CN103182089A - 用表达自杀基因的间充质干细胞进行细胞介导癌症基因治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种使用表达自杀基因的间充质干细胞(MSC)的细胞介导的癌症基因治疗。向有肿瘤的个体施予该MSC，让该MSC迁移到肿瘤部位，并且接着向所述个体施用前药。该MSC在肿瘤部位对自杀基因的表达将所述前药转换成杀死肿瘤细胞的药物。肿瘤对该个体健康的影响因而能够减轻或者消除。本发明的MSC通过使用永生化的MSC系以及筛选具有免疫学特性的MSC以防止移植物抗宿主反应，可最优化为即用型产品。

Description

用表达自杀基因的间充质干细胞进行细胞介导癌症基因治疗
技术领域
本发明总体上涉及癌症治疗领域，以及细胞分离和基因改变的领域。更具体地，其涉及使用诸如胸苷激酶之类自杀基因转染的干细胞治疗癌症。 
背景技术
癌症是当今世界面临的最大的健康挑战之一，每年有超过1000万个的新癌症病例。据来自美国癌症协会的信息，2007年报道的癌症新病例超过140万。据来自美国国家卫生研究院的信息，在美国治疗癌症患者每年的直接费用约780亿美元。在中国，癌症是导致死亡和疾病的头号原因。据来自IMS Global Insights的信息，受人口老龄化、更好医疗条件以及还有很多年专利保护期的进一步的创新产品的引入等因素的驱动，到2012年，中国的癌症治疗市场价值将超过400亿美元。全球对抗癌症的斗争在继续，需要更多的方式来治疗不能用当前可用的抗癌药物治疗的病例。 
在观察发育成纤维细胞集落形成细胞(CFU-F)的细胞群时，最先识别出成人间充质干细胞(MSC)。从那时起，这些细胞的治疗用途和临床应用已被建议用于组织工程、基因治疗、器官移植和组织损伤。参见P M等，Open Orthop J.2011；5(Suppl 2)：253-60。 
以干细胞为基础的癌症治疗已由M.Cihova等在MolPharmaceutics 2011，8，1480-7中进行了概括评述。已发现MSCs深入(home)到肿瘤微环境中(Mishra PJ et al.，Cancer Res 2008；68：4331-9；Hall B et al.，Handbook of Experimental Pharmacology2007；(180)：263-83)。它们被用来作为载体在体内提供临床相关的各种抗癌药物，包括细胞因子(Elzaouk L et al.，Exp Dermato 2006；15：865-74)、干扰素(Nakamizo A et al.，Cancer Res 2005；65：3307-18；Studeny M et al.，J Nat Cancer Inst 2004；96：1593-603.)、前药(Miletic H et al.，Mol Ther 2007；15：1373-81；Kucerova L et al.，Cancer Res 2007；67：6304-13.)或复制型腺病毒(Sonabend AM et al.，Stem Cells 2008；26：831-41；Chan J et al.，Stem Cells 2005；23：93-102.)。已在肿瘤转移模型中使用转基因祖细胞系对治疗效果进行了探索(Aboody KS et al.，PLoS ONE 2006；1：e23)。 
Myers TJ等在Expert Opin Biol Ther.2010Dec；10(12)：1663-79中对间充质干细胞和基因治疗进行了评述。Gu C等已用老鼠实验脑膜胶质瘤模型对遗传工程化间充质干细胞的治疗效果进行了测试，参见Cancer Lett.2010May 28；291(2)：256-62。Bak XY等建议将杆状病毒转导的骨髓MSC用于系统性的癌症治疗，参见Cancer Gene Ther.2010Oct 17(10)：721-9。Amano S等建议将遗传工程化的骨髓衍生的间充质干细胞用于胶质瘤基因治疗，参见Int J Oncol.2009Dec；35(6)：1265-70。利用工程化间充质干细胞的靶向肿瘤基质已被建议用于减少胰腺癌的增长，参见Zischek C et al.，Ann Surg.2009Nov；250(5)：747-53.Erratum in：Ann Surg.2010Jan；251(1)：187。根据Matuskova M et al.，Cancer Lett.2010Apr 1；290(1)：58-67，表达HSV-TK的间充质干细胞已被认为能对人脑胶质瘤细胞施加旁观者效应。Uchibori R等已建议将产生逆转录病毒载体的间充质干细胞用于靶向自杀肿瘤基因治疗，参见J Gene Med.2009 May；11(5)：373-81。Dai LJ等在Cancer Lett.2011Jun 1；305(1)：8-20中对在癌症治疗中间充质干细胞的潜在影响进行了论述。 
美国专利公布号US 2011/250188A1涉及用于肿瘤治疗的LCMV-GP-VSV的假型载体和肿瘤浸润病毒产生细胞。美国专利US 2008/0241115A1涉及使用基因改造的间充质干细胞来表达用于治疗癌症的自杀基因。美国专利US 2010/0233200A1涉及编码治疗性多肽和用以清除转导细胞的安全元件的载体。 
在其技术能商业可行地用于人类治疗之前，这样的背景研究还需要进一步发展。 
发明内容
本发明提供一种使用表达自杀基因的间充质干细胞(MSC)的细胞介导的癌症基因治疗形式。本发明的MSC通过使用永生化的MSC系以及筛选具有免疫学特性的MSC以防止移植物抗宿主反应，可最优化为即用型(off-the-shelf)产品。 
根据本发明的治疗个体所罹患的肿瘤的方法，其通常包括下述步骤：a)向个体施予重组表达自杀基因的间充质干细胞(MSC)群；b)等待足够时间使得至少一些所述间充质干细胞从它们在步骤a)中的施予部位迁移至所述肿瘤所处的部位或所述肿瘤所处部位的附近；以及然后c)给予所述个体有效量的前药，藉此，由位于所述肿瘤部位或者其附近的所述间充质干细胞表达的所述自杀基因引起所述前药转换成杀死肿瘤细胞的药物。 
作为即用型产品的用途，这些细胞可以被表征为“多向”。此术语是指细胞足够无免疫原性，从而可以将其给予人群中各种基因 型的个体而不必考虑组织配型。对于群体中的大多数，有效比例的间充质干细胞将迁移到肿瘤而不会被个体的免疫系统去除或者导致失效。多向性细胞可以包含在现成的医药产品中，而无需预先知道什么个体将接受治疗，或个体各自的组织类型。 
通常，MSC来自已被永生化的细胞系，永生化是通过使用诸如慢病毒之类的载体用SV40大T抗原转染进行的。优选地，MSC是胚胎间充质干细胞或来自构成多形性免疫图谱(profile)的源的细胞。典型的自杀基因是胸苷激酶(例如，来自HSV)，对于胸苷激酶，前药是更昔洛韦(gancicloir)。其他自杀基因和前药在本公开的后文列明。 
本发明的另一实施方式是用于药物或用于制备药物的产品。这些产品包括重组表达自杀基因的间充质干细胞系。优选地，MSC是胚胎间充质干细胞或来自构成多形性免疫图谱的另一个源的细胞。再者，MSC通常来自已被永生化的细胞系，永生化是通过使用诸如慢病毒之类的载体用SV40大T抗原转染进行的。可以使用自杀基因转染细胞，与此同时进行永生化，或作为单独的步骤进行。 
这种细胞系可用于制备治疗癌症的药物组合物。该组合物将包括本发明的MSC群，以及生理相容的缓冲剂或其他赋形剂。本发明还提供了一种用于治疗个体肿瘤的药剂盒(kit)。该药剂盒可包含本发明的药物组合物以及相应的前药，其中在该组合物的MSC中的自杀基因的表达导致前药被转换为对肿瘤细胞致命的药物。根据本发明方法，这样的药物组合物和药剂盒通常与使用指南一起包装。 
根据下述的说明，本发明的其他实施方式将是明显的。 
附图说明
图1显示人类胚胎BMSC的干细胞的特性。1(A)显示单集落形成能力。1(B)显示与人类成人的MSC相比，人类胚胎骨髓MSC的多向分化潜能。 
图2显示由流式细胞仪检测到的人类胚胎骨髓衍生MSC的表面标记。 
图3提供了在转导BMSC编码大和小T抗原的SV40的质粒(上)以及TK和GFP共表达质粒(下)的基因图。 
图4显示了MSC集落(上)、用免疫印迹(Western blot)测得的SV40的表达(中)和在4批转导MSC中的SV40的表达(下)。 
图5显示了MSC的GFP阳性集落(上)、挑选集落的基因表达(中)和SV40-TK-GFP表达的MSC形态。 
图6(A)显示本发明的基因转导的MSC的示例性表面标记。 
图6(B)显示了SV40-TK-GFP-过表达hfBMSC的表面标记。 
图7(A)显示转导后分选MSC的工作流程。 
图7(B)显示了从分选的细胞群鉴定的单一集落(10×物镜)。 
图8显示转导后MSC的成骨和成脂分化能力。 
图9显示转导后MSC的细胞增殖。 
图10显示在人类前列腺癌细胞的存在或缺乏的情况下hfBMSC的跨孔迁移能力的研究结果。 
图11显示慢病毒转导对BMSC朝向肿瘤迁移的影响。 
图12显示，在SV40-TK-GFP人类胚胎MSC共培养中的GCV对人前列腺癌细胞系(DU145)的体外细胞毒性。 
图13显示对转导的MSC的MLR分析结果。 
图14显示本发明的MSC在体内的抗肿瘤效果。 
具体实施方式
本发明提供用于治疗癌症的药物组合物和治疗方法。对间充质干细胞(MSC)进行工程化使其表达将前药转化成杀死肿瘤细胞的药物的自杀基因。将MSC给予具有肿瘤的个体，MSC将由此迁移到肿瘤部位。然后给该个体施用前药，通过MSC表达的自杀基因该前药在肿瘤处或肿瘤附近转化成致命的形式。肿瘤对个体健康的影响因而减少或消除。 
本发明相对于以前的间充质干细胞(MSC)为基础的治疗方式提供了许多改进。这些改进可单独或合并应用以生产即用型产品，使这些即用型产品具有良好特征的干细胞属性、肿瘤趋向性、低免疫原性、能够提供自杀基因至肿瘤微环境以及有适合成批生产的增殖能力。 
以前的MSC工作通常依靠新鲜分离的或培养的细胞，该些细胞然后被施用给个体，该个体与该细胞制剂是同源的或异源的。作为实际问题，本发明的MSC可永生化为具有公知表型的标准化的细胞源，从而可以成规模地用于商业用途。已发现，通过根据本发明将细胞永生化并可选地选择该细胞，能够建立具有持续增殖能力的混合或克隆细胞系，同时还保留深入到肿瘤细胞的能力从而可以将有效制剂递送到靶标。 
还发现，获得相对早期的MSC，在潜在的个体人群中可以获得相对无免疫原性的细胞群以用于药物。这些细胞因此可以给予具有广范围的不同组织类型的个体。这意味着，可以在不知道预期受体的情况下，在治疗前制备这些细胞。具有此属性的药物组合物可称作为即用型产品。 
干细胞的可能的源和表征
用于本发明的MSC制剂的起始细胞群可能要从个体发生(ontogenetically)的原始源获取。创造这项发明所做的实验研究表明这种获取方式提供了几个优势。首先，细胞可以更好地适应组织培养，有更大的增殖能力，并可能更适合基因的改变和永生化。 
其次，个体发生(ontogenetically)的原始细胞一般有所需的跨广泛组织类型的相对无免疫原性的属性。除非MSC对于预期的受体是自体的，否则MSC给人类的用药几乎不可避免地会涉及细胞系和受体之间的组织类型的差异。通常情况下，组织移植会导致免疫初始 
Figure BDA0000128131350000071
个体的IV型移植物抗宿主反应，或导致具有预制抗体的个体的超急性排斥反应。免疫反应可能在细胞与个体的目标肿瘤细胞进行反应之前就将所述细胞清除，或阻止随后的相同细胞剂型的有效性。 
然而，可用作本发明的细胞系或药物组合物的起始群的早期MSC可能在个体体内是免疫豁免的，或激起沉默(muted)应答。这在以下示例中进行证实，人类的MSC可以在动物模型的异种移植(xenograph)中使用，并仍然有效地将自杀基因递送至肿瘤部位。 
示例性的起始MSC可从第二或第三孕期胚胎组织中获得：特别是从骨髓中(例1)获得。原理上，胚胎MSC也可以从胚胎间充 质细胞、中胚层、脐带血、胚胎组织匀浆或其他胚胎组织中获得。人的多能间充质干细胞也可以从羊水分离(Tsai MS et al.，Hum Reprod.2004Jun；19(6)：1450-6)。 
MSC可根据功能特性和表型标记进行表征。例如，它们可能是CD34-ve，CD44+ve，CD73+ve，和CD90+ve(例3)。美国专利US 2006/0166214A1提供了检测间充质干细胞的标记系统和区分间充质干细胞的方法。也请参见P M等在Open Orthop J.2011；5(Suppl 2)：253-6中对用于间充质干细胞的细胞表面标记的评述。MSC群也可由功能性特征进行表征，这些功能性特征如分化为成骨、成脂或软骨组织的能力和/或深入到肿瘤细胞的能力。 
只要细胞有深入肿瘤和自杀基因表达的属性，这些功能就不是绝对必要的。然而，表型标记可用于细胞制备以从其他细胞类型中筛选出所需的MSC。它们也可用于不同阶段的质量控制，例如，在初始分离时、经过一段时间组织培养后、在永生化后、在转导以表达自杀基因后以及在制备药物产品后。 
永生化 
一旦源MSC适应了组织培养，就可以对其进行处理以提高增殖能力和/或增殖率。 
有几种方法可用于哺乳动物细胞在培养基中的永生化。病毒基因，包括猿猴病毒40(SV40)T抗原、EB病毒(EBV)、腺病毒E1a和E1b、和人类乳头状瘤病毒(HPV)E6和E7，可诱导不同类型的细胞永生化。在大多数情况下，病毒基因通过使诱导细胞进入复制性衰老状态的抑癌基因(P53，Rb和其他)失活来实现永生化。 
实现细胞永生化的另一种方法是通过表达端粒酶逆转录酶蛋白(TERT)。这种蛋白在大多数体细胞中是不活跃的，但当hTERT外源性表达时，细胞能够维持足以避免衰老的端粒长度。一些对端粒酶-永生化的细胞株的分析已证实，细胞保持了稳定的基因型以及保留了关键的表型标记：见美国专利No.7195911。 
SV40T抗原已被证明是在培养基中转化许多不同类型细胞的可信赖试剂。细胞可通过象慢病毒这样的递送载体转染关键SV40基因而被永生化，而不是感染病毒SV40本身。可选地，同样的载体可用于同时递送自杀基因(下文)，或者是象绿色荧光蛋白(GFP)这样的标记基因。合适的载体是市售的。例如，Capital Biosciences提供的重组慢病毒载体，该载体含有SV40大和小T抗原，可表达用于基因特异性的细胞永生化的突变pLenti-SV40基因。 
MSC一旦以这样的方式处理后，就可测试它们的增殖能力，例如，使用标准的BrdU试验(3例)。如果细胞的增殖特性不是最佳的，细胞群还可以接受几轮的永生化。也可能通过同时转染诸如SV40T抗原基因以及细胞标记物来对增殖能力提高的细胞进行富集。例如，标记物可以编码在相同的载体中，通过IRES把它与SV40抗原分隔开来。如果标记物是化学发光的或象绿色荧光蛋白(GFP)这样生物发光的，细胞可以通过荧光激活细胞分选来富集。另外，如果标记物是独特的细胞表面抗原，被转染的细胞可用特异性针对标记物的荧光抗体来富集。使用者可对细胞进行任意按需组合的多轮细胞永生化和富集。 
自杀基因转导 
本发明的MSC经过基因改造以表达自杀基因。可用任何合适的使自杀基因的表达由在靶组织或肿瘤细胞中具有活性的启动子控制的载体。可选择在所有细胞具有活性的启动子，如CMV启动子。此外，也可以选择启动子使得自杀基因是组织特异性的。这意味着它只在目标特征的细胞中表达。例如，针对前列腺癌的药剂可包括在PSA启动子控制下的自杀基因。载体可以选择性地包括诸如SV40T抗原的永生化成分，以使得永生化与自杀基因的转导可一步完成。载体可以选择性地包含荧光标记物或细胞表面标记物，以协助随后富集表达自杀基因的被转导细胞。 
一旦自杀基因表达到足够水平的细胞群已经建立，其疗效可通过该细胞群和来自肿瘤细胞系(优选与拟接受治疗的人群的目标肿瘤的类型相同)的细胞群在体外结合的方法来测试。MSC有机会表达自杀基因以后，将前药添加到培养基中，然后测定由此产生的对肿瘤细胞的毒性。按照本发明的治疗方法，疗效可用合适的动物模型(例7)进行活体测试。 
在本发明中的术语“自杀基因”是指表达能够把特定的前药转换成对目标肿瘤细胞具有毒性的药物的酶的基因。这种药物可以对或可以不对把它传递到肿瘤部位的MSC有毒性。 
虽然来自于HSV的胸苷激酶(TK)已经作为本发明的自杀基因原型，还有其他选择。根据靶细胞类型、预期的效果、和前药的适用性，表1所示的基因药物组合可以根据本发明进行测试和开发。(表改编自W.A.Denny，J.Biomedicine Biotechnol 1：48-70，2003年)。 
Figure BDA0000128131350000111
治疗中的应用 
表达自杀基因的MSC群落可用于对需要治疗的个体的癌症的治疗或肿瘤细胞的清除。 
先从其来源中取出MS C并做好给药的准备(例如，准备必要的清洗，和/或交换进入到给药缓冲剂)。然后，将其通过合适介质给药到个体，所述介质如生理盐水或生理相容的缓冲剂，可选择性地含有其他诸如增稠剂或可协助在冷冻保存的试剂等赋形剂。给药的方式可以是全身(静脉注射或皮下注射)或局部注射或通过留置导管的输液。 
前药可以在任何合适的时间给药，通常每次至少一部分的MSC(大约3％，5％，10％，20％或者更多)从给药点转移到肿瘤细胞或肿瘤细胞附近的位置。 
调整MSC和相应前药的剂量以使得副作用最小且对肿瘤的效果最佳。通过从动物模型的有效剂量(每个老鼠0.2万个细胞)推断，MSC人体全身给药的有效剂量可能是每公斤1×107细胞的量级，或者介于0.2×107和5x107每千克之间，如果局部给药剂量适当减小。像GCV这样的前药的有效剂量是30毫克/千克量级，或者介于5至150毫克/千克之间。给药途径和剂量的最终选择由主治医生决定。 
原则上，经过适当的事先测试，本发明可用于治疗任何形式的肿瘤。由于MSC深入到肿瘤细胞，本发明的方法可适用于不能手术切除的肿瘤或转移性肿瘤的治疗。根据本发明的治疗可能有几个理想的终点中的任何一个或多个。所述终点包括减少或停止肿瘤的 生长，减少病人所遭受的症状，降低目标肿瘤的血清标志物，根除肿瘤以及增加寿命。 
本发明还提供了治疗多个患者和/或多次治疗一个病人的系统和药剂盒。这些系统和药剂盒包括多个具有不同组织类型的、经过基因改造后能表达相同或不同自杀基因的细胞系。通常情况下，MSC来源于O型血，这样才能用于任何ABO血型的个体。然而，任何血型的原始细胞产生的不同MSC制备物，可用于相同血型患者的给药。 
当MSC的无性生殖属性很低，组织配型通常是没有必要的。然而，如果需要(例如，如果个体已经对同种抗免疫球蛋白(allotypes)敏感)，临床医师不妨做一个细胞毒性试验(病人血清中的MSCS)和/或对于I类和/或II类组织相容性标志物的组织配型。然后从系统中选出特别的MSC制备物，以尽量减少同种异体性(allogenicity)和/或超急性排斥反应。当需要多剂量时，临床医生可能每次要选择不同组织类型的MSC以防以前的剂量使得患者对以前的剂型中所用的组织类型敏感。 
定义 
在本文中使用的术语“间充质干细胞”(MSC)根据其在本领域的标准意义使用。该术语一般是指可以分化成特定细胞类型的多能干细胞，例如，成骨细胞(骨细胞)，软骨细胞和脂肪细胞，并且具有间质干细胞的特征标记，如CD44、CD73和CD90。 
“多向性”细胞是指足够无免疫原性因而可以给予群体中不同基因型的个体而不必考虑其组织配型的细胞。对于群体中的大部 分，有效比例的多向性间充质干细胞将迁移到肿瘤而不会被个体免疫系统清除或导致失效。 
细胞可以被描述为“永生化的”，如果它被人为改变(例如，通过用SV40的T抗原转染)，以使得相较于改变之前，其增殖能力增加到至少50倍，或至少细胞海弗利克极限的3倍。 
本发明中的术语“自杀基因”是指表达能够把特定的前药转换成对目标肿瘤细胞具有毒性的药物的酶的基因。这种药物可以对或可以不对把它传递到肿瘤部位的MSC有毒性。 
术语“前药”是指一种化合物，其最初的结构形式基本上是惰性的，但被特定的酶修饰后的结构具有显著的生理活性-例如，对肿瘤细胞有毒性的一种化合物。 
用特定的组合物“治疗”个体的方法是指将所述组合物给药到个体，其目的为减轻与一定疾病或者病症相关的病理、症状、或者不良状况例如肿瘤或癌变组织在个体中的存在。 
药物组合物的“有效剂量”是组合物(当以规定的方式给药)，能有效地减轻与实际被治疗的个体处于相同的状况并具有相同的表型和病症的大多数个体的与所指疾病或者病症相关的病理、症状、或者不良状况的剂量。 
一般技术 
分子遗传学和基因工程中的一般方法在当前版本的《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(Sambrook等Cold Spring Harbor)、《哺乳动物细胞基因转移载体》 (Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(Miller & Calos eds.)、和《分子生物学的当前协议》(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等eds.，Wiley & Sons)中有描述。细胞生物学、蛋白质化学、和抗体技术可以在《蛋白质科学的当前协议》(Current Protocols in Protein Science)(J.E.Colligan等eds.，Wiley & Sons)、《细胞生物学的当前协议》(Current Protocols in Cell Biology)(J.S.Bonifacino等Wiley & Sons)和《免疫学的当前协议》(Current protocols in Immunology)(J.E.Colligan等eds.，Wiley & Sons)中发现。在该文件中提到的试剂、克隆载体和基因操作试剂盒是由诸如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Clontech和Sigma-Aldrich Co市售的。 
细胞培养方法一般在当前版本的《动物细胞培养：基本技术手册》(Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique)(R.I.Freshney ed.，Wiley & Sons)和《胚胎干细胞：方法和协议》(Embryonic Stem Cells：Methods and Protocols)(K.Turksen ed.，Humana Press)，中有描述。组织培养耗材和试剂是由诸如Gibco/BRL，Nalgene-Nunc International，S igma Chemical Co.，和ICN Biomedicals市售的。 
根据本发明制备的对人类或兽医治疗有用的细胞优选以药物组合物的形式提供，药物组合物中包括在充分无菌条件下制备的用于人类或兽医给药的合适赋形剂。对于药物配方的一般原则，可参考《细胞疗法：干细胞移植、基因治疗和细胞免疫疗法》(Cell Therapy：Stem Cell Transplantation，Gene Therapy，and Cellular Immunotherapy)G.Morstyn & W.Sheridan eds，Cambridge University Press，1996年，和《造血干细胞治疗》(Hematopoietic Stem Cell Therapy)E.D.Ball，J.Lister & P.Law，Churchill Livingstone，2000。根据本发明的方法，组合物可以和关于在癌症治疗中使用细胞的书 面使用指南一起包装。细胞可冷冻保存或以另一种可以保持所需的细胞功能直到使用时的稳定存储方式保存。 
以进一步说明的方式提供下面的例子，但并不意在对要求保护的发明或者其等同发明在实践中进行任何限制。 
具体实施方式
概要 
在以下详细描述的实例中，人间充质干细胞(MSC)取自胚胎骨髓，其是经伦理批准从妊娠终止外科手术的临床废弃物中收集得到。所述细胞在体外分离、鉴定和培养。培养的细胞表现出对塑料表面具有粘附性，表达MSC-特异表面标记以及多向分化潜能。 
然后所述MSC转染猿猴空泡形成病毒40(SV40)的大T抗原和小T抗原。与野生型相比较，带有所述基因的细胞具有更大的增殖速率。同时进行胸苷激酶(TK)的转移。所述质粒还包括增强型绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因。因此，可以通过显微观察确定所述TK基因的转移效率。进行额外的慢病毒感染循环，构建具有预期特性的细胞系。 
已发现转导的细胞系保留了重要的特性，包括集落形成能力、MSC特异表面表型以及多向分化。维持了SV40-TK-GFP人胚胎BMSC(骨髓源性MSC)的增殖速率。体外荧光素酶活性研究证明了SV40-TK-GFP人胚胎BMSC以及GSV添加的共培养可显著诱导两种人前列腺癌细胞系中的细胞毒性。 
后续的体内研究表明，与阴性对照相比较，全身注射所述BMSC(每只小鼠注射20万细胞)以及随后的腹腔内注射GCV(30 mg/kg)可减少在动物模型中肿瘤的质量以及肿瘤细胞的荧光素酶活性。 
实施例1.胚胎间充质干细胞的特性 
人胚胎组织的使用是获得CUHK-NTEC联合临床研究伦理委员会(伦理批准编号：CRE-2011.383)批准。胚胎上肢和下肢在具有10％PS的PBS中进行运输。从骨上除去外部的肌肉/薄膜/组织/血管。用DPBS彻底冲洗所述骨两次。加入完全敲除DMEM(Completed Knockout DMEM)(KO-DMEM)，将所述骨切成小块。骨块进一步切碎成细粒，将所有的物质(包括所述培养基)转移至50ml离心管。翻转所述管数次，以洗脱剩余细胞。通过70um细胞过滤网收集细胞悬浮液。通过在20℃、400g旋转5min使细胞沉淀，并在补充有10％FBS、10％青霉素和链霉素以及1％glutamax的KO-DMEM中培养。细胞接种到T175培养瓶时需要使用30ml培养基，接种到T75培养瓶时需要使用15ml培养基，接种到T25培养瓶时需要使用5ml培养基。 
用DPBS冲洗由胰蛋白酶消化收集的人胚胎骨髓源性MSC细胞两次，以便超低温保存。通过旋转(400g，5min，4℃)使细胞沉淀，在冷65％的无添加的KO-DMEM、30％FBS和5％DMSO中重悬浮，并转移到具有适当标签(包括实验者姓名、细胞批次的编号、细胞的名称、传代数、细胞数量以及实验日期)的1.8ml冷冻保存管中。以控制的速度冷冻所述细胞，其中以1℃/min的速度使温度从4℃下降至-80℃。然后将细胞转移至液氮罐中长期储存。 
图1显示了人胚胎BMSC的干细胞特性。图1(A)显示在低密度接种(50细胞/100mm平皿)并由结晶紫染色之后第14天的单集落形成能力。图1(B)显示，与人成年BMSC相比较，人胚 胎BMSC的多向分化潜能。对于成骨分化(OS)，接种所述细胞直到汇合，在诱导培养基存在下孵育14天，并用茜素红染色。对于成脂分化(AS)，接种所述细胞直到汇合，在诱导培养基存在下孵育14天，并用油红O染色。对于成软骨分化(CS)，在诱导培养基存在下孵育所述沉淀物培养物(5×105)21天，用番红O染色，用固绿复染色。 
根据以下对表面表型进行流式细胞计量术：制备1×106/mL细胞悬浮液，并用PBS冲洗两次。根据制造厂商的说明书，在针对CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD 105以及相应的同种型的结合荧光染料的初级抗体中孵育100ul的细胞悬浮液。将所述染色的细胞用于流式细胞检测分析。 
图2显示了通过流式细胞仪确定的hfBMSC的表面标记。 
实施例2.细胞的永生化以及用所述自杀基因进行转导 
根据下文进行慢病毒的制备以及基因的转导。将1×106人胚胎肾细胞(298FT细胞)接种到100mm平皿。在细胞生长至60％汇合时，加入转移载体质粒(pLenti CMV/TO SV40小+大T，或pLOX-GFP-IRES-TK)DNA(8μg)、辅助质粒plp-1DNA(5.28μg)、plp-1DNA(4μg)以及包膜质粒plp-VSVG DNA(2.8μg)。在1×HBS存在下通过磷酸钙进行转染。在所述转染后8h，更换培养基。在72h后，收集含有病毒的培养基，过滤通过0.45μm过滤器，并在-80℃储存直到应用。通过将所述过滤的含有病毒的培养基加入到MSC(在12孔板中2000细胞/孔)中进行基因转导，并在35℃在1000g离心1h以促进所述基因转导。 
图3(上图)显示了在诱导细胞复制的转导的BMSC中编码大和小T抗原的SV40质粒的示意结构。图3(下图)显示了在转导的BMSC中编码HSV1-TK和GFP的HSV1-TK和GFP共表达的质粒的示意结构。 
图4(上图)显示了在转导SV40慢病毒后人胚胎BMSC的单一集落。图4(中间的图)显示了如Western印迹确定的在SV40-转导的hfBMSC中SV40的表达。图4(下图)显示了在四批SV40-转导的hfBMSC中SV40的表达。 
图5(上图)显示了在转导HSV1-TK和GFP共表达的慢病毒之后SV-人胚胎BMSC的GFP-阳性集落。图5(中间的图)：挑选一些集落，扩大培养至足以进行Western印迹的数量。图5(下图)：被选择用于进一步扩大的具有较高HSV1-TK蛋白水平的SV40-TK-GFP-人胚胎BMSC批次的代表性图像。 
实施例3.转染的MSC的表征以及分选 
图6(A)显示了由流式免疫细胞计量术(flow immunocytometry)检测的hfBMSC的表面标记。图6(B)显示了SV40-TK-GFP-过表达hfBMSC的表面标记。在hfBMSC中，采用结合FITC的抗-CD34，因此采用针对该FITC-结合抗体的同型对照。而对于GFP-阳性转导的hfBMSC，采用结合PE的抗-CD34用于2-色检测。所述细胞是CD34-ve、CD44+ve、CD73+ve、CD90+ve，而CD105部分阳性。 
图7(A)显示了GFP阳性和CD90-PE标记的hfBMSC的分选工作流程。进行所述分选以富集具有预期特性的细胞。图7(B)显示了从分选的细胞群鉴定的单一集落(10×物镜)。 
为了观察到所述MSC保留有干细胞的功能特性，进行试验以确定是否它们可以分化成成熟细胞类型。 
多向分化 
成骨诱导：以10000细胞/孔接种到24孔板上，在完全α-MEM中培养直至汇合。细胞进一步在成骨培养基的存在下或在作为对照的完全培养基的存在下分别孵育17天和21天。在第17天或21天，用PBS冲洗细胞，并用新鲜配制的4％多聚甲醛固定所述细胞15分钟。通过用0.5％(w/v)茜素红(pH 4.1)染色60分钟，评价钙结节的形成。所述板被允许风干1-2天，并在光学显微镜下拍照。 
成脂诱导：以10000细胞/孔接种到24孔板上，在完全α-MEM中培养直至汇合。细胞进一步在成脂培养基的存在下或在作为对照的完全培养基的存在下分别孵育17天和21天。在第17天或21天，用PBS冲洗细胞，并用新鲜配制的4％多聚甲醛固定所述细胞15分钟。通过用0.3％(w/v)油红-O溶液染色2h，评价油滴的形成。所述板被允许风干1-2天，并在光学显微镜下拍照。 
成软骨诱导：用PBS冲洗细胞悬浮液两次。在15ml管中在450g离心10分钟制备1×106细胞沉淀物。所述沉淀物与成软骨培养基或作为对照的完全培养基分别孵育21天或28天(松散地盖上)。为了组织学研究，所述沉淀物在新鲜配制的4％多聚甲醛中固定1天，并用70％乙醇脱水，石蜡包埋。包埋的细胞沉淀物切片，切片的厚度为5μm，在脱蜡后用番红-O/固绿染色，并在显微镜下观察。 
图8显示了在相应的诱导培养基中诱导21天后SV40-TK-GFP人胚胎BMSC的成骨分化能力以及成脂分化能力(右栏)，并与其未转导的对应物相比较。 
采用溴脱氧鸟苷(BrdU)掺入实验确定所述细胞的增殖能力。将2000细胞接种在96-孔板上，并分别培养24h、48h和72h。在不同的时间点将100μl的在完全培养基中的1×BrdU添加到所述细胞中，并进一步培养24h。除去所述培养基，每孔加入200μl固定剂，在室温固定30分钟。完全除去所述固定剂，用200μl的在工作溶液中的抗-BrdU抗体孵育所述细胞90分钟。用PBS冲洗所述细胞3次。加入底物，在黑暗中孵育20分钟。加入25μl  1M H2SO4停止反应，用酶标仪在450nm处以及在参考波长690nm处测量所述BrdU的强度。 
图9显示了观察到的细胞增殖。结果为三个独立实验的平均值±SD。经过3天的实验，胚胎MSC系以及用GFP/TK载体转导的系大量增殖，而成年MSC系没有增殖。 
实施例4.通过转染MSC保留肿瘤归巢性 
进行体外细胞迁移实验，确定是否所述转染的细胞保留它们的天然的返回至肿瘤细胞的能力。 
将DU145或PC3癌细胞的2×105细胞(这些细胞已被基因改造并包含荧光素酶和增强型GFP)接种于具有600ul完全α-MEM的底部室，在37℃培养24h。于次日将正常MSC或SV40-eGFP/TK转导的MSC的50000细胞(以50000细胞/100ul培养基密度)接种于具有600ul完全α-MEM的跨孔嵌套(transwell insert)上，并在37℃培养1h。将所述完全α-MEM更换成包含DU145或PC3癌细胞的所述底部室的1％FBS和5％PSN α-MEM(600μl)。 
包含所述正常的或SV40-eGFP/TK转导的MSC的所述跨孔嵌套被转移到所述底部室，并在37℃培养16h。在对照组的底部室中 仅采用1％FBS和5％PSN α-MEM(600μl)，以测量hfBMSC的背景迁移(background migration)。用棉签小心移去保持粘附在所述跨孔嵌套的上表面的细胞。用新鲜配制的4％多聚甲醛固定已迁移至所述跨孔嵌套的底表面的细胞。在PBS中冲洗所述跨孔嵌套，用结晶紫溶液染色15分钟。在PBS中冲洗所述跨孔嵌套，并允许风干1-2天。切下所述跨孔嵌套的过滤器，固定在载玻片上。在每个过滤器上的5个随机视野中选择细胞，计算所有视野的细胞总数。 
图10显示了在人前列腺癌细胞的存在或不存在时hfBMSC的跨孔迁移能力研究的结果。 
图11显示了慢病毒转导对BMSC朝向肿瘤迁移的作用。 
实施例5.体外抗肿瘤作用 
可通过以下实验体系评价所述转导的MSC从TK基因表达胸苷激酶并且从而将所述前药更昔洛韦(GCV)转换成其杀伤相应物的能力： 
通过MTT实验检测GCV毒性：SV40-TK-GFP转导的MSC、Luc-GFP-DU145或Luc-GFP-PC3细胞以5000细胞/孔分别接种于96-孔板，并培养过夜。每三天，更换所述培养基，并将在完全α-MEM中的范围从0、0.1、1、10、50至100μg/ml的不同浓度的GCV添加到所述细胞中，培养3或6天。在第6天，将所述培养基更换为补充有0.5mg/ml MTT的完全α-MEM。孵育3h后，除去含有MTT的培养基，通过加入100μl DMSO溶解MTT沉淀物。由酶标仪在570nm以及参考波长630nm处测量吸收度。 
在GCV存在下MSC对癌细胞的抗癌作用：DU145或PC3的5000细胞与SV40-TK-GFP转导的MSC以1∶2、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1或50∶1的比例，或者癌细胞单独或者与SV40-TK-GFP转导的MSC条件化培养基在96孔板中共培养。过夜培养后，不同浓度(0，1，10和100μg/ml)的GCV加入到所述细胞培养物中，培养6天。每三天重新补充GCV。在第6天，由包含有培养基的MTT(0.5mg/ml)替代所述培养基，所述细胞再培养3h。除去所述培养基，由100μl DMSO溶解MTT沉淀物。由酶标仪在570nm以及参考波长630nm处测量吸收度。 
荧光素酶实验检测GCV毒性：SV40-TK-GFP转导MSC，Luc-GFP-DU 145或Luc-GFP-PC3细胞以5000细胞/孔分别接种于96-孔板，并培养过夜。每三天，更换所述培养基，并将在完全α-MEM中的范围从0、0.1、1、10、50至100μg/ml的不同浓度的GCV添加到所述细胞中，培养3或6天。在第6天，将所述培养基更换为补充有150μg/ml D-荧光素的完全α-MEM。孵育10分钟后，采用IVIS 200体系检测由荧光素酶活性表示的细胞活力。 
由荧光素酶实验检测在GCV存在下抗癌作用：DU145或PC3的5000细胞与转导的MSC以1∶5、1∶1、5∶1的比例，或者癌细胞单独或者与SV40-TK-GFP转导的MSC条件化培养基在96孔板中共培养。过夜培养后，不同浓度(0，10，50和100μg/ml)的GCV加入到所述细胞培养物中，培养6天。每三天重新补充GCV。在第6天，所述培养基更换为补充有150μg/ml D-荧光素的完全α-MEM。孵育10分钟后，采用IVIS 200体系检测由荧光素酶活性表示的细胞活力。 
图12(A)显示了在SV40-TK-GFP人胚胎BMSC的共培养中GCV对人前列腺癌细胞系(DU145)的体外细胞毒性。通过IVIS 200 检测细胞活力并由在所述癌细胞系中表达的荧光素酶活性表示。数据为三个独立实验的平均值±SD。通过单因素方差分析以及Tukey’s事后检验(Tukey’s Post hoc test)进行统计学分析。*p＜0.05；***p＜0.001。图12(B)显示了在SV40-TK-GFP人胚胎BMSC的共培养中GCV对人前列腺癌细胞系(PC3)的体外细胞毒性。通过IVIS200检测细胞活力并由在所述癌细胞系中表达的荧光素酶活性表示。数据为三个独立实验的平均值±SD。通过单因素方差分析以及Tukey’s事后检验进行统计学分析。***p＜0.001。 
实施例6.免疫原性特征 
采用混合的人外周血淋巴细胞培养物(MLR实验)确定转导的MLR细胞的免疫反应性。 
第1天：在96-孔板中，5000、10000和20000未分化的MSC(hfBMSC001或001SV40+GFP/TK，刺激因子)接种于每个孔中，培养24h。第2天：将成骨的、成脂的或成软骨的刺激培养基分别添加到所述细胞中，并且添加正常的培养基作为对照，培养7天。在诱导培养期间，所有的刺激因子细胞用2.5μg/ml丝裂霉素C处理。第8天：在分化处理的最后，用PBS冲洗细胞两次，然后将从健康捐赠者分离得到的1×105hPBLs(反应者)添加到每个孔中。不添加所述hPBL而单独培养MSC作为阴性对照，单独hPBL作为基线对照，以及用100ng/ml LPS处理hPBL 18h作为阳性对照。第13天：由溴脱氧鸟苷(BrdU)掺入实验(罗氏BrdU药剂盒)、根据制造商的使用手册评估hPBL的增殖速度。第14天：由酶标仪在450nm以及690nm处(参考波长)测量吸收度。 
图13显示了在所述转导的MSC上MLR实验的结果。从两名健康亚洲男性志愿者采集淋巴细胞作为PBMCJ和PBMCW。数据 为三个独立实验的平均值±SD。通过单因素方差分析以及Tukey’s事后检验进行统计学分析。*p＜0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。 
实施例7.体内抗肿瘤作用 
进行体内植入作为生物安全性试验。将1.5×106MSC或基因转导的MSC与40mg HA/TCP粉末混合2h以允许细胞粘附。然后将MSCs-HA/TCP粉末皮下植入到12周的雄性裸鼠的背侧。植入后8周，收获移植物，用10％中性缓冲的福尔马林固定，用缓冲的9％甲酸脱钙2-3周，石蜡包埋以进行组织学检查。检查肿瘤形成的标记和其它组织(例如骨和软骨)形成的标记。 
根据如下测定体内抗肿瘤作用：Luc-GFP-DU145或Luc-GFP-PC3的5×106细胞被沉淀，并皮下接种于裸鼠(22g)的背侧。通过荧光素酶实验确定所述细胞沉淀物的活力。4周后，肿瘤内注射SV40-TK-GFP转导的MSC的1×106细胞。恢复2天后，连续5天在所述背侧皮下注射60mg/kg GCV。再次重复步骤2和3。随着所述治疗肿瘤尺寸的变化通过卡尺测量，并计算成长度×宽度2/2，以及由荧光素酶实验检测。 
图14显示了在全身注射转导的BMSC的实验中和腹腔内注射GCV的实验中的体内抗肿瘤作用。个体是具有人前列腺癌细胞(DU145)的裸鼠。 
为了在美国可以通用，在本文中列举的每个和每一份出版物和专利文件通过引用的方式合并入本文中，犹如每一个所述出版物或文件具体地和单独地表明通过引用方式合并入本文中。 

Claims (15)

1.治疗个体所罹患的肿瘤的方法，其包括：
a)向该个体施予重组表达自杀基因的间充质干细胞群；
b)等待足够时间使得至少一些所述间充质干细胞从它们在步骤a)中的施予部位迁移至所述肿瘤所处的部位或所述肿瘤所处部位的附近；以及然后
c)给予所述个体有效量的前药，藉此，由位于所述肿瘤部位或者其附近的所述间充质干细胞表达的所述自杀基因引起所述前药转换成杀死肿瘤细胞的药物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述间充质干细胞群是多向性的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞已被永生化。
4.根据权利要求3所述的方法，其中通过转染SV40大T抗原使所述细胞永生化。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是胚胎间充质干细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述自杀基因是胸苷激酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述前药是更昔洛韦。
8.多向性间充质干细胞系，其重组表达自杀基因。
9.根据权利要求8所述的细胞系，其中所述细胞已被永生化。
10.根据权利要求9所述的细胞系，其中所述细胞已通过转染慢病毒永生化。
11.根据权利要求8所述的细胞系，其中所述细胞是胚胎间充质干细胞。
12.根据权利要求8所述的细胞系，其中所述自杀基因是胸苷激酶。
13.用于治疗癌症的药物组合物，其包括根据权利要求8所述的间充质干细胞系以及生理学上相容的缓冲液。
14.用于治疗个体所罹患的肿瘤的药剂盒，其包括：
a)根据权利要求8所述的药物组合物，以及
b)前药，其中所述组合物的所述间充质干细胞中表达的所述自杀基因引起所述前药转换成杀死肿瘤细胞的药物。
15.根据权利要求14所述的药剂盒，其中所述自杀基因是胸苷激酶，所述前药是更昔洛韦。
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