CN113388586A - 一种溶瘤病毒ndv-nrp1及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种溶瘤病毒NDV‑NRP1及其构建方法与应用，属于微生物技术领域。本发明采用反向遗传技术构建重组病毒NDV‑NRP1‑scFv‑GT，利用hTERT启动子在转录水平上实现rNDV在肿瘤细胞的特异性复制，通过NRP1‑scFv与NRP1结合，抑制肿瘤的侵袭生长，过表达α‑Gal抗原表位，则可以实现诱导人体自身的anti‑Gal对肿瘤细胞特异性打靶，激活补体，实现对肿瘤细胞的杀伤，达到有效的抗肿瘤效果。

Description

一种溶瘤病毒NDV-NRP1及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种溶瘤病毒NDV-NRP1及其构建方法与应用。
背景技术
溶瘤病毒作为一种新的肿瘤治疗制剂，通过病毒对肿瘤细胞的杀伤作用和诱导全身性抗肿瘤免疫反应两种作用机制引发抗肿瘤免疫反应。溶瘤病毒疗法联合免疫激活已成为有吸引力的肿瘤治疗手段，同时也具有原位肿瘤疫苗的作用。而且，溶瘤病毒可以构建成具有肿瘤特异性、可强化免疫激活途径或可与其他肿瘤治疗药物联合使用的制剂。1971年匈牙利医生Csatary发现患有胃癌的农场主在感染新城疫病毒(newcastle diseasevirus，NDV)后而治愈，因此发现了NDV具有治疗肿瘤的作用。NDV基因组全长15186(或15192)个核苷酸，有六种结构基因(3’-NP-P-M-F-HN-L-5’)，其中HN蛋白与肿瘤表面的唾液酸受体结合，介导病毒吸附细胞膜；而F蛋白使病毒与宿主细胞膜融合，介导病毒进入细胞，并且F蛋白与病毒的毒力相关。
近年来溶瘤病毒作为一类具有复制能力的肿瘤杀伤型病毒，在肿瘤治疗中显示出很好的前景,在临床试验中显示出良好的治疗疗效，使其再次成为一个研究热点。NDV作为溶瘤病毒的典型代表，天然拥有对肿瘤细胞靶向复制能力，能够通过直接溶瘤作用杀死肿瘤细胞；同时可激活机体本身的免疫防御系统，使细胞毒性T淋巴细胞、NK细胞和辅助性T细胞等增殖，加强机体抗肿瘤免疫反应；也可通过感染肿瘤细胞制成疫苗对患者进行特异性免疫治疗。
随着分子病毒学和分子生物学技术的发展，现代溶瘤病毒治疗开始发展为治疗肿瘤的有效手段。分子病毒学技术使得对病毒基因组的改造和重组成为可能。经典遗传学的方向是从研究生物的表型、性状过渡到生命的遗传物质基因组，由表及里，由外而内，以此研究生命发生、发展、变化的规律。而反向遗传学(Reverse Genetics)则是由里及表，通过生物的基因组观察生物将会表现出的表型，性状。反向遗传学是在已知生物体全部基因组序列的基础上，对靶基因进行定向加工和修饰，再按组成顺序构建含物种必需元件的修饰基因组，进而装配出具有生命活性的个体。运用反向遗传学技术可以在体外对RNA病毒基因组进行改造，构建新的负链RNA病毒。反向遗传技术的发展和完善，解决了对病毒进行定向改造及利用其表达外源肿瘤治疗基因的技术难题，同时又可以发挥新城疫病毒本身的天然溶瘤作用，使新城疫病毒载体在临床治疗和疫苗研发上具有很好的应用前景。
有目的性的改造溶瘤病毒，使病毒具有更强的溶瘤能力，单独治疗或与其它抗肿瘤疗法联合使用已经成为溶瘤病毒治疗肿瘤的热门研究方向。随着基因工程技术、分子生物学的不断发展，溶瘤病毒在治疗肿瘤领域中不断取得不菲的成果。首次获得美国食品药监局临床批文的溶瘤病毒是由Amgen公司推出的Talimogene Laherparepvec(T-VEC)，用于黑色素瘤患者在第一次手术后复发的难以切除的皮肤、皮下和淋巴结病灶的局部治疗。T-VEC是经过基因修饰改造的1型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus 1,HSV-1)，具有在肿瘤细胞内复制并表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage-ColonyStimulating Factor，GM-CSF)的特点。将修饰后的1型单纯疱疹病毒直接注射到肿瘤局部，病毒在肿瘤中大量复制，进而导致肿瘤细胞裂解死亡，释放出大量的肿瘤相关抗原(TAA)和GM-CSF因子，增强抗肿瘤的免疫应答。目前，全球范围内注册开展进行中的溶瘤病毒临床试验不少于52项。而在这些溶瘤病毒的临床研究中，尚未发现有一例因溶瘤病毒引起的机体的严重不良反应。
神经菌毛素1(neuropilinl，NRP1)是脊椎动物特有的单次跨膜糖蛋白，NRP1的过表达与肺癌、卵巢癌、胃肠道肿瘤、前列腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤等肿瘤的生长和浸润相关。NRP1单链抗体(NRP1-scFv)分子量小，可以与NRP1结合，通过血管壁渗透到肿瘤组织，达到有效的抗肿瘤效果。
α-半乳糖基(α-galactosy，α-Gal)是广泛存在于猪、牛等非灵长类动物细胞表面糖脂和糖蛋白分子上的碳链结构。由于α-Gal合成所需的α-1,3半乳糖基转移酶(α-1,3galactosyltransferase,α1,3GT)的缺陷，人、猿及旧世界猴不表达α-Gal，但是，由于人类血清中存在大量抗α-Gal的天然抗体(anti-Gal)，约占血清IgG的1％，而人体细胞却缺乏α-Gal表位。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种重组新城疫病毒，该重组新城疫病毒含有如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
进一步的，所述重组新城疫病毒还含有P2A序列，以其作为Linker连接SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明的目的之二在于提供上述重组新城疫病毒的构建方法，其包括以下步骤：
(1)将同时含有SEQ ID NO.1所示的NRP1-scFv和SEQ ID NO.2所示的GT的目的片段与线性化的rLaSota载体PBRN-FL质粒进行同源重组；
(2)将步骤(1)中的同源重组产物转化感受态细胞；
(3)筛选阳性单克隆菌株；
(4)对步骤(3)中筛选得到的阳性单克隆菌株进行质粒提取；
(5)重组质粒转染BSR细胞；
(6)重组病毒的增殖；
(7)重组病毒的鉴定。
进一步的，所述步骤(1)中同时含有NRP1-scFv和GT的目的片段是以质粒PcDNA3.1-NRP1-scFv-GT为模板，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5为引物扩增得到的。
更进一步的，所述步骤(1)中线性化的rLaSota载体PBRN-FL质粒是使用Pme I限制性内切酶体系酶切得到。
更进一步的，所述步骤(1)中线性化的rLaSota载体PBRN-FL质粒与目的基因的DNA总质量之比为1:1到1:3。
更进一步的，所述步骤(2)中感受态细胞为TransStbl3化学感受态细胞。
更进一步的，所述步骤(6)中将质粒转染BSR细胞的培养液接种于9-11日龄SPF级鸡胚中进行病毒的扩增。
本发明的目的之三在于提供上述重组新城疫病毒在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用反向遗传技术构建重组病毒NDV-NRP1-scFv-GT，利用hTERT启动子在转录水平上实现rNDV在肿瘤细胞的特异性复制，通过NRP1-scFv与NRP1结合，抑制肿瘤的侵袭生长，过表达α-Gal抗原表位，则可以实现诱导人体自身的anti-Gal对肿瘤细胞特异性打靶，激活补体，实现对肿瘤细胞的杀伤，达到有效的抗肿瘤效果。
附图说明
图1为本发明溶瘤病毒NDV-NRP1-scFv-GT结构示意图。
图2为实施例1中NRP1-scFv-Cherry片段的扩增结果图。
图3为实施例1中共转染BSR细胞后72h后观察图。
图4为实施例1中血凝实验结果图。
图5a为实施例1中SCID鼠肿瘤生长曲线图。
图5b为实施例1中SCID鼠肿瘤生存曲线图。
具体实施方式
实施例1
1.材料
1.1 基因序列
本实验插入仅包含人NRP1-scFv或α1,3GT基因或联合表达人NRP1-scFv-α1,3GT基因的cDNA感染性克隆NDV-NRP1-scFv，NDV-GT和NDV-NRP1-scFv-GT(NRP1-scFv基因与α1,3GT基因之间以P2A序列作为Linker)，使用反向遗传技术拯救重组病毒。本实验所用到的载有目的基因序列的质粒(pcDNA3.1-GT,pcDNA3.1-NRP1-scFv-GT)及引物均由上海生工生物工程有限公司合成纯化。基因序列如下所示：
NRP1-scFv序列(726bp)SEQ ID NO.1：
ATGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGTTATTATATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCGATCTCTCCTGGTAGTAGTAATAAATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAGGAAGTATATGTTCGACTACTGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGAATCCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATGATGTCTACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCACCCAAACTCCTCATCTATTCTGATAGTAATCGGCCAAGCGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCTTCTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTA。
α1,3GT序列(1344bp)SEQ ID NO.2：
cgggggccat ccccgagcgc acccagcttc tgccgatcag gagaaaataa tgaatgtcaaaggaagagtg gttctgtcaa tgctgcttgt ctcaactgta atggttgtgt tttgggaata catcaacagaaacccagaag ttggcagcag tgctcagagg ggctggtggt ttccgagctg gtttaacaat gggactcacagttaccacga agaagaagac gctataggca acgaaaagga acaaagaaaa gaagacaaca gaggagagcttccgctagtg gactggttta atcctgagaa acgcccagag gtcgtgacca taaccagatg gaaggctccagtggtatggg aaggcactta caacagagcc gtcttagata attattatgc caaacagaaa attaccgtgggcttgacggt ttttgctgtc ggaagataca ttgagcatta cttggaggag ttcttaatat ctgcaaatacatacttcatg gttggccaca aagtcatctt ttacatcatg gtggatgata tctccaggat gcctttgatagagctgggtc ctctgcgttc ctttaaagtg tttgagatca agtccgagaa gaggtggcaa gacatcagcatgatgcgcat gaagaccatc ggggagcaca tcctggccca catccagcac gaggtggact tcctcttctgcattgacgtg gatcaggtct tccaaaacaa ctttggggtg gagaccctgg gccagtcggt ggctcagctacaggcctggt ggtacaaggc acatcctgac gagttcacct acgagaggcg gaaggagtcc gcagcctacattccgtttgg ccagggggat ttttattacc acgcagccat ttttggggga acacccactc aggttctaaacatcactcag gagtgcttca agggaatcct ccaggacaag gaaaatgaca tagaagccga gtggcatgatgaaagccatc taaacaagta tttccttctc aacaaaccca ctaaaatctt atccccagaa tactgctgggattatcatat aggcatgtct gtggatatta ggattgtcaa gatagcttgg cagaaaaaag agtataatttggttagaaat aacatctgac tttaaattgt gccagcagtt ttctgaattt gaaagagtat tactctggctacttcctcag agaagtagca cttaatttta acttttaaaa aatactaaca aaataccaac acagtaagtacatattattc ttccttgcaa ctttgagcct tgtcaaatgg gagaatgact ctgtagtaat cagatgtaaattcccaatga tttcttatct gcg。
1.2 病毒和质粒
rLaSota载体PBRN-FL质粒，表达T7聚合酶重组痘病毒vTF7-3，以及辅助质粒：核蛋白(pBS-NP)、磷蛋白(pBS-P)和大聚合酶蛋白(pBS-L)，由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室惠赠，-80℃超低温冰箱保存备用。
1.3 细胞
BSR T7/5细胞(适应狂犬病毒CVS株的BHK-21细胞的克隆株)，由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室惠赠，在5％CO2，37℃的细胞恒温培养箱中培养。其所用培养基为胎牛血清含量10％、青霉素(100U/mL)和链霉素(100U/mL)双抗生素含量1％的DMEM培养基。
1.4 实验动物
BALB/c小鼠，体重18～20g，6-8周龄，雌性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SCID/beige鼠，鼠龄为6-8周，体重18～20g，雌性，无免疫渗漏(ELISA法测定鼠血清IgG<10μg/mL)，购于北京维通利华实验动物技术公司。
所有实验动物饲养于广西医科大学动物中心的SPF级环境中，水、食物及填料均高压灭菌。饲养温度22℃，湿度55％，12小时白/昼节律。所有的相关动物实验通过广西医科大学动物伦理委员会审核。
1.5 血液来源
采自健康志愿者外周血180mL。
1.6 鸡胚
SPF鸡胚购买自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。培养在37.8℃，50％湿度的鸡胚孵育箱中。
1.7 所用主要溶液
(1)0.01M磷酸盐缓冲液(PBS)；
(2)LB培养基；
(3)完全DMEM培养基；
(4)0.02％PBST缓冲液；
(5)抗原修复液(10mM pH 6.0枸橼酸钠缓冲液)。
2 方法
2.1 重组质粒的构建
2.1.1 重组质粒引物序列
表1 引物序列信息表
Figure BDA0003115147020000061
2.1.2 目的基因的PCR扩增
使用Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase试剂盒(Vazyme，P515)以PcDNA3.1-GT、PcDNA3.1-NRP1-scFv-Cherry、PcDNA3.1-NRP1-scFv-GT为模板，用目的基因的特异性上下游引物GT-PF/GT-PR、hTERT-PF/NRP1-PR、hTERT-PF/GT-PR分别进行PCR扩增，此过程在冰上操作，PCR扩增体系参见表2，其中携带Pme I酶切位点的基因片段NRP1-scFv-Cherry的扩增结果参见图2，目的基因片段NRP1-scFv-Cherry长为1839bp，M：2000bpMarker，泳道1、2、3均为扩增的NRP1-scFv-Cherry片段。
表2 PCR扩增体系
名称 体积
2×Phanta Max Master Mix 25μL
hTERT-PF/GT-PF(10μM) 1μL
GT-PR/NRP1-PR(10μM) 1μL
pcDNA3.1-NRP1-GT(100ng/μL) 1μL
ddH<sub>2</sub>O up to 50μL
将上述体系在PCR管中充分混匀，瞬时离心后，按照表3循环体系进行PCR扩增。
表3 循环体系
Figure BDA0003115147020000062
Figure BDA0003115147020000071
反应结束后用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，并进行回收。
2.1.3 NDV载体线性化
使用Pme I限制性内切酶体系对环状NDV载体进行线性化，后使用1％琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳鉴定并对目的条带进行胶回收并检测其DNA浓度。
2.1.4 同源重组
使用ClonExpres sⅡ One Step Cloning Kit(Vazyme,C112)对目的基因PCR扩增产物和线性化的LaSota载体进行同源重组连接。ClonExpress DNA无缝克隆技术具有简单、快速和高效的连接特点，可将的目的基因片段定向插入至载体的任意位置。载体通过酶切线性化后，在插入片段上下游PCR引物的5’端引入线性化载体酶切位点的末端序列，使得PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端相一致的基因序列(15bp-20bp)。将线性化载体和PCR产物和按一定比例混合后，在ClonExpress重组酶的作用下，37℃水浴锅中反应30min即可进行转化，完成定向克隆，具体过程如下：
1)将目的基因的PCR扩增胶回收产物(NRP1-scFv,GT,NRP1-scFv-GT)、线性化的LaSota载体的胶回收产物、试剂盒中的5×CE II Buffer置于冰上解冻；准备37℃水浴锅；
2)此过程在冰上操作。按照表4体系进行同源重组：
表4 同源重组体系
名称 体积
Exnase II 1μL
5×CE II Buffer 2μL
线性化的LaSota载体 3μL
目的基因的PCR扩增产物 5μL
ddH<sub>2</sub>O up to 20μL
该体系中，线性化的LaSota载体与目的基因的DNA总量之比为1:1到1:3之间。将上述体系在200μL的PCR管中充分混匀，瞬时离心后，用泡沫板拖住PCR管头部，置于37℃水浴锅中恒温水浴30min；
3)若立即进行下一步实验，则将同源重组完成的产物置于冰上冷却；若不需立即使用，同源重组产物可置于-20℃保存一周，待需要时解冻转化即可。
2.1.5 质粒转化
使用TransStbl3化学感受态细胞对同源重组产物进行转化。
1)从-80℃冰箱中取出TransStbl3感受态细胞，冰浴融化(解冻时间不宜过长，8-10min为宜，避免反复化冻)；
2)吸取10μL同源重组产物加入100μL的感受态细胞中(此步骤需在无菌操作台内且在冰上进行)，轻弹管身，混匀(不可吹打混匀)，置于冰上30min；
3)42℃恒温水浴锅热激45s后，置于冰上2min；
4)加入500μL的无抗生素的液体LB培养基，置于37℃恒温摇床，200rpm，振荡孵育45-60min使细菌复苏；
5)1000rpm，离心1min；
6)弃去上清培养基，剩余200μL液体，轻轻吹打混匀后，使用无菌的涂布棒将培养物均匀涂抹在100μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养板上；
7)将固体LB培养板倒扣置于30℃的细菌恒温培养箱中培养(16-24h)；
8)待固体LB培养板上长出菌落后，挑取单克隆菌落接种至3-4mL的氨苄青霉素含量为50μg/mL的LB培养液中，置于30℃恒温摇床，180rpm，振荡孵育12-16h后进行后续实验。
2.1.6 菌液PCR筛选阳性单克隆菌
使用Transgen EasyTaq PCR SuperMix(TransgenAS111)进行菌液PCR筛选。此过程在冰上操作。菌液PCR扩增体系如表5：
表5 菌液PCR扩增体系
名称 体积
2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5μL
LA3000PF(10μM) 0.5μL
LA3300PR(10μM) 0.5μL
菌液 1.0μL
ddH<sub>2</sub>O up to 25μL
将上述体系在200μL的PCR管中充分混匀，瞬时离心后，按照表6循环体系进行PCR扩增：
表6 循环体系
Figure BDA0003115147020000081
Figure BDA0003115147020000091
反应结束后用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定菌液PCR扩增产物。
2.1.7 质粒提取
2.1.8 测序鉴定
将重组质粒进行高保真PCR扩增，扩增产物电泳跑胶鉴定，出现目的基因大小的条带则将PCR扩增产物送去上海生工生物工程有限公司测序。测序结果使用NCBI网站进行BLAST序列比对。
2.1.9 质粒大提
2.2 重组新城疫病毒的拯救
2.2.1 复苏并培养BSR细胞
2.2.2 重组质粒转染BSR细胞
使用Exfect 2000Transfection Reagent(脂质体转染试剂盒)进行质粒转染。
1)使用G418筛选培养BSR细胞传代3次后，消化处理细胞，将其接种到6孔板中，在细胞培养箱中培养12-24h，待细胞汇合度达到70％-80％时可进行转染；
2)稀释痘病毒：将痘病毒原液用未完全的DMEM培养基以1:100的比例稀释，混匀；
3)弃去6孔板中的培养基，PBS缓冲液清洗一次；
4)每孔细胞加入200μL的痘病毒稀释液，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育50min，每隔10min摇匀一次，使痘病毒与BSR细胞充分接触。孵育期间配置转染体系A液和B液。
5)A液：使用125μL的Opti-MEM培养基稀释10μL的ExFect2000(表7)，轻轻吹打混匀，室温静置5min。
表7 A液配制
名称 体积/孔
Opti-MEM培养基 125μL
ExFect 2000 10μL
6)配制转染体系B液：稀释质粒：使用125μL的Opti-MEM培养基稀释DNA总量为5μg的重组质粒及其辅助质粒，重组质粒：辅助质粒pBS-NP：辅助质粒pBS-P：辅助质粒pBS-L＝4:2:2:1，吹打混匀后，室温静置5min。表8为每孔的试剂用量；
表8 B液配制
Figure BDA0003115147020000092
Figure BDA0003115147020000101
使用移液枪将B液缓慢地滴加入A液中，轻柔吹打混匀后，室温静置5-10min；
7)弃去痘病毒稀释液，每孔加入1.75mL的Opti-MEM培养基或者未完全的DMEM培养基及250μL的AB混合液，轻轻摇晃6孔板，使之混匀后，将6孔板放置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养6-8h；
8)弃去6孔板中的培养基，每孔加入2mL的5％胎牛血清的DMEM培养基、10μL的阿拉伯糖苷(10μg/mL)，混匀后，将6孔板放置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育24h；
9)弃去6孔板中的培养基，每孔加入2mL的Opti-MEM培养基、10μL的阿拉伯糖苷及8μL的TPCK-胰蛋白酶(1μg/mL)，混匀后，将6孔板放置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育24-72h；
10)待BSR细胞存活10％左右时，刮落细胞，通过0.45μm的过滤器收集细胞培养液，置于-20℃中保存备用。
将构建的目的质粒NDV-GT，NDV-NRP1-scFv，NDV-NRP1-scFv-GT和辅助核蛋白(pBS-NP)、磷蛋白(pBS-P)和大聚合酶蛋白(pBS-L)重组辅助质粒利用脂质体转染法共转染BSR细胞，从细胞中拯救出重组病毒。在转染72h后观察到细胞聚集成团，核缩小，细胞脱落并裂解(参见图3)。
2.2.3 病毒增殖
将收集的质粒转染细胞培养液接种于9-11日龄SPF级鸡胚中进行病毒的扩增。此操作在无菌超净台进行。
1)以强光电筒照射9日龄鸡胚，选取鸡胚气室与尿囊腔相接且没有血管或者血管稀少的位置作为接种时的注射孔，用铅笔标记注射孔位置；
2)使用碘伏擦拭鸡胚注射孔周围表面，再用75％的消毒酒精擦拭一次；
3)使用无菌的锥子在注射孔位置轻轻击孔，只留下浅坑即可，不可打穿蛋壳；
4)使用1mL注射器吸取200-500μL细胞转染上清，针头垂直于水平面，以浅坑作为着力点，将注射器针头缓慢插入尿囊腔，直至针头全部没入蛋壳，将细胞转染上清注射入尿囊腔中，取出注射器；
5)用液化石蜡封住注射孔，用铅笔在蛋壳表面做好标记
6)将接种好的鸡胚放入37℃孵化箱孵育5天，每天检查鸡胚是否死亡，去除24h内死亡的鸡胚，24h后死亡的鸡胚，置于4℃冰箱。
7)第5天时，取出所有鸡胚放入4℃冰箱4h以上，使鸡胚的血管收缩，鸡胚死亡，便于收毒。
8)取出鸡胚，用镊子去掉气室的蛋壳，露出尿囊膜，收集清澈的尿囊液，尽量不要吸取组织或者变性的蛋白。
9)收集的尿囊液于-80℃保存。
2.3 重组病毒的鉴定
2.3.1 血凝实验
将在BSR细胞中拯救出来的重组病毒，接种200μL于9日龄鸡胚中，在孵蛋箱中孵育扩增5天后，收集鸡胚尿囊液。使用血液凝集试验(HA)检测从鸡胚尿囊液中扩增的重组病毒NDV-GT血凝效价为29，NDV-NRP1-scFv血凝效价为29，NDV-NRP1-scFv-GT血凝效价为210(参见图4)。
1)收集新鲜鸡血。在45mL的无菌的PBS缓冲液中加入5mL新鲜采集的鸡血，轻轻颠倒混匀。操作需轻柔，否则容易发生溶血。8000rpm，离心10min，缓降。小心弃去上清，保留红细胞。此步骤重复2次；
2)将离心好的鸡红细胞取2mL加入至200mL的高压灭菌的PBS缓冲液中，配置成1％鸡红细胞悬液，4℃保存备用；
3)用排枪在96孔U形板中加入50μL的PBS缓冲液；
4)在左侧第1孔位置加入50μL的鸡胚尿囊液，充分混匀后，吸取50μL加入第2孔，以此类推，倍比稀释至第12孔，第12孔混匀后弃去50μL。同时设置阳性对照与PBS阴性对照组(参见表9)；
表9 血凝实验
Figure BDA0003115147020000111
Figure BDA0003115147020000121
5)每孔加入50μL的1％的鸡红细胞液，充分混匀后，室温静置20-30min；
6)观察结果：90°倾斜96孔U形板，病毒的存在会与红细胞表面的受体相结合引起凝集，红细胞沉于孔底，平铺呈网状，即为阳性。红细胞全部凝集，沉于U形板底部，平铺成薄膜状，表明100％凝集(++++)，此时不会出现“流泪现象”；若红细胞全部沉淀于U形板底部，呈红点状，则表明不凝集(－)，此孔为阴性结果，会出现“流泪现象”。以100％凝集的尿囊液最大稀释度为重组病毒的血凝价，此为一个血凝单位。
2.3.2 提取尿囊液的病毒的RNA
2.3.3 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
使用TransScript II One-Step RT-PCR SuperMix试剂盒对血凝阳性的尿囊液进行RT-PCR反转录扩增并将产物送去测序。
1)准备无RNA酶的200μL的PCR管，按照表10反应体系加入试剂：
表10 RT-PCR体系
名称 体积
Enzyme Mix 0.8μL
2×One Step Reaction Mix 20μL
LA 3000PF 0.8μL
LA 3300PF 0.8μL
目的RNA 18μL
将上述体系混合均匀，瞬时离心后，按照表11循环体系进行反转录PCR扩增：
表11 循环体系
Figure BDA0003115147020000122
2)反应完成后，取出RT-PCR产物置于4℃保存待用，配制1％的琼脂糖凝胶进行电泳鉴定病毒RNA是否正确。出现目的条带则将RT-PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，测序结果在NCBI(National Coalition Building Institute)网站进行BLAST序列比对。
2.4 检测重组病毒感染力的滴度(TCID50测定)
TCID50为半数细胞培养物感染量。
1)使用胰酶消化BSR细胞，PBS缓冲液清洗2次，加入适量培养基将之重悬为细胞悬液；
2)在96孔板中每孔加入100μL细胞悬液，每孔2×103个细胞，在细胞培养箱中培养12h；
3)将病毒尿囊液用2％DMEM培养基10倍倍比稀释；
4)弃去96孔板中的培养基，PBS缓冲液清洗2次，分别加入100μL 10-1到10-10稀释度的病毒，每个稀释度重复8个平行孔，第12列作为对照孔，加入100μL 2％DMEM培养基，置于细胞培养箱中培养5天，每24h观察记录细胞病变的孔数。
5)根据Reed-Muench方法计算TCID50：
距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)；
TCID50＝高于50％病变的病毒最高稀释度的对数+距离比例。
2.5 重组病毒生长动力学比较研究
为确定拯救的重组病毒鸡胚生长特性，将rNDV(LaSota)的病毒尿囊液和重组病毒NDV-GT、NDV-NRP1-scFv、NDV-NRP1-scFv-GT病毒尿囊液按1×104TCID50，分别接种9-11日龄SPF鸡胚。每只鸡胚接种0.2mL，以石蜡封口，置37-38℃培养，每日观察，24h之内死亡的鸡胚弃掉，分别在接种后24、48、72及96h收获尿囊液，每一检测时间点随机收取6枚鸡胚，鸡胚置4℃保存。连续培养5天，取尿囊液作血球凝集试验，出现血凝者判阳性，记录结果，测定每0.2mL尿囊液的半数鸡胚感染量(EID50,50％egg infective dose)。
2.6 间接免疫荧光检测
六孔板做细胞爬片铺BSR细胞，在细胞密度为70％～80％时，将NDV病毒亲本株病毒尿囊液和重组病毒重组病毒NDV-GT、NDV-NRP1-scFv、NDV-NRP1-scFv-GT尿囊液用DMEM稀释为1MOI，200μL感染细胞，37℃孵育1小时后用PBS洗涤三遍，然后加入完全DMEM培养基继续培养36-48h至细胞病变(CPE)出现，弃培养基，PBS洗三遍后用4％多聚甲醛室温固定细胞30min，用PBST(0.05％Tween 20)洗涤三遍，加入1％BSA 100倍稀释的鸡抗NDV一抗，室温孵育1h后PBST洗涤三遍后，分别加入1:1000倍1％BSA稀释的荧光素(FITC)标记兔抗鸡IgG二抗室温避光孵育1h，PBST洗涤三遍，取出盖玻片，细胞面朝上，晾干；在干净的载玻片上滴2滴荧光抗淬灭剂，将盖玻片轻轻覆盖在载玻片上封片，荧光显微镜下观察并记录试验结果。
2.方法
2.1 BALB/c小鼠肝癌模型建立
1)将购入的BALB/c雌性小鼠在SPF级实验室，规范的实验条件下，适应性地饲养1周。
2)H22细胞加入PBS清洗2次，胰酶消化细胞，收集消化后的细胞，离心1000rpm，5min；
3)弃上清，加入PBS清洗2次，然后再以计数板进行细胞计数，调整细胞液浓度至1×107个/mL；
4)然后以右前肢外侧皮下为接种部位，每只BALB/c小鼠接种H22细胞2×106个；
5)观察出瘤情况：荷瘤后继续饲养7天，注意荷瘤部位有肉眼可见结节后，出瘤较均一，认为小鼠体内模型制作成功，再进行分组。
6)肿瘤体积达到200mm3时，实验动物随机分为5组，每组12只，治疗前各组体重、荷瘤大小无统计学差异，具有可比性。各组依次采用经尾静脉注射PBS、NDV、NDV-NRP1-scFv、NDV-GT和NDV-NRP1-scFv-GT，同时依次相应命名为：PBS对照组、NDV治疗组、NDV-NRP1-scFv治疗组、NDV-GT治疗组和NDV-NRP1-scFv-GT治疗组；
7)以分组注射重组新城疫病毒及PBS的第1天为治疗起始，每两天给药1次，共给药5次。每只小鼠的治疗剂量为：2×107PFU重组新城疫病毒为治疗量，作为对照，空白组小鼠则以200μL PBS/只/次以同样给药方式注射；
8)记录各组BALB/c小鼠每日的体重、精神状态、饮食饮水的变化以及其生存情况。在开始治疗在第1日起，即用游标卡尺测小鼠皮下肿瘤的体积，记录其短径(A，单位：cm)与长径(B，单位：cm)的结果，隔日测量1次，肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(V)＝A2×B×0.52。
9)在治疗后的第28天，每组中随机选择6只小鼠处死，统计并比较每组小鼠肿瘤重量大小。
2.2 人外周血单个核细胞(PBMC)的分离
1)取新鲜抗凝脐血(肝素、EDTA或枸橼酸钠抗凝均可)80mL，用等体积的PBS稀释全血；
2)在离心管(紫色分血管)垂直加入15mL淋巴细胞分离液，在分离液液面上方小心加入稀释后的血液(20-30mL)，注意保持两液面界面清晰；(可以使用巴氏吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为二者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。)
3)室温下2500rpm离心20min，缓降；
4)离心结束后将出现明显的分层：最上层黄色的是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的一层浅浅的白膜层即为淋巴细胞层，沉于离心管底部的是红细胞与粒细胞；
5)吸走弃掉2/3血浆层，将剩余血浆和白膜层细胞倒到50mL洁净的离心管中，等体积PBS液洗涤白膜层细胞。2000rpm离心10min；
6)弃上清，5mL的PBS重悬细胞，2000rpm离心10min；
7)加入10mL红细胞裂解液重悬细胞，静置5min后，2000rpm离心5min；
8)弃上清，PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1×108个/mL，备用。
2.3 免疫重建SCID/beige鼠(Hu-PBMC-SCID)荷人肝癌模型的建立
1)60只SCID/beige小鼠后随机分成6组，每组10只。A组为空白对照组，不进行免疫重建，皮下和尾静脉仅注射PBS；B组为单纯免疫重建组,经鼠尾静脉注射2×107个PBMC和200μL的新鲜人血清，5天后尾静脉再次注射2×107个PBMC和200μL的新鲜人血清。C-F组为免疫重建+荷瘤组，尾静脉注射2×107个PBMC和200μL的新鲜人血清。5天后尾静脉再次注射2×107个PBMC和200μL的新鲜人血清。2周后于小鼠右前肢外侧皮接种2×I06个HepG2细胞。
2)记录各组SCID小鼠每日的体重、生存状态、饮食饮水的变化以及其存活情况。异种移植物抗宿主病(GVHD)诊断标准参照文献判定；
3)肿瘤体积达到约150mm3时，实验动物随机分为5组，每组10只，各组经尾静脉注射PBS、NDV、NDV-NRP1-scFv、NDV-GT和NDV-NRP1-scFv-GT，同时依次相应命名为：PBS对照组、NDV治疗组、NDV-NRP1-scFv治疗组、NDV-GT治疗组和NDV-NRP1-scFv-GT治疗组；
4)以分组注射重组新城疫病毒及PBS的第1天为治疗起始，每两天给药1次，共给药5次。每只小鼠的治疗剂量为：2×107PFU重组新城疫病毒为治疗量，作为对照，空白组小鼠则以200μLPBS/只/次以同样给药方式注射；
5)在开始治疗在第1日起，即用游标卡尺测小鼠皮下肿瘤的体积，记录其长径(A，单位：cm)与短径(B，单位：cm)结果，每周测量2次，肿瘤体积按如下公式计算：肿瘤体积(V)＝A×B2×0.52；
6)在治疗后的第27天，取出每组小鼠肿瘤，统计并比较每组小鼠肿瘤重量大小；
7)组织观察:处死小鼠取睥脏、移植瘤组织，以福尔马林固定、石蜡包埋、切片染色后镜检。
图5a为SCID鼠肿瘤生长曲线图，从图5a的结果可以看出，小鼠分别经过PBS、NDV、NDV-NRP1-scFv、NDV-GT和NDV-NRP1-scFv-GT治疗后，随时间的延长，PBS组肿瘤体积不断增加，无治疗或抑制肿瘤的效果。重组病毒治疗组肿瘤体积均增长缓慢。在治疗后27天，经统计学分析，NDV-NRP1-scFv-GT治疗组肿瘤体积小于NDV治疗组，差异有统计学意义(P<0.001)，NDV治疗组，NDV-NRP1-scFv治疗组，NDV-GT治疗组和NRP1-scFv-GT治疗组肿瘤体积都小于PBS对照组(P<0.0001)。
图5b为SCID鼠肿瘤生存曲线图，从图5b动物存活率结果看，与PBS对照组相比(中位生存期＝33天)，NDV治疗组(中位生存期＝45天，P<0.01)、NDV-NRP1-scFv治疗组(中位生存期＝45天，P<0.01)、NDV-GT治疗组(中位生存期＝58天，P<0.001)和NDV-NRP1-scFv-GT治疗组(中位生存期＝60天，P<0.001)显着延长中位生存期。与NDV治疗组相比，用NDV-NRP1-scFv-GT治疗的小鼠表现出显着的肿瘤生长抑制变化(P<0.05)。表明NDV-NRP1-scFv-GT病毒在小鼠体内能够显著减小肝癌肿瘤体积，且可以延长小鼠的整体存活率。
端粒酶是一种RNA依赖的RNA聚合酶,负责细胞端粒延伸。它能将端粒DNA加到真核染色体末端，填补DNA复制过程中丢失的端粒，延长端粒修复时间，防止端粒因细胞分裂而丢失，增加细胞分裂次数。人类端粒酶主要由3部分组成，包括人端粒酶RNA(telomeraseRNA，TR)、人端粒酶相关蛋白和人端粒酶逆转录酶(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)。在众多调控端粒酶活性的因素中，hTERT的调控起关键作用。在肿瘤细胞系中hTERT基因启动子明显激活，但在正常体细胞中除了活化的淋巴细胞、干细胞和生殖细胞外，hTERT的表达几乎只限制在肿瘤细胞中。因此构建hTERT启动子调控的抑癌基因或自杀基因的病毒载体，转染肿瘤细胞或组织，特异性的引导肿瘤治疗基因只在肿瘤细胞中表达，从而减轻对正常组织的损伤成为目前肿瘤靶向性基因治疗的研究热点。本研究所应用的hTERT序列位于hTERT基因5’端的一个5.8kb基因片段中，是位于转录起始区上游区域,长286bp的具有最大启动子活性。
神经菌毛素1(neuropilinl，NRP1)是脊椎动物特有的单次跨膜糖蛋白，NRP1作为神经丛蛋白的共受体参与神经细胞导向和轴突生长的调控；同时也作为血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)的共受体对内皮细胞的活化、增殖与迁移进行调控。已有研究结果表明NRP1的过表达与肿瘤的增殖和浸润有关，并且和胃肠道肿瘤、前列腺瘤、肺癌、卵巢癌、神经胶质瘤、骨肉瘤、黑色素瘤的不良预后有关。NRP1单链抗体NRP1-scFv分子量小，可以与NRP1结合，通过血管壁渗透到肿瘤组织，达到有效的抗肿瘤效果。
α-1,3半乳糖苷转移酶(α-1,3Galactosyltransferase，α1,3GT)负责细胞表面α-半乳糖基抗原表位(α-Gal)的合成，普遍存在于猪、牛、羊、小鼠等非灵长类动物中。人类不具有这种抗原，但血清中存在高浓度的抗α-Gal抗体，因此，α1,3GT成为异种器官移植中产生超急性免疫排斥(hyperacute rejection,HAR)的主要诱因。
所以本研究采用反向遗传技术将肿瘤细胞特异性启动子hTERT插入到融合表达NRP1-scFv和α1,3GT基因的NDV基因组中，构建重组病毒NDV-NRP1-scFv-GT。利用hTERT启动子在转录水平上实现NDV在肿瘤细胞的特异性复制，通过NRP1-scFv与NRP1结合，抑制肿瘤的侵袭生长，在肿瘤细胞表面过表达α-Gal抗原表位，则可以诱导人体自身的anti-Gal对肿瘤细胞特异性打靶，激活补体，实现对肿瘤细胞的杀伤，达到有效的抗肿瘤效果。在构建过程中，我们发现病毒载体的保真性对于目的片段的连接具有非常大的影响，载体的突变将会导致目的片段无法连接至病毒载体。因此，构建过程中，对载体的基因序列的反复检测很有必要。本研究中，重组病毒在BSR细胞中的拯救也是难点，该过程耗时长，拯救率低。其中BSR细胞状态，脂质体转染试剂与质粒的比例优化尤其关键。
在肿瘤的治疗中，针对每个患者的个体化治疗方案才能最大限度维护患者的利益、得到最佳的治疗效果。因此，在进行临床前研究中，选择合适的动物模型选择也是实验成功的关键。理想的动物模型应尽可能与人类疾病生长进程及功能相似，生命周期满足实验需要，能够准确所要研究的人类疾病,动物疾病表现应与人类疾病相似，反映疾病的发生发展变化，还应在临床上有专一性和可控性，复制率高，复制时经济易行。
SCID鼠具有T细胞和B细胞联合免疫缺陷的生物学特性，SCID小鼠体重发育正常，但胸腺、脾、淋巴结的重量不及正常的30％，组织学上表现为淋巴细胞显著缺陷。SCID小鼠是异种移植的良好动物载体，可以通过移植人类免疫细胞、免疫组织或免疫器官到SCID鼠中进行人免疫功能重建，从而成为了建立人源化动物模型的理想选择。虽然具备以上优势，但SCID鼠像裸鼠一样，其体内还残留有NK细胞，外周血单核细胞等，容易发生“免疫渗漏”，对荷瘤免疫重建有一定的影响。因此需要清除SCID鼠的NK细胞或降低其活性，以减轻或消除SCID鼠对人源细胞的移植排斥反应。
SCID/beige双重突变型小鼠是SCID小鼠与另外一种突变种小鼠beige鼠进行杂交。由此获得的SCID/beige小鼠表现为T、B细胞和NK细胞功能缺陷，细胞因子信号传递能力缺失，更适合人造血干细胞及外周血单核细胞的移植和生长。因此,移植入小鼠体内的人PBMC成功率大为提高，虽然人B细胞还不能出现在小鼠的循环系统中，但是PBMC已经能够出现在淋巴器官中并且可以在血液中检测到人IgG的表达。因此，SCID/beige鼠成为一种更易于异种移植成功的动物模型。同时，Beige小鼠寿命平均时间长达1.5年，更利于实验使观察。
免疫重建移植途径主要为经尾静脉注射和经腹腔注射人外周血淋巴细胞(hu-PBL)，本文采取小鼠尾静脉内注射2×107个PBMC来重建具有人免疫特性的Hu-PBMC-SCID/beige小鼠模型。重建后的动物模型中可以检测到人免疫球蛋白IgG，人T淋巴细胞，且随时间延长而逐渐增高。在尾静脉内注射PBMC的同时我们在小鼠皮下接种HepG2细胞，成功建立了人免疫重建荷人肝癌小鼠复合模型。
NDV病毒可以在人类的肿瘤细胞中进行有选择性的复制而不损害正常组织细胞。目前，NDV的抗肿瘤作用己经在多种人类癌症上进行临床研究。与亲代野生型毒株相比，利用基因工程改造的NDV病毒的溶瘤活性和抗肿瘤效果的长效性已明显改善。NDV作为载体插入抑癌基因，治疗性抗体、免疫调节因子等，通过多种途径协同作用杀伤肿瘤细胞，可以有效避免目前单一靶点抗癌药物普遍存在的耐药性问题。本实验采用反向遗传技术将肿瘤细胞特异性启动子hTERT插入到融合表达NRP1-scFv-GT基因的NDV基因组中，构建重组病毒NDV-NRP1-scFv-GT。利用hTERT启动子在转录水平上实现NDV在肿瘤细胞的特异性复制，通过NRP1-scFv与NRP1结合，抑制肿瘤的侵袭生长，过表达α-Gal抗原表位，则可以实现诱导人体自身的anti-Gal对肿瘤细胞特异性打靶，激活补体，实现对肿瘤细胞的杀伤，达到有效的抗肿瘤效果。
病毒的给药方式主要分为局部给药和全身用药。但病毒全身给药的溶瘤效果被认为高度依赖于免疫反应的诱导，溶瘤病毒在快速裂解肿瘤细胞的同时会释放肿瘤特异性抗原，诱发全身性的抗肿瘤反应，增加肿瘤组织处的天然免疫细胞(如NK细胞、巨噬细胞)浸润和T细胞浸润，达到有效的抗肿瘤效果。
本实验通过移植人PBMC可以很好的在SCID-beige鼠体内建立人源性免疫系统，较好的模拟人肝癌及其免疫环境，建立了人免疫重建荷人肝癌小鼠复合模型。通过静脉注射的方式探讨了重组新城疫病毒NDV、NDV-NRP1-scFv、NDV-GT和NDV-NRP1-scFv-GT的体内抑瘤作用。实验结果表明，重组新城疫病毒NDV、NDV-NRP1-scFv、NDV-GT和NDV-NRP1-scFv-GT均可抑制肿瘤的生长，但就抑瘤水平和平均生存期而言，NDV-NRP1-scFv-GT的治疗效果优于其他重组病毒。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 广西医科大学
<120> 一种溶瘤病毒NDV-NRP1及其构建方法与应用
<130> 2021.06.01
<141> 2021-06-15
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atggaggtgc agctgttgga gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 60
ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttt agcagttatt atatgagctg ggtccgccag 120
gctccaggga aggggctgga gtgggtctca gcgatctctc ctggtagtag taataaatat 180
tacgctgatt ctgtaaaagg tcggttcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 240
tatctgcaaa tgaacagcct gagagccgag gacacggccg tgtattactg tgcgagaagg 300
aagtatatgt tcgactactg gggccagggt acactggtca ccgtgagctc aggtggaggc 360
ggttcaggcg gaggtggctc tggcggtggc ggaatccagt ctgtgctgac tcagccaccc 420
tcagcgtctg ggacccccgg gcagagggtc accatctctt gtactggctc ttcatctaat 480
attggcaata atgatgtcta ctggtaccag cagctcccag gaacggcacc caaactcctc 540
atctattctg atagtaatcg gccaagcggg gtccctgacc gattctctgg ctccaagtct 600
ggcacctcag cctccctggc catcagtggg ctccggtccg aggatgaggc tgattattac 660
tgtgcttctt gggattctag cctgagtggt tatgtcttcg gcggaggcac caagctgacg 720
gtccta 726
<210> 2
<211> 1343
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
cgggggccat ccccgagcgc acccagcttc tgccgatcag gagaaaataa tgaatgtcaa 60
aggaagagtg gttctgtcaa tgctgcttgt ctcaactgta atggttgtgt tttgggaata 120
catcaacaga aacccagaag ttggcagcag tgctcagagg ggctggtggt ttccgagctg 180
gtttaacaat gggactcaca gttaccacga agaagaagac gctataggca acgaaaagga 240
acaaagaaaa gaagacaaca gaggagagct tccgctagtg gactggttta atcctgagaa 300
acgcccagag gtcgtgacca taaccagatg gaaggctcca gtggtatggg aaggcactta 360
caacagagcc gtcttagata attattatgc caaacagaaa attaccgtgg gcttgacggt 420
ttttgctgtc ggaagataca ttgagcatta cttggaggag ttcttaatat ctgcaaatac 480
atacttcatg gttggccaca aagtcatctt ttacatcatg gtggatgata tctccaggat 540
gcctttgata gagctgggtc ctctgcgttc ctttaaagtg tttgagatca agtccgagaa 600
gaggtggcaa gacatcagca tgatgcgcat gaagaccatc ggggagcaca tcctggccca 660
catccagcac gaggtggact tcctcttctg cattgacgtg gatcaggtct tccaaaacaa 720
ctttggggtg gagaccctgg gccagtcggt ggctcagcta caggcctggt ggtacaaggc 780
acatcctgac gagttcacct acgagaggcg gaaggagtcc gcagcctaca ttccgtttgg 840
ccagggggat ttttattacc acgcagccat ttttggggga acacccactc aggttctaaa 900
catcactcag gagtgcttca agggaatcct ccaggacaag gaaaatgaca tagaagccga 960
gtggcatgat gaaagccatc taaacaagta tttccttctc aacaaaccca ctaaaatctt 1020
atccccagaa tactgctggg attatcatat aggcatgtct gtggatatta ggattgtcaa 1080
gatagcttgg cagaaaaaag agtataattt ggttagaaat aacatctgac tttaaattgt 1140
gccagcagtt ttctgaattt gaaagagtat tactctggct acttcctcag agaagtagca 1200
cttaatttta acttttaaaa aatactaaca aaataccaac acagtaagta catattattc 1260
ttccttgcaa ctttgagcct tgtcaaatgg gagaatgact ctgtagtaat cagatgtaaa 1320
ttcccaatga tttcttatct gcg 1343
<210> 3
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
cccaaggtcc aactctgttt aaacttagaa aaaatacggg tagaagtgcc accgaccccc 60
gggt 64
<210> 4
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
aggtccaact ctgtttaaac ttagaaaaaa tacgggtaga agtgccacca tgaatgtcaa 60
agga 64
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
gaggattgcc gcttgggttt aaactcagat gttatttcta accaaattat actctt 56
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
gaggattgcc gcttgggttt aaacttactt gtacagctc 39
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
gttagatgca gccgggtcg 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
aatgggcaga atcaaagta 19

Claims (10)

1.一种重组新城疫病毒，其特征在于，所述重组新城疫病毒含有如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于，所述重组新城疫病毒还含有P2A序列，以其作为Linker连接SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将同时含有SEQ ID NO.1所示的NRP1-scFv和SEQ ID NO.2所示的GT的目的片段与线性化的rLaSota载体PBRN-FL质粒进行同源重组；
(2)将步骤(1)中的同源重组产物转化感受态细胞；
(3)筛选阳性单克隆菌株；
(4)对步骤(3)中筛选得到的阳性单克隆菌株进行质粒提取；
(5)重组质粒转染BSR细胞；
(6)重组病毒的增殖；
(7)重组病毒的鉴定。
4.根据权利要求3所述的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中同时含有NRP1-scFv和GT的目的片段是以质粒PcDNA3.1-NRP1-scFv-GT为模板，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5为引物扩增得到的。
5.根据权利要求4所述的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中线性化的rLaSota载体PBRN-FL质粒是使用Pme I限制性内切酶体系酶切得到。
6.根据权利要求5所述的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中线性化的rLaSota载体PBRN-FL质粒与目的基因的DNA总质量之比为1:1到1:3。
7.根据权利要求6所述的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中感受态细胞为TransStbl3化学感受态细胞。
8.根据权利要求7所述的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤(6)中将质粒转染BSR细胞的培养液接种于9-11日龄SPF级鸡胚中进行病毒的扩增。
9.根据权利要求4-8中任一项所述的构建方法构建得到的重组新城疫病毒。
10.根据权利要求9所述的重组新城疫病毒在制备治疗恶性肿瘤药物中的应用。
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