CN114262693B

CN114262693B - 一种低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒和应用

Info

Publication number: CN114262693B
Application number: CN202111470427.4A
Authority: CN
Inventors: 贾凡; 徐富强
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2021-12-03
Filing date: 2021-12-03
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2041-12-03
Also published as: CN114262693A

Abstract

本发明公开了一种低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒及制备方法和应用。所述制备方法包括如下步骤：以pCDNA3.1(+)为骨架载体，采用NheI和XbaI双酶切处理pCDNA3.1(+)，采用同源重组的方式将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列顺次插入到载体中，获得第一克隆；将第一克隆转染BHK21细胞，然后感染伪狂犬病毒PRV531，收集细胞培养基上清；纯化后即获得低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒。本发明的低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

Description

一种低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒和应用。

背景技术

人脑是自然界中最为复杂的系统之一，而神经网络是大脑行使功能的基础。神经网络的正常连接，使得人体产生正常的生理活动，如认知、学习、记忆和恐惧等；神经网络的异常往往导致神经疾病的出现，如：阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等，但是还没有有效的手段来治疗这些神经疾病。目前，正常生理活动和致病机制均不清楚，主要的原因在于脑神经网络连接信息的缺乏。因此，开展脑神经环路的研究而绘制高精度的脑功能连接图谱，对于了解人的生理活动和致病机制具有重要的意义。我国政府高度重视脑科学的研究，《国家中长期科学和技术发展规划》将“脑科学与认知科学”列为八大前沿科学问题之一，有一批科学家已投身于该领域的研究，并取得了一系列的成果。2012年，中国科学院启动了战略性先导科技专项“脑功能联结图谱研究”，并在2014年成立了“脑科学卓越创新中心”。2013年，美国和欧盟已经开始实施人脑图谱研究计划。脑科学研究计划是继人类基因组计划后又一个具有挑战的伟大计划，该计划的研究成果将会和人类基因组计划的成果一样造福人类。性能优良的神经环路示踪工具对于顺利开展该项目具有十分重要的作用。

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)属于疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科成员，基因组为线状双链DNA分子，约150kb，成熟病毒粒子含有约50种蛋白质，PRV除了具有疱疹病毒科成员的优点外，其不感染人，因而成为研究神经环路的重要工具。然而，野生型PRV毒力强，感染大鼠后3天左右即引起死亡，同时具有双向运动的特点，因此，限制了其在神经环路研究中的应用。而由野生型PRV衍生而来的疫苗株(PRV-Bartha)的毒性大大减弱，感染大鼠后10天才引起动物死亡，而且具有严格逆向传播的特点，大大提高了其在神经环路研究中的应用价值。目前为止，研究人员以PRV为对象，构建了一系列的带有荧光蛋白标签的重组PRV，并成功应用于神经网络结构和功能的研究。尽管如此，PRV的毒性较大，标记鼠脑后3天即可导致动物死亡，因此，建立低毒的重组伪狂犬病毒具有十分重要的意义。

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒及制备方法和应用。所述制备方法包括如下步骤：以pCDNA3.1(+)为骨架载体，采用NheI和XbaI双酶切处理pCDNA3.1(+)，采用同源重组的方式将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列顺次插入到载体中，获得第一克隆；将第一克隆转染BHK21细胞，然后感染伪狂犬病毒PRV531，收集细胞培养基上清；纯化后即获得低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒。

本发明提供一种低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法，包括如下步骤：

(1)构建克隆：以pCDNA3.1(+)为骨架载体，采用NheI和XbaI双酶切处理pCDNA3.1(+)，采用同源重组的方式将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列顺次插入到载体中，获得第一克隆；

(2)构建低毒的重组伪狂犬病毒：将步骤(1)所得的第一克隆转染BHK21细胞，然后感染伪狂犬病毒PRV531，收集细胞培养基上清；纯化后即获得低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒。

本发明还提供一种低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒，由所述的制备方法制备得到。

本发明还提供所述的低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在哺乳动物脑神经环路示踪中的应用。

本发明还提供所述的低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在研究药物抑制伪狂犬病毒作用机制中的应用。

本发明还提供所述的低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在开发伪狂犬病毒疫苗中的应用。

本发明还提供所述的低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在建立伪狂犬病毒感染的动物模型中的应用。

本发明还提供所述的低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在分析伪狂犬病毒复制和致病机制中的应用。

本发明还提供所述的低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在建立伪狂犬病毒的药物筛选平台中的应用。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

1.本发明制备了低毒表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒，其毒性与现有PRV相比，毒性显著降低，能更好的实现对神经环路的标记，便于开展相关的研究。该重组病毒的毒性比现有的伪狂犬病毒的毒性显著降低。

2.本发明对于开展伪狂犬病毒的基础性研究(如致病机制、复制机制等)和应用性研究(如神经环路标记、药物筛选、抗原表位分析、新型疫苗和诊断试剂等)具有重要的现实意义和广泛的应用价值。

3.解析神经环路结构是开展脑科学研究的基础，良好用于神经环路标记的工具对于解析神经环路的结构具有重要意义。低毒的表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒能够感染鼠等动物的神经细胞，能作为神经环路标记工具。

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为一种低毒表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的构建示意图。其中，A为低毒表达绿色荧光蛋白克隆的不同元件的顺序示意图；B为伪狂犬病毒Bartha株的基因组示意图；C为重组伪狂犬病毒重组示意图。

图2为一种低毒表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒产生的细胞病变和表达荧光示意图。其中，A为未感染病毒的细胞；B为重组伪狂犬病毒感染BHK21细胞产生的细胞病变；C为重组伪狂犬病毒感染BHK21细胞表达荧光蛋白。

图3为一种低毒表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒感染动物存活结果。实验组为PRV532，是本发明制备的减毒型PRV；对照组为PRV531，是本发明制备的减毒型PRV的母本，为野毒。

图4为一种低毒表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒解析鼠脑神经环路示意图。其中，A为重组伪狂犬病毒标记鼠皮层示意图；B为重组伪狂犬病毒标记鼠内侧隔核示意图；C为重组伪狂犬病毒标记鼠海马示意图；D为重组伪狂犬病毒标记鼠腹侧被盖区示意图；E为重组伪狂犬病毒标记鼠梨状皮层示意图。

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

随着分子生物学的不断发展，科学家已经能够通过反向遗传学的手段来定向改造病毒，为深入开展相关的病毒学研究提供了良好的工具。因此，本发明分别采用不同的技术途径获得了一种低毒且带有荧光蛋白基因的伪狂犬病毒。将在解析脑神经环路、病毒抗原表位分析和药物(如抗体药物)筛选、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值和前景。

本发明提供了一种低毒表达绿色荧光蛋白(Enhanced Green FluorescentProtein，EGFP)的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法。包括如下步骤：

(1)构建克隆：以pCDNA3.1(+)为骨架载体，采用NheI和XbaI处理pCDNA3.1(+)，采用同源重组的方式将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6顺次插入到载体，获得克隆命名为pCDNA3.1(+)-left arm-Ubc-PRVTK-HA-PEST-right arm；

(2)构建低毒的重组伪狂犬病毒：将所得的质粒pCDNA3.1(+)-left arm-Ubc-PRVTK-HA-PEST-right arm转染BHK21细胞，然后感染伪狂犬病毒PRV531，收集细胞培养基上清；纯化后即获得低毒的表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒。

本发明还提供了一种低毒表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的应用，该重组病毒可应用于脑科学研究和药物筛选和抗原表位分析，也在哺乳动物的脑神经环路示踪、药物抑制病毒作用机制的分析、疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立和病毒复制与致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

本发明对哺乳动物的脑神经环路进行示踪，具体的，包括如下步骤：

取0.1μl重组伪狂犬病毒定位注射到鼠海马，感染后2天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；取脑片后使用荧光显微镜观察。

所述的应用对象不仅限于鼠，还能用于猪等动物的神经环路标记；本发明所用的绿色荧光蛋白基因只是作为一个范式，因此，还可用其他外源基因替代本发明的绿色荧光蛋白基因。

实施例1 本发明的低毒表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒的制备方法，包括下述步骤：

(1)构建克隆：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6为质粒的左同源臂和右同源臂，模板来自重组伪狂犬病毒PRV531(Jia F et al.,Front Neuroan at.2019,13:63.)，然后采用PCR的方法扩增病毒重组需要的左同源臂(序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.6)；SEQ ID NO.2是广谱启动子Ubc；SEQ ID NO.3是序列优化后的PRVTK基因；SEQ ID NO.4是HA标签的序列，便于后续对目标基因的表达进行蛋白分析；SEQ ID NO.5序列是PEST降解信号序列。通过PCR获得各自的PCR片段，并采用酶切重组的方式，按照图1的方式将左同源臂(left arm)、Ubc启动子、PRVTK、HA、PEST和右同源臂(right arm)顺次拼接，使用的载体是pCDNA3.1(+)。

扩增相应序列的引物分别如下：DNA片段左同源臂的引物：SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8，模板为PRV531的基因组；DNA片段Ubc启动子的引物：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，模板为pUC57-Ubc，模板来自含有Ubc启动子的pUC57质粒(该质粒为合成的Ubc序列插入到pUC57的载体里面)；DNA片段PRVTK的引物：SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，模板为pUC57-PRVTK(该质粒为合成的PRVTK序列插入到pUC57的载体里面)；DNA片段PEST的引物：SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14，模板为pUC57-PEST(该质粒为合成的PEST序列插入到pUC57的载体里面)；DNA片段右同源臂的引物：SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，模板为PRV531的基因组。本发明所有PCR所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

首先使用NheI和XbaI双酶切pCDNA3.1(+)，然后采用同源重组的方式将SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6顺次插入到载体，获得克隆命名为pCDNA3.1(+)-left arm-Ubc-PRVTK-HA-PEST-right arm。构建的克隆均在生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。

(2)构建低毒表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒：

(a)病毒的重组：将上述构建的质粒pCDNA3.1(+)-left arm-Ubc-PRV TK-HA-PEST-right arm采用脂质体转染的方法转染到BHK21细胞，4小时后更换含有2％FBS的DMEM，并加入伪狂犬病毒PRV531(Jia F et al.,Front Neuroanat.2019,13:63.)。在不同时间观察荧光的表达和细胞的病变情况，感染2天后收集培养基上清(含有病毒液体)，病毒命名为PRV532；

(b)病毒的纯化：采用双层plaque assay的方法，结合荧光显微镜产生的蚀斑(绿色)和产生的浅色斑点的对应特点，挑取含有绿色荧光斑点的浅色空斑到新鲜培养的BHK21细胞(含有2％FBS的DMEM)，37℃，5％(v/v)CO₂培养箱中培养，分别在感染后观察荧光的表达和细胞产生的病变情况，待细胞病变明显且有可见绿色荧光时，将含有细胞的培养板放在-80℃，30min后置于37℃解冻，重复此过程3次；重复上述过程，直到所有的荧光斑和浅色的空斑完全一致，即表示病毒已经纯化；

(c)病毒的扩大培养和浓缩：将病毒感染BH2K1细胞后2天收集培养基上清，400g离心10min，然后使用0.45μm虑膜过滤，采用双层空斑的方法检测每种重组病毒的滴度；采用高速离心的方法对病毒进行浓缩(50000g，离心2.5小时)，(离心前的病毒滴度是9.6×10⁶PFU/ml，离心后的病毒滴度是2.1×10⁹PFU/ml)以便达到动物实验的要求。

实施例2 本发明的低毒表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒毒性明显降低

为了表明本发明毒性比现有的系统具备明显的优势，本实施例将在毒性方面进行分析：一方面，取0.1μl实施例1制备的低毒表达绿色荧光蛋白的逆向神经环路示踪重组伪狂犬病毒PRV532(病毒滴度是2.1×10⁹PFU/ml)定位注射到鼠脑腹侧海马，另一方面，取0.1μl(对照的病毒滴度是1.3×10⁹PFU/ml)伪狂犬病毒PRV531(Jia F et al.,FrontNeuroanat.2019,13:63.)定位注射到鼠脑腹侧海马，分别在注射后观察动物的情况。结果如图3所示，本发明制备的PRV532对动物的毒性比PRV531(Jia F et al.,FrontNeuroanat.2019,13:63.)明显降低(图3)。

实施例3 一种低毒表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒在解析脑神经环路中的应用

包括如下步骤：

取0.1μl实施例1制备的低毒表达绿色荧光蛋白的重组伪狂犬病毒PR V532(病毒滴度是2.1×10⁹PFU/ml)定位注射到鼠脑腹侧海马，感染后7天后麻醉动物，分别用0.9％(V/V)生理盐水灌流，然后用4％(V/V)多聚甲醛固定，取出脑组织浸泡于4％(V/V)多聚甲醛液中，然后将脑组织先置于20％(V/V)蔗糖溶液中1天，然后置于30％(V/V)蔗糖溶液中2天；将脑组织底部切平，置于底座上包埋冰冻1h后切片；挑取脑片使用荧光显微镜观察。

重组病毒注射到鼠脑后，可见绿色荧光蛋白信号，表明重组病毒能够在鼠脑内产生病毒，且该病毒具有表达绿色荧光蛋白的能力。如在皮层(图4中A)，内侧隔核(图4中B)，海马(图4中C)，腹侧被盖区(图4中D)和梨状皮层(图4中E)均有绿色荧光蛋白的表达，表明重组的病毒能够在神经网络中运输，具有标记脑神经环路的能力。

综上，本发明公开了一种低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒及制备方法和应用。所述制备方法包括如下步骤：以pCDNA3.1(+)为骨架载体，采用NheI和XbaI双酶切处理pCDNA3.1(+)，采用同源重组的方式将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列顺次插入到载体中，获得第一克隆；将第一克隆转染BHK21细胞，然后感染伪狂犬病毒PRV531，收集细胞培养基上清；纯化后即获得低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒。本发明的低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在神经环路标记、药物筛选平台的建立、药物抑制病毒作用机制、病毒疫苗和诊断试剂的研发、动物模型的建立、病毒复制和致病机制的分析等方面具有广泛的应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

SEQ ID NO.1

TCACCGCCGCGGCCCGGCGACGTACTCGGCGAGGCCGCGCACGGTCGCGGCCATCGCGCTCGCGTTGCCGCGCGTCTGGGTGCAGGGCAGGCGCGTCACGTCGAGCACGCGCATGCTCCGCTGGGCCACAAACACCAGCAGGGGCACGAGCGTGATCTCCTCGCCGCCCGGGGGCACGGCGGCGGCGAGGAGGCGCGCCGAGTCGCGCAGCTGGCACAGCCCCTCGTGCCGCTGCCCGCGCTTGCTGGGCGTGTTGAGGTTCCGGGGGAAGCGGCACGTCTTGAGCTCGATGACGAAGCACAGGTGCGGCCCCACCCCCAGCCGCACCACGCACACGCAGTCGGGGCGGCGCACCCCGAGGTTGACTTCAAAGGCCAGGGTCAAGGACGCCTTCTTAAGCGTCTCGCGGGGAAGCCCGAAGAGACTCTCGCCGTACGCGGACGGGTCGCGGCGCAGGCGTTCGTAGAAGCGGTTGTGGCAGCGGATCCCCGCCCGGAAGCGCGCCGGGATGCGCAT

SEQ ID NO.2

GCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAGGAGCGTTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGTTCCGTCGCAGCCGGGATTTGGGTCGCGGTTCTTGTTTGTGGATCGCTGTGATCGTCACTTGGTGAGTTGCGGGCTGCTGGGCTGGCCGGGGCTTTCGTGGCCGCCGGGCCGCTCGGTGGGACGGAAGCGTGTGGAGAGACCGCCAAGGGCTGTAGTCTGGGTCCGCGAGCAAGGTTGCCCTGAACTGGGGGTTGGGGGGAGCGCACAAAATGGCGGCTGTTCCCGAGTCTTGAATGGAAGACGCTTGTAAGGCGGGCTGTGAGGTCGTTGAAACAAGGTGGGGGGCATGGTGGGCGGCAAGAACCCAAGGTCTTGAGGCCTTCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGGTTTGTCGTCTGGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGCTTATAATGCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGTGAGGGGAGGGATAAGTGAGGCGTCAGTTTCTTTGGTCGGTTTTATGTACCTATCTTCTTAAGTAGCTGAAGCTCCGGTTTTGAACTATGCGCTCGGGGTTGGCGAGTGTGTTTTGTGAAGTTTTTTAGGCACCTTTTGAAATGTAATCATTTGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGTTAGACTAGTAAATTGTCCGCTAAATTCTGGCCGTTTTTGGCTTTTTTGTTAGAC

SEQ ID NO.3

ATGCGTATACTTAGAATCTACCTCGACGGCGCATACGGTACCGGTAAGAGTACTACCGCTAGGGTTATGGCACTCGGCGGCGCACTATACGTACCCGAACCAATGGCATATTGGCGCACTCTATTCGATACCGATACCGTCGCCGGTATATACGACGCTCAAACGCGTAAACAGAACGGTTCGCTTAGCGAAGAGGACGCCGCACTCGTTACCGCGCAACACCAGGCCGCATTCGCTACACCATATCTGTTATTGCATACGCGACTCGTACCGTTATTCGGACCCGCCGTCGAGGGACCCCCCGAAATGACCGTCGTATTCGATAGGCACCCCGTCGCCGCTACCGTATGTTTTCCCCTCGCTAGGTTTATCGTCGGCGATATTAGCGCCGCCGCATTCGTCGGACTCGCCGCTACACTCCCCGGCGAACCCCCCGGCGGTAATCTCGTCGTCGCTAGTCTCGATCCCGACGAACACCTTAGGCGATTGCGCGCTAGGGCACGCGCCGGCGAACACGTCGACGCTAGACTGCTTACCGCATTGCGTAACGTATACGCTATGCTCGTTAATACTAGTAGGTATCTTAGTAGCGGTAGACGGTGGCGCGACGATTGGGGGCGCGCTCCTAGATTCGATCAGACTACTCGCGATTGTCTCGCACTTAACGAGTTATGTCGCCCTCGCGACGATCCCGAATTGCAGGATACATTGTTCGGCGCATATAAGGCACCCGAATTGTGCGATAGGCGCGGTAGGCCCCTCGAGGTACACGCTTGGGCTATGGACGCACTCGTCGCTAAACTGTTACCGTTACGCGTTAGTACCGTCGATCTCGGACCATCCCCTCGCGCTTGCGCCGCCGCCGTCGCCGCACAGGCACGCGGTATGGAGGTTACCGAATCCGCGTACGGCGATCATATTCGCCAATGCGTATGCGCATTTACTAGCGAAATGGGCGTA

SEQ ID NO.4

TACCCATACGACGTCCCAGACTACGCT

SEQ ID NO.5

GGATATCTCAGCCATGGCTTCCCGCCGGAGGTGGAGGAGCAGGATGATGGCACGCTGCCCATGTCTTGTGCCCAGGAGAGCGGGATGGACCGTCACCCTGCAGCCTGTGCTTCTGCTAGGATCAATGTG

SEQ ID NO.6

CCCTCGCCCCTCCCACCCGCGCCGCGGCCGGATGGAGACCGCGACGGAGGCAACGACGACGGCGTGGGAGGGGGCTCGGGGCGCGTATAAAGCCATGTGTATGTCATCCCAATAAAGTTTGCCGTGCCCGTCACCATGCCCGCGTCGTCCGTGCGCCTCCCGCTGCGCCTCCTGACCCTCGCGGGCCTCCTGGCCCTCGCGGGGGCCGCCGCCCTCGCCCGCGGCGCGCCGCAGGGTGGGCCGCCCTCGCCGCAGGGGGGTCCCGCGCCCACCGCGGCGCCCGCGCGCGGGCCCACCCTGTTCGTCCTGGACGGCGACGGCTCCGCGTGGTTCGTCTTCCAGCTCGGCGGGCTGGGGGCGCTCAACGACACGCGCATCCGCGGGCACCTGCTCGGCCGGTACCTCGTCTCGTACCAGGTGGTGCCCCCGCCCGTCTCCGCGTGGTACTTTGTGCAGCGCCCGCGCGAGCGCCCGCGCCTCTCGGGGCCGCCCTCGGGCGCGGAGCTCGTGGCCTTCGACGCGCCCGGCGTCCGGCGCACGTACACCACGGCGGCGGTGTGGCCCGCGGAGGTGGCCGTCCTCGCGGACGCGGAGGCGCGCTGCCCCGCGGCCGTCTTCAACGTGACGCTGGGCGAGGCCTTCCTCGGCCTGCGCGTCGCGCTGCGCTCCTTCCTGCCGCTGGAGGTCATCATCTCCGCCGAGCGGATGCGCATGATCGCGCCCCCGGCGCTCGGCTCGGACCTGGAGCCGCCGGGCCCGCCCGCGGGCCGCTTCCACGTGTACACGCTCGGCTTCCTCTCCGACGGGGCCATGCACCAGACGATGCGCGACGTGGCCGCCTACGTGCACGAGAGCGACGACTACCTCGCCCAGCTGTCGGCGGCGCACGC

SEQ ID NO.7

GGGAGACCCAAGCTGGCTAGCggccgcgcggcggcg

SEQ ID NO.8

ATGCGCATCCCGGCGCGCTTC

SEQ ID NO.9

AAGCGCGCCGGGATGCGCATGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCC

SEQ ID NO.10

TAGATTCTAAGTATACGCATGGTATCGATTCCGAGCTCGTCTAACAAAAAAGCCAAAAA

SEQ ID NO.11

ATGCGTATACTTAGAATCTAC

SEQ ID NO.12

AGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATACGCCCATTTCGCTAGTAAA

SEQ ID NO.13

ACGACGTCCCAGACTACGCTGGATATCTCAGCCATGGCTT

SEQ ID NO.14

TTACACATTGATCCTAGCAGAAGC

SEQ ID NO.15

CTGCTAGGATCAATGTGTAACCCTCGCCCCTCCCACCCGCG

SEQ ID NO.16

GGTTTAAACGGGCCCTCTAGAGCGTGCGCCGCCGACAGCTGG

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院深圳先进技术研究院

<120> 一种低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒和应用

<130> 20211203

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 516

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcaccgccgc ggcccggcga cgtactcggc gaggccgcgc acggtcgcgg ccatcgcgct 60

cgcgttgccg cgcgtctggg tgcagggcag gcgcgtcacg tcgagcacgc gcatgctccg 120

ctgggccaca aacaccagca ggggcacgag cgtgatctcc tcgccgcccg ggggcacggc 180

ggcggcgagg aggcgcgccg agtcgcgcag ctggcacagc ccctcgtgcc gctgcccgcg 240

cttgctgggc gtgttgaggt tccgggggaa gcggcacgtc ttgagctcga tgacgaagca 300

caggtgcggc cccaccccca gccgcaccac gcacacgcag tcggggcggc gcaccccgag 360

gttgacttca aaggccaggg tcaaggacgc cttcttaagc gtctcgcggg gaagcccgaa 420

gagactctcg ccgtacgcgg acgggtcgcg gcgcaggcgt tcgtagaagc ggttgtggca 480

gcggatcccc gcccggaagc gcgccgggat gcgcat 516

<210> 2

<211> 1204

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgccgggtt ttggcgcctc ccgcgggcgc ccccctcctc acggcgagcg ctgccacgtc 60

agacgaaggg cgcaggagcg ttcctgatcc ttccgcccgg acgctcagga cagcggcccg 120

ctgctcataa gactcggcct tagaacccca gtatcagcag aaggacattt taggacggga 180

cttgggtgac tctagggcac tggttttctt tccagagagc ggaacaggcg aggaaaagta 240

gtcccttctc ggcgattctg cggagggatc tccgtggggc ggtgaacgcc gatgattata 300

taaggacgcg ccgggtgtgg cacagctagt tccgtcgcag ccgggatttg ggtcgcggtt 360

cttgtttgtg gatcgctgtg atcgtcactt ggtgagttgc gggctgctgg gctggccggg 420

gctttcgtgg ccgccgggcc gctcggtggg acggaagcgt gtggagagac cgccaagggc 480

tgtagtctgg gtccgcgagc aaggttgccc tgaactgggg gttgggggga gcgcacaaaa 540

tggcggctgt tcccgagtct tgaatggaag acgcttgtaa ggcgggctgt gaggtcgttg 600

aaacaaggtg gggggcatgg tgggcggcaa gaacccaagg tcttgaggcc ttcgctaatg 660

cgggaaagct cttattcggg tgagatgggc tggggcacca tctggggacc ctgacgtgaa 720

gtttgtcact gactggagaa ctcgggtttg tcgtctggtt gcgggggcgg cagttatgcg 780

gtgccgttgg gcagtgcacc cgtacctttg ggagcgcgcg cctcgtcgtg tcgtgacgtc 840

acccgttctg ttggcttata atgcagggtg gggccacctg ccggtaggtg tgcggtaggc 900

ttttctccgt cgcaggacgc agggttcggg cctagggtag gctctcctga atcgacaggc 960

gccggacctc tggtgagggg agggataagt gaggcgtcag tttctttggt cggttttatg 1020

tacctatctt cttaagtagc tgaagctccg gttttgaact atgcgctcgg ggttggcgag 1080

tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt tgaaatgtaa tcatttgggt caatatgtaa 1140

ttttcagtgt tagactagta aattgtccgc taaattctgg ccgtttttgg cttttttgtt 1200

agac 1204

<210> 3

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcgtatac ttagaatcta cctcgacggc gcatacggta ccggtaagag tactaccgct 60

agggttatgg cactcggcgg cgcactatac gtacccgaac caatggcata ttggcgcact 120

ctattcgata ccgataccgt cgccggtata tacgacgctc aaacgcgtaa acagaacggt 180

tcgcttagcg aagaggacgc cgcactcgtt accgcgcaac accaggccgc attcgctaca 240

ccatatctgt tattgcatac gcgactcgta ccgttattcg gacccgccgt cgagggaccc 300

cccgaaatga ccgtcgtatt cgataggcac cccgtcgccg ctaccgtatg ttttcccctc 360

gctaggttta tcgtcggcga tattagcgcc gccgcattcg tcggactcgc cgctacactc 420

cccggcgaac cccccggcgg taatctcgtc gtcgctagtc tcgatcccga cgaacacctt 480

aggcgattgc gcgctagggc acgcgccggc gaacacgtcg acgctagact gcttaccgca 540

ttgcgtaacg tatacgctat gctcgttaat actagtaggt atcttagtag cggtagacgg 600

tggcgcgacg attgggggcg cgctcctaga ttcgatcaga ctactcgcga ttgtctcgca 660

cttaacgagt tatgtcgccc tcgcgacgat cccgaattgc aggatacatt gttcggcgca 720

tataaggcac ccgaattgtg cgataggcgc ggtaggcccc tcgaggtaca cgcttgggct 780

atggacgcac tcgtcgctaa actgttaccg ttacgcgtta gtaccgtcga tctcggacca 840

tcccctcgcg cttgcgccgc cgccgtcgcc gcacaggcac gcggtatgga ggttaccgaa 900

tccgcgtacg gcgatcatat tcgccaatgc gtatgcgcat ttactagcga aatgggcgta 960

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tacccatacg acgtcccaga ctacgct 27

<210> 5

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggatatctca gccatggctt cccgccggag gtggaggagc aggatgatgg cacgctgccc 60

atgtcttgtg cccaggagag cgggatggac cgtcaccctg cagcctgtgc ttctgctagg 120

atcaatgtg 129

<210> 6

<211> 890

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccctcgcccc tcccacccgc gccgcggccg gatggagacc gcgacggagg caacgacgac 60

ggcgtgggag ggggctcggg gcgcgtataa agccatgtgt atgtcatccc aataaagttt 120

gccgtgcccg tcaccatgcc cgcgtcgtcc gtgcgcctcc cgctgcgcct cctgaccctc 180

gcgggcctcc tggccctcgc gggggccgcc gccctcgccc gcggcgcgcc gcagggtggg 240

ccgccctcgc cgcagggggg tcccgcgccc accgcggcgc ccgcgcgcgg gcccaccctg 300

ttcgtcctgg acggcgacgg ctccgcgtgg ttcgtcttcc agctcggcgg gctgggggcg 360

ctcaacgaca cgcgcatccg cgggcacctg ctcggccggt acctcgtctc gtaccaggtg 420

gtgcccccgc ccgtctccgc gtggtacttt gtgcagcgcc cgcgcgagcg cccgcgcctc 480

tcggggccgc cctcgggcgc ggagctcgtg gccttcgacg cgcccggcgt ccggcgcacg 540

tacaccacgg cggcggtgtg gcccgcggag gtggccgtcc tcgcggacgc ggaggcgcgc 600

tgccccgcgg ccgtcttcaa cgtgacgctg ggcgaggcct tcctcggcct gcgcgtcgcg 660

ctgcgctcct tcctgccgct ggaggtcatc atctccgccg agcggatgcg catgatcgcg 720

cccccggcgc tcggctcgga cctggagccg ccgggcccgc ccgcgggccg cttccacgtg 780

tacacgctcg gcttcctctc cgacggggcc atgcaccaga cgatgcgcga cgtggccgcc 840

tacgtgcacg agagcgacga ctacctcgcc cagctgtcgg cggcgcacgc 890

Claims

1.一种低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒，其特征在于，所述重组伪狂犬病毒的制备方法如下：

(1)构建克隆：以pCDNA3.1(+)为骨架载体，采用NheI和XbaI双酶切处理pCDNA3.1(+)，采用同源重组的方式将SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列顺次插入到载体中，获得第一克隆；

2.权利要求1所述的低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在开发伪狂犬病毒疫苗中的应用。

3.权利要求1所述的低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在建立伪狂犬病毒感染的动物模型中的应用。

4.权利要求1所述的低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在哺乳动物脑神经环路示踪中的应用。

5.权利要求1所述的低毒的逆向神经环路示踪的重组伪狂犬病毒在建立伪狂犬病毒的药物筛选平台中的应用。