CN107586759A - 一种重组新城疫病毒的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种重组新城疫病毒的构建方法及应用，属于微生物技术领域。所述的重组新城疫病毒含有如SEQ ID NO：1所示的DNA序列。所述的重组新城疫病毒DNA包括由于插入、缺失或突变导致的与SEQ ID NO：1同源性超过90%以上的衍生DNA序列。所述的重组新城疫病毒的构建方法包括构建携带IP10基因质粒、重组病毒的拯救和病毒生长。本发明构建出了表达IP10蛋白的rNDV‑IP10，为以后探究rNDV‑IP10的联合抗瘤作用奠定基础。

Description

一种重组新城疫病毒的构建方法及应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种重组新城疫病毒的构建方法及应用。

背景技术

癌症是引起人类死亡的重要原因之一。因为前期缺乏特异性的观测指标，所以人们往往不能及时发现和治疗，从而错过了最佳治疗时间。另外，对于肿瘤的治疗往往也缺乏有效的药物和治疗手段。随着研究的深入，溶瘤病毒治疗吸引越来越多研究者的关注。溶瘤病毒能够增强肿瘤相关抗原的表达，引起肿瘤特异性免疫反应。新城疫病毒作为溶瘤病毒家族中的一员也逐渐被人们认识和研究。

新城疫病毒（NDV）为副粘病毒科、腮腺炎病毒属的单股负链RNA病毒，核酸长度为15186bp,核酸序列为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，每一个基因都有独立的基因起始区（GS）、基因终止区(GE)和基因间序列（IG）。根据对鸟类致病力不同可以将病毒分为三种：强毒株、中强毒株、弱毒株。新城疫病毒的致病性通常被认为由F基因所决定。F基因产生的F蛋白以F₀融合蛋白形式存在，只有经胰蛋白酶作用后才具有重新感染细胞的能力。新城疫病毒感染人体后，不依赖于人体细胞分裂能够独立复制，并且不会将基因组整合到人的基因组中。另外，新城疫病毒能够诱导肿瘤细胞凋亡，而对人体正常细胞无明显毒副作用。虽然中强毒株对肿瘤的杀伤作用更强，但是考虑到保存和利用的不恰当，流落到自然界，会给鸟类和家禽业带来重大损失。并且中强毒株对正常细胞的杀伤作用也远高于弱毒株。考虑到以上方面，弱毒株组Lasota将作为溶瘤药物的很好选择。

干扰素γ诱导蛋白10（IP10/CXCL10）是一种分子量为10KDa的细胞因子，为CXC趋化家族的一员。通过与CXCR3配体结合，能够趋化NK细胞，活化CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞等。它由活化的T细胞、单核细胞、NK等细胞分泌。它能够通过趋化细胞毒性T细胞杀伤肿瘤细胞。并且，IP10具体抑制血管生成的作用，它能够独自或与其它药物共同作用治疗肿瘤。

随着反向遗传学技术的迅速发展，将新城疫病毒与免疫治疗相结合提供了可能。在本研究中，我们将具有肿瘤选择性的新城疫病毒Lasota和具有趋化免疫细胞的IP10基因序列进行重组，利用反向遗传学技术拯救出重组病毒rNDV-IP10。并且，验证了重组病毒的生长动力学和IP10基因的表达，为以后的研究建立基础。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种重组新城疫病毒及其应用。

本发明的另一目的是提供该重组新城疫病毒的构建方法。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述的重组新城疫病毒含有如SEQ IDNO：1所示的DNA序列。

进一步地，所述的重组新城疫病毒DNA包括由于插入、缺失或突变导致的与SEQ IDNO：1同源性超过90%以上的衍生DNA序列。

进一步地，重组新城疫病毒的构建方法包括构建携带IP10基因质粒、重组病毒的拯救和病毒生长，具体构建步骤如下：

(1) 构建携带IP10基因质粒：使用限制性内切酶酶切开pBRN-FL-PmeⅠ载体中P和M基因间的PmeⅠ位点，使用上游引物和下游引物通过PCR扩增出携带GN和GE片段的IP10基因，然后使用胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将纯化的产物用重组酶克隆入pBRN-FL-PmeⅠ载体中，构建出携带IP10基因的质粒，命名为pBRN-FL-IP10；

(2) 重组病毒的拯救：将BSR-7细胞铺于六孔板中，待细胞长满六孔板约80%时，将5μg的pBRN-FL-IP10质粒和2.5μg的pBS-NP质粒、1.25μg的pBS-P质粒和1.25μg 的pBS-L质粒共转染入BSR-7细胞；12小时后用10%的DMSO休克细胞2.5min，用1×pbs溶液洗一次，然后加入完全培养基；24小时后换成opti-MEM并加入TPCK，将细胞放入培养箱中培养3天后，刮取细胞用0.25μm过滤器过滤，滤液注入9~11日龄的SPF鸡胚尿囊腔中；注射后的鸡胚在孵化箱中继续孵育5天后，抽取鸡胚尿囊液50μl，用1%鸡红细胞测病毒效价，收取效价阳性鸡胚尿囊液，即rNDV-IP10，放入-80℃保存；

(3) 病毒生长：将rNDV-IP10以MOI=0.01感染24孔板中的CEF细胞一小时后，去除病毒稀释液，随后加入10%FBS的DMEM继续培养，每隔24小时收集细胞培养液，将收集到的培养液再次感染CEF细胞。

进一步地，所述的上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，所述的下游引物序列如SEQID NO：3所示。

进一步地，所述的重组酶为重组酶ExnaseTM II。

进一步地，所述的步骤（2）加入TPCK的浓度为1μg/ml。

进一步地，所述的步骤（2）SPF鸡胚尿囊腔中浓度为400μl/枚。

进一步地，根据以上所述DNA序列拯救出的重组新城疫病毒。

进一步地，根据以上所述的重组新城疫病毒在治疗恶性肿瘤的药物中的应用。

首先，溶瘤病毒对人体的安全性需要被考虑。新城疫病毒对Ⅰ型干扰素比较敏感，而许多肿瘤细胞缺乏干扰素信号转导通路，所以致使新城疫病毒能在肿瘤细胞中复制而不能在正常细胞中生长。另外，肿瘤细胞也缺乏相应的抗病毒信号通路。数据表明，新城疫病毒在肿瘤细胞中的复制能力是正常细胞的10000倍，并且不具有嗜神经性。临床结果表明，即使当人体感染新城疫病毒后也仅表现出轻微流感样病理反应，而没有其它严重的病理反应。根据以上特性说明它被作为药物具有人们所注重的安全性。另外，新城疫病毒可刺激机体的免疫功能，通过诱导细胞毒性T细胞、NK细胞、单核细胞等来增强机体的抗瘤作用。虽然部分新城疫病毒株被用于临床，并取得一定的疗效，但是它的溶瘤疗效仍然需要被提高。随着反向遗传学技术成熟，研究者正通过对新城疫病毒基因改造来增强溶瘤效果。将外源基因——IL2、IL15、NS1等插入到新城疫病毒基因中发现，外源基因的插入不会影响病毒的复制，并且目的基因能够正常表达。更重要的是，重组新城疫病毒对肿瘤细胞的选择性杀伤作用没有改变，并增强了对肿瘤细胞的杀伤作用。重组新城疫病毒明显抑制了肿瘤的生长和延长了小鼠的生存时间。

本发明突出的实质性进步和显著的特点是：

IP10通过与CXCR3配体结合定向趋化CD4⁺T、CD8⁺T、NK细胞等抑制肿瘤。并且能够与其它基因或是药物联合治疗肿瘤，明显延长了动物生存时间和抑制了肿瘤血管的生成。本研究中，我们通过反向遗传技术将IP10序列插入到新城疫病毒基因组中。最终成功构建出了表达IP10蛋白的rNDV-IP10，为以后探究rNDV-IP10的联合抗瘤作用奠定基础。

附图说明

图1是实施例2构建携带IP10基因的重组NDV-IP10病毒示意图；图中显示在新城疫病毒P和M基因间的PmeⅠ位点插入IP10基因；其中，白色方格代表基因起始序列，黑色方格代表基因终止序列。

图2是实施例2 NDV-IP10和NDV病毒在CEF细胞中的生长曲线示意图。

图3是实施例2目的基因IP10的间接免疫荧光结果。

图4是实施例2重组病毒NDV-IP10和NDV western blot检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

1、材料和方法

细胞和质粒

能稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR-7细胞、原代鸡胚成纤维细胞（CEF细胞）和乳仓鼠肾细胞（BHK-21细胞）均用10%FBS的DMEM培养，生长环境为37℃和5%CO₂。使用弱毒株Lasota 作为重组病毒的载体。重组新城疫病毒基因组转录载体pBRN-FL-PmeⅠ及辅助质粒pBS-NP、pBS-P和pBS-L以上质粒和细胞均有哈尔滨兽医研究所提供。MHCC-97L细胞为本实验室保存，使用含10%FBS的高糖DMEM培养。IP10的编码基因序列由长沙优宝生物科技有限公司合成，由pMD18-T载体携带。SPF鸡胚由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

试剂

重组酶ExnaseTM II、Taq酶及限制性内切酶均购自Vazyme公司。磷酸钙试剂盒购自Invitrogen。小鼠抗人Ip10抗体购自Abcam公司。小鼠抗人β-actin抗体购自武汉三鹰公司。FITC标记山羊抗鼠抗体购自sigma公司。携带IgG-HRP标记的山羊抗小鼠抗体购自北京全式金有限公司。ECL 超敏化学发光检测试剂盒购自索莱宝公司。荧光显微镜购自奥林巴斯公司。

构建携带IP10基因质粒

使用限制性内切酶切开pBRN-FL-PmeⅠ载体中P和M基因间的PmeⅠ位点。使用上游引物（5’-AGGTCCAACTCTGTTTAAACTTAGAAAAAATACGGGTAGAAGTGCCACCATGAATCAAACTGCCATTCTG-3’）和下游引物（5’-ATTGCCGCTTGGGTTTAAACTTAAGGAGATCTTTTAGACCTTTCC -3’）通过PCR扩增出携带基因起始序列（GN）和基因终止序列（GE）的IP10基因序列。然后使用胶回收试剂盒纯化目的基因片段。将纯化的产物用重组酶克隆入pBRN-FL-PmeⅠ载体中，构建出携带IP10基因的质粒。对构建的质粒进行测序，挑选出正确质粒命名为pBRN-FL-IP10。

重组病毒的拯救

将BSR-7细胞铺于六孔板中，待细胞长满六孔板约80%时，将5μg的pBRN-FL-IP10质粒和2.5μg的pBS-NP质粒、1.25μg的pBS-P质粒和1.25μg 的pBS-L质粒共转染入BSR-7细胞。12小时后用10%的DMSO休克细胞2.5min，用1×pbs溶液洗一次，然后加入完全培养基。24小时后换成opti-MEM并加入TPCK (1μg/ml)。将细胞放入细胞培养箱继续培养。3天后刮取细胞，将混合液使用0.25μm过滤器过滤。滤液注入9~11日龄的SPF鸡胚尿囊腔中（400μl/枚）。注射后的鸡胚在孵化箱中继续孵育5天。随后抽取鸡胚尿囊液50μl，用1%鸡红细胞测病毒效价。收取效价阳性鸡胚尿囊液，放入-80℃保存。

病毒生长曲线

使用CEF细胞检测病毒的生长动力学。简而言之，将NDV和rNDV-IP10以MOI=0.01感染24孔板中的CEF细胞一小时后，去除病毒稀释液，随后加入10%FBS的DMEM继续培养。每隔24小时收集细胞培养液，将收集到的培养液再次感染CEF细胞。病毒滴度使用终点滴定检测和50%组织细胞感染量（TCID50）计算。

间接免疫荧光

将NDV和rNDV-IP10以MOI=0.0001感染BHK-21细胞1小时，随后去除病毒稀释液换成含10%FBS培养基继续培养24小时。弃掉培养液，用1×PBST洗两次；4%的多聚甲醛室温固定15min。弃掉固定液，随后用1×PBST洗三遍，每次五分钟。含1%的BSA溶液室温封闭1小时。小鼠抗人IP10抗体室温孵育1小时；弃掉抗体稀释液，用1×PBST洗三次，每次5min；使用FITC标记山羊抗鼠抗体避光孵育30min。1×PBST洗三次，每次5min。最后使用荧光显微镜观察荧光。

分别用NDV和rNDV-IP10以MO=0.1感染MHCC-97L细胞1h，随后加入含10%FB的高糖DMEM继续培养，36h后收获细胞。冰上裂解细胞30min后12000×g离心15min，收取上清。将样品用12%SDS-PAGE分离，然后将凝胶中的样品通过湿转法转移到0.2μm的PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1小时。小鼠抗人IP10特异性抗体和小鼠抗人β-actin特异性抗体4℃孵育过夜。TBST洗膜，使用辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗小鼠抗体孵育1小时。TBST洗膜，用ECL发光液浸泡后扫膜。

实施例2

2 结果

重组病毒NDV-IP10的产生

IP10基因序列插入到重组病毒质粒的P和M基因间（图1），将重组质粒命名为pBRN-FL-IP10。重组质粒pBRN-FL-IP10和pBS-NP、pBS-P和pBS-L共转染入BSR-7细胞，拯救出重组病毒rNDV-IP10。然后将收集到的培养液注入9~ 11日龄鸡胚尿囊腔中扩增，5天后收取尿囊液测得血凝效价滴度约为1：256，收取阳性尿囊液。

重组病毒生长特征

为了探究外源基因的插入是否影响重组病毒的生长，我们使用CEF细胞测定病毒的生长特征。利用无外源基因的亲本NDV作为对照组。如图2所示，两种病毒的生长特征基本相同，约在72h时滴度最高。结果证明，插入外源基因的rNDV-IP10在CEF细胞中能够如亲本一样正常生长复制。

间接免疫荧光

为了验证重组病毒rNDV-IP10能够成功表达外源基因IP10，采用间接免疫荧光技术来追踪目的基因。如图3所示，感染了rNDV-IP10的BHK细胞能够表达IP10蛋白，而感染了亲本NDV的细胞未能表达IP10。结果证明，重组病毒NDV-IP10能够成功表达IP10基因。

重组NDV-IP10在MHCC-97L细胞中的表达

为了验证rNDV-IP10能否在肿瘤细胞中正常表达IP10基因,我们使用western blot检测IP10蛋白的表达。根据图4所示，感染了rNDV-I10的细胞蛋白样品有特异条带，而感染了NDV的样品没有出现条带。由此可以得出结论，rNDV-IP10可以在肝癌细胞中成功表达IP10基因。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的包含范围之内。

序列表

<110> 广西医科大学

<120> 一种重组新城疫病毒的构建方法及应用

<130> 2017

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15528

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<220>

<221> misc_feature

<223> 对人工序列的描述：构建重组新城疫病毒的DNA序列

<400> 1

accaaacaga gaatccgtga gttacgataa aaggcgaaag agcaattgaa gtcacacggg 60

tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagcacaaac tcgagaaagc cttctgccaa 120

catgtcctcc gtatttgatg agtacgaaca gctcctcgcg gctcagactc gccccaacgg 180

agctcatgga gggggagaaa aagggagtac cttaaaagta gacgtcccgg tattcactct 240

taacagtgat gacccagaag atagatggag ctttgtggta ttctgcctcc ggattgctgt 300

tagcgaagat gccaacaaac cactcaggca aggtgctctc atatctcttt tatgctccca 360

ctcacaggta atgaggaacc atgttgccct tgcagggaaa cagaatgaag ccacattggc 420

cgtgcttgag attgatggct ttgccaacgg cacgccccag ttcaataata ggagtggagt 480

gtctgaagag agagcacaga gatttgcgat gatagcagga tctctccctc gggcatgcag 540

caacggaacc ccgttcgtca cagccggggc cgaagatgat gcaccagaag acatcaccga 600

taccctggag aggatcctct ctatccaggc tcaagtatgg gtcacagtag caaaagccat 660

tactgcgtat gagactgcag atgagtcgga aacaaggcga atcaataagt atatgcagca 720

aggcagggtc caaaagaaat acatcctcta ccccgtatgc aggagcacaa tccaactcac 780

gatcagacag tctcttgcag tccgcatctt tttggttagc gagctcaaga gaggccgcaa 840

cacggcaggt ggtacctcta cttattataa cctggtaggg gacgtagact catacatcag 900

gaataccggg cttactgcat tcttcttgac actcaagtac ggaatcaaca ccaagacatc 960

agcccttgca cttagtagcc tctcaggcga catccagaag atgaagcagc tcatgcgttt 1020

gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacatta cttggtgata gtgaccagat 1080

gagctttgcg cctgccgagt atgcacaact ttactccttt gccatgggta tggcatcagt 1140

cctagataaa ggtactggga aataccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 1200

gagacttgga gtagagtacg ctcaggctca gggaagtagc attaacgagg atatggctgc 1260

cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag gggcctggca gctgctgccc aacgggtctc 1320

cgaggagacc agcagcatag acatgcctac tcaacaagtc ggagtcctca ctgggcttag 1380

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cggggatggg gagacccaat tcctggatcg gatgagagcg gtagcaaata gcatgaggga 1500

ggcgccaaac tctgcacagg gcactcccca atcggggcct cccccaactc ctgggccatc 1560

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ctcaaacaaa catccccctc tttcctccct ccccctgctg tacaactccg cacgccctag 1740

ataccacagg cacaatgcgg ctcactaaca atcaaaacag agccgaggga attagaaaaa 1800

agtacgggta gaagagggat attcagagat cagggcaagt ctcccgagtc tctgctctct 1860

cctctacctg atagaccagg acaaacatgg ccacctttac agatgcagag atcgacgagc 1920

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ctgacaaaca accatccaca cccgagcaaa cgaccccgca tgacagcccg ccggccacat 2160

ccgccgacca gccccccacc caggccacag acgaagccgt cgacacacag ctcaggaccg 2220

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ctggaaacca gggcacagac gtgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac 2460

tatcagctgg tgcaacccct catgctctcc gatcaaggca gagccaagac aatacccttg 2520

tatctgcgga tcatgtccag ccacctgtag actttgtgca agcgatgatg tctatgatgg 2580

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tgagtgatct acgggcagtt gcccgatctc acccggtttt agtttcaggc cctggagacc 2820

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tcctaagcaa gttagatgca gccgggtcga tcgaggaaat caggaaaatc aagcgccttg 3060

ctctaaatgg ctaattacta ctgccacacg tagcgggtcc ctgtccactc ggcatcacac 3120

ggaatctgca ccgagttccc ccccgcagac ccaaggtcca actctgttta aacttagaaa 3180

aaatacgggt agaagtgcca ccatgaatca aactgccatt ctgatttgct gccttatctt 3240

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aagccaattt tgtccacgtg ttgagatcat tgctacaatg aaaaagaagg gtgagaagag 3420

atgtctgaat ccagaatcga aggccatcaa gaatttactg aaagcagtta gcaaggaaag 3480

gtctaaaaga tctccttaag tttaaaccca agcggcaatc ctctctcgct tcctcagccc 3540

cactgaatga tcgcgtaacc gtaattaatc tagctacatt taagattaag aaaaaatacg 3600

ggtagaattg gagtgcccca attgtgccaa gatggactca tctaggacaa ttgggctgta 3660

ctttgattct gcccattctt ctagcaacct gttagcattt ccgatcgtcc tacaagacac 3720

aggagatggg aagaagcaaa tcgccccgca atataggatc cagcgccttg acttgtggac 3780

tgatagtaag gaggactcag tattcatcac cacctatgga ttcatctttc aagttgggaa 3840

tgaagaagcc actgtcggca tgatcgatga taaacccaag cgcgagttac tttccgctgc 3900

gatgctctgc ctaggaagcg tcccaaatac cggagacctt attgagctgg caagggcctg 3960

tctcactatg atagtcacat gcaagaagag tgcaactaat actgagagaa tggttttctc 4020

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atacaaggtg aactttgtct ccttgactgt ggtaccgaag aaggatgtct acaagatccc 4200

tgctgcagta ttgaaggttt ctggctcgag tctgtacaat cttgcgctca atgtcactat 4260

taatgtggag gtagacccga ggagtccttt ggttaaatct ctgtctaagt ctgacagcgg 4320

atactatgct aacctcttct tgcatattgg acttatgacc accgtagata ggaaggggaa 4380

gaaagtgaca tttgacaagc tggaaaagaa aataaggagc cttgatctat ctgtcgggct 4440

cagtgatgtg ctcgggcctt ccgtgttggt aaaagcaaga ggtgcacgga ctaagctttt 4500

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agcaggtacc caacgcgctg tcgcagtgac cgccgaccac gaggttacct ctactaagct 4680

ggagaagggg cacacccttg ccaaatacaa tccttttaag aaataagctg cgtctctgag 4740

attgcgctcc gcccactcac ccagatcatc atgacacaaa aaactaatct gtcttgatta 4800

tttacagtta gtttacctgt ctatcaagtt agaaaaaaca cgggtagaag attctggatc 4860

ccggttggcg ccctccaggt gcaagatggg ctccagacct tctaccaaga acccagcacc 4920

tatgatgctg actatccggg ttgcgctggt actgagttgc atctgtccgg caaactccat 4980

tgatggcagg cctcttgcag ctgcaggaat tgtggttaca ggagacaaag ccgtcaacat 5040

atacacctca tcccagacag gatcaatcat agttaagctc ctcccgaatc tgcccaagga 5100

taaggaggca tgtgcgaaag cccccttgga tgcatacaac aggacattga ccactttgct 5160

cacccccctt ggtgactcta tccgtaggat acaagagtct gtgactacat ctggaggggg 5220

gagacagggg cgccttatag gtgccattat tggcggtgtg gctcttgggg ttgcaactgc 5280

cgcacaaata acagcggccg cagctctgat acaagccaaa caaaatgctg ccaacatcct 5340

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atcgcaacta gcagtggcag ttgggaagat gcagcagttt gttaatgacc aatttaataa 5460

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acttgacacc tcatactgta tagaaactga cttagattta tattgtacaa gaatagtaac 5940

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ctcaaagacc gaaggcgcac ttactacacc atacatgact atcaaaggtt cagtcatcgc 6060

caactgcaag atgacaacat gtagatgtgt aaaccccccg ggtatcatat cgcaaaacta 6120

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aactttaagg ctcagtgggg aattcgatgt aacttatcag aagaatatct caatacaaga 6240

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ctcgatcagt aatgctttga ataagttaga ggaaagcaac agaaaactag acaaagtcaa 6360

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acaaaagacc ttattatggc ttgggaataa tactctagat cagatgagag ccactacaaa 6540

aatgtgaaca cagatgagga acgaaggttt ccctaatagt aatttgtgtg aaagttctgg 6600

tagtctgtca gttcagagag ttaagaaaaa actaccggtt gtagatgacc aaaggacgat 6660

atacgggtag aacggtaaga gaggccgccc ctcaattgcg agccaggctt cacaacctcc 6720

gttctaccgc ttcaccgaca acagtcctca atcatggacc gcgccgttag ccaagttgcg 6780

ttagagaatg atgaaagaga ggcaaaaaat acatggcgct tgatattccg gattgcaatc 6840

ttattcttaa cagtagtgac cttggctata tctgtagcct cccttttata tagcatgggg 6900

gctagcacac ctagcgatct tgtaggcata ccgactagga tttccagggc agaagaaaag 6960

attacatcta cacttggttc caatcaagat gtagtagata ggatatataa gcaagtggcc 7020

cttgagtctc cgttggcatt gttaaaaact gagaccacaa ttatgaacgc aataacatct 7080

ctctcttatc agattaatgg agctgcaaac aacagtgggt ggggggcacc tatccatgac 7140

ccagattata taggggggat aggcaaagaa ctcattgtag atgatgctag tgatgtcaca 7200

tcattctatc cctctgcatt tcaagaacat ctgaatttta tcccggcgcc tactacagga 7260

tcaggttgca ctcgaatacc ctcatttgac atgagtgcta cccattactg ctacacccat 7320

aatgtaatat tgtctggatg cagagatcac tcacattcat atcagtattt agcacttggt 7380

gtgctccgga catctgcaac agggagggta ttcttttcta ctctgcgttc catcaacctg 7440

gacgacaccc aaaatcggaa gtcttgcagt gtgagtgcaa ctcccctggg ttgtgatatg 7500

ctgtgctcga aagtcacgga gacagaggaa gaagattata actcagctgt ccctacgcgg 7560

atggtacatg ggaggttagg gttcgacggc cagtaccacg aaaaggacct agatgtcaca 7620

acattattcg gggactgggt ggccaactac ccaggagtag ggggtggatc ttttattgac 7680

agccgcgtat ggttctcagt ctacggaggg ttaaaaccca attcacccag tgacactgta 7740

caggaaggga aatatgtgat atacaagcga tacaatgaca catgcccaga tgagcaagac 7800

taccagattc gaatggccaa gtcttcgtat aagcctggac ggtttggtgg gaaacgcata 7860

cagcaggcta tcttatctat caaggtgtca acatccttag gcgaagaccc ggtactgact 7920

gtaccgccca acacagtcac actcatgggg gccgaaggca gaattctcac agtagggaca 7980

tctcatttct tgtatcaacg agggtcatca tacttctctc ccgcgttatt atatcctatg 8040

acagtcagca acaaaacagc cactcttcat agtccttata cattcaatgc cttcactcgg 8100

ccaggtagta tcccttgcca ggcttcagca agatgcccca acccgtgtgt tactggagtc 8160

tatacagatc catatcccct aatcttctat agaaaccaca ccttgcgagg ggtattcggg 8220

acaatgcttg atggtgtaca agcaagactt aaccctgcgt ctgcagtatt cgatagcaca 8280

tcccgcagtc gcattactcg agtgagttca agcagtacca aagcagcata cacaacatca 8340

acttgtttta aagtggtcaa gactaataag acctattgtc tcagcattgc tgaaatatct 8400

aatactctct tcggagaatt cagaatcgtc ccgttactag ttgagatcct caaagatgac 8460

ggggttagag aagccaggtc tggctagttg agtcaattat aaaggagttg gaaagatggc 8520

attgtatcac ctatcttcca cgacatcaag aatcaaaccg aatgccggcg cgtgctcgaa 8580

ttccatgttg ccagttgacc acaatcagcc agtgctcatg cgatcagatt aagccttgtc 8640

aatagtctct tgattaagaa aaaatgtaag tggcaatgag atacaaggca aaacagctca 8700

tggtaaataa tacgggtagg acatggcgag ctccggtcct gaaagggcag agcatcagat 8760

tatcctacca gagtcacacc tgtcttcacc attggtcaag cacaaactac tctattactg 8820

gaaattaact gggctaccgc ttcctgatga atgtgacttc gaccacctca ttctcagtcg 8880

acaatggaaa aaaatacttg aatcggcctc tcctgatact gagagaatga taaaactcgg 8940

aagggcagta caccaaactc ttaaccacaa ttccagaata accggagtgc tccaccccag 9000

gtgtttagaa gaactggcta atattgaggt cccagattca accaacaaat ttcggaagat 9060

tgagaagaag atccaaattc acaacacgag atatggagaa ctgttcacaa ggctgtgtac 9120

gcatatagag aagaaactgc tggggtcatc ttggtctaac aatgtccccc ggtcagagga 9180

gttcagcagc attcgtacgg atccggcatt ctggtttcac tcaaaatggt ccacagccaa 9240

gtttgcatgg ctccatataa aacagatcca gaggcatctg atggtggcag ctaggacaag 9300

gtctgcggcc aacaaattgg tgatgctaac ccataaggta ggccaagtct ttgtcactcc 9360

tgaacttgtc gttgtgacgc atacgaatga gaacaagttc acatgtctta cccaggaact 9420

tgtattgatg tatgcagata tgatggaggg cagagatatg gtcaacataa tatcaaccac 9480

ggcggtgcat ctcagaagct tatcagagaa aattgatgac attttgcggt taatagacgc 9540

tctggcaaaa gacttgggta atcaagtcta cgatgttgta tcactaatgg agggatttgc 9600

atacggagct gtccagctac tcgagccgtc aggtacattt gcaggagatt tcttcgcatt 9660

caacctgcag gagcttaaag acattctaat tggcctcctc cccaatgata tagcagaatc 9720

cgtgactcat gcaatcgcta ctgtattctc tggtttagaa cagaatcaag cagctgagat 9780

gttgtgtctg ttgcgtctgt ggggtcaccc actgcttgag tcccgtattg cagcaaaggc 9840

agtcaggagc caaatgtgcg caccgaaaat ggtagacttt gatatgatcc ttcaggtact 9900

gtctttcttc aagggaacaa tcatcaacgg gtacagaaag aagaatgcag gtgtgtggcc 9960

gcgagtcaaa gtggatacaa tatatgggaa ggtcattggg caactacatg cagattcagc 10020

agagatttca cacgatatca tgttgagaga gtataagagt ttatctgcac ttgaatttga 10080

gccatgtata gaatatgacc ctgtcaccaa cctgagcatg ttcctaaaag acaaggcaat 10140

cgcacacccc aacgataatt ggcttgcctc gtttaggcgg aaccttctct ccgaagacca 10200

gaagaaacat gtaaaagaag caacttcgac taatcgcctc ttgatagagt ttttagagtc 10260

aaatgatttt gatccatata aagagatgga atatctgacg acccttgagt accttagaga 10320

tgacaatgtg gcagtatcat actcgctcaa ggagaaggaa gtgaaagtta atggacggat 10380

cttcgctaag ctgacaaaga agttaaggaa ctgtcaggtg atggcggaag ggatcctagc 10440

cgatcagatt gcacctttct ttcagggaaa tggagtcatt caggatagca tatccttgac 10500

caagagtatg ctagcgatga gtcaactgtc ttttaacagc aataagaaac gtatcactga 10560

ctgtaaagaa agagtatctt caaaccgcaa tcatgatccg aaaagcaaga accgtcggag 10620

agttgcaacc ttcataacaa ctgacctgca aaagtactgt cttaattgga gatatcagac 10680

aatcaaattg ttcgctcatg ccatcaatca gttgatgggc ctacctcact tcttcgaatg 10740

gattcaccta agactgatgg acactacgat gttcgtagga gaccctttca atcctccaag 10800

tgaccctact gactgtgacc tctcaagagt ccctaatgat gacatatata ttgtcagtgc 10860

cagagggggt atcgaaggat tatgccagaa gctatggaca atgatctcaa ttgctgcaat 10920

ccaacttgct gcagctagat cgcattgtcg tgttgcctgt atggtacagg gtgataatca 10980

agtaatagca gtaacgagag aggtaagatc agacgactct ccggagatgg tgttgacaca 11040

gttgcatcaa gccagtgata atttcttcaa ggaattaatt catgtcaatc atttgattgg 11100

ccataatttg aaggatcgtg aaaccatcag gtcagacaca ttcttcatat acagcaaacg 11160

aatcttcaaa gatggagcaa tcctcagtca agtcctcaaa aattcatcta aattagtgct 11220

agtgtcaggt gatctcagtg aaaacaccgt aatgtcctgt gccaacattg cctctactgt 11280

agcacggcta tgcgagaacg ggcttcccaa agacttctgt tactatttaa actatataat 11340

gagttgtgtg cagacatact ttgactctga gttctccatc accaacaatt cgcaccccga 11400

tcttaatcag tcgtggattg aagacatctc ttttgtgcac tcatatgttc tgactcctgc 11460

ccaattaggg ggactgagta accttcaata ctcaaggctc tacactagaa atatcggtga 11520

cccggggact actgcttttg cagagatcaa gcgactagaa gcagtgggat tactgagtcc 11580

taacattatg actaatatct taactaggcc gcctgggaat ggagattggg ccagtctgtg 11640

caacgaccca tactctttca attttgagac tgttgcaagc ccaaatattg ttcttaagaa 11700

acatacgcaa agagtcctat ttgaaacttg ttcaaatccc ttattgtctg gagtgcacac 11760

agaggataat gaggcagaag agaaggcatt ggctgaattc ttgcttaatc aagaggtgat 11820

tcatccccgc gttgcgcatg ccatcatgga ggcaagctct gtaggtagga gaaagcaaat 11880

tcaagggctt gttgacacaa caaacaccgt aattaagatt gcgcttacta ggaggccatt 11940

aggcatcaag aggctgatgc ggatagtcaa ttattctagc atgcatgcaa tgctgtttag 12000

agacgatgtt ttttcctcca gtagatccaa ccacccctta gtctcttcta atatgtgttc 12060

tctgacactg gcagactatg cacggaatag aagctggtca cctttgacgg gaggcaggaa 12120

aatactgggt gtatctaatc ctgatacgat agaactcgta gagggtgaga ttcttagtgt 12180

aagcggaggg tgtacaagat gtgacagcgg agatgaacaa tttacttggt tccatcttcc 12240

aagcaatata gaattgaccg atgacaccag caagaatcct ccgatgaggg taccatatct 12300

cgggtcaaag acacaggaga ggagagctgc ctcacttgca aaaatagctc atatgtcgcc 12360

acatgtaaag gctgccctaa gggcatcatc cgtgttgatc tgggcttatg gggataatga 12420

agtaaattgg actgctgctc ttacgattgc aaaatctcgg tgtaatgtaa acttagagta 12480

tcttcggtta ctgtcccctt tacccacggc tgggaatctt caacatagac tagatgatgg 12540

tataactcag atgacattca cccctgcatc tctctacagg gtgtcacctt acattcacat 12600

atccaatgat tctcaaaggc tgttcactga agaaggagtc aaagagggga atgtggttta 12660

ccaacagatc atgctcttgg gtttatctct aatcgaatcg atctttccaa tgacaacaac 12720

caggacatat gatgagatca cactgcacct acatagtaaa tttagttgct gtatcagaga 12780

agcacctgtt gcggttcctt tcgagctact tggggtggta ccggaactga ggacagtgac 12840

ctcaaataag tttatgtatg atcctagccc tgtatcggag ggagactttg cgagacttga 12900

cttagctatc ttcaagagtt atgagctcaa tctggagtca tatcccacga tagagctaat 12960

gaacattctt tcaatatcca gcgggaagtt gattggccag tctgtggttt cttatgatga 13020

agatacctcc ataaagaatg acgccataat agtgtatgac aatacccgaa attggatcag 13080

tgaagctcag aattcagatg tggtccgcct atttgaatat gcagcacttg aagtgctcct 13140

cgactgttct taccaactct attacctgag agtaagaggc ctagacaata ttgtcttata 13200

tatgggtgat ttatacaaga atatgccagg aattctactt tccaacattg cagctacaat 13260

atctcatccc gtcattcatt caaggttaca tgcagtgggc ctggtcaacc atgacggatc 13320

acaccaactt gcagatacgg attttatcga aatgtctgca aaactattag tatcttgcac 13380

ccgacgtgtg atctccggct tatattcagg aaataagtat gatctgctgt tcccatctgt 13440

cttagatgat aacctgaatg agaagatgct tcagctgata tcccggttat gctgtctgta 13500

cacggtactc tttgctacaa caagagaaat cccgaaaata agaggcttaa ctgcagaaga 13560

gaaatgttca atactcactg agtatttact gtcggatgct gtgaaaccat tacttagccc 13620

cgatcaagtg agctctatca tgtctcctaa cataattaca ttcccagcta atctgtacta 13680

catgtctcgg aagagcctca atttgatcag ggaaagggag gacagggata ctatcctggc 13740

gttgttgttc ccccaagagc cattattaga gttcccttct gtgcaagata ttggtgctcg 13800

agtgaaagat ccattcaccc gacaacctgc ggcatttttg caagagttag atttgagtgc 13860

tccagcaagg tatgacgcat tcacacttag tcagattcat cctgaactca catctccaaa 13920

tccggaggaa gaccacttag tacgatactt gttcagaggg atagggactg catcttcctc 13980

ttggtataag gcatctcatc tcctttctgt acccgaggta agatgtgcaa gacacgggaa 14040

ctccttatac ttagctgaag ggagcggagc catcatgagt cttctcgaac tgcatgtacc 14100

acatgaaact atctattaca atacgctctt ttcaaatgag atgaaccccc cgcaacgaca 14160

tttcgggccg accccaactc agtttttgaa ttcggttgtt tataggaatc tacaggcgga 14220

ggtaacatgc aaagatggat ttgtccaaga gttccgtcca ttatggagag aaaatacaga 14280

ggaaagtgac ctgacctcag ataaagcagt ggggtatatt acatctgcag tgccctacag 14340

atctgtatca ttgctgcatt gtgacattga aattcctcca gggtccaatc aaagcttact 14400

agatcaacta gctatcaatt tatctctgat tgccatgcat tctgtaaggg agggcggggt 14460

agtaatcatc aaagtgttgt atgcaatggg atactacttt catctactca tgaacttgtt 14520

tgctccgtgt tccacaaaag gatatattct ctctaatggt tatgcatgtc gaggagatat 14580

ggagtgttac ctggtatttg tcatgggtta cctgggcggg cctacatttg tacatgaggt 14640

ggtgaggatg gcaaaaactc tggtgcagcg gcacggtacg cttttgtcta aatcagatga 14700

gatcacactg accaggttat tcacctcaca gcggcagcgt gtgacagaca tcctatccag 14760

tcctttacca agattaataa agtacttgag gaagaatatt gacactgcgc tgattgaagc 14820

cgggggacag cccgtccgtc cattctgtgc ggagagtctg gtgagcacgc tagcgaacat 14880

aactcagata acccagatca tcgctagcca cattgacaca gttatccggt ctgtgatata 14940

tatggaagct gagggtgatc tcgctgacac agtatttcta tttacccctt acaatctctc 15000

tactgacggg aaaaagagga catcacttaa acagtgcacg agacagatcc tagaggttac 15060

aatactaggt cttagagtcg aaaatctcaa taaaataggc gatataatca gcctagtgct 15120

taaaggcatg atctccatgg aggaccttat cccactaagg acatacttga agcatagtac 15180

ctgccctaaa tatttgaagg ctgtcctagg tattaccaaa ctcaaagaaa tgtttacaga 15240

cacttctgta ctgtacttga ctcgtgctca acaaaaattc tacatgaaaa ctataggcaa 15300

tgcagtcaaa ggatattaca gtaactgtga ctcttaacga aaatcacata ttaataggct 15360

ccttttttgg ccaattgtat tcttgttgat ttaatcatat tatgttagaa aaaagttgaa 15420

ccctgactcc ttaggactcg aattcgaact caaataaatg tcttaaaaaa aggttgcgca 15480

caattattct tgagtgtagt ctcgtcattc accaaatctt tgtttggt 15528

<210> 2

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<220>

<221> misc_feature

<223> 对人工序列的描述：上游引物NDV-F-F序列

<400> 2

aggtccaact ctgtttaaac ttagaaaaaa tacgggtaga agtgccacca tgaatcaaac 60

tgccattctg 70

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence Latin)

<220>

<221> misc_feature

<223> 对人工序列的描述：下游引物NDV-F-R序列

<400> 3

attgccgctt gggtttaaac ttaaggagat cttttagacc tttcc 45

Claims (9)

1.一种重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述的重组新城疫病毒含有如SEQID NO：1所示的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述的重组新城疫病毒DNA包括由于插入、缺失或突变导致的与SEQ ID NO：1同源性超过90%以上的衍生DNA序列。

3.根据权利要求1或2所述的重组新城疫病毒的构建方法，包括构建携带IP10基因质粒、重组病毒的拯救和病毒生长，其特征在于，具体构建步骤如下：

(1) 构建携带IP10基因质粒：使用限制性内切酶切开pBRN-FL-PmeⅠ载体中P和M基因间的PmeⅠ位点，使用上游引物和下游引物通过PCR扩增出携带GN和GE片段的IP10基因，然后使用胶回收试剂盒纯化目的基因片段，将纯化的产物用重组酶克隆入pBRN-FL-PmeⅠ载体中，构建出携带IP10基因的质粒，命名为pBRN-FL-IP10；

(2) 重组病毒的拯救：将BSR-7细胞铺于六孔板中，待细胞长满六孔板约80%时，将5μg的pBRN-FL-IP10质粒和2.5μg的pBS-NP质粒、1.25μg的pBS-P质粒和1.25μg 的pBS-L质粒共转染入BSR-7细胞；12小时后用10%的DMSO休克细胞2.5min，用1×pbs溶液洗一次，然后加入完全培养基；24小时后换成opti-MEM并加入TPCK，将细胞放入培养箱中培养3天后，刮取细胞用0.25μm过滤器过滤，滤液注入9~11日龄的SPF鸡胚尿囊腔中；注射后的鸡胚在孵化箱中继续孵育5天后，抽取鸡胚尿囊液50μl，用1%浓度的鸡红细胞测病毒效价，收取效价阳性鸡胚尿囊液，即rNDV-IP10，放入-80℃保存；

(3) 病毒生长：将rNDV-IP10以MOI=0.01感染24孔板中的CEF细胞一小时后，去除病毒稀释液，随后加入10%FBS的DMEM继续培养，每隔24小时收集细胞培养液，将收集到的培养液再次感染CEF细胞。

4.根据权利要求3所述的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述的上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，所述的下游引物序列如SEQ ID NO：3所示。

5.根据权利要求3所述的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述的重组酶为重组酶ExnaseTM II。

6.根据权利要求3所述重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述的步骤（2）加入TPCK的浓度为1μg/ml。

7.根据权利要求3所述重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述的步骤（2）SPF鸡胚尿囊腔中浓度为400μl/枚。

8.根据权利要求1 所述DNA序列拯救出的重组新城疫病毒。

9.根据权利要求8 所述的重组新城疫病毒在治疗恶性肿瘤的药物中的应用。