CN114181936B - 一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA及其应用 - Google Patents

一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114181936B
CN114181936B CN202111400176.2A CN202111400176A CN114181936B CN 114181936 B CN114181936 B CN 114181936B CN 202111400176 A CN202111400176 A CN 202111400176A CN 114181936 B CN114181936 B CN 114181936B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
shrna
gene
expression
chicken
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111400176.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114181936A (zh
Inventor
陈继兰
孙研研
石雷
李云雷
麻慧
袁经纬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Animal Science of CAAS
Original Assignee
Institute of Animal Science of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Animal Science of CAAS filed Critical Institute of Animal Science of CAAS
Priority to CN202111400176.2A priority Critical patent/CN114181936B/zh
Publication of CN114181936A publication Critical patent/CN114181936A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114181936B publication Critical patent/CN114181936B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01001—Carbonate dehydratase (4.2.1.1), i.e. carbonic anhydrase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA，所述shRNA为以下CA38、CA39、CA40中的任意一条，每一条shRNA分子包括正义链和反义链；其中，CA38‑a正义链和CA38‑b反义链分别具有序列表SEQ ID NO:1的碱基序列和序列表SEQ ID NO:2碱基序列，CA39‑a正义链和CA39‑b反义链分别具有序列表SEQ ID NO:3碱基序列和序列表SEQ ID NO:4碱基序列，CA40‑a正义链和CA40‑b反义链分别具有序列表SEQ ID NO:5碱基序列和序列表SEQ ID NO:6碱基序列；本发明的有益效果是，上述三种shRNA可有效抑制鸡CA13基因的表达量，在基因水平的抑制效率分别为36％、38％和47％。

Description

一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA及其应用。
背景技术
碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase，CA)是红细胞中将CO2快速转变成HCO3 -的催化因子，该酶首先在牛红细胞中发现，随后人们陆续从动物、植物、古细菌和真细菌中鉴定出不同的碳酸酐酶，截至目前，发现该酶是拥有16种亚型的含锌金属蛋白质家族，这些亚型均能在不同水平上、可逆性催化CO2进行水合反应，对生物体维持内环境稳态至关重要，碳酸酐酶编码基因存在于哺乳动物大多数重要组织和细胞中，如胃肠道、附睾、肾脏、破骨细胞、成骨细胞和骨骼肌细胞等；虽然碳酸酐酶催化的只是一个简单的生理反应，但是其底物CO2，以及产物HCO3 -和H+却与机体多种生理及病理活动关系密切，如呼吸过程中代谢组织与肺之间CO2/HCO3 -的转运，pH与CO2浓度之间的平衡，组织器官中电解质的分泌，骨质疏松症、青光眼等疾病；已知碳酸酐酶参与家禽蛋壳的矿化过程，但目前对其编码基因CA13的相关功能仍鲜有报道；
RNAi干扰技术是研究基因功能的重要方法，通过设计靶向目的基因mRNA的干扰片段，可以抑制其表达，进而通过细胞表型或其他相关基因的变化，推测基因的功能，短发卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)是可以克隆到表达载体并表达短的干扰RNA(siRNA，19-21个核苷酸的双链RNA)的DNA分子，包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，由polIII启动子控制，随后再连上5-6个T碱基作为RNA聚合酶III的转录终止子。通过载体将“短干涉RNA”输送入细胞或活体组织中，被细胞机制切割成siRNA，由siRNA发挥作用达到沉默靶基因表达的作用；慢病毒以其较低的转染条件(可转染分裂和非分裂细胞)和较高的转染效率被广泛应用于基因表达的研究中。
随着RNA干扰技术的深入发展，将设计合成的shRNA构建到慢病毒表达系统，进而感染特定的靶细胞，引起特异性沉默相关基因表达，已经成为研究基因功能的最有效的手段之一，也是靶向基因治疗的有效途径；shRNA慢病毒表达系统有效克服了以往人工合成的siRNA转染效率低、持续时间短等不足，已经逐步发展成为在原代细胞及家禽体内研究基因功能的有效途径之一。
发明内容
鉴于此，本发明目的在于提出一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA及其应用，该shRNA干扰序列可以有效降低鸡CA13基因的表达量，对于鸡CA13基因的功能研究具有广泛的应用前景。
实现上述目的本发明的技术方案为，一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA，所述shRNA为以下CA38、CA39、CA40中的任意一条，每一条shRNA分子包括正义链和反义链；
CA38-a正义链：
5’-CCGGGCCAGTCACCTATTGACATCACTCGAGTGATGTCAATAGGTGACTGGCTTTTTG-3’，其具有序列表SEQ ID NO:1碱基序列；
CA38-b反义链：
5’-AATTCAAAAAGCCAGTCACCTATTGACATCACTCGAGTGATGTCAATAGGTGACTGGC-3’，其具有序列表SEQ ID NO:2碱基序列；
CA39-a正义链：
5’-CCGGGGACTACTGGACTTACTTTGGCTCGAGCCAAAGTAAGTCCAGTAGTCCTTTTTG-3’，其具有序列表SEQ ID NO:3碱基序列；
CA39-b反义链：
5’-AATTCAAAAAGGACTACTGGACTTACTTTGGCTCGAGCCAAAGTAAGTCCAGTAGTCC-3’，其具有序列表SEQ ID NO:4碱基序列；
CA40-a正义链：
5’-CCGGGCTCGTCAGTCAGATGGATTGCTCGAGCAATCCATCTGACTGACGAGCTTTTTG-3’，其具有序列表SEQ ID NO:5碱基序列；
CA40-b反义链：
5’-AATTCAAAAAGCTCGTCAGTCAGATGGATTGCTCGAGCAATC CATCTGACTGACGAGC-3’，其具有序列表SEQ ID NO:6碱基序列；
其中，CTCGAG为loop序列。
上述抑制鸡CA13基因表达的shRNA在抑制鸡CA13基因表达中的应用。
一种慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体含有上述所述的抑制鸡CA13基因表达的shRNA。
一种慢病毒表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)分别合成抑制鸡CA13基因表达的shRNA的正义链和反义链；
(2)将正义链和反义链序列混合进行退火，以形成带有粘性末端的双链DNA；
(3)将慢病毒载体双酶切后，得到线性化的慢病毒载体；
(4)将步骤(2)中的双链DNA和步骤(3)中的线性化的慢病毒载体进行连接，转入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有抗生素的平板上，挑取平板上的单克隆进行测序验证，构建得到慢病毒表达载体。
上述慢病毒表达载体的构建方法，所述慢病毒载体为GV248载体。
上述慢病毒表达载体在抑制鸡CA13基因表达中的应用。
其有益效果在于，本发明提出了抑制鸡CA13基因表达的shRNA，并构建了相应的shRNA慢病毒表达载体；本发明的三种shRNA序列其分别为CA38，CA39和CA40均可有效降低鸡CA13基因的表达量，在基因水平的抑制效率分别为36％、38％和47％，将抑制鸡CA13基因表达的shRNA构建于慢病毒载体上，适用于体内及体外研究；同时，对于深入研究鸡CA13基因的功能等具有重要的科学意义及应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例中GV248载体图谱；
图2为载体酶切电泳图谱，其中，1﹟：GV112 Vector，2﹟：经过AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的GV112 Vector，3﹟：1kb DNA Ladder(条带从上到下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)；
图3为pHelper 1.0载体图谱；
图4为pHelper 2.0载体图谱；
图5为慢病毒包装载体转染鸡原代成骨细胞；
图6为转染表达干扰序列的慢病毒包装载体并诱导成骨7天后鸡原代成骨细胞中CA13基因表达情况；
图7为转染了CA40序列并诱导成骨7天后的鸡原代成骨细胞矿化情况。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并结合附图，对本发明进一步详细说明。
实施例1
RNAi慢病毒克隆的制备
(1)针对GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)中鸡CA13基因序列信息(XM_003640811.5)，设计干扰序列，序列信息如表1所示；
表1病毒载体构建框架
Name 5’ STEM Loop STEM 3’
CA38 CCGG GCCAGTCACCTATTGACATCA CTCGAG TGATGTCAATAGGTGACTGGC TTTTTG
CA39 CCGG GGACTACTGGACTTACTTTGG CTCGAG CCAAAGTAAGTCCAGTAGTCC TTTTTG
CA40 CCGG GCTCGTCAGTCAGATGGATTG CTCGAG CAATCCATCTGACTGACGAGC TTTTTG
对照 CCGG TTCTCCGAACGTGTCACGT CTCGAG ACGTGACACGTTCGGAGAA TTTTTG
(2)利用限制性内切酶消化获得线性化载体
目的慢病毒载体的载体名称：GV248，其载体图谱如图1所示。
配制50μL酶切体系，如表2，按列表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，见图2，回收目的条带。
表2酶切体系
试剂 体积(μL)
ddH<sub>2</sub>O 41
10×cutsmart buffer 5
纯化的质粒DNA(1μg/μL) 2
Age I(10U/μL) 1
EcoRI 1
合计 50
(3)病毒载体构建框架
根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建，在正义链的5’端添加了CCGG(AgeI酶切位点)，在反义链的5’端添加了AATTCAAAAA(EcoRI酶切位点)，G：酶切位点互补序列，除此之外，在正义链的3’端添加TTTTT终止信号，在反义链的5’端添加终止信号互补序列，如表3所示。
表3合成oligo信息
Figure BDA0003364492630000051
(4)合成单链条引物，如表4所示。
表4合成单链引物
NO. Sequence(5’-3’)
CA38-a CCGGGCCAGTCACCTATTGACATCACTCGAGTGATGTCAATAGGTGACTGGCTTTTTG
CA38-b AATTCAAAAAGCCAGTCACCTATTGACATCACTCGAGTGATGTCAATAGGTGACTGGC
CA39-a CCGGGGACTACTGGACTTACTTTGGCTCGAGCCAAAGTAAGTCCAGTAGTCCTTTTTG
CA39-b AATTCAAAAAGGACTACTGGACTTACTTTGGCTCGAGCCAAAGTAAGTCCAGTAGTCC
CA40-a CCGGGCTCGTCAGTCAGATGGATTGCTCGAGCAATCCATCTGACTGACGAGCTTTTTG
CA40-b AATTCAAAAAGCTCGTCAGTCAGATGGATTGCTCGAGCAATCCATCTGACTGACGAGC
对照-a CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG
对照-b AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA
(5)引物退火形成双链DNA
合成后成对的引物干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，自然冷却至室温，配对结果如表4所示，该引物退火后形成带有粘性末端的双链DNA，带有粘性末端的双链DNA与线性化克隆载体两末端含有相同的酶切位点。
(6)退火产物与载体进行连接
通过T4 DNA ligase将双酶切线性化的载体和退火双链DNA连接，16℃连接1-3h，反应体系如下表5所示。
表5连接反应体系
试剂 体积(μL)
线性化载体(100ng/μL) 1
双链DNA(100ng/μL) 1
10×T4 DNA ligase缓冲液 2
T4 DNA ligase 1
ddH<sub>2</sub>O 15
(7)转化
将10μL连接反应产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，冰水浴孵育2min，加入500μL LB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。
(8)菌落PCR鉴定
挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。配制如下反应体系，震荡混匀，短暂离心，在超净工作台中，用无菌的枪头挑取单个菌落至20μL鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应，其中PCR反应体系如表6，PCR反应条件如表7：
表6 PCR反应体系
试剂 体积(μL)
ddH<sub>2</sub>O 9.2
2×Taq Plus Master Mix 10
上游引物(10μM) 0.4
下游引物(10μM) 0.4
单菌落 -
Total 20
表7 PCR反应条件
Figure BDA0003364492630000071
(8)根据PCR结果，将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含氨苄西林的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序验证。
(9)质粒抽提
将测序正确的菌液转接于10mL含氨苄西林的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，详细步骤如下：
1.收集过夜培养的菌液于标记好的5mL离心管，12000rpm，离心2min收菌；
2.弃上清，加入250μL细胞重悬液，充分振荡，使菌块悬浮均匀；
3.加入250μL细胞裂解液，再加入10μL蛋白酶K，上下颠倒5-6次，轻轻混匀；静置1-2min，使菌体裂解澄清；
4.加入350μL中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5min；
5.10000rpm离心10min，弃蛋白，收集上清于另一干净无菌的1.5mL EP管；
6.12000rpm离心5min，同时准备标记好的回收柱，将上清液转移至回收柱中，12000rpm离心1min，弃下层废液；
7.加入600μL预先配置好的漂洗液，12000rpm离心1min，弃下层废液，重复一次，12000rpm空离2min，进一步除去残留的漂洗液；
8.在超净台中将回收柱转至新的1.5mL EP管中，静置10-20min，自然晾干；
9.往回收柱中加入95μL Nuclease-Free Water，静置2min，12000rpm离心2min，收集样品做好编号，电泳、测定浓度，进行质检。
实施例2
慢病毒包装与质量检测
病毒包装共涉及三个质粒，分别为携带靶点序列的工具载体质粒GV248(参见实施例1)，病毒包装辅助质粒(Helper 1.0)和病毒包装辅助质粒(Helper 2.0)，分别如图3和图4所示。
1.质粒的制备
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8-2.0之间。
2.质粒转染与慢病毒收获
(1)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的培养基调整细胞密度约5×106细胞/15mL，重新接种于直径10cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养；24h待细胞密度达70％～80％时用于转染；
(2)转染前2h更换为无血清培养基；
(3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(GV载体质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg)，与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀，调整总体积为1mL，在室温下温育15min；
(4)混合液缓慢滴加至293T细胞培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；
(5)培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10mL的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；
(6)缓慢加入含10％血清的细胞培养基20mL，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48-72h。
3.慢病毒浓缩与纯化
(1)根据细胞状态，收集转染后48h(转染即可计为0h)的293T细胞上清液；
(2)于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片；
(3)以0.45μm滤器过滤上清液于40mL超速离心管中；
(4)分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，25000rpm，离心2h，离心温度控制在4℃；
(5)离心结束后，弃去上清，去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用PBS或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬；
(6)经充分溶解后，高速离心10000rpm、5min后，取上清分装；
(7)准备样品待检测。
4.慢病毒质量检测
①物理指标检测
1)颜色判定：通过肉眼判定，慢病毒保存液呈粉红色澄清液体状；
2)粘稠度判定：用20-200μL移液器缓慢吸收50μL慢病毒保存液体，无明显粘稠感或吸液滞后现象；
②无菌检测
将病毒加入293T细胞验证，正常培养24h后镜检，无任何细菌及真菌污染情况，同时参照空细胞组，细胞间隙无明显颗粒存在，培养基澄清透明。
③滴度检测
1)测定前一天，使用293T贴壁细胞铺板，96孔板，每孔4×104个细胞，体积100μL；
2)根据病毒的预期滴度，准备7-10个无菌的EP管，每管中加入90μL无血清培养基；
3)取待测定的病毒原液10μL加入到第一个管中，混匀后，取10μL加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管；
4)选取所需的细胞孔，弃去90μL培养基，加入90μL稀释好的病毒溶液，培养箱培养；
5)24h后，加入完全培养基100μL，小心操作，不要吹起细胞；
6)4天后，观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。
实施例3
慢病毒感染鸡原代成骨细胞
将上述3种shRNA重组慢病毒和对照shRNA的慢病毒颗粒转染鸡原代成骨细胞，该细胞表达CA13基因，利用荧光显微镜检测不同shRNA的感染效率。
(1)试验分组：试验分为未转染任何慢病毒组(空白对照组)、转染了CA38干扰序列的慢病毒组、转染了CA39干扰序列的慢病毒组、转染了CA40干扰序列的慢病毒组和转染了对照非靶向序列的慢病毒组(对照组)，共5组，所有组的细胞数量和培养条件均相同。
(2)细胞感染试验方法：将鸡原代成骨细胞以1×105细胞/孔接种于6孔板中，混匀后39℃、5％CO2培养箱培养24h；24h后更换为含三抗的培养基，取慢病毒原液，放置冰上至全溶，小离心机瞬离；取无菌EP管吸取1×108TU/mL的慢病毒与含10％FBS的DMEM培养基以2:23(复感染指数MOI为40)混合，再以5ug/mL的浓度加入吉凯基因转染增强液Polybrene，混匀，加入细胞孔；在39℃、5％CO2条件下培养13h，更换成骨诱导培养基(含10％FBS、50μg/ml维生素C和10mMβ-甘油磷酸钠)，继续培养96h。
(3)细胞感染的24h、48h、72h和96h，采用荧光显微镜进行观察并拍照，同时采用明场观察总细胞并拍照。如图5所示，细胞在72h的感染效率达80％以上。以上说明含有所设计合成的干扰序列及对照序列的慢病毒均能有效感染鸡原代成骨细胞。
实施例4
重组慢病毒对鸡原代成骨细胞中CA13基因表达的抑制作用
采用real-time PCR检测shRNA对鸡原代成骨细胞中CA13基因表达水平的影响。
(1)试验分组：试验分为未转染任何慢病毒组(空白对照组)、转染了CA38干扰序列的慢病毒组、转染了CA39干扰序列的慢病毒组、转染了CA40干扰序列的慢病毒组和转染了对照非靶向序列的慢病毒组(对照组)，共5组，所有组的细胞数量和培养条件均相同。
(2)RNA提取及real-time PCR检测：感染后的细胞经成骨诱导培养基(含10％FBS、50μg/ml维生素C和10mMβ-甘油磷酸钠)诱导7天，TrizolA+裂解细胞，并采用氯仿-异丙醇法提取每组细胞的总RNA，将所提取的mRNA逆转录为cDNA。取各组细胞的cDNA作为模板，以GAPDH基因作为内参，real-time PCR检测CA13基因的表达。
如图6所示，shRNA序列对鸡原代成骨细胞中CA13基因的表达表现出抑制作用，与非靶向的对照序列相比，CA38，CA39和CA40能够显著降低CA13基因的表达，在基因水平的抑制效率分别为36％、38％和47％，其中CA40的干扰效果最好。
实施例5
CA40抑制CA13基因的表达对鸡原代成骨细胞矿化的影响
(1)试验分组：试验分为转染了CA40干扰序列的慢病毒组和转染了对照非靶向序列的慢病毒组(对照组)，共2组，所有组的细胞数量和培养条件均相同。
(2)成骨细胞茜素红染色检测矿化程度：将鸡原代成骨细胞以1×105细胞/孔接种于6孔板中，每组3个复孔。感染后的细胞经成骨诱导培养基(含10％FBS、50μg/ml维生素C和10mMβ-甘油磷酸钠)诱导7天，采用1％茜素红染色液(pH＝4.2)染色，显微镜下观察成骨细胞矿化情况。最后加入10％十六烷基氯化吡啶在37℃条件下孵育20min溶解矿化结节，酶标仪在560nm波长下检测OD值，以OD值代表矿化程度；结果如图7所示，发现与对照组相比，试验组细胞矿化程度显著下降。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA的编码DNA序列，其特征在于，所述shRNA的编码DNA序列为以下CA38、CA39、CA40中的任意一条，每一条包括正义链和反义链；
CA38-a正义链：
5’-CCGGGCCAGTCACCTATTGACATCACTCGAGTGATGTCAATAGGTGACTGGCTTTTTG-3’，其具有序列表SEQ ID NO:1碱基序列；
CA38-b反义链：
5’-AATTCAAAAAGCCAGTCACCTATTGACATCACTCGAGTGATGTCAATAGGTGACTGGC-3’，其具有序列表SEQ ID O:2碱基序列；
CA39-a正义链：
5’-CCGGGGACTACTGGACTTACTTTGGCTCGAGCCAAAGTAAGTCCAGTAGTCCTTTTTG-3’，其具有序列表SEQ ID NO:3碱基序列；
CA39-b反义链：
5’-AATTCAAAAAGGACTACTGGACTTACTTTGGCTCGAGCCAAAGTAAGTCCAGTAGTCC-3’，其具有序列表SEQ ID NO:4碱基序列；
CA40-a正义链：
5’-CCGGGCTCGTCAGTCAGATGGATTGCTCGAGCAATCCATCTGACTGACGAGCTTTTTG-3’，其具有序列表SEQ ID NO:5碱基序列；
CA40-b反义链：
5’-AATTCAAAAAGCTCGTCAGTCAGATGGATTGCTCGAGCAATCCATCTGACTGACGAGC-3’，其具有序列表SEQ ID NO:6碱基序列；
其中，CTCGAG为loop序列。
2.根据权利要求1所述的一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA的编码DNA序列在制备抑制鸡CA13基因表达的shRNA中的应用。
3.一种慢病毒表达载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体含有权利要求1所述的抑制鸡CA13基因表达的shRNA的编码DNA序列。
4.一种如权利要求3所述的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别合成抑制鸡CA13基因表达的shRNA的编码DNA序列的正义链和反义链；
(2)将正义链和反义链序列混合进行退火，形成带有粘性末端的双链DNA；
(3)将慢病毒载体双酶切后，得到线性化的慢病毒载体；
(4)将步骤(2)中的双链DNA和步骤(3)中的线性化的慢病毒载体进行连接，转入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有抗生素的平板上，挑取平板上的单克隆进行测序验证，构建得到慢病毒表达载体。
5.根据权利要求4所述的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，所述慢病毒载体为GV248载体。
6.根据权利要求3所述的一种慢病毒表达载体在制备抑制鸡CA13基因表达的shRNA中的应用。
CN202111400176.2A 2021-11-19 2021-11-19 一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA及其应用 Active CN114181936B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111400176.2A CN114181936B (zh) 2021-11-19 2021-11-19 一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111400176.2A CN114181936B (zh) 2021-11-19 2021-11-19 一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114181936A CN114181936A (zh) 2022-03-15
CN114181936B true CN114181936B (zh) 2022-09-02

Family

ID=80602451

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111400176.2A Active CN114181936B (zh) 2021-11-19 2021-11-19 一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114181936B (zh)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108441496B (zh) * 2018-04-03 2020-07-10 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种抑制鸡SOX5基因表达的shRNA序列及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN114181936A (zh) 2022-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108486060B (zh) 一种用于治疗肿瘤的外泌体及其制备方法和应用
CN114181936B (zh) 一种抑制鸡CA13基因表达的shRNA及其应用
CN105039342A (zh) 能抑制MAT2A基因表达的siRNA及其应用
CN105200059B (zh) 靶向抑制小鼠UCP2基因表达的siRNA及其表达载体的构建
CN108441496B (zh) 一种抑制鸡SOX5基因表达的shRNA序列及其应用
CN108465108B (zh) 一种预防或治疗脑胶质瘤的特异性基因靶点
CN110129319B (zh) 一种PRALR的siRNA及其用途
CN107513571B (zh) miRNA的应用
CN114959057B (zh) 与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的circRNA及其应用
CN113186187B (zh) 基于CRSIPR技术构建14-3-3ε基因敲除细胞株的方法及其应用
CN112941020B (zh) 一种鸡环状rna在促进成肌细胞的增殖的应用
CN111926018B (zh) 降低usp1表达的物质在制备治疗儿童t系急性淋巴细胞白血病的药物中的应用
CN109055429B (zh) 一种靶向RunX2基因的小鼠成骨样细胞慢病毒载体及其构建方法
CN110079527B (zh) 降低OSBPL2基因表达的siRNA、重组载体及其应用
CN110117593B (zh) 特异性降低fam84b基因表达的核酸、重组载体和重组慢病毒的应用
CN110129321B (zh) 降低LSG1基因表达的siRNA、重组载体及其应用
CN110055249B (zh) 降低THEM6基因表达的siRNA、重组载体及其应用
CN109988762B (zh) 降低PSMD12基因表达的siRNA、重组载体及其应用
CN110042101B (zh) 降低ROGDI基因表达的siRNA、重组载体及其应用
CN104342440A (zh) CDKL1基因及其siRNA和应用
CN118252844B (zh) lncRNA抑制剂在制备毛囊发生发育促进剂中的应用
CN109988764B (zh) 降低NKIRAS2基因表达的siRNA、重组载体及其应用
CN102181481B (zh) 两个MSTN-shRNA慢病毒载体的构建方法
CN110923313B (zh) LncRNA的检测及其在骨质疏松诊治中的应用
CN117587020B (zh) 抑制ST3GAL1基因表达的shRNA及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant