PL205922B1 - Zmodyfikowany wirus Ankara (MVA), zakażona nim komórka gospodarza, jego zastosowania, kompozycja farmaceutyczna i sposoby otrzymywania wirusa oraz sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu i/lub polipeptydu - Google Patents

Zmodyfikowany wirus Ankara (MVA), zakażona nim komórka gospodarza, jego zastosowania, kompozycja farmaceutyczna i sposoby otrzymywania wirusa oraz sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu i/lub polipeptydu

Info

Publication number
PL205922B1
PL205922B1 PL357378A PL35737801A PL205922B1 PL 205922 B1 PL205922 B1 PL 205922B1 PL 357378 A PL357378 A PL 357378A PL 35737801 A PL35737801 A PL 35737801A PL 205922 B1 PL205922 B1 PL 205922B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
mva
cells
cell line
virus
vero
Prior art date
Application number
PL357378A
Other languages
English (en)
Other versions
PL357378A1 (pl
Inventor
Anton Mayr
Original Assignee
Bavarian Nordic As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bavarian Nordic As filed Critical Bavarian Nordic As
Publication of PL357378A1 publication Critical patent/PL357378A1/pl
Publication of PL205922B1 publication Critical patent/PL205922B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C12N7/08—Inactivation or attenuation by serial passage of virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24161—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiot wynalazku dotyczy nowych szczepów zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA), które mają silnie zmniejszoną wirulencję dla większości ssaków, szczególnie ludzi, ale które jednak rosną w ciągłej linii komórkowej dopuszczonej do produkcji czynnika terapeutycznego takiego jak szczepionka. Wynalazek dotyczy także sposobu produkcji takich przystosowanych szczepów MVA. MVA mogą być stosowane, na przykład, dla immunizacji pozajelitowej, jako system wektora lub w formie aktywnej lub nieaktywnej, jako adiuwant lub jako regulator niespecyficznych składników układu odpornościowego.
Stan techniki
Organizm jest ciągle prowokowany przez czynniki zakaźne jak bakterie, wirusy, grzyby lub pasożyty. Układ odpornościowy chroni organizm przed trwałym zakażeniem powodowanym przez te organizmy przez niszczenie i eliminację tych czynników zakaźnych i dowolnych toksycznych cząsteczek przez nieprodukowanych. Układ odpornościowy może być podzielony na część specyficzną i niespecyficzną, chociaż obie części są blisko powiązane ze sobą. Niespecyficzna odpowiedź odpornościowa pozwala na natychmiastową obronę przed wieloma różnymi obcymi substancjami i czynnikami zakaźnymi. W przeciwieństwie, specyficzna odpowiedź odpornościowa powstaje po okresie opóźnienia, gdy organizm prowokowany jest przez substancję po raz pierwszy. Jednak specyficzna odpowiedź odpornościowa jest wysoce skuteczna. Specyficzna odpowiedź odpornościowa jest odpowiedzialna za fakt, że osobnik, który zdrowieje po specyficznym zakażeniu chroniony jest przez tym specyficznym zakażeniem, ale nadal podatny jest na inne choroby zakaźne. Ogólnie mówiąc, drugie zakażenie tym samym lub bardzo podobnym czynnikiem zakaźnym powoduje znacznie łagodniejsze objawy lub wcale ich nie powoduje. Odporność pozostaje przez bardzo długi okres czasu, w niektórych przypadkach nawet przez całe życie. Ta pamięć immunologiczna stosowana jest do szczepienia, gdy organizm prowokowany jest peptydu i/lub polipeptydu nieszkodliwą lub inaktywowaną formą czynnika zakaźnego, aby indukować specyficzną odporność. Czasem adiuwanty są włączane do szczepionek, aby wzmagać specyficzną odpowiedź odpornościową.
Wiele danych o chorobach zakaźnych i odporności uzyskano z badań nad ospą. Choroba powodowana jest przez wirus ospy, członka rodzaju wirusów Orthopox. Nieomal dwa wieki temu rozpoczęto profilaktyczne zastrzyki wirusem krowianki, co dało immunizację przeciwko ospie. Później immunizację przeprowadzano z wirusem krowianki. We wczesnych latach 1950-tych wiele z krajów uprzemysłowionych wyeliminowało endemiczną ospę przez stosowanie szczepienia wirusem krowianki. Jednak szczepienia ospy tym wirusem krowianki czasem powodowały poważne komplikacje, takie jak poszczepionkowe zapalenie mózgu, uogólnione zakażenie krowianką lub zakażenia kontaktowe.
Nową szczepionkę, która nie wykazuje tych komplikacji opracował Anton Mayr. Szczepionka ospy składa się z wirusa ospy, zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA) i była stosowana do pozajelitowego szczepienia przeciwko ospie w około 150000 szczepieniach bez powodowania jakichkolwiek komplikacji związanych ze szczepieniem. Nawet dzieci z niedoborami odporności nie wykazywały poważnych efektów ubocznych. MVA uzyskano przez mutację i selekcję oryginalnego wirusa krowianki Ankara po 575 pasażach w hodowlach fibroblastów zarodków kurczęcia. Odbiciem bezpieczeństwa wirusa Ankara są jego cechy biologiczne, chemiczne i fizyczne. MVA ma zmniejszoną masę cząsteczkową, sześć delecji w genomie i jest wysoce atenuowany dla komórek ssaków, to znaczy DNA i białko są syntetyzowane, ale zasadniczo nie są tworzone żadne cząsteczki wirusa. Zmodyfikowany wirus Ankara opracowany przez Antona Mayra zdeponowano w European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, UK, jako depozyt nr V 94012707.
Szczepienie przeciwko ospie było wysoce skuteczne. W 1979 roku Światowa Organizacja Zdrowia oznajmiła, że ospa została usunięta. Tak, więc zaniechano masowych szczepień dzieci i szczepi się tylko pracowników laboratoriów i cz łonków sił zbrojnych w niektórych krajach.
Wraz z usunięciem ospy, usunięta została główna przyczyna zakażeń ospą u ludzi. Jednak niektóre nie-ludzkie wirusy ospy mają obniżoną specyficzność w stosunku do gospodarza, to znaczy powodują zakażenia nie tylko u swoich typowych gospodarzy (na przykład, ospa krowia dla krowy), ale także u innych zwierząt (na przykład, szczury i koty). Ludzie mogą być także zakażeni tą drogą. Ponieważ część populacji nie jest już odporna na ospę, zakażenia orthopox gatunków zwierzęcych mogą być dla nich niebezpieczne. Zwierzęta domowe są głównym źródłem zakażenia dla ludzi. Tak, więc szczepienie zwierząt domowych przeciwko wirusom orthopox ma rosnące znaczenie. Dodatkowo,
PL 205 922 B1
MVA może być ważny, jako wektor do terapii genowej, to znaczy do przenoszenia sekwencji kwasu nukleinowego do komórki docelowej, w której są one wyrażane.
Do logarytmicznego namnożenia MVA, potrzebne są hodowle komórek pierwotnych lub wtórnych fibroblastów zarodka kurczęcia. Komórki uzyskuje się z jaj kury, które inkubowane są przez 10 do 12 dni. Ponieważ jaja podlegają zmienności biologicznej, komórki uzyskane systemu hodowli komórkowej są także zmienne na poziomie komórkowym. Dodatkowo w „hodowli fibroblastów zarodka kurczęcia” spotykane są często inne typy komórek takie jak komórki nabłonka. Ta zmienność komórek także powoduje zmienność wirusów produkowanych w fibroblastach zarodka kurczęcia. Jest więc dlatego trudne standaryzowanie i walidacja systemu hodowli komórek, aby zagwarantować stałą wysoką jakość produkowanego MVA. Co więcej, skażenie systemu hodowli komórek przez mikroorganizmy lub wirusy już obecne w inkubowanych jajach nie może być całkowicie wykluczona. Gdy MVA jest hodowany w komórkach zanieczyszczonych przez wirus, MVA może rekombinować z wirusem zanieczyszczającym. W ten sposób może być wygenerowany MVA z nowymi i nieprzewidywalnymi cechami. Do produkcji wirusa na dużą skalę w hodowli zawiesinowej, pierwotne lub wtórne fibroblasty zarodka kurczęcia są także nie bardzo odpowiednie. Dodatkowo, oczyszczenie i zatężanie MVA przez wirowanie w gradiencie gęstości byłoby korzystne. Jednak takie oczyszczanie jest trudne, gdy MVA jest hodowany na pierwotnych lub wtórnych fibroblastach zarodka kurczęcia. Na koniec, coraz większa liczba pacjentów rozwinęła alergie na białko jaja kury. Choć warunki in vitro hodowli silnie zmniejszają potencjał alergiczny, to nie można całkowicie wykluczyć niebezpieczeństwa reakcji alergicznej.
W konkluzji, z jednej strony, MVA może być tylko wydajnie hodowany w pierwotnych lub wtórnych fibroblastach kurczęcia powodując szereg wad, jednak z drugiej strony, wykazano bezpieczne stosowanie MVA u ludzi przez jego stosowanie, jako szczepionki na dużą skalę.
Cel wynalazku
Celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie warunków dla produkcji homogennych cząsteczek wirusa MVA. Ponadto, warunki te powinny pozwolić na łatwą i na dużą skalę produkcję MVA.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowany wirus Ankara (MVA) przystosowany do mazania w komórkach linii komórkowej Vero i otrzymany sposobem obejmującym:
a) zakażanie komórek linii komórkowej Vero wirusem MVA typu dzikiego, korzystnie szczepem MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem depozytowym V 94012707;
b) zbieranie wirusów wytwarzanych przez zainfekowane komórki wspomnianej linii komórkowej; oraz,
c) zakażanie świeżych komórek linii komórkowej Vero nowo wytworzonymi wirusami i zbieranie wirusów wytwarzanych przez te komórki, przy czym etap c) powtarza się do uzyskania większego od 1 stosunku wartości uzyskiwanego miana wirusów do wartości początkowego miana wirusów.
Korzystnie linia komórkowa jest linią komórek Vero zdeponowaną w ATCC pod numerem depozytowym CCL-81. Równie korzystnie wirus MVA według wynalazku jest szczepem zdeponowanym w ECACC pod numerem depozytowym 99101431 lub zmodyfikowanym wirusem Ankara przystosowanym do namnażania w komórkach linii komórkowej Vero na takim samym poziomie jak poziom namnażania uzyskiwany dla szczepu zdeponowanego, przy czym zawiera, od co najmniej jedną różnicę w swoim genomie lub jest szczepem zdeponowanym w ECACC pod numerem depozytowym 01021411 lub zmodyfikowanym wirusem Ankara przystosowanym do namnażania w komórkach linii komórkowej Vero na takim samym poziomie jak poziom namnażania uzyskiwany dla szczepu zdeponowanego, przy czym zawiera, od co najmniej jedną różnicę w swoim genomie. Równie korzystnie wirus MVA według wynalazku zawiera, co najmniej jedną heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego, przy czym korzystnie heterologiczną sekwencja kwasu nukleinowego koduje białko terapeutyczne i/lub determinantę antygenową.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza zakażona wirusem MVA według wynalazku zdefiniowanym powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja, korzystnie kompozycja farmaceutyczna, zawierająca MVA i/lub DNA MVA zdefiniowanego powyżej. Korzystnie kompozycja według wynalazku, że jest szczepionką, zwłaszcza przeznaczoną do immunizacji żywego organizmu zwierzęcia, w tym człowieka, w szczególności przeciw zakażeniom Orthopox. Równie korzystnie jest ona przeznaczona do immunizacji kotów przeciw zakażeniu ospą kotów, myszy przeciw zakażeniu ektomelią i/lub wielbłądów przeciwko ospie wielbłądów.
PL 205 922 B1
Korzystnie w kompozycji według wynalazku MV A jest aktywatorem, supresorem i/lub stabilizatorem układu immunologicznego.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja, korzystnie kompozycja farmaceutyczna, zawierająca, jako adiuwant MVA i/lub DNA MVA według wynalazku zdefiniowanego powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja, korzystnie kompozycja farmaceutyczna, zawierająca rekombinowany MVA i/lub DNA rekombinowanego MVA, według wynalazku zdefiniowanego powyżej, do stosowania w terapii genowej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wprowadzania homologicznej i/lub heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego do komórki docelowej obejmujący zakażenie komórki docelowej MVA i/lub DNA MVA według wynalazku zdefiniowanego powyżej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania szczepu MVA według wynalazku zdefiniowanego powyżej, charakteryzujący się tym, że obejmuje:
a) zakażanie komórek linii komórkowej Vero wirusem MVA typu dzikiego, korzystnie szczepem MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem depozytowym V 94012707;
b) zbieranie wirusów wytwarzanych przez zainfekowane komórki wspomnianej linii komórkowej; oraz,
c) zakażanie świeżych komórek linii komórkowej Vero nowo wytworzonymi wirusami i zbieranie wirusów wytwarzanych przez te komórki, przy czym etap c) powtarza się do uzyskania większego od 1 stosunku wartości uzyskiwanego miana wirusów do wartości początkowego miana wirusów.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób namnażania wirusów MVA według wynalazku zdefiniowanych powyżej, charakteryzujący się tym, że obejmuje:
a) hodowanie komórek linii komórkowej, w której wirus MVA ulega replikacji w odpowiednich warunkach;
b) zakażanie wspomnianej linii komórkowej wirusem MVA określonym w zastrz. wybranym spośród od 1 do 6, oraz
c) zbieranie wirusów namnażanych w tych komórkach.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu i/lub polipeptydu, charakteryzujący się tym, że obejmuje:
a) zakażanie komórki gospodarza zrekombinowanym wirusem MVA według wynalazku zdefiniowanym powyżej;
b) hodowanie zakażonej komórki gospodarza w odpowiednich warunkach; i ewentualnie
c) izolowanie i/lub zagęszczanie sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu lub białka produkowanego przez tę komórkę gospodarza.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wirusa MVA według wynalazku zdefiniowanego powyżej do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia lub zapobiegania lub zaburzeniu reagującemu na tego MVA.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wirusa MVA według wynalazku zdefiniowanego powyżej do wytwarzania szczepionki do immunizacji organizmu żywego zwierzęcia, w tym człowieka.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wirusa MVA według wynalazku zdefiniowanego powyżej do wytwarzania aktywatora, supresora i/lub stabilizatora układu immunologicznego.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wirusa MVA według wynalazku zdefiniowanego powyżej do wytwarzania adiuwanta.
Szczegółowy opis wynalazku
Aby osiągnąć powyższe i inne cele, niniejszy wynalazek zapewnia szczep MVA, który jest przystosowany do rosnących komórek ciągłej linii komórkowej, która to linia komórkowa dopuszczona jest do produkcji czynnika terapeutycznego.
Według niniejszego wynalazku, po raz pierwszy możliwa jest wydajna produkcja MVA na dużą skalę. Ponieważ komórki linii ciągłej są homogenne i ich cechy są stabilne MVA zebrany z tych komórek jest też homogenny z wysoce przewidywalnymi cechami. Co więcej, ryzyko skażenia przez mikroorganizmy może być kontrolowane i skażenie preparatu MVA przez białka jaja kurzego, jakie istnieje przy hodowli MVA na fibroblastach zarodka kurzego, może być wykluczone. Obróbka trwałej linii komórkowej jest wygodna i w zawiązku z tym wysoce odpowiednia dla zastosowań przemysłowych.
W korzystnym wykonaniu wynalazku, MVA przystosowany jest do hodowania komórek w linii komórkowej ssaka, która dopuszczona jest do produkcji szczepionki. Nieoczekiwanie stwierdzono, że MVA przystosowany do linii komórkowej ssaka takiej jak linia komórkowa Vero nadal ma obniżoną
PL 205 922 B1 wirulencję w stosunku do ludzi i także dla szerokiego zakresu innych ssaków. Zgodnie z tym, MVA jest wysoce atenuowany, to znaczy, że DNA i białko są syntetyzowane, ale zasadniczo nie są produkowane cząsteczki wirusa, dając w zasadzie wyeliminowaną zdolność do powodowania choroby. Tak, więc, MVA według niniejszego wynalazku jest też wysoce odpowiedni, jako szczepionka dla ludzi i dla szerokiego zakresu ssaków. Stosownie do tego, MVA jest szczególnie stosowalny w dziedzinie weterynarii.
Ponadto, zapewniony jest sposób otrzymywania szczepu MVA według wynalazku. Według tego wykonania wynalazku, komórki linii komórkowej, która dopuszczona jest do produkcji substancji terapeutycznych, są zakażane MVA typu dzikiego. Korzystnie, w tym zakażeniu stosowana jest wysoka wielokrotność infekcji (multiplicity of infection - MOI), to znaczy stosowana jest duża liczba wirusów na komórkę. Następnie, zbiera się wirusy i nowo wyprodukowanymi wirusami zakaża się świeże komórki z tej samej linii komórkowej. Ten proces powtarza się (pasażowanie seryjne) aż MVA przystosowany jest do tej linii komórkowej. Przystosowanie osiąga się, gdy 72 godziny po zakażeniu miano wirusa jest, co najmniej 1 do 9 razy, korzystnie 10 do 99 razy, bardziej korzystnie 100 do 106 razy, a najbardziej korzystnie ponad 107 do 1010 razy zwiększone w porównaniu z mianem wirusa stosowanego pierwotnie. Adaptację osiąga się po ograniczonej liczbie pasaży.
„Przystosowany do wzrostu” oznacza, że ilość wirusa wyprodukowana z zakażenia (uzysk) jest zwiększona w porównaniu z ilością wirusa oryginalnie stosowanego do zakażenia komórek (wsad). W tym przypadku stosunek uzysk/wsad jest wię kszy niż 1.
„Pochodna” MVA zdeponowanego w ECACC, Salisbury, UK pod numerem depozytu 99101431 i/lub tymczasowym numerem dostępu 01021411 oznacza MVA, który jest przystosowany do wzrostu w komórkach Vero z tempem, które jest zasadniczo takie same jak tempo wzrostu zdeponowanego szczepu, ale niesie on przynajmniej jedną różnicę w swoim genomie w porównaniu ze szczepem zdeponowanym.
Określenie „układ odpornościowy” zasadniczo opisuje kompleks biorący udział w obronie organizmu przed obcymi substancjami lub mikroorganizmami. Jest on podzielony na część komórkową obejmującą kilka typów komórek takich jak, na przykład, limfocyty i inne komórki pochodzące z krwinek białych, i część humoralną obejmującą peptydy i białka takie jak przeciwciała, czynniki dopełniacza i cytokiny.
Określenie „odpowiedź odpornościowa” opisuje reakcję układu odpornościowego, gdy do organizmu wnika obca substancja lub mikroorganizm. Ogólnie ujmując, odpowiedź odpornościowa podzielona jest na specyficzną i niespecyficzną reakcję, chociaż obie są blisko powiązane ze sobą. Niespecyficzna odpowiedź odpornościowa uważana jest za natychmiastową obronę przed szerokim zakresem obcych substancji i czynników zakaźnych. Specyficzna odpowiedź odpornościowa może być scharakteryzowana, jako wysoce skuteczny mechanizm obronny organizmu przed obcą substancją, który jest produkowany przeciwko tej substancji po okresie opóźnienia, i który jest wysoce specyficzny dla tej substancji. Specyficzna odpowiedź odpornościowa jest odpowiedzialna za zjawisko, że osobnik, który wyzdrowiał po specyficznym zakażeniu jest w przyszłości chroniony przed tym specyficznym zakażeniem.
„Aktywator układu odpornościowego” oznacza dowolną substancję zdolną do wywoływania lub wzmagania odpowiedzi odpornościowej.
„Supresor układu odpornościowego” oznacza dowolną substancję zdolną do zmniejszania lub hamowania odpowiedzi odpornościowej.
„Stabilizator układu odpornościowego” oznacza dowolną substancję zdolną do utrzymywania odpowiedzi odpornościowej na poziomie stałym.
Wynalazcy dostarczają dwa korzystne szczepy MVA, które przystosowane są do linii komórek afrykańskiej małpy zielonej, zwanej linią komórkową Vero (ATCC nr CCL-81). Szczep MVA, który był pasażowany 100 razy w komórkach Vero nazwano „Vero-MVA” i zdeponowano w European Collection of Celi Cultures, Salisbury, UK, pod numerem depozytu nr 99101431. Szczep MVA po 200 pasażach w komórkach Vero nazwano „Vero-MVA-200” i zdeponowano w ECACC pod tymczasowym numerem dostępu 01021411.
MVA uzyskany jak powyżej dalej zamplifikowano przez hodowlę komórek dopuszczonej linii komórkowej w odpowiednich warunkach, zakażając komórki MVA i zbierając cząsteczki wirusa wyprodukowane przez te komórki. Stąd MVA może być wydajnie i łatwo amplifikowany na dużą skalę. Nieoczekiwanie, MVA według wynalazku nie wykazuje zwiększonej wirulencji w komórkach innych niż Vero, takich jak ludzkie linie komórkowe obejmujące HL, HEP-2 lub HeLa.
PL 205 922 B1
W innym wykonaniu wynalazku MVA zawiera, co najmniej jedną heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego, to znaczy sekwencję kwasu nukleinowego, która nie jest naturalnie spotykana w genomie MVA (zrekombinowany MVA). Korzystnie heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego jest genem, korzystnie genem kodującym immunizujące białko, a najkorzystniej kodującym białko immunizujące przeciwko malarii, wściekliźnie i/lub wirusowemu zapaleniu wątroby. Ekspresja tej heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego jest korzystnie pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa krowianki, a korzystniej własnego promotora MVA. W dalszym korzystnym wykonaniu wynalazku, heterologiczną sekwencja kwasu nukleinowego wstawiona jest w naturalnie występującym miejscu delecji genu MVA (ujawnionym w PCT/EP96/02926).
Zrekombinowany MVA stosowany jest do wprowadzania sekwencji kwasu nukleinowego do komórki docelowej, przy czym ta sekwencja kwasu nukleinowego jest homologiczna lub heterologiczną dla komórki docelowej. Wprowadzenie heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego do komórki docelowej może być stosowane do produkcji heterologicznych kwasów nukleinowych, peptydów i/lub polipeptydów i/lub białek kodowanych przez tę sekwencję kwasu nukleinowego in vitro. Sposób ten obejmuje zakażenie komórki gospodarza zrekombinowanym MVA, hodowlę zakażonej komórki gospodarza w odpowiednich warunkach i dowolnie izolację i/lub wzbogacenie peptydu i/lub białka produkowanego przez tę komórkę gospodarza.
Co więcej, wprowadzenie sekwencji homologicznej lub heterologicznej może być stosowane do terapii genowej in vitro i korzystnie in vivo. Do terapii genowej in vitro i ex vivo, odpowiednio, komórki izoluje się od osobnika, który ma być leczony, transformuje zrekombinowanym MVA i ponownie wprowadzą do osobnika, z którego pobrano komórki. Dla terapii genowej in vivo, zrekombinowany MVA jest bezpośrednio podawany do organizmu żywego zwierzęcia, w tym do organizmu człowieka. W korzystnym wykonaniu wynalazku zrekombinowany MVA wyraża antygen lub epitop antygenu. Najbardziej korzystnie, ten wektor wyraża determinantę antygenową z Plasmodium falciparum, Mykobakterii, wirusa opryszczki, wirusa grypy, wirusa zapalenia wątroby lub ludzkiego wirusa niedoboru odporności.
Ponieważ MVA według wynalazku jest nadal - zadziwiająco - wysoce atenuowany MVA jest idealny do immunizacji szerokiego zakresu ssaków, w tym ludzi. Tak, więc niniejszy wynalazek zapewnia także szczepionkę zawierającą MVA do immunizacji żywego organizmu zwierzęcia, w tym człowieka przeciwko zakażeniom ospą, korzystnie zakażeniom Orthopox. Szczepionka może zawierać oprócz MVA jeden lub więcej dodatków takich jak antybiotyk, konserwant lub stabilizator. Szczepionka ma szczególnie zastosowanie w dziedzinie weterynarii, na przykład, do immunizacji zwierząt przeciwko zakażeniom orthopox takim jak kotów przeciwko ospie kotów, myszy przeciwko ektromelii lub wielbłądów przeciwko ospie wielbłądów. Immunizacja korzystnie przeprowadzana jest poza-jelitowo.
Efekt immunizujący determinanty antygenowej szczepionki jest często wzmagany przez dodatek tak zwanego adiuwantu. Adiuwant współ-stymuluje układ odpornościowy w sposób niespecyficzny powodując silniejszą specyficzną reakcję odpornościową przeciwko antygenowej determinancie szczepionki. Według innego wykonania wynalazku MVA stosowany jest, jako adiuwant, aby współstymulować odpowiedź odpornościową przeciwko antygenowemu determinantowi szczepionki. W tym przypadku korzystne jest, aby MVA był inaktywowany. Inaktywacja MVA może być przeprowadzona, na przykład, za pomocą ciepła lub chemikaliów. Korzystnie MVA inaktywowany jest, przez β-propiolakton. Według tego wykonania wynalazku inaktywowany MVA może być dodawany do szczepionek przeciwko licznym chorobom zakaźnym, aby zwiększyć odporność na tę chorobę.
W przypadku zakażeniu układy odpornościowy, nerwowy, hormonalny i naczyniowy osobnika blisko współpracują ze sobą. Ich interakcje mogą być regulowane przez elementy niespecyficznego układu odpornościowego, na przykład, cytokiny takie jak interferony i interleukiny. Wirusy ospy mogą wpływać na regulację układu odpornościowego (Swiss Vet 11/99, 13-17). Stąd, w dalszym wykonaniu wynalazku, MVA i korzystnie inaktywowany MVA stosowany jest u ssaków, w tym u ludzi, aby regulować komórkowe i humoralne elementy niespecyficznego (wrodzonego) układu odpornościowego. Korzystnie MVA jest stosowany, jako bioregulator, gdzie eliminuje się dysfunkcje układu odpornościowego i aktywuje, stabilizuje i/lub suprymuje własne mechanizmy obronne organizmu. Najbardziej korzystnie, MVA stosowany jest, jako bioregulator w przypadku infekcji wirusem, na przykład, opryszczką, wirusem zapalenia wątroby typu B lub C, w przypadku przewlekłej choroby zapalnej i/lub, aby wspomagać terapię nowotworów. MVA może być też stosowany do stabilizacji układu odpornościowego w sytuacji zwiększonej podatności na zakażenia takiej jak w przypadku stresu lub u noworodków. Aktywny i/lub korzystnie inaktywowany MVA może być stosowany ogólnoustrojowo, na przykład, domięśniowo i/lub miejscowo, na przykład, przez błony śluzowe i/lub skórę.
PL 205 922 B1
Podsumowując, niniejszy wynalazek zapewnia szczepy MVA, które mogą być ogólnie stosowane do tych samych zastosowań jak MVA typu dzikiego, ale które eliminują problemy powodowane przez namnażanie MVA typu dzikiego w fibroblastach zarodków kurczęcia.
Istota wynalazku
Wynalazek, między innymi, obejmuje, pojedynczo lub w kombinacji: Zmodyfikowany wirus Ankara (MVA) przystosowany do wzrostu w komórkach ciągłej linii komórkowej, która to linia komórkowa dopuszczona jest do produkcji substancji terapeutycznej.
MVA jak powyżej, dostosowane do wzrostu w komórkach linii komórkowej ssaka.
MVA jak powyżej, w którym linia komórkowa dopuszczona jest do produkcji szczepionki.
MVA jak powyżej, w którym ta dopuszczona linia komórkowa jest linią komórkową Vero.
MVA jak powyżej, w którym ta dopuszczona linia komórkowa jest linią komórkową Vero ATCC nr CCL-81.
MVA jak powyżej, zdeponowany w European Collection of Cell Cultures, Salisbury, UK, pod numerem depozytu 99101431 i/lub jego pochodna.
MVA jak powyżej, zdeponowany w ECACC, Salisbury, UK, pod tymczasowym numerem depozytu 01021411 i/lub jego pochodna.
MVA jak powyżej, zawierający, co najmniej jedną heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego.
MVA jak powyżej, zawierający heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego, na przykład, gen kodujący białko terapeutyczne i/lub determinantę antygenową taką jak peptyd immunizujący przeciwko malarii, wirusowemu zapaleniu wątroby i/lub wściekliźnie.
Komórkę gospodarza zakażoną powyżej opisanym MVA.
Kompozycję, korzystnie kompozycję farmaceutyczną, zawierająca MVA i/lub DNA MVA opisane powyżej.
Kompozycję farmaceutyczną opisaną powyżej, w której kompozycja farmaceutyczna jest szczepionką.
Kompozycję opisaną powyżej do immunizacji żywego organizmu zwierzęcia, w tym człowieka.
Kompozycję jak powyżej do immunizacji przeciw zakażeniu orthopox.
Kompozycję jak powyżej do immunizacji kotów przeciw zakażeniu ospą kotów, myszy przeciwko zakażeniu ektromelią i/lub wielbłądów przeciwko ospie wielbłądów.
Kompozycję farmaceutyczną opisaną powyżej, w której MV A jest aktywatorem, supresorem i/lub stabilizatorem niespecyficznego układu odpornościowego.
Kompozycję farmaceutyczną, zawierającą MVA i/lub DNA MVA opisane, powyżej jako adiuwant.
Kompozycję farmaceutyczną, zawierającą zrekombinowany MVA i/lub DNA zrekombinowanego MVA opisane powyżej.
Kompozycję jak opisano powyżej do stosowania w terapii genowej.
Sposób wprowadzania homologicznej i/lub heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego do docelowej komórki obejmujący zakażenie komórki docelowej powyżej opisanym MVA.
Sposób uzyskania szczepu MVA jak opisano powyżej, obejmujący:
a) zakażenie komórek dopuszczonej linii komórkowej MVA typu dzikiego, korzystnie MVA zdeponowanego w ECACC pod depozytem Nr V 94012707,
b) zebranie wirusów,
c) zakażenie świeżych komórek tej samej linii komórkowej nowo wyprodukowanymi wirusami i opcjonalnie,
d) powtórzenie etapu (b) i (c), aż wirus będzie przystosowany do wzrostu w komórkach tej linii komórkowej.
Sposób produkcji cząsteczek wirusa MVA opisanych powyżej, obejmujący hodowlę komórek dopuszczonej linii komórkowej w odpowiednich warunkach, zakażenie tej linii komórkowej tym MVA, i zebranie czą steczek wirusów wyprodukowanych przez te komórki.
Sposób jak opisano powyżej, w którym ta linia komórkowa jest zakażona MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem depozytu nr 99101431 i/lub MVA zdeponowanym w ECACC pod tymczasowym numerem depozytu 01021411 lub pochodną jednego z tych szczepów.
Sposób przygotowania sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu i/lub polipeptydu obejmujący zakażenie komórki gospodarza zrekombinowanym MVA opisanym powyżej, hodowlę zakażonej komórki gospodarza w odpowiednich warunkach, i opcjonalnie izolację i/lub wzbogacenie sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu i/lub białka produkowanego przez tę komórkę gospodarza.
PL 205 922 B1
Zastosowanie MVA opisanego powyżej do produkcji kompozycji farmaceutycznej do leczenia lub do zapobiegania chorobie lub zaburzenia reagującemu na ten MVA.
Zastosowanie MVA opisanego powyżej, do produkcji szczepionki do immunizacji żywego organizmu zwierzęcia, w tym człowieka.
Zastosowanie opisanego powyżej MVA do produkcji aktywatora, supresora i/lub stabilizatora niespecyficznego układu odpornościowego.
Zastosowanie jak opisano powyżej do produkcji adiuwantu.
Zastosowanie opisanego powyżej, MVA jako szczepionki.
Zastosowanie opisanego powyżej, MVA jako adiuwantu.
Zastosowanie opisanego powyżej, MVA jako aktywatora, supresora i/lub stabilizatora niespecyficznego układu odpornościowego.
Sposób immunizacji żywego organizmu zwierzęcia, w tym człowieka, który to sposób obejmuje podanie potrzebującej tego osobie skutecznej ilości kompozycji farmaceutycznej opisanej powyżej.
Sposób wprowadzania homologicznej i/lub heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego do komórki docelowej obejmujący zakażenie komórki docelowej opisanym powyżej MVA i/lub DNA MVA.
Sposób aktywacji, supresji i/lub stabilizacji niespecyficznego układu odpornościowego żywego organizmu zwierzęcia, w tym człowieka, który to sposób obejmuje podanie kompozycji farmaceutycznej opisanej powyżej żywemu organizmowi zwierzęcia, w tym człowiekowi.
Sposób zwiększenia specyficznej odpowiedzi immunologicznej w stosunku do determinanty antygenowej w szczepionce obejmujący podanie opisanego powyżej MVA, jako adiuwantu żywemu organizmowi zwierzęcia, w tym człowiekowi. Zmodyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA) przystosowany do wzrostu w komórkach ciągłej linii komórkowej możliwy do uzyskania za pomocą sposobu obejmującego następujące etapy: zakażenie komórek linii komórkowej dopuszczonej do produkcji substancji terapeutycznej, zebranie cząsteczek wirusa wyprodukowanych przez te linie komórkowe i opcjonalnie powtórzenie powyż szych etapów, aż uzyska się pożądane cechy wzrostu wymienionego MVA w tych komórkach.
P r z y k ł a d y
Następujące przykłady dalej zilustrują niniejszy wynalazek. Dla specjalisty jest zrozumiałe, że podane przykłady w żaden sposób na mogą być interpretowane, jako ograniczające stosowalność technologii dostarczanej przez niniejszy wynalazek do tych przykładów.
P r z y k ł a d 1: Przystosowanie MVA do komórek Vero i charakterystyka szczepu MVA
1. Przystosowanie MVA do komórek Vero
Szczep dziki MVA, opracowany przez Antona Mayra jest zmodyfikowanym szczepem krowianki Ankara, który był zdeponowany w ECACC pod numerem depozytu nr V 94012707. MVA typu dzikiego przystosowano do wzrostu w komórkach Vero przez seryjne pasażowanie wirusa w komórkach Vero (tabela 1). Klon komórek ATCC-Nr CCL-81 stacjonarnej linii komórkowej Vero (WHO zapas do szczepień ECACC nr 88020401) zastosowano w pasażu nr 148 do 165 (WHO zapas do szczepień, Bank Referencyjny i Roboczy). Komórki namnażano w podłożu złożonym z MEM Earle'a (ICN) pH 7,4 - 7,6 i 5% substytutu surowicy BMS (Biochrom). Według techniki znanej specjalistom zawsze zaszczepiano te same komórki banku roboczego przez rozszczepienie 1:2 do 1:4. Podłoże zawierało około 250000 komórek na ml. Komórki odpowiednio namnażano w probówkach (2 ml), szalkach Roux (100 ml), i plastikowych szalkach (6 i 40 ml, odpowiednio). Ogólnie, komórki tworzyły konfluentną pojedynczą warstwę po upływie 16 do 24 godzin. Następnie, podłoże zastępowano zwykłym MEM Earle'a bez żadnych dodatków.
Dla adaptacji MVA typu dzikiego stosowano system hodowli w probówkach. Wyniki pasaży podsumowano w tabeli 1 i 2. Komórki Vero zakażano 10 MOI (wielokrotność infekcji) MVA typu dzikiego, to znaczy średnio 10 cząsteczek wirusa na komórkę Vero. MVA typu dzikiego na początku był genetycznie homogennym, oczyszczonym z łysinek MVA po 575 pasażach w fibroblastach zarodka kurczęcia (miano: 107,75 KID50/ml). Po 24 godzinach, 90% komórek Vero pojedynczej konfluentnej warstwy niszczono za pomocą toksycznych procesów (50% przez toksyczność i 40% przez lizę). Podłoże plus szczątki komórek po zamrożeniu i rozmrażaniu komórek zawierające wyprodukowane wirusy zbierano i 0,2 ml tej mieszaniny zaszczepiano na pojedynczej warstwie komórek Vero w probówkach do hodowli (2 pasaż). Procedurę te powtarzano 200 razy. Po trzecim pasażu już nie obserwowano toksycznego efektu, podczas gdy łagodny efekt cytopatyczny (CPE) charakteryzowany przez zaokrąglenie komórek i lizę w okresie od 4 do 6 dni po zakażeniu był widoczny. Miano wirusa wynosiło 101,0 KID50/ml. Wywnioskowano, że proliferacja MVA w komórkach Vero rozpoczęła się, choć bardzo
PL 205 922 B1 niewydajnie. Po piątym pasażu obserwowano typowy efekt CPE, który był zakończony 4 do 5 dni po infekcji. Miano wirusa zwiększyło się z 101,0 KID50/ml po trzecim pasażu do 104,0 KID50/ml po piątym pasażu. Tak, więc, wirus namnażał się bardziej wydajnie w komórkach Vero. W pasażach 5 do 11 całkowity CPE obserwowano coraz wcześniej i miano wirusa rosło z każdym pasażem. W pasażu nr 11, osiągnięto wypłaszczenie przy 107,5 KID50/ml. Stąd, po jedenastu pasażach uzyskano adaptację MVA do komórek Vero. W następnych 30 dodatkowych pasażach dla wszystkich pasaży wyniki były takie same i wysoce powtarzalne: CPE zaczynał się już 24 godziny po zakażeniu i wszystkie komórki były dotknięte trzy dni po infekcji. W tym czasie 20% komórek Vero było zaokrąglonych i 80% było zlizowanych. Po trzech dniach po infekcji, miano wirusa było zawsze około 107,75 KID50/ml. Po piętnastym pasażu, wirusy zawsze zbierano po dwóch do trzech dni po infekcji i stosowano tylko 1 MOI zamiast 10 MOI do zakażania komórek (tabela 2). W następujących dodatkowych pasażach cechy wzrostowe MVA zmieniały się tylko nieznacznie. Uderzające jest, że optymalne miano wirusa dalej wzrastało i osią gnęło 1010 KID50/ml przy pasaż u 200.
W konkluzji, wirus rośnie powtarzalnie w sposób ekspotencjalny w komórkach Vero. Taka cecha wzrostu jest uderzająco odmienna od charakterystyki dzikiego MVA. Tak, więc uzyskano nowy szczep MVA za pomocą seryjnych pasaży. Ten nowy szczep nazwano „Vero-MVA”, a po pasażu 200 w komórkach Vero „Vero-MVA-200”.
Vero-MVA i Vero-MVA-200 hodowano w większych ilościach. Dla przechowywania Vero-MVA zatężono za pomocą wirowania, zawieszono ponownie w 2,5% poliżeliny i liofilizowano w fiolkach 2 ml. Miano po liofilizacji wynosiło nadal, co najmniej 108,5 KID50/ml. Liofilizowane Vero-MVA i Vero-MVA-200 sprawdzono pod kątem skażenia i toksyczności i przechowywano w +4°C.
2. Charakterystyka właściwości biologicznych Vero-MVA.
Cechy biologiczne Vero-MVA (pasaż 100) i Vero-MVA-200 (pasaż 200) porównano z cechami MVA typu dzikiego (tabela 3 i tabela 5). W tym celu stosowano techniki znane specjaliście. Wynalazcy wykazali, że zakres gospodarza wirusa nie był zmieniony poza komórkami Vero, a wirulencja w stosunku do zwierząt i ludzki nie była zwiększona. Vero-MVA jest nadal charakteryzowana przez poronne namnażanie w niepermisywnych komórkach gospodarza.
Zasadniczą tożsamość cząsteczek wirusa Vero-MVA porównano z cząsteczkami wirusa szczepu Elstree wirusa krowianki wykazano przez reakcje krzyżowe przeciwciał uzyskanych dla szczepu Elstree. Szczep Elstree jest szczepem krowianki zalecanym przez WHO do szczepienia ospy. Poliklonalne hiperimmunologiczna surowica królików uzyskanych dla szczepu Elstree była dodana do VeroMVA. 100 KID50/ml Vero MVA były całkowicie neutralizowane w rozcieńczeniu surowicy 1:512. Dwukrotne rozcieńczenie surowicy było konieczne do zobojętnienia tej samej ilości szczepu krowianki Elstree (1:256). Tak, więc Vero-MVA może być nadal wydajnie neutralizowany przez surowicę odpornościową krowianki.
Vero-MVA, Vero-MVA-200 i MVA typu dzikiego porównywano za pomocą szeregu dodatkowych testów, jak wskazano w tabelach 3, 4 i 5. Wynalazcy pokazali, że wirulencja Vero-MVA i Vero-MVA-200 dla ssaków, w tym ludzi nie była zwiększona w porównaniu z MVA typu dzikiego. Wykazano także, że Vero-MVA i Vero-MVA-200 nie są zakaźne lub toksyczne dla ssaków, w tym dla ludzi. Zadziwiająco, specyficzność komórkowa Vero-MVA była mniej więcej identyczna dla specyficzności MVA typu dzikiego z wyjątkiem komórek Vero: Vero-MVA amplifikuje się nieomal tak niewydajnie w komórkach ludzkich linii komórkowych (patrz Tabela 4: komórki HL-, HEP-2, i HeLa) tak jak MVA typu dzikiego. Tak, więc, chociaż komórki ludzkie i komórki zielonej małpy afrykańskiej są filogenetycznie blisko spokrewnione, Vero-MVA nie zyskał zdolności amplifikacji w komórkach ludzkich. W innych testach także nie stwierdzono znaczącej różnicy.
Ponadto, porównano cechy fizyczne, chemiczne i biologiczne MVA typu dzikiego i Vero-MVA-200 (tabela 5). Podczas gdy MVA typu dzikiego rosnący w hodowlach fibroblastów zarodków kurczęcia ma trzy delecje w lewym regionie terminalnym, Vero-MVA-200 ma cztery delecje w lewym regionie terminalnym w porównaniu z genomem wirusa ospy oryginalnie wyizolowanego w Ankarze. Stąd też, pasażowanie MVA typu dzikiego w komórkach Vero dało w efekcie w dodatkową delecje.
Vero-MVA zastosowano do immunizacji zwierząt domowych na zakażenia orthopox. Zebrano surowicę zwierząt i przeprowadzono test neutralizacji. Wynalazcy wykazali, że zwierzęta produkowały przeciwciała z wysokim mianem. Miana przeciwciał były stabilne przez okres przynajmniej 111 dni. Wykazano także, że przeciwciała były zdolne do neutralizacji in vitro cząsteczek wirusa MVA w teście redukcji łysinek. W konkluzji Vero-MVA może być stosowane u zwierząt domowych i u ludzi.
PL 205 922 B1
T a b e l a 1. Przystosowanie MVA do komórek Vero
Pasaż nr Hodowla komórek Najwyższe miano wirusa [log10 /ml] Wynik Wniosek
1 efekt toksyczny po 24 godzinach 2,0 Resztki zaszczepionego wirusa Pasaże ślepe Zjawisko zon i produkcji cytokin
3 Brak toksyczności, umiarkowany CPE po 4-6 dniach 1,0 Resztki zaszczepionego wirusa ? Początek namnażania wirusa
5 typowy CPE zakończony po 4-5 dniach 4,0 Rosnące namnażanie wirusa
11 CPE zakończony po 3 dniach 7,5 Logarytmiczne namnażanie wirusa Udane przystosowanie
12-42* CPE zaczyna się po 24 godzinach, zakończony po 3 dniach 7,75 Powtarzalne namnażanie wirusa Vero-MVA
43-100* CPE zaczyna się po 24 godzinach, zakończony po 3 dniach 8,0 Powtarzalne namnażanie wirusa Vero-MVA
100-200* CPE zaczyna się po 24 godzinach, zakończony po 3 dniach 10,0 Powtarzalne namnażanie wirusa Daje Vero MYA-200
* Tylko 1 MOI zamiast 10 MOI zaszczepia się po jedenastym pasaż u
T a b e l a 2. Zmiana mian wirusa w czasie adaptacji MVA do komórek VERO
Pasaż Nr Zebrane po (dni po zakażeniu) Miano na ml [log10/ml]
1 2 3
1 1 < 2,0
2 3 2,0
3 5 1,0
5 5 4,0
8 4 6,5
11 3 7,5
18 2 8,0
19 2 7,75
20 3 8,0
25 2 7,75
29 2 7,75
PL 205 922 B1 cd. tabeli 2
1 2 3
30 3 7,75
31 3 8,0
45 2 7,75
51 3 7,75
60 2 8,0
66 2 7,75
68 2 8,0
75 3 8,0
100 2 8,0
200 2 10,0
T a b e l a 3. Porównanie cech biologicznych MVA typu dzikiego i Vero-MVA
Marker MVA typu dzikiego Vero-MVA (pasaż 100) Vero-MVA-200
CPE w jednowarstwowych hodowlach komórek Zaokrąglenie i liza komórek po dniu 5 (90% CPE) Zaokrąglenie i liza komórek po dniu 5 (100% CPE) Zaokrąglenie i liza komórek po dniu 3 do 5 (100% CPE)
Miano optymalnego zbioru 108,0 KID50/ml 107,75 KID50/ml 1010,0 KID50/ml
Poranne namnażanie wirusa w niepermisywnych układach komórek Tak Tak Tak
Zmniejszona wirulencja dla ludzi i zwierząt Tak Tak Tak: wcale nie jest wirulentny
Zakaźność Nie Nie Nie
Charakter pierwotnych łysinek na błonie omocznikosmówki Brak proliferujących węzłów bez nerkozy Brak proliferujących węzłów bez nerkozy Brak proliferujących węzłów bez nerkozy
Hemaglutynacja (erytrocyty kurczęcia) Ujemna Ujemna Ujemna
Inaktywacja przez β-propiolakton Kinetyka pierwszego rzędu dla 0,05% Kinetyka pierwszego rzędu dla 0,05% Kinetyka pierwszego rzędu dla 0,04-0,05%
Ochronny efekt w teście prowokacji VSVniemowlę myszy Tak Tak tak
Toksyczność dla ludzi i zwierząt Nie Nie Nie
Stymulacja cytokinami Interferon α, IL-2 i 12, CSA Interferon α, IL-2 i 12, CSA Interferon α, IL-2 i 12, CSA
Aktywacja fagocytozy, komórek naturalnych zabójców i limfocytów T Tak Tak Tak, zwiększona
PL 205 922 B1
T a b e l a 4: Tempo namnażania w KID50/ml VERO-MVA i MVA typu dzikiego w różnych systemach hodowli komórek [log10/ml]
System hodowli komórek Vero-MVA (31.pasaż Vero) MVA typu dzikiego (575.pasaż w pierwotnych fibroblastach zarodka kurczęcia)
1) Vero (komórki nerki małpy zielonej afrykańskiej) 8,0 4,5
Pierwotne fibroblasty zarodka kurczęcia 4,5 8,5
1,2) HL (płuco ludzkie) 3,0 2,5
1,2) HEP-2 (ludzki rak epidermalny) 3,0 2,5
1,2) HeLa (ludzki rak szyjki macicy) 2,75 2,75
1,2) BHK (komórki nerki chomika) 5,75 5,25
1,2) MDBK (komórki nerki bydlęcej) 3,5 3,5
1,2) PK-15 (komórki nerki świni) 3,25 3,5
1) Ciągła linia komórkowa pochodząca z tkanki i gatunku wskazanego w nawiasach 2) Linie komórkowe otrzymane z kolekcji Instytutu Mikrobiologii Medycznej w Monachium, Niemcy
T a b e l a 5: Porównanie MVA typu dzikiego (572. pasaż w fibroblastach zarodków kurczęcia (CEF) z Vero-MVA-200 (200. pasaż w komórkach Vero)
Marker MVA typu dzikiego Vero-MVA-200
Markery genetyczne (porównanie ze szczepami wirusa ospy jak wyizolowano w Ankarze) 3 delecje w lewym regionie końcowym 4 delecje w lewym regionie terminalnym
Wielkość genomu zredukowana z 208 do 178 kb Dalsza redukcja wielkości genomu do 172 kb
Utrata 15% molekularnej masy oryginalnego genomu Utrata 20% molekularnej masy oryginalnego genomu
Utrata receptora interferonu Dodatkowa utrata receptorów, np. dla IL-Ιβ
Markery komórkowe Aktywacja komórek T pomocniczych (CD4, CD8, CD25) Zwiększona aktywacja cytotoksycznych limfocytów T
Aktywacja komórek NK Zwiększona aktywacja komórek NK
Poronne namnażanie w komórkach ssaków (poza komórkami BHK) Dalsze zawężenie spektrum gospodarza w układach hodowli komórek
Cytokina Interferon α, IL-2, IL-12 Interferon α i γ, IL-1, 2, 12
Miano wirusa CEF: 109,5 KID50/ml Komórki Vero: 104,0 KID50/ml CEF: 104,5 KID50/ml Komórki Vero: 109,5 KID50/ml
Układ odpornościowy Zmniejszenie aktywności specyficznego układu odpornościowego Zwiększona aktywność niespecyficznego układu odpornościowego
Wirulencja dla ludzki i zwierząt niska Niska brak
PL 205 922 B1
Numer akt sprawy Złaszającego . ~~ ρρτ Nr zgłoszenia międzynarodowego pCT/FPOI/nPTn^
lub pełnomocnika
DANE DOTYCZĄCE ZDEPONOWANEGO MIKROORGANIZMU (Zasada 13Ζ?ώ· PCT)
A. Dane podane poniżej dotyczą mikroorganizmu, o którym mowa w opisie na stronie_6, 7, 10, 12, 24, wiersze
3, 10, 23, 16, 25
B. IDENTYFIKACJA DEPOZYTU
Dalsze depozyty zidentyfikowane są na dodatkowych stronach
Nazwa instytucji deponującej ECACC
Centre for Applied Microbiology and Research & European Collection _of Celi Cultures_
Adres instytucji deponującej (w tym kod pocztowy i kraj)
Salisbury
Wiltshire SP4 OJG
United Kingdom
Data zdeponowania
Numer dostępu lutego 2001 roku (Tymczasowy) 01021411
C. DODATKOWE DANE (nie wypełniać, jeśli nie dotyczy) Ta informacja kontynuowana jest na dodatkowym arkuszu [~~]
W odniesieniu do wszystkich krajów wyznaczonych, dla których takie działanie jest możliwe i w zakresie, który jest dozwolony zgodnie z prawem wyznaczonego kraju, wnosi się, aby próbka zdeponowanego mikroorganizmu była dostępna wyłącznie przez wydanie jej niezależnemu ekspertowi, zgodnie z odnośnym prawem patentowym, na przykład, EPC Rule 28(4); Patent Rules UK 1995, Załącznik 2, Ustęp 3; Austraiian Regulation 3.25(3); Danish Patents Act Sections 22 i 33(3) oraz, mutatis mutandis, z generalnie podobnymi przepisami dla każdego innego kraju wyznaczonego.
D. KRAJE WYZNACZONE, DLA KTÓRYCH PRZEDKŁADANE SĄ DANE (jeśl i dane nie są dla wszystkich krajów' wyznaczonych)
E. ODDZIELNE DOSTARCZENIE DANYCH (nie wypełniać, jeśli nie dotyczy
Dane podane poniżej zostaną przedłożone do Biura Międzynarodowego w terminie późniejszym {podać ogólną cechę danych, na przykład, Numer dostępu depozytu)
Kopia ostatecznego Zaświadczenia o Depozycie
Wypełnia wyłącznie Urząd przyjmujący
Ί en arkusz otrzymany został wiąz ze zgłoszeniem m iędzynarodo wym _Wypełnia wyłącznie Biuro M i ędzynarodowe
I [ Ten arkusz otrzymany został przez Biuro Międzynarodowe dnia:
Osoba upoważniona
Claudia Aragonc
Osoba upoważniona
Form PCT/RO/134 (lipiec 1992)
PL 205 922 B1
Numer akt sprawy Złaszającego oo ρρτ Nr zgłoszenia międzynarodowego ρπτ/ΡΡηΐ/η27Π3
lub pełnomocnika
DANE DOTYCZĄCE ZDEPONOWANEGO MIKROORGANIZMU (Zasada 136/j PCI')
A. Dane podane poniżej dotyczą mikroorganizmu, o którym mowa w opisie na stronie 6,7,10,12,24 , wiersze 2,8,21,14,20
B. IDENTYFIKACJA DEPOZYTU Dalsze depozyty zidentyfikowane są na dodatkowych stronach | I
Nazwa instytucji deponującej ECACC
Centre for Applied Microbiology and Research & European Collection _of Celi Cuttures_
Adres instytucji deponującej (w tym kod pocztowy i kraj)
Salisbury
Wiltshire SP4 OJG
United Kingdom__
Data zdeponowania · Numer dostępu _14 października 2001 roku______________[_______________99101431__________________________
C. DODATKOWE DANE (nie wypełniać, jeśli nie dotyczy) Ta informacja kontynuowana jest na dodatkowym arkuszu I I
W odniesieniu do wszystkich krajów wyznaczonych, dla których takie działanie jest możliwe i w zakresie, który jest dozwolony zgodnie z prawem wyznaczonego kraju, wnosi się, aby próbka zdeponowanego mikroorganizmu była dostępna wyłącznie przez wydanie jej niezależnemu ekspertowi, zgodnie z odnośnym prawem patentowym, na przykład, EPC Rule 28(4); Patent Rules UK 1995, Załącznik 2, Ustęp 3; Australian Regulation 3.25(3); Danish Patents Act Sections 22 i 33(3) oraz, mutatis mutandis, z generalnie podobnymi przepisami dla każdego innego kraju wyznaczonego.
D. KRAJE WYZNACZONE, DLA KTÓRYCH PRZEDKŁADANE SĄ DANE (jeśli dane nic są dla wszystkich krajów wyznaczonych)
E. ODDZIELNE DOSTARCZENIE DANYCH (nie wypełniać, jeśli nie dotyczy)_
Dane podane poniżej zostaną przedłożone do Biura Międzynarodowego w terminie późniejszym {podać ogólną cechę danych, na przykład, Numer dostępu depozytu)
form PCT/RO/134 (July 1992)
PL 205 922 B1

Claims (23)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Zmodyfikowany wirus Ankara (MVA) przystosowany do namnaż ania w komórkach linii komórkowej Vero i otrzymany sposobem obejmującym:
    a) zakażanie komórek linii komórkowej Vero wirusem MVA typu dzikiego, korzystnie szczepem MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem depozytowym V 94012707;
    b) zbieranie wirusów wytwarzanych przez zainfekowane komórki wspomnianej linii komórkowej;
    oraz,
    c) zakażanie świeżych komórek linii komórkowej Vero nowo wytworzonymi wirusami i zbieranie wirusów wytwarzanych przez te komórki, przy czym etap c) powtarza się do uzyskania większego od 1 stosunku wartości uzyskiwanego miana wirusów do wartości początkowego miana wirusów.
  2. 2. MVA wedł ug zastrz. 1, znamienny tym, ż e linia komórkowa jest linią komórek Vero zdeponowaną w ATCC pod numerem depozytowym CCL-81.
  3. 3. MVA według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jest szczepem zdeponowanym w ECACC pod numerem depozytowym 99101431 lub zmodyfikowanym wirusem Ankara przystosowanym do namnażania w komórkach linii komórkowej Vero na takim samym poziomie jak poziom namnażania uzyskiwany dla szczepu zdeponowanego, przy czym zawiera, od co najmniej jedną różnicę w swoim genomie.
  4. 4. MVA według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jest szczepem zdeponowanym w ECACC pod numerem depozytowym 01021411 lub zmodyfikowanym wirusem Ankara przystosowanym do namnażania w komórkach linii komórkowej Vero na takim samym poziomie jak poziom namnażania uzyskiwany dla szczepu zdeponowanego, przy czym zawiera, od co najmniej jedną różnicę w swoim genomie.
  5. 5. MVA wedł ug jednego spoś ród zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, ż e zawiera, co najmniej jedną heterologiczną sekwencję kwasu nukleinowego.
  6. 6. MVA wedł ug zastrz. 5, znamienny tym, ż e heterologiczna sekwencja kwasu nukleinowego koduje białko terapeutyczne i/lub determinantę antygenową.
  7. 7. Komórka gospodarza zakażona wirusem MVA określonym w jednym spośród zastrz. od 1 do 6.
  8. 8. Kompozycja, korzystnie kompozycja farmaceutyczna, zawierająca MVA i/lub DNA MVA określonego w jednym spośród zastrz. od 1 do 6.
  9. 9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że jest szczepionką.
  10. 10. Kompozycja według zastrz. 9, do immunizacji żywego organizmu zwierzęcia, w tym człowieka.
  11. 11. Kompozycja według zastrz. 9 albo 10, do immunizacji przeciw zakażeniom Orthopox.
  12. 12. Kompozycja według jednego spośród zastrz. od 9 do 11, do immunizacji kotów przeciw zakażeniu ospą kotów, myszy przeciw zakażeniu ektomelią i/lub wielbłądów przeciwko ospie wielbłądów.
  13. 13. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że MVA jest aktywatorem, supresorem i/lub stabilizatorem układu immunologicznego.
  14. 14. Kompozycja, korzystnie kompozycja farmaceutyczna, zawierająca, jako adiuwant MVA i/lub DNA MVA określonego w jednym spośród zastrz. od 1 do 6.
  15. 15. Kompozycja, korzystnie kompozycja farmaceutyczna, zawierająca rekombinowany MVA i/lub DNA rekombinowanego MVA określonego w zastrz. 5 albo 6 do stosowania w terapii genowej.
  16. 16. Sposób wprowadzania homologicznej i/lub heterologicznej sekwencji kwasu nukleinowego do komórki docelowej obejmujący zakażenie komórki docelowej MVA i/lub DNA MVA określonego w zastrz. 5 albo 6.
  17. 17. Sposób otrzymywania szczepu MVA określonego w zastrz. wybranym spośród od 1 do 6, znamienny tym, że obejmuje:
    a) zakażanie komórek linii komórkowej Vero wirusem MVA typu dzikiego, korzystnie szczepem MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem depozytowym V 94012707;
    b) zbieranie wirusów wytwarzanych przez zainfekowane komórki wspomnianej linii komórkowej; oraz,
    c) zakażanie świeżych komórek linii komórkowej Vero nowo wytworzonymi wirusami i zbieranie wirusów wytwarzanych przez te komórki, przy czym etap c) powtarza się do uzyskania większego od 1 stosunku wartości uzyskiwanego miana wirusów do wartości początkowego miana wirusów.
  18. 18. Sposób namnażania wirusów MVA określonych w zastrz. wybranym spośród od 1 do 6, znamienny tym, że obejmuje:
    PL 205 922 B1
    a) hodowanie komórek linii komórkowej, w której wirus MVA ulega replikacji w odpowiednich warunkach;
    b) zakażanie wspomnianej linii komórkowej wirusem MVA określonym w zastrz. wybranym spośród od 1 do 6, oraz
    c) zbieranie wirusów namnażanych w tych komórkach.
  19. 19. Sposób otrzymywania sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu i/lub polipeptydu, znamienny tym, że obejmuje:
    a) zakażanie komórki gospodarza zrekombinowanym wirusem MVA określonym w zastrz. 5 albo 6;
    b) hodowanie zakażonej komórki gospodarza w odpowiednich warunkach; i ewentualnie
    c) izolowanie i/lub zagęszczanie sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu lub białka produkowanego przez tę komórkę gospodarza.
  20. 20. Zastosowanie wirusa MVA określonego w zastrz. wybranym spośród od 1 do 6 do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia lub zapobiegania lub zaburzeniu reagującemu na tego MVA.
  21. 21. Zastosowanie wirusa MVA określonego w zastrz. wybranym spośród od 1 do 6 do wytwarzania szczepionki do immunizacji organizmu żywego zwierzęcia, w tym człowieka.
  22. 22. Zastosowanie wirusa MVA określonego w zastrz. wybranym spośród od 1 do 6 do wytwarzania aktywatora, supresora i/lub stabilizatora układu immunologicznego.
  23. 23. Zastosowanie wirusa MVA określonego w zastrz. wybranym spośród od 1 do 6 do wytwarzania adjuwanta.
PL357378A 2000-03-14 2001-03-10 Zmodyfikowany wirus Ankara (MVA), zakażona nim komórka gospodarza, jego zastosowania, kompozycja farmaceutyczna i sposoby otrzymywania wirusa oraz sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu i/lub polipeptydu PL205922B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200000410 2000-03-14
PCT/EP2001/002703 WO2001068820A1 (en) 2000-03-14 2001-03-10 Altered strain of the modified vaccinia virus ankara (mva)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL357378A1 PL357378A1 (pl) 2004-07-26
PL205922B1 true PL205922B1 (pl) 2010-06-30

Family

ID=8159327

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL357378A PL205922B1 (pl) 2000-03-14 2001-03-10 Zmodyfikowany wirus Ankara (MVA), zakażona nim komórka gospodarza, jego zastosowania, kompozycja farmaceutyczna i sposoby otrzymywania wirusa oraz sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu i/lub polipeptydu

Country Status (25)

Country Link
US (1) US6682743B2 (pl)
EP (1) EP1263936B1 (pl)
JP (1) JP4759201B2 (pl)
KR (1) KR100880765B1 (pl)
CN (1) CN1291012C (pl)
AT (1) ATE305030T1 (pl)
AU (1) AU780696B2 (pl)
BR (1) BR0109158A (pl)
CA (1) CA2397675C (pl)
CZ (1) CZ293690B6 (pl)
DE (1) DE60113512T2 (pl)
DK (1) DK1263936T3 (pl)
EE (1) EE05633B1 (pl)
ES (1) ES2249430T3 (pl)
HK (1) HK1052725B (pl)
HU (1) HU228691B1 (pl)
IL (3) IL150736A0 (pl)
MX (1) MXPA02008873A (pl)
NO (1) NO20024246L (pl)
NZ (1) NZ521270A (pl)
PL (1) PL205922B1 (pl)
RU (1) RU2280075C2 (pl)
SI (1) SI1263936T1 (pl)
UA (1) UA84388C2 (pl)
WO (1) WO2001068820A1 (pl)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ524661A (en) 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
US7445924B2 (en) 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
US7097842B2 (en) 2000-11-23 2006-08-29 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
US7628980B2 (en) 2000-11-23 2009-12-08 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
EP1357127A1 (de) * 2002-04-10 2003-10-29 Immusystems GmbH CD4+ T-Lymphozyten spezifische Hepatitis C Virus-Epitope
EP1839672A3 (en) * 2002-04-19 2007-11-21 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus Ankara for the vaccination of neonates
EA007811B1 (ru) * 2002-05-16 2007-02-27 Бавариан Нордик А/С Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
KR101044538B1 (ko) * 2002-09-05 2011-06-27 버베리안 노딕 에이/에스 무혈청 조건하에서 일차세포의 배양 및 바이러스의 증식방법
JP5052893B2 (ja) 2003-02-20 2012-10-17 アメリカ合衆国 ポックスベクターにおける新規の挿入部位
EP1518932A1 (en) * 2003-09-29 2005-03-30 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof
US7423155B2 (en) 2003-11-14 2008-09-09 3M Innovative Properties Company N-sulfonyldicarboximide containing tethering compounds
DK1536015T3 (da) * 2003-11-24 2008-02-18 Bavarian Nordic As Promotorer til ekspression i modificeret vacciniavirus Ankara
DE102004003572A1 (de) * 2004-01-23 2005-08-18 Bavarian Nordic A/S Monoparamunitätsinducer basierend auf attenuierten Myxomaviren des Kaninchens
WO2006113927A2 (en) * 2005-04-20 2006-10-26 University Of Washington Immunogenic vaccinia peptides and methods of using same
EP1835031A1 (en) 2006-03-14 2007-09-19 Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe Use of a recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) for the treatment of type I hypersensitivity in a living animal including humans
US7607323B1 (en) 2007-10-16 2009-10-27 Hall Charles F Curl resistant shirt collar and method of fabricating same
US8691502B2 (en) 2008-10-31 2014-04-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
US9005632B2 (en) 2009-11-20 2015-04-14 Takeda Vaccines, Inc. Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs against influenza virus subtypes or strains
EP2501405A4 (en) * 2009-11-20 2013-12-04 Inviragen Inc COMPOSITION, METHOD, AND USES OF POX VIRUS ELEMENTS IN VACCINATE CONSTRUCTS
US20110159031A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Baxter International Inc. Vaccine to Influenza A Virus
WO2012151272A2 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
WO2015077717A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status
WO2015085147A1 (en) 2013-12-05 2015-06-11 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
CA2934073A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 The Broad Institute, Inc. Combination therapy with neoantigen vaccine
WO2015138471A1 (en) * 2014-03-10 2015-09-17 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Heat inactivated poxvirus improves vaccination results
EP3234193B1 (en) 2014-12-19 2020-07-15 Massachusetts Institute of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
EP3757211A1 (en) 2014-12-19 2020-12-30 The Broad Institute, Inc. Methods for profiling the t-cell-receptor repertoire
NL2014148B1 (en) 2015-01-16 2017-01-05 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Combination vaccine for camelids.
CA2977660A1 (en) * 2015-02-25 2016-09-15 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Use of inactivated nonreplicating modified vaccinia virus ankara (mva) as monoimmunotherapy or in combination with immune checkpoint blocking agents for solid tumors
RU2020132040A (ru) 2015-05-20 2020-10-12 Те Брод Инститьют Инк. Общие неоантигены
TW202241500A (zh) 2015-06-09 2022-11-01 美商博德研究所有限公司 用於贅瘤疫苗之調配物及其製備方法
FR3042121A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-14 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
WO2017184590A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 The Broad Institute Inc. Improved hla epitope prediction
WO2018140391A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
US11306292B2 (en) 2017-05-15 2022-04-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
WO2018211419A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
JP7320601B2 (ja) 2018-09-11 2023-08-03 上▲海▼市公共▲衛▼生▲臨▼床中心 広域スペクトルな抗インフルエンザワクチン免疫原及びその使用
WO2020072700A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hla single allele lines
US20220062394A1 (en) 2018-12-17 2022-03-03 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
IL308018A (en) 2021-04-30 2023-12-01 Kalivir Immunotherapeutics Inc Oncolytic viruses for different MHC expression
WO2023077147A2 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Pellis Therapeutics, Inc. T-cell vaccines for patients with reduced humoral immunity
WO2023220283A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Pellis Therapeutics, Inc. Poxvirus adjuvant for t-cell vaccination
WO2024015892A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 The Broad Institute, Inc. Hla-ii immunopeptidome methods and systems for antigen discovery

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341245C (en) * 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
DE4405841C1 (de) * 1994-02-23 1995-01-05 Mayr Anton Prof Dr Med Vet Dr Multipotente Paramunitätsinducer auf der Basis von Kombinationen von Pockenviruskomponenten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
UA68327C2 (en) * 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
WO1999018994A1 (fr) * 1997-10-15 1999-04-22 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Procede pour conserver la qualite d'une solution parenterale aqueuse de thrombomoduline pour l'entreposage ou la distribution

Also Published As

Publication number Publication date
BR0109158A (pt) 2003-04-22
DE60113512D1 (de) 2006-02-02
HK1052725A1 (en) 2003-09-26
IL188667A0 (en) 2008-04-13
IL188667A (en) 2011-09-27
RU2280075C2 (ru) 2006-07-20
EE200200507A (et) 2004-02-16
NZ521270A (en) 2003-06-30
PL357378A1 (pl) 2004-07-26
EP1263936A1 (en) 2002-12-11
CN1418248A (zh) 2003-05-14
DE60113512T2 (de) 2006-06-22
JP4759201B2 (ja) 2011-08-31
RU2002124622A (ru) 2004-03-27
MXPA02008873A (es) 2003-02-10
AU780696B2 (en) 2005-04-14
WO2001068820A1 (en) 2001-09-20
KR100880765B1 (ko) 2009-02-02
CA2397675A1 (en) 2001-09-20
IL150736A0 (en) 2003-02-12
ATE305030T1 (de) 2005-10-15
EP1263936B1 (en) 2005-09-21
HUP0300120A3 (en) 2010-01-28
AU5826901A (en) 2001-09-24
HUP0300120A2 (en) 2003-05-28
UA84388C2 (ru) 2008-10-27
CZ293690B6 (cs) 2004-07-14
CA2397675C (en) 2012-11-13
HK1052725B (zh) 2007-03-23
US20030013190A1 (en) 2003-01-16
EE05633B1 (et) 2013-02-15
US6682743B2 (en) 2004-01-27
ES2249430T3 (es) 2006-04-01
SI1263936T1 (sl) 2006-06-30
KR20030032928A (ko) 2003-04-26
NO20024246D0 (no) 2002-09-05
DK1263936T3 (da) 2006-02-13
HU228691B1 (en) 2013-05-28
JP2003526362A (ja) 2003-09-09
CN1291012C (zh) 2006-12-20
IL150736A (en) 2008-06-05
NO20024246L (no) 2002-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL205922B1 (pl) Zmodyfikowany wirus Ankara (MVA), zakażona nim komórka gospodarza, jego zastosowania, kompozycja farmaceutyczna i sposoby otrzymywania wirusa oraz sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu i/lub polipeptydu
Steinhoff et al. Antiviral protection by vesicular stomatitis virus-specific antibodies in alpha/beta interferon receptor-deficient mice
JP5690214B2 (ja) 新生仔予防接種用変異ワクシニアウイルスアンカラ
CN105251000B (zh) 猪伪狂犬病病毒疫苗组合物及其制备方法和应用
JP2017526737A (ja) 組み換え血清型９トリアデノウイルスベクター形式でのワクチン
Sureau Rabies vaccine production in animal cell cultures
KR20210055668A (ko) 부유세포 배양에 적응된 O/ME-SA/Ind-2001 유전형 구제역 바이러스 백신주 및 이의 제조방법
EP0485463B1 (en) Attenuated canine parvovirus (cpv), vaccine comprising cpv and method of preventing infection by cpv in dogs
JP4549530B2 (ja) ワクチン剤
JP2004528833A (ja) レポリポックスベースのベクターワクチン
KR20210082306A (ko) 지카바이러스 재조합 서브유닛 백신의 개발 및 이의 제조방법
US6773710B2 (en) Recombinant canine distemper virus vaccine against canine distemper and leishmaniasis
US8986711B2 (en) Vaccine to protect animals against leishmania
EP1371375B1 (en) Vaccine to protect animals against leishmania
Aseginolaza González et al. Vaccine to protect animals against leishmania

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140310