遍

（7）1：500的浓度加入二抗

（8）PBS洗3遍

（9）DAB显色。

实验结果表明，JAM1过表达慢病毒感染前后，细胞均不表达间质细胞抗原波形蛋白，高表达表皮细胞特异性抗原角蛋白。如图5所示。

实施例3：体内致瘤试验

实验所用裸鼠BALB/c Nｕ品系，SPF级。体重约15~25ｇ，3周龄，购自上海实验动物中心。共12只裸鼠，分4组：JAM1^ov-EC注射组，GFP-EC注射组，JAM1^kd-EC注射组，PBS注射组。细胞量为10⁴，用1ml注射器抽取细胞悬液0.15ml注入裸鼠前肢背部皮下。SPF级条件下喂养、每日观察，移植后4周取材。

各组动物，经实验处理后，在外形、活性等方面无差异。处死后各组裸鼠之间相比，H-E染色，肝、脾、肾等脏器无差异。

对各组裸鼠注射部位的皮肤组织做H-E染色，显微镜下观察发现：无畸胎瘤形成。

具体方法如下：

1）苏木精-伊红（HE）染色

方法同常规石蜡切片苏木精-伊红（HE）染色。镜下可见细胞注射处皮肤结构完整，无畸胎瘤形成，如图6所示。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (6)

1.一种促进表皮细胞增殖的方法，是用链接粘附分子JAM1基因修饰和基因干扰表皮细胞，该方法包括：

A、构建JAM1RNA干扰的慢病毒；

B、将步骤A获得的慢病毒去感染表皮干细胞，获得JAM1低表达的表皮细胞。

2.根据权利要求1所述的一种促进表皮细胞增殖的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

A、构建JAM1RNA干扰的慢病毒：

JAM1基因干扰慢病毒质粒构建中合成片段如下：

pSCF4772-1如SEQ ID NO:9所示；

pSCF4772-2如SEQ ID NO:10所示；

退火成双链DNA并连接到酶切后的病毒载体pFU-GW-RNAi上，构建JAM1RNA干扰的慢病毒即pFU-GW-JAM1RNAi-GFP；

B、将pFU-GW-JAM1RNAi-GFP慢病毒颗粒感染表皮干细胞，获得JAM1低表达的表皮细胞，即JAM1^kd-EC，表皮细胞增殖加快。

3.根据权利要求2所述的一种促进表皮细胞增殖的方法，其特征在于，步骤B为：

（a）先将10μL三个不同梯度的病毒加到各组的相应孔中，加入的病毒量分别为5×10⁵TU，1×10⁵TU，1×10⁴TU，而细胞经过生长，此时细胞的数目大约为1×10⁴个，所以三个孔的MOI分别为50、10、1；

（b）每孔中加入10μL的Polybrene稀释液；

（c）在水平方向轻轻拍打培养板，使培养基和病毒等试剂充分混匀，然后把细胞板放回培养箱孵育；

（d）培养8~12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基；

（e）感染3~4天后，观察荧光表达情况，对于生长缓慢代谢慢的细胞，可以适当延长观察时间，中途可以换液，保持细胞的活性；

（f）通过细胞感染效果，确认MOI值为50可获得最佳感染效果。

4.一种链接粘附分子JAM1基因低表达的表皮细胞，其特征在于，是用以下方法制备得到的：

A、构建JAM1RNA干扰的慢病毒：

JAM1基因干扰慢病毒质粒构建中合成片段如下：

pSCF4772-1如SEQ ID NO:9所示；

pSCF4772-2如SEQ ID NO:10所示；

退火成双链DNA并连接到酶切后的病毒载体pFU-GW-RNAi上，构建JAM1RNA干扰的慢病毒即pFU-GW-JAM1RNAi-GFP；

B、将pFU-GW-JAM1RNAi-GFP慢病毒颗粒感染表皮干细胞，获得JAM1低表达的表皮细胞，即JAM1^kd-EC。

5.一种如权利要求1至3任一所述的促进表皮细胞增殖的方法在制备创面修复材料或皮肤移植物中的应用。

6.一种如权利要求4所述的链接粘附分子JAM1基因低表达的表皮细胞在制备创面修复材料或皮肤移植物中的应用。

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