KR20030032928A - 변형된 백시니아 바이러스 안카라(ｍｖａ)의 변형 균주 - Google Patents

변형된 백시니아 바이러스 안카라(ｍｖａ)의 변형 균주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대부분의 포유류 특히 사람에 대한 독성이 크게 감소되면서도 백신 같은 치료제의 제조 용도로서 허용된 연속세포주의 세포내에서 성장하는 새로운 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA)의 균주를 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 상기 적응된 MVA 균주를 생산하는 방법도 제공한다. 적응된 MVA 는 예컨대, 비경구적 면역화를 위해 벡터계로 사용될 수 있거나 혹은, 면역계의 비특이성분들의 면역강화물질(adjuvant)이나 조절제로서 활성 혹은 비활성 형태로 사용될 수 있다.

Description

변형된 백시니아 바이러스 안카라(ＭＶＡ)의 변형 균주 {ALTERED STRAIN OF THE MODIFIED VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA)}
생명체는 계속해서 감염원들 즉, 박테리아, 바이러스, 진균류 혹은 기생충 등에 의해 감염위협을 받고 있다. 면역계는 감염원 및 이에 의해 생성된 기타 독성 분자들의 파괴 및 제거로서 생명체를 영구적 감염으로부터 보호한다. 면역계는 비록 양쪽이 가까이 교차결합되어 있으나 특이 및 비특이성 부분으로 나뉠 수 있다. 비특이성 면역반응은 광범위한 종류의 외래 물질 및 감염원에 대한 즉시방어를 가능하게 한다. 대조적으로, 특이성 면역반응은 유기체가 최초의 물질에 의한 침입을 받을 때 일정한 지체단계(lag phase)후에 일어난다. 그러나, 특이성 면역반응은 큰효율성이 있다. 특이성 면역반응은 특이감염으로부터 회복된 개인이 비록 다른 감염성 질환에 대해서는 그렇지 않으나, 상기 특이감염에 대한 보호를 받는 측면에서 응답성이 있다. 대체로, 동일 혹은 매우 유사한 감염원에 의한 2차감염은 훨씬 경미한 증세 혹은 거의 증세를 일으키지 않는다. 면역성은 장시간 지속되며 어떤 경우 일생동안 지속되기도 한다. 이 면역학적 기억은 특이면역성을 유발하기 위해 유기체가 무해 혹은 비활성화된 형태의 감염원으로 면역검사하는 백신접종에 이용된다. 가끔 면역강화물질을 백신에 첨가시켜 이러한 특이 면역 반응을 향상시킨다.
감염성 질환 및 면역성에 대한 지식의 대부분은 천연두의 연구에서 얻어진 것이다. 이 질환은 오르토폭스 바이러스종 중 하나인 바리올라 바이러스에 의해 발병한다. 2세기 전부터, 코폭스(copox)로 예방접종 하면 천연두에 대한 면역효과를 얻을 수 있었다. 후기의 면역방법은 백시니아 바이러스를 이용하여 수행되었다. 1950년대 초, 대부분의 기술공업국들은 백시니아 바이러스를 이용한 백신방법에 의해 풍토성 천연두를 제거하였다. 그러나, 백시니아 바이러스를 이용한 천연두 백신방법은 태로 심각한 합병증 예컨대, 후백신뇌염 등을 유발하거나 백시니아 혹은 접촉감염증을 확대시키는 결과를 가져왔다.
이러한 합병증을 나타내지 않는 새로운 백신을 안톤 메이어(Anton Mayr)가 개발하였다. 발진백신은 발진 바이러스 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA)로 구성되고 이는 백신화에 관련된 다른 합병증을 일으킴 없이 약 150 000 회의 백신치료에서 천연두에 대해 주사형 백신방법에 사용되었다. 면역학적 결핍의 어린이들에서도 심각한 부작용을 나타내지 않는다. MVA 는 닭 태아 섬유종 조직에서 575회의 배양을 거친후 본래의 백시니아 바이러스 안카라의 돌연변이 및 선별에 의해 수득되었다. MVA의 안전도는 생물학적, 화학적 및 물리적 특성에 의해 반영된다. MVA는 6개의 게놈결손을 갖는 감소된 분자량을 가지며, 포유류 세포에서 크게 어테뉴에이트되어 있다. 즉 DNA와 단백질이 합성되지만 실질적으로는 바이러스 입자가 생성되지 않는다. 안톤 메이어에 의해 개발된 변형된 백시니아 바이러스 안카라는 유럽 세포배양물 기탁협회 (ECACC)에 수탁번호 V 94012707 로 기탁되었다 (Salisbury, UK).
천연두 백신치료법은 매우 성공적이었다. 1979년에, 세계보건기구(WHO)는 천연두의 완전근절을 선언했다. 따라서, 어린이에 대한 대량 백신접종은 중단되었고 실험실의 연구자 및 일부 국가의 군 내부에서만 백신접종이 시행되고 있다.
천연두 근절과 함께, 인체의 발진 감염의 예상원인도 제거되었다. 그러나, 인간외 발진바이러스 중에는 숙주특이성이 감소된 것도 있으며 예컨대, 이들은 전형의 숙주에서 뿐만 아니라 다른 동물들 (예, 쥐 및 고양이 등)에서도 감염을 일으키기도 한다. 사람 역시 이들 경로를 통해 감염될 수 있다. 집단 중 일부는 천연두에 대해 더이상 면역성이 없어, 동물종의 오르토폭스 감염이 이들에게 치명적이 될 수도 있다. 가축류가 인체감염의 주 원인이다. 따라서, 가축에 대한 오르토폭스바이러스 백신접종에 대한 중요성이 증가하는 추세이다. 또한, MVA는 예컨대 핵산서열을 그들이 발현되는 타겟세포 속에 전달하기 위한 유전자치료에 대한 벡터로서 중요성을 가지기도 한다.
MVA의 로가리즈믹 재생산에서, 1차 혹은 2차 닭 태아 섬유아세포의 세포배양이 필요하다. 세포는 10일 내지 12일 동안 배양한 달걀로부터 수득된다. 달걀이 생물학적 다양성을 갖기 때문에, 세포배양 시스템용으로 얻은 세포도 세포 수준에서 다양하다. 또한, 닭의 태아 "섬유아세포 조직"에서 다른 세포타입 예컨대 상피세포가 발견되는 것우가 종종있다. 이러한 세포 다양성은 닭의 태아 섬유아세포 내에서 생성되는 바이러스의 변형을 가져온다. 따라서, 세포배양계를 표준화 및 유효화 하여 일정한 고품질 MVA 의 생산을 보장하기는 어렵다. 더욱더, 배양된 달걀 내에 이미 존재하는 미생물 혹은 바이러스에 의해 세포배양계가 오염되는 것을 완전히 배제할 수 없는 것이다. MVA가 바이러스-오염세포에서 성장할 때, MVA는 오염 바이러스와 재조합되기도 한다. 따라서, 새로운 및 예상할 수 없는 특징을 갖는 MVA가 발생하기도 한다. 대규모의 서스펜젼 배양에서 바이러스 제조에 있어서, 1차 혹은 2차 닭 태아 섬유아세포는 또한 크게 적합하지 않다. 덧붙여서, 초구배 원심분리법에 따른 MVA의 정제 및 농축처리가 바람직하다. 그러나, 이러한 정제처리는 MVA를 1차 혹은 2차 닭 태아 섬유아세포 상에서 배양될 경우 난점이 있다. 따라서, 증가되는 많은 수의 환자가 달걀 알부민에 대해 알러지를 일으킨다. 비록in vitro배양조건에서 알러지 발생 가능성을 크게 감소억제하고 있으나 알러지반응의 위험을 완벽히 제거할 수는 없다.
결론적으로, 한편으로는 MVA를 다수의 문제를 일으키는 1차 혹은 2차 닭 태아 섬유아세포에서 효과적으로 증식되어 질 수 있고, 그러나 다른 한편으로는 사람에서 MVA의 안전한 이용은 그것의 백신으로서 대량 이용에 의해서 보여져 왔다.
본 발명은 많은 포유류, 특히 인간에 대해 크게 감소된 발병독성을 갖는 한편, 연속세포주의 세포 내에서의 성장이 백신 같은 치료제의 생성에 유익한 것으로 확인된 새로운 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA)의 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 적응된 MVA 균주를 생성하는 방법에도 관계한다. MVA 는 예컨대, 비경구적 면역화를 위해 벡터계로서 사용될 수 있거나 혹은, 면역계의 비특이성분들의 면역강화물질(adjuvant)이나 조절제로서 활성 혹은 비활성 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 한가지 목적은 MVA의 균질한 바이러스입자를 생성하기 위한 조건을 제공하는 것이다. 또한, 상기 조건은 용이하고 대규모의 MVA 생산이 가능하다.
상기 목적 및 기타의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 연속 세포주의 세포 내에서의 성장할 수 있게 적응된 MVA 균주를 제공하고, 상기 균주는 치료제의 생산에 허용된 것이다.
본 발명에 따르면, 최초로 효율적이고, 대규모의 MVA 생산이 가능하다. 연속 세포주의 세포는 균질하며 이들의 특성이 안정하므로 세포주로부터 수득된 MVA 역시 예기되는 특성과 함께 균질성을 갖는다. 더욱더, 미생물에 의한 오염의 위험을 억제할 수 있고 달걀 단백질에 의한 MVA 제조시의 오염(닭 태아 섬유아세포 상의 MVA 배양시 발견되는)도 제거할 수 있다. 영구 세포주의 취급도 편리하며 따라서 산업적 응용 측면에서 크게 적합하다.
본 발명의 바람직한 구현에서, MVA는 백신 생산에 허용되는 포유류 세포주의 세포 내에서 성장하기에 적합하다. 놀랍게도 베로 세포주 같은 포유류 세포주에 적응되는 MVA는 사람 및 기타 광범위한 포유류에 대해 감소된 독성을 가진다. 따라서, MVA는 크게 어테뉴에이트되어 있다. 즉 DNA 및 단백질은 합성되나 실질적으로 바이러스 입자는 생성되지 않으므로 질병유발력은 사실상 소실되는 결과를 얻는다. 따라서, 본 발명에 따른 MVA는 사람 및 광범위한 포류류에 대한 백신으로 매우 적합하다. 그러므로, MVA는 특히 수의학 분야에서 응용할 수 있다.
본 발명은 MVA 균주 수득 방법을 제공한다. 본 발명의 구현에 따르면, 치료학적 물질의 생산을 위하여 허용되는 세포주의 세포가 야생형 MVA에 감염된다. 바람직하게, 고감염중복도(MOI) 즉, 세포당 고 바이러스 갯수가 이 감염에 이용된다. 이에, 바이러스가 수득되고 동일 세포주의 새로운 세포들이 새로 생성된 바이러스로 감염된다. MVA가 상기 세포주에 적응될 때까지 상기 방법을 반복한다 (순차배양). 감염후 72시간 때 적응(adaptation)에 도달하면, 바이러스 역가는 공급바이러스 역가에 비교할 때 적어도 1 내지 9배 바람직하게는 10 내지 99배 더욱 바람직하게는 100 내지 106배, 가장 바람직하게는 107내지 1010배로 증가한다. 적응은 제한횟수의 패시지(passage)후 도달한다.
"성장에 적응된" 이란 감염에 의해 생성된 바이러스의 양 (생성량)이 본래에 세포 감염에 이용된 바이러스의 양(공급량)에 비교하여 더 증가함을 의미한다. 이 경우 생성량/공급량의 비가 1보다 크다.
ECACC (Salsbury, UK)에 기탁된 MVA의 "유도체" (기탁번호 99101431 및/또는 프로비저널 액서션 번호01021411)란 기탁된 균주와 마찬가지의 기탁된 균주와 같은 성장속도로 베로 세포에서 성장할 수 있게 적응된 MVA를 의미하고, 그러나 상기 기탁된 균주와 비교하여 게놈에 있어서 적어도 하나의 차이점을 갖는 것을 말한다.
"면역계" 란 기본적으로 외래 물질 및 미생물에 대한 유기체의 방어시 수반되는 복합체를 말한다. 이것은 수개의 세포종류를 포함하는 예컨대, 임파구 및 기타 백혈구로부터 유발된 세포들을 포함한 세포부, 및 펩티드와 항체, 보조인자 및 사이토킨 같은 단백질을 포함하는 체액부로 구분된다.
"면역반응" 이란 기본적으로 외래 물질 혹은 미생물이 유기체 내에 들어갈때의 면역계의 반응을 말한다. 일반적으로, 면역반응은 특이성 및 비특이성 반응으로 구분되며 양쪽 모두 밀접하게 교차결합된다. 비특이성 면역반응은 광범위한 종류의 외래물질 및 감염원에 대한 즉시방어로 간주한다. 특이성 면역반응은, 지체단계 후 외래 물질에 대해 일어나고 상기 물질에 대한 고특이성을 갖는, 외래 물질에 대한 유기체의 고효율적 방어메카니즘 이라고 특징화 할 수 있다. 특이면역 반응은 특이감염으로부터 회복된 대상자가 추후의 특이감염에 대해 보호받는 현상에 상응한다.
"면역계의 활성체" 란 면역반응을 일으키거나 향상시킬 수 있는 물질을 말한다.
"면역계의 억제체" 란 면역반응을 감소시키거나 저해시킬 수 있는 물질을 말한다.
"면역계의 안정화제" 란 면역반응을 일정수준으로 지속시킬 수 있는 물질을 말한다.
본 발명자는 베로 세포주(ATCC No. CCL-81)라고 하는 아프리카 녹색 원숭이 세포주에 적응되는 2가지의 바람직한 MVA 균주를 제공한다. 베로 세포에서 100회 패시지된 MVA-균주를 "베로-MVA"라고 하고 이는 유럽 세포배양물 기탁협회 (Salisbury, UK)에 수탁번호 99101431 로 기탁되었다. 베로 세포주 내에서 200회 패시지한 후의 MVA 균주를 "베로-MVA-200" 라고 하고 이는 역시 ECACC 에 기탁접수번호 01021411 로 기탁되었다.
상술한 바와 같이 수득된 MVA는 허용된 세포주의 세포를 적절한 조건하에 배양하고 MVA로 이들 세포를 감염시키고 및 상기 세포에 의해 생성된 바이러스 입자들을 수득함으로써 증식된다. 따라서, MVA는 효율적으로 및 쉽게 대규모로 증식될 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 MVA는 HL, HEP-2 혹은 HeLA 를 포함하는 사람 세포주 같은 베로 세포이외의 세포내에서도 독성증가를 보이지 않는다.
본 발명의 또다른 구현에서, MVA는 적어도 하나의 헤테로성 핵산서열 즉, MVA 유전자 (재조합 MVA) 내에서 자연적으로 발견되지 않는 핵산 서열을 포함한다. 바람직하게, 헤테로성 핵산서열은 유전자, 더 바람직하게는 면역단백질을 코드화하는 유전자, 가장 바람직하게는 말라리아, 광견병 및/또는 간염에 대해 면역화하는 단백질을 코딩하는 유전자이다. 상기 헤테로성 핵산서열의 발현은 바람직하게는 백시니아 바이러스 프로모터, 더 바람직하게는 MVA-소유 프로모터의 전사 조절 조건하에 있다. 더 바람직한 본 발명의 구현예에서,헤테로성 핵산서열은 MVA 게놈 내의 자연스럽게 발생하는 탈락위치에 삽입된다 (PCT/EP96/02926 에 기술됨).
재조합 MVA는 타겟 세포 내에 핵산서열을 공급하기 위해 사용되며, 상기 핵산서열은 타겟 세포에 상동성이거나 헤테로성이다. 헤테로성 핵산서열을 타겟 세포에 삽입은 헤테로성 핵산, 펩타이드 및/또는 상기 헥산서열에 의해 in vitro 코딩된 폴리펩티드 및/또는 단백질을 생산하기 위해 사용된다. 이 방법은 숙주세포를 재조합 MVA로 감염, 감염된 숙주세포를 적절한 조건하에서 배양, 및 선택적으로 상기 숙주세포에 의해 생성된 펩티드 및/또는 단백질을 분리 및/또는 농축 등의 단계를 포함한다.
또한, 상동성 혹은 헤테로성 서열의 삽입은 in vitro 및 바람직하게는 invivo 유전자치료에 적용할 수 있다. In vitro 및 ex vivo 유전자 치료 각각에 있어서, 세포는 치료할 환자로부터 분리되어 재조합 MVA로 트랜스포메이션되고 다시 상기 환자세포에 재공급한다. In vivo 유전자 치료의 경우, 재조합 MVA를 사람을 포함 직접 살아있는 동물 몸체에 투여한다. 본 발명의 바람직한 구현에서, 재조합 MVA는 항원 혹은 항원 에피토프를 발현한다. 가장 바람직하게, 상기 벡터는 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum) , 마이코박테리아(Mycobacteria), 헤르페스 바이러스(Herpes virus), 독감(Influenza) 바이러스, 간염 혹은 사람 면역결핍 바이러스 등으로부터 항원결정군을 발현한다.
본 발명의 MVA는 -놀랍게도-여전히 크게 어테뉴에이트된 상태이므로, MVA는 사람을 포함한 광범위한 종류의 포유류를 면역화하는데 이상적이다. 따라서, 본 발명은 폭스(pox)감염 특히 오르토폭스(orthopox) 감염에 대한 사람을 포함 살아있는 동물의 몸체 면역용 MVA를 함유하는 백신을 제공한다. 백신은 MVA 이외에도 하나 이상의 첨가제 예컨대, 항생제, 보존제 혹은 안정화제를 더 포함할 수 있다. 백신은 특별히 동물을 오르토폭스 감염에 대해 면역화시키는 등의 수의학 분야에 응용되며, 예컨대, 고양이 폭스에 대해 고양이를, 기지증(ectromelia)에 대해 생쥐를 혹은 카멜폭스에 대해 낙타를 각각 면역화시킬 수 있다. 면역화는 바람직하게는 비경구적 방식으로 실행된다.
백신내 항원결정군의 면역화 효과는 종종 소위 면역강화물질(adjuvant)을 첨가에 의하여 강화된다. 면역강화물질은 백신의 항원결정군에 대해 더 강한 특이적 면역반응을 일으키는 비특이적 방식으로 면역계를 공동 자극시킨다. 본 발명의 또다른 구현예에 따르면, MVA는 면역강화물질로 사용되어 백신의 항원결정군에 대한 면역반응을 공동자극시킨다. 이 경우, MVA는 비활성화된 것이 바람직하다. MVA의 비활성화는 예컨대 열이나 화학약품 등에 의해 수행되기도 한다. 바람직하게, MVA는 β-프로피오락톤에 의해 비활성화된다. 본 발명의 이 구현예에서, 비활성화된 MVA는 수많은 감염성 질환에 대해 면역성을 증대시킬 목적으로 백신에 첨가되기도 한다.
감염시, 환자의 면역, 신경계, 호르몬 및 혈관계는 서로 밀접하게 작용한다. 이 상호반응은 비특이적 면역계의 요소들, 예컨대, 인터페론 및 인터루킨 같은 사이토킨에 의해 조정될 수 있다. 폭스 바이러스는 면역계의 조정에 영향을 미칠 수 있다 (스위스 VEet 11/99, 13-17). 그러므로, 본 발명의 또다른 구현예에서, MVA 및 바람직하게는 비활성화된 MVA는 비특이적(innate) 면역계의 세포 및 체액 요소를 조정하기 위해 사람을 포함한 포유류에 이용된다. 바람직하게, MVA는 생체조절자 역할을 하여 면역계의 기능장애를 없애고 몸의 자기방어기전을 활성화, 안정화 및/또는 억제시킨다. 가장 바람직하게는, MVA는 바이러스 감염 예컨대, 헤르페스, B 나 C 형 간염 바이러스 등에 의한 감염시, 만성 염증성(inflammatory) 질환 및/또는 종양치료를 돕기 위한 목적 등의 경우에 생체조절자로 사용된다. MVA는 또한 스트레스를 받거나 혹은 신생아와 같이 감염에 영향받기 쉬운 경우의 면역계를 안정화시키기 위해 이용된다. 활성 및/또는 비활성 MVA는 전신의 적용 예컨대, 근육내 주사로 공급하거나 및/또는 국소적 예컨대, 점막 및/또는 피부를 통해 공급될 수도 있다.
결론적으로, 본 발명은 대체로 야생형 MVA 와 동일한 응용분야에 사용되면서도, 닭 태아 섬유아세포 내에서 야생형 MVA의 증식에 의해 일어나는 문제들을 해결할 수 있는 MVA 균주를 제공하는 것이다.
본 발명은 특히 다음의 내용을 각각 혹은 이들의 조합으로서 포함한다;
변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA)는 치료물질의 제조를 위해 허용된 연속 세포주의 세포 내에서 성장하기 위해 적응된다.
상기 MVA는 포유류 세포주의 세포 내에서 성장하기 위해 적응된다.
상기 MVA에서 세포주는 백신 제조를 위해 허용된 것이다.
상기 MVA에서 상기 허용된 세포주는 베로 세포주이다.
상기 MVA에서 상기 허용된 세포주는 베로 세포주 ATCC No. CCL-81 이다.
상기 MVA는 유럽 세포배양물 기탁협회 (Salisbury, UK)에 수탁번호 99101431 로서 기탁된 것 및/또는 그의 유도체이다.
상기 MVA는 ECACC (Salisbury, UK)에 프로비저널 액서션 번호 01021411 로서 기탁된 것 및/또는 그의 유도체이다.
상기 MVA는 적어도 하나의 헤테로성 핵산 서열을 포함한다.
상기 MVA는 치료용 단백질 및/또는 말라리아, 간염 및/또는 광견병 감염에 대한 면역화를 위한 펩티드 같은 항원결정군을 코딩하는 헤테로성 핵산서열을 포함한다.
숙주 세포는 상기 MVA에 의해 감염된다.
조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물은 상기 MVA 및/또는 MVA의 DNA를 포함한다.
상술한 약제학적 조성물에서, 이 조성물은 백신이다.
상기 백신은 사람을 포함한 살아있는 동물의 몸을 면역시킨다.
상기 백신은 오르토폭스 감염에 대해 면역시킨다.
상기 백신은 고양이 폭스 감염에 대해 고양이를, 기지증 감염에 대해 생쥐를 및/또는 카멜폭스 감염에 대해 낙타를 각각 면역시킨다.
상기 약제학적 조성물에서, MVA는 비특이적 면역계의 활성제, 억제제 및/또는 안정화제이다.
상기 약제학적 조성물은 상기 MVA 및/또는 이 MVA의 DNA를 면역강화물질로서 포함한다.
상기 약제학적 조성물은 상기 재조합 MVA 및/또는 재조합 MVA의 DNA를 포함한다.
상기 약제학적 조성물은 유전자 치료의 용도로 사용된다.
상동성 및/또는 헤테로성 핵산 서열을 타겟 세포에 삽입하는 방법은 타겟 세포를 상기 MVA로 감염시키는 단계를 포함한다.
상술한 MVA 균주 수득방법은 (a) 허용된 세포주의 세포를 야생형 MVA, 바람직하게는 ECACC에 수탁번호 V 94012707 로서 기탁된 MVA로 감염시키는 단계, (b) 바이러스를 수득하는 단계, (c) 동일한 세포주의 새로운 세포를 새롭게 생성된 바이러스로 감염시키는 단계, 및 임의로서, (d) 바이러스가 상기 세포주의 세포 내에서 성장에 적응하게 될 때까지 (b)단계 및 (c)단계를 반복하는 단계를 포함한다.
상기 MVA의 바이러스 입자를 제조하는 방법은 허용된 세포주의 세포를 적절한 조건 하에서 배양하는 단계, 상기 세포주를 상기 MVA로 감염시키는 단계 및 상기 세포에 의해 생성된 바이러스 입자들을 수득하는 단계를 포함한다.
상기 방법에서, 상기 세포주는 ECACC에 수탁번호 99101431 로서 기탁된 MVA 및/또는 역시 ECACC에 프로비저널 액서션 번호 01021411 또는 그 균주 중의 하나의 유도체로서 기탁된 MVA에 의해 감염된다.
핵산서열, 펩티드 폴리펩티드 및/또는 단백질을 제조하는 방법은 상기 재조합 MVA로 숙주세포를 감염시키는 단계, 감염된 숙주세포를 적절한 조건하에 배양하는 단계, 및 선택적으로, 상기 숙주세포에 의해 생성된 핵산서열, 펩티드 및/또는 단백질을 분리 및/또는 농축하는 단계를 포함한다.
상기 MVA에 관련한 질병이나 질환을 치료 혹은 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위해 상기 MVA를 사용한다.
사람을 포함한 살아있는 동물의 몸을 면역시키기 위한 백신의 제조에 상기 MVA를 사용한다.
비특이적 면역계의 활성제, 억제제 및/또는 안정화제를 제조하기 위해 상기 MVA를 사용한다.
면역강화물질의 생산에 상기의 MVA를 사용한다.
백신으로서 상기 MVA를 사용한다.
면역강화물질로서 상기 MVA를 사용한다.
상기 MVA를 비특이적 면역계의 활성제, 억제제 및/또는 안정화제로서 사용한다.
사람을 포함한 살아있는 동물의 몸을 면역시키기 위한 방법은, 필요한 대상체에게 치료학적 유효량의 상기 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
타겟 세포에 상동성 및/또는 헤테로성 핵산 서열을 삽입하는 방법은 타겟 세포를 상기 MVA 및/또는 MVA의 DNA로 감염시키는 것을 포함한다.
사람을 포함한 살아있는 동물의 몸의 면역계를 활성화, 억제 및/또는 안정화하는 방법은 상기 약제학적 조성물을 사람을 포함한 살아있는 동물의 몸에 투여하는 것을 포함한다.
백신 내의 항원결정군에 대한 특이적 면역반응을 강화하는 방법은 상기 MVA를 면역강화물질로서 사람을 포함한 살아있는 동물의 몸에 투여하는 것을 포함한다. 연속세포주의 세포 내에서의 성장에 적응되는 변형된 백시니아 바이러스 안카라는 다음의 단계들을 포함하는 방법에 따라 수득될 수 있으며; 즉, 치료물질의 제조를 위해 허용된 세포주의 세포를 감염시키는 단계, 상기 세포주에 의해 생성된 바이러스 입자를 수득하는 단계, 및 선택적으로, 상기 MVA의 원하는 성장특성이 상기 세포 내에서 수득될 때까지 상기 단계들을 반복하는 단계를 포함한다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명을 더 상세히 설명하기 위한 것이다. 당업자라면 여기서의 실시예가 단지 예시를 위한 것이며 본 발명에 따른 기술의 응용이 이들 실시예에 국한되지 않는다는 사실을 이해할 수 있다.
실시예 1: 베로 세포에 대한 MVA의 적응 및 상기 MVA 균주의 특성화
1. 베로 세포에 대한 MVA의 적응
안톤 메이어가 개발한 변형된 백시니아 바이러스 안카라인 야생형 MVA는 ECACC에 수탁번호 V 94012707 로서 기탁되었다. 야생형 MVA 는 베로 세포 내에서 순차적 바이러스 패시지로 (표 1 참조) 상기 베로 세포 내에서 성장하도록 적응되었다. 스테이셔너리 베로 세포주 (WHO 시드 스톡 ECACC 수탁번호 88020401) 의 세포 클론 ATCC-No. CCL-81 를 패시지 번호 148 내지 165 까지 사용했다. (WHO 시드 로트, 마스터 및 워킹 뱅크). 세포를 얼리(Earle) MEM(ICN), pH7.4-7.6 및 5% 혈청 치환 BMS (바이로크롬사)로 구성된 배지에서 증식시켰다. 당업자에게 공지된 기술에 따라, 상기 워킹뱅크의 세포는 항상 세포를 1:2 내지 1:4 로 나누어서 시드했다. 배지는 약 250 000 개의 세포/ml 를 함유했다. 세포를 각각 관(2ml), 록스(Roux) 디쉬(100ml) 및 플라스틱 디쉬(각각 6 및 40ml)에서 증식시켰다. 대체로, 16 내지 24시간 후에 세포들이 컨푸루언트(confluent) 모노레이어를 형성했다. 이어서, 배지를 별도의 첨가물 없이 플레인 얼리 MEM 으로 교체했다.
야생형 MVA의 적응에 있어서, 관배양계를 사용했다. 접종결과를 표 1 및 2 에 요약한다. 베로 세포는 예컨대, 평균 10개의 바이러스입자/베로세포인 10 MOI (중복감염수)의 야생형 MVA에 의해 감염되었다. 시작할 때의 야생형 MVA는 닭 태아 섬유아세포 내에서의 575회의 접종 후에도, 유전적으로 균질한 플라그-정제된 MVA (역가:107.75KID50/ml) 이었다. 24시간 후, 상기 모노레이어의 90%의 베로세포가 독성과정에 의하여 파괴되었다 (50% 독성, 40% 용혈). 세포의 동결 및 해빙 후, 생성된 바이러스가 함유된 배지와 세포 데드리투스(dedritus)를 수득했고 이 혼합물 중 0.2ml를 배양관 내의 베로세포 단일층 상에 시드했다(2차 패시지). 이 과정을 200회 반복했다. 3차 패시지 후, 독성효과는 더 이상 관찰되지 않았으며 반면에, 4 내지 6일 후감염 기간 내 (p.inf.)의 세포 라운딩 및 용혈을 특징으로 하는 가벼운 세포병리효과(CPE)가 나타났다. 바이러스 역가는 101,0KID50/ml 이었다. 비록 아주 비효율적이지만 베로세포 내의 MVA의 증식이 시작되었다는 것으로 결론을 내렸다. 5차 패시지 후, 4 내지 5일 p.inf. 뒤 완료된 전형적인 CPE가 관측되었다. 바이러스 역가는 3차 패시지 후의 101.0KID50/ml 로부터 5차 패시지 후의 104.0KID50/ml 로 증가하였다. 따라서, 바이러스는 베로 세포 내에서 더욱 효율적으로 증식되었다. 패시지 번호 5번 내지 11번의 패시지에서, 더욱 빨리 완료된 CPE를 관측하였고 바이러스 역가는 매 패시지마다 증가하였다. 패시지번호 11번의 접종시, 한개의 접시당 107.5KID50/ml 에 도달하였다. 따라서, 11회 패시지 후 베로 세포에 대한 MVA의 적응이 달성되었다. 다음 30회의 추가 패시지에서, 모든 패시지처리의 결과가 동일하였고 높은 재현성을 나타내었다; CPE는 이미 24시간 p.inf을 개시했고 모든 세포는 3일 p.inf 후에 영향을 받았다. 그 때, 20%의 베로 세포가 라운드되고 80%는 용혈되었다. 3일 p.inf. 후에, 바이러스 역가는 항상 107.75KID50/ml 정도였다. 15차 패시지 후, 바이러스는 항상 2일 내지 3일 p.inf. 뒤에 수득되었고, 10 MOI 이 아닌 1 MOI 만 세포 감염에 사용되었다 (표 2). 후속의 추가 패시지에서, MVA의 성장특성이 약간 달라졌을 뿐이다. 최적의 바이러스 역가로 증가했고 200 패시지에서 1010KID50/ml 에 도달했다.
결과적으로, 바이러스는 베로 세포 내에서 엑스포넨셜 형태로 재현적으로 성장한다. 놀랍게도, 상기 성장특성은 야생형 MVA의 특성과 다르다. 따라서, 새로운 MVA 균주는 순차적 패시지에 의해 수득되었다. 상기 새로운 균주를 "베로-MVA" 라고 하며 베로세포 내의 패시지 200 후를 "베로-MVA-200" 이라고 하였다.
베로-MVA 및 베로-MVA-200을 모두 대량으로 배양했다. 보관용으로 베로-MVA는 원심분리로 농축하고 2.5% 폴리겔린에 재현탁 및 2ml의 유리병에 넣어 동결건조하였다. 동결건조 후의 역가는 여전히 적어도 108.5KID50/ml 을 유지했다. 동결건조된 베로-MVA 및 베로-MVA-200 을 오염 및 독성 검사하고 +4℃ 에서 보관했다.
2. 베로-MVA의 생물학적 특성의 특성화
베로-MVA (패시지 100) 및 베로-MVA-200 (패시지 200)의 생물학적 특성을 야생형 MVA의 특성과 비교했다 (표 3 및 표 5). 이에, 당업자에게 공지된 기술을 응용하였다. 본 발명자는 바이러스의 숙주 범위는 베로 세포를 제외하고 변화가 없었으며 사람 혹은 동물에 대한 독성도 증가하지 않았음을 입증했다. 비허용(non-permissive) 숙주세포 내의 어보티브(abortive) 증식은 여전히 베로-MVA을 특성화한다.
백시니아 바이러스의 얼스트리(Elstree) 균주의 바이러스 입자와 비교되는 베로-MVA의 바이러스 입자의 주된 아이덴티티는 얼스트리(Elstree) 균주에 대한 항체의 교차반응성을 통해 보여 주었다. 얼스트리 균주는 천연두 백신접종을 위해 WHO에서 권장한 백시니아 균주이다. 얼스트리 균주에 대한 토끼의 폴리클로날 과면역(hyperimmune) 혈청을 베로-MVA에 첨가했다. 100KID50/ml 의 베로 MVA는 1:512 희석농도의 혈청에서 완전중화되었다. 동일량의 백시니아 균주(1:256)를 중화하기 위해서는 2배의 희석 혈청이 필요하였다. 따라서, 백시니아 면역혈청은 베로-MVA를 여전히 효과적으로 중화시킬 수 있다.
베로-MVA, 베로-MVA-200 및 야생형 MVA를 표 3, 4 및 5에서 나타낸 다수의 추가시험으로 통해 비교했다. 본 발명자는 사람을 포함한 포유류에 대한 베로-MVA 및 베로-MVA-200의 독성이 야생형 MVA와 비교하여 증가하지 않았음을 입증했다. 또한, 베로-MVA 및 베로-MVA-200는 사람을 포함한 포유류에서 접촉전염성이나 독성이 없다는 점도 증명했다. 놀랍게도, 베로-MVA의 세포특이성은 베로세포를 제외한 야생형 MVA의 특이성과 다소 유사했다. 베로-MVA는 야생형 MVA와 마찬가지로 사람 세포주의 세포 내에서 사실상 비효율적으로 증식한다(표 4 참조: HL-, HEP-2-, HeLa-세포). 따라서, 사람세포 및 아프리카 녹색 원숭이의 세포가 계통학적으로 밀접한 관계가 있다해도, 베로-MVA는 사람세포 내에서는 증식력을 얻지 못하였다. 다른 시험들에서도 큰 차이점은 발견되지 않았다.
또한, 야생형 MVA 및 베로-MVA-200의 물리적, 화학적 및 생물학적 성질을 비교했다(표 5). 닭 태아 섬유아세포 배양에서 성장하는 야생형 MVA는 좌측 인버티드 말단부위에 3개의 유전자 결손이 있는 반면 베로-MVA-200은 본래에 안카라에서 분리된 폭스 바이러스의 게놈과 비교할 때, 좌측 말단부위에 4개의 유전자결손이 있었다. 따라서, 베로 세포 내의 야생형 MVA의 패시지는 추가 유전자결손을 가져왔다.
표 1: 베로 세포에 대한 MVA의 적응
패시지 넘버 세포 배양 최고 바이러스 역가(log10/ml) 결과 결론
1 24시간 후 독성효과 2,0 나머지 바이러스가 시드됨. 블라인드 패시지구역(zone) 및 사이토킨 생성 현상
3 독성없음, 4-6일후 중간 CPE 1,0 나머지 바이러스가 시드됨?바이러스 재생산 시작
5 전형적인 CPE, 4-5일후 완료 4,0 바이러스 재생산 증가
11 3일후 CPE 완료 7,5 로그방식의 바이러스 재생산 적응 성공
12-42* 24시간 후 CPE 시작, 3일후 완료 7,75 재생가능한 바이러스의 재생산 베로-MVA
43-100* 24시간 후 CPE 시작, 3일후 완료 8,0 재생가능한 바이러스의 재생산 베로-MVA
100-200* 24시간 후 CPE 시작, 3일후 완료 10,0 재생가능한 바이러스의 재생산 베로-MVA-200 원인
* 11 패시지 후 10 MOI 대신 1 MOI만 시드됨.
표 2: 베로 세포에 대한 MVA의 적응 기간동안 바이러스 역가의 변화
패시지 넘버 [일 p.inf]후 수득 역가/ml(log10/ml)
1 1 < 2,0
2 3 2,0
3 5 1,0
5 5 4,0
8 4 6,5
11 3 7,5
18 2 8,0
19 2 7,75
20 3 8,0
25 2 7,75
29 2 7,75
30 3 7,75
31 3 8,0
45 2 7,75
51 3 7,75
60 2 8,0
66 2 7,75
68 2 8,0
75 3 8,0
100 2 8,0
200 2 10,0
표 3: 야생형 MVA 및 베로-MVA의 생물학적 특성의 비교
표시자 야생형 MVA 베로-MVA(100 패시지) 베로-MVA-200
모노레이어 세포 배양의 CPE (1MOI 시드된) 5일후 세포의 라운딩 및 용혈 (90% CPE) 5일후 세포의 라운딩 및 용혈 (100% CPE) 3일 내지 5일후 세포의 라운딩 및 용혈 (100% CPE)
최적 수득의 역가 108,0KID50/ml 107,75KID50/ml 1010,0KID50/ml
비허가된 세포계 내에서의 어버티브 바이러스 재생산 예스 예스 예스
사람 및 동물의 감소된 독성 예스 예스 예스: 전혀 독성없음
접촉전염성 없음 없음 없음
난막 요막 상의 1차 플라그의 성질 괴사없이 증식노드(node) 없음 괴사없이 증식노드 없음 괴사없이 증식노드 없음
혈구응집반응 (닭 적혈구) 음성 음성 음성
베타-프로피올락톤에 의한 비활성화 0.05%의 1차 카이네틱 0.05%의 1차 카이네틱 0.04-0.05%의 1차 카이네틱
VSV-새끼생쥐 챌런지시험시의 방어효과 있음 있음 있음
사람 및 동물에 대한 독성 없음 없음 없음
사이토킨 자극 인터페론α, IL-2, 및 12, CSA 인터페론α, IL-2, 및 12, CSA 인터페론α및γ, IL-1, 2, 및 12, CSA
식균세포, 자연 킬러세포, 및 T-임파구의 활성화 있음 있음 있음, 증가됨
표 4: 여러 세포배양계에서의 베로-MVA 및 야생 MVA의 KID50/ml 재생산율 [log10/ml]
세포 배양계 베로-MVA (31 베로-패시지) 야생형 MVA (1차 닭 태아 섬유아세포에서의 575. 패시지)
1) 베로 (아프리카 녹색 원숭이의 신장세포) 8,0 4,5
1차 닭 태아 섬유아세포 4,5 8,5
1,2) HL (사람 폐) 3,0 2,5
1,2) HEP-2 (사람 피부암) 3,0 2,5
1,2) HeLA (사람 자궁경부암) 2,75 2,75
1,2) BHK (햄스터 신장세포) 5,75 5,25
1,2) MDBK(소 신장세포) 3,5 3,5
1,2) PK-15 (돼지 신장세포) 3,25 3,5
1) 조직 및 종으로부터 유래된 연속 세포주는 괄호안에 표시함
2) 의학 미생물학 연구소 (독일 뮌헨)의 컬렉션에서 구한 세포주.
표 5: 야생형 MVA (닭 태아 섬유아세포(CEF)내에서의 572.패시지) 및 베로-MVA-200 (베로세포 내에서의 200. 패시지)의 비교
마커 야생형 MVA 베로-MVA-200
유전형 마커(안카라에서 분리된 폭스 바이러스 균주와의 비교) 좌측 말단부위 (인버티드 말단 리피트)에 3개의 유전자결손 좌측 말단부위에 4개의 유전자결손
게놈크기는 208 에서 178kb 로 감소됨 게놈크기가 172kb 로 추가 감소됨
최초 게놈의 분자량이 15% 감소됨 최초 게놈의 분자량이 20% 감소됨
인터페론 수용체의 상실 수용체의 추가 상실, 예, IL-1β
세포 마커 T-헬퍼 세포의 활성화 (CD4, CD8, CD25) 세포독성 T-임파구의 활성화 증가
NK 세포의 활성화 NK 세포의 활성화 증가
포유류 세포의 재생산 실패 (BHK 세포 제외) 세포배양계 내 숙주스펙트럼의 협소화
사이토카인 인터페론α, IL-1, IL-12 인터페론α및γ, IL-1,2,12
바이러스 역가 CEF: 109,5KID50/ml베로 세포: 104,0KID50/ml CEF: 104,5KID50/ml베로 세포: 109,5KID50/ml
면역계 특이 면역계의 활성화 감소 비특이 면역계의 활성도 향상
사람 및 동물에 대한 독성 낮음 없음
베로-MVA는 오르토폭스 감염에 대해 가축류를 면역시키는데 사용했다. 동물혈청을 수거하여 중화시험을 행했다. 본 발명자는 동물이 고역가의 항체를 생성함을 발견했다. 항체 역가는 적어도 111일 기간동안 안정했다. 또한 항체는 플라그-리덕션 시험에서 MVA의 바이러스 입자을 in vitro 중화시킬 수 있었다. 결론적으로, 베로-MVA는 가축류 및 사람의 오르토폭스 감염에 대한 백신으로서 사용할 수있다.

Claims (36)

  1. 치료물질의 제조를 위해 허용된 연속 세포주의 세포 내에서 성장하기 위해 적응되는 것을 특징으로 하는 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA).
  2. 제1항에 있어서,
    포유류 세포주의 세포 내에서 성장하도록 적응되는 것을 특징으로 하는 MVA.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 세포주는 백신 제조용으로 허용되는 것임을 특징으로 하는 MVA.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 항에 있어서,
    상기 허용된 세포주는 베로 세포주임을 특징으로 하는 MVA.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 허용된 세포주는 베로 세포주 ATCC No. CCL-81인 것을 특징으로 하는 MVA.
  6. 제5항에 있어서,
    유럽 세포배양물 기탁협회(ECACC) (Salisbury, UK)에 수탁번호 99101431 로기탁된 것 및/또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 MVA.
  7. 제5항에 있어서,
    유럽 세포배양물 기탁협회(ECACC) (Salisbury, UK)에 프로비저널 액서션 번호 01021411 로 기탁된 것 및/또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 MVA.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 항 에 있어서,
    적어도 하나의 헤테로성 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 MVA.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 헤테로성 핵산서열은 치료 단백질 및/또는 항원결정군을 코딩하는 헤테로성 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 MVA.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 MVA 바이러스에 의해 감염된 숙주세포.
  11. 제1항 내지 제9항에 따른 MVA 및/또는 이 MVA의 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물이 백신인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    사람을 포함한 살아있는 동물의 몸을 면역시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    오르토폭스 감염에 대하여 면역시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 항에 있어서,
    고양이 폭스 감염에 대해 고양이를, 기지증 감염에 대해 생쥐를 및/또는 카멜폭스 감염에 대해 낙타를 각각 면역시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제11항에 있어서,
    MVA는 비특이적 면역계의 활성제, 억제제 및/또는 안정화제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제1항 내지 제9항에 따른 MVA 및/또는 이 MVA의 DNA를 면역강화물질(adjuvant)로서 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물.
  18. 제8항 또는 제9항에 따른 재조합 MVA 및/또는 이 재조합 MVA의 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기의 조성물은 유전자 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 타겟 세포를 제8항 또는 제9항에 따른 MVA로 감염시키는 단계를 포함하는, 상동성 및/또는 헤테로성 핵산 서열을 타겟 세포에 공급하는 방법.
  21. 제1항 내지 제7항 중 어느 항에 따른 MVA 균주를 수득하기 위한 방법으로서,
    (a) 허용된 세포주의 세포를 야생형 MVA, 바람직하게는 ECACC에 수탁번호 V 94012707 로서 기탁된 MVA로 감염시키는 단계,
    (b) 바이러스를 수득하는 단계,
    (c) 동일한 세포주의 새로운 세포를 새롭게 생성된 바이러스로 감염시키는 단계, 및 선택적으로,
    (d) 바이러스가 상기 세포주의 세포 내에서 성장에 적응될 때까지 (b)단계 및 (c)단계를 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항 내지 제9항 중 어느 항에 따른 MVA의 바이러스 입자들을 수득하는 방법으로서,
    (a) 허용된 세포주의 세포를 적절한 조건 하에서 배양하는 단계,
    (b) 상기 세포주를 상기 MVA로 감염시키는 단계 및
    (c) 상기 세포에 의해 생성된 바이러스 입자들을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 세포주는 제6항 또는 제7항에 따른 MVA에 의해 감염되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 핵산서열, 펩티드 폴리펩티드 및/또는 단백질을 제조하는 방법으로서,
    (a) 제8항 또는 제9항에 따른 재조합 MVA로 숙주세포를 감염시키는 단계,
    (b) 감염된 숙주세포를 적절한 조건하에 배양하는 단계, 및 선택적으로,
    (c) 상기 숙주세포에 의해 생성된 핵산서열, 펩티드 및/또는 단백질을 분리 및/또는 농축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  25. 상기 MVA에 반응하는 질병 혹은 질환의 치료나 예방을 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위하여 제1항 내지 제9항 중 어느 항에 따른 MVA를 사용하는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    사람을 포함한 살아있는 동물의 몸을 면역시키기 위한 용도의 백신을 제조하기 위하여 MVA를 사용하는 방법.
  27. 제25항에 있어서,
    비특이적 면역계의 활성제, 억제제 및/또는 안정화제를 제조하기 위하여 MVA를 사용하는 방법.
  28. 제25항에 있어서,
    면역강화물질을 제조하기 위하여 MVA를 사용하는 방법.
  29. 제1항 내지 제9항에 따른 MVA를 백신으로서 사용하는 방법.
  30. 제1항 내지 제9항에 따른 MVA를 면역강화물질로서 사용하는 방법.
  31. 제1항 내지 제9항에 따른 MVA를 면역계의 활성제, 억제제 및/또는 안정화제로서 사용하는 방법.
  32. 사람을 포함한 살아있는 동물의 몸을 면역시키는 방법으로서, 필요한 대상에게 치료학적 유효량의 제11항 내지 제15항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역화 방법.
  33. 상동성 및/또는 헤테로성 핵산서열을 타겟 세포에 공급하는 방법으로서, 타겟 세포를 제8항 또는 제9항에 따른 MVA 및/또는 MVA의 DNA로 감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 공급방법.
  34. 사람을 포함한 살아있는 동물의 몸의 비특이적 면역계의 활성화, 억제 및/또는 안정화 방법으로서, 제16항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 백신 내의 항원결정군에 대한 특이적 면역반응을 강화하는 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 항에 따른 MVA를 면역강화물질로서 사람을 포함한 살아있는 동물의 몸에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 강화방법.
  36. 다음의 단계들을 포함하는 방법에 따라 수득될 수 있고 또한 연속세포주의 세포 내에서의 성장에 적응되는 변형된 백시니아 바이러스 안카라(MVA)로서,
    (a) 치료물질의 제조를 위해 허용되는 세포주의 세포를 감염시키는 단계,
    (b) 상기 세포주에 의해 생성된 바이러스 임자를 수득하는 단계, 및 선택적으로,
    (c) MVA의 원하는 성장특성이 상기 세포 내에서 수득될 때까지 상기 단계들을 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 MVA.
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