CEPA ALTERADA DEL VIRUS DE VACCINIA ANKARA MODIFICADO (MVA) La presente invención se refiere a dos nuevas cepas del virus de Vaccinia Ankara modificado (MVA) que tiene una virulencia fuertemente reducida para la mayoría de los mamíferos, particularmente humanos, pero que no obstante crece en células de una línea continua de células aprobada para la producción de agentes terapéuticos tales como una vacuna. La invención se refiere también a un método para producir las cepas adaptadas de MVA mencionadas. El MVA puede usarse, por ejemplo, para inmunización parenteral, como sistema de vector, o en forma activa o desactivada como auxiliar o como regulador de los componentes no específicos del sistema inmunológico . Fondo de la invención Un organismo está siendo retado constantemente por agentes infecciosos como bacterias, virus, fungos o parásitos. El sistema inmunológico protege al organismo de infecciones permanentes causadas por estos agentes mediante la destrucción y eliminación de estos agentes infecciosos y de cualquier molécula tóxica producida por ellos. El sistema inmunológico puede dividirse en una parte específica y una parte no específica, no obstante ambas partes están entrelazadas estrechamente. La respuesta inmunológica - o específica hace posible una defensa inmediata contra una amplia gama de substancias ajenas y
agentes infecciosos. En contraste, la respuesta inmunologica especifica se levanta después de una fase de retraso, cuando el organismo es retado con una substancia por primera vez. Sin embargo, la respuesta inmunologica especifica es altamente eficiente. La respuesta inmunologica especifica es responsable del hecho que un individuo que se recupera de una infección especifica es protegido contra esa infección especifica pero aún vulnerable a otras enfermedades infecciosas. En general, una segunda infección con el mismo agente infeccioso o uno muy similar causa síntomas mucho más ligeras o ningún síntoma en absoluto. La inmunidad persiste durante un largo período, en algunos casos por toda la vida. Esta memoria inmunologica se usa para vacunación, donde el organismo es retado mediante un agente inofensivo o una forma desactivada de el, para inducir una inmunidad específica. A veces auxiliares se incorporan a la vacuna para mejorar la respuesta inmunologica específica. Una gran parte del conocimiento acerca de enfermedades infecciosas e inmunidad es contribuido por estudios de la viruela. Esta enfermedad es causada por el virus varióla, un miembro de la especie de los virus Orthopox. Hace casi dos siglos se inició la inoculación preventiva con la viruela vacuna dando como resultado la inmunización contra la viruela. Inmunización posterior se
llevó a cabo con el virus de Vaccinia. A principios de los años 1950, muchos países industrializados habían eliminado la viruela endémica usando vacunación con el virus de Vaccinia. Sin embargo, la vacunación contra la viruela con este virus de Vaccinia provocó ocasionalmente serias complicaciones, tales como encefalitis posvacunal, Vaccinia generalizada o infección de contacto. Una nueva vacuna que no muestra estas complicaciones fue desarrollada por Antón Mayr. La vacuna de pox consiste en el Virus de Vaccinia Ankara modificado (MVA) con poxvirus y se usó para vacunación parenteral contra la viruela en aproximadamente 150 000 vacunaciones sin causar complicación alguna relacionada con la vacunación. Ni siquiera niños con deficiencias inmunológicas mostraron efectos colaterales serios. El MVA se obtuvo por mutación y selección de virus de vaccinia Ankara original después de 575 pasajes en cultivos fibroblast de embriones de pollo. La seguridad de este MVA se refleja en características biológicas, químicas y físicas. MVA tiene un peso molecular reducido, seis supresiones en el genoma, y es altamente atenuado para células de mamífero, es decir, se sintetiza el ADN y las proteínas, pero virtualmente ninguna partícula viral es producida. El virus de vaccinia Ankara modificado desarrollado por Antón Mayr se depositó en la Colección
Europea de Cultivos Celulares (ECACC) , Salisbury, Reino Unido, bajo el número de depósito V94012707. La vacunación contra viruela era altamente exitosa. En 1979, la Organización Mundial de Salud declaró la erradicación de la viruela. Consecuentemente, la vacunación masiva de niños se descontinuó y solamente se vacunaron trabajadores de laboratorio y miembros de las fuerzas armadas de algunos países. Con la erradicación de la viruela, se eliminó la causa predominante de infecciones con pox en los humanos. Sin embargo, algunos poxvirus no humanos tienen una especifidad de huésped reducida, es decir, pueden causar infecciones no solamente en su huésped típico (por ejemplo la vaca para la vaccinia) , sino también en otros animales. Como una partes de la población ya no son inmunes contra la viruela, infecciones con orthopox de especies animales pueden ser peligrosas para ellas. Animales domésticos son la fuente principal de infecciones para los humanos. Consecuentemente, la vacunación de animales domésticos contra virus orthopox es de importancia creciente. Adicionalmente, el MVA puede ser de importancia como vector para la terapia genética, es decir, para transferir secuencias de ácido nucleico a células meta donde se expresan . Para una reproducción logarítmica del MVA, se
requieren cultivos de células de fibroblastos primarios o secundarios de embriones de pollo. Las células se obtienen de huevo de pollo incubados por 10 a 12 días. Como los huevos están sujetos a variabilidad biológica, las células obtenidas para el sistema de cultivo celular son variables a un nivel celular también. En adición, en un "cultivo de fibroblasto" de embriones de pollo, muchas veces se encuentran otros tipos de células tales como células epitélicas. Esta variación de las células da como resultado una variación en los virus producidos en los fibroblastos de embriones de pollo. Por lo tanto es difícil estandarizar y validar un sistema de cultivo celular para garantizar una calidad constantemente alta del MVA producido. Además, no se puede excluir completamente la contaminación de un sistema de cultivo celular con microorganismos o virus ya presentes en el huevo incubado. Cuando el MVA se cultiva un células contaminadas con virus, el MVA puede recombinarse con el virus contaminante. De esta forma se puede generar un MVA con características nuevas e impredecibles . Para la producción de virus a gran escala en un cultivo de suspensión, fibroblastos primarios o secundarios de embriones de pollo tampoco son altamente adecuados. Adicionalmente, la purificación y concentración de MVA por ultra-centrifugación de gradientes sería ventajosa. Sin embargo, tal purificación es difícil, cuando MVA se cultiva
en fibroblastos primarios o secundarios de embriones de pollo. Finalmente, una cantidad creciente de pacientes han desarrollado alergias contra albumen de huevo de pollo. Aún cuando condiciones in vítro de la cultivación reducen el potencial alérgico fuertemente, el riesgo de una reacción alérgica con puede excluirse completamente. En suma, por un lado puede cultivarse el MVA de forma eficiente solamente en fibroblastos primarios o secundarios de embriones de pollo, causando una serie de desventajas, sin embargo, por el otro lado, la aplicación segura del MVA en humanos se ha mostrado mediante su aplicación a gran escala como vacuna. Objetivo de la invención Es un objetivo de la presente invención ofrecer condiciones para la producción homogénea de partículas de virus de MVA. Adicionalmente, las condiciones mencionadas debería permitir una producción sencilla y en gran escala de MVA. Descripción detallada de la invención Para lograr lo precedente y otros objetivos, la invención ofrece una cepa de MVA que es adaptada para el cultivo en células de una línea continua de células, siendo que la línea de células mencionada es aprobada para la producción de un agente terapéutico. De conformidad con la presente invención, por vez
primera se hace posible una producción eficiente y a gran escala de MVA. Ya que células de una linea continua de células son homogéneas y sus características estables, el rendimiento de MVA de esas líneas de células también es homogénea con características altamente predecibles. Adicionalmente, el riesgo de contaminación con microorganismos puede controlarse y la contaminación de la preparación de MVA con proteínas del huevo de pollo - como se encuentra cuando se cultiva MVA en fibroblastos de embrión de pollo - puede excluirse. El manejo de una línea permanente de células es conveniente y de tal forma altamente ventajoso para la aplicación industrial. En una materialización preferida de la invención, el MVA se adapta para el cultivo en células de una línea de células mamarias, que es aprobada para la producción de una vacuna. Se ha encontrado de manera sorpresiva que el MVA adaptado a una línea de células mamarias tal como la célula Vero aún tiene una virulencia reducida para los humanos y también para una gama amplia de otros mamíferos. Consecuentemente, el MVA es altamente atenuado, es decir, se sintetiza ADN y proteína pero virtualmente ninguna partícula de virus de produce, dando como resultado una capacidad virtualmente eliminada de causar la enfermedad. Por lo tanto, MVA de conformidad con la presente invención también es altamente ventajoso como una vacuna para humanos
y una gama amplia de mamíferos. Consecuentemente, el MVA es aplicable particularmente en el campo veterinario. Además se ofrece un método para obtener una cepa de MVA de conformidad con la presente invención. De conformidad con la materialización de la invención, células de una línea de células que está aprobada para la producción de una substancia terapéutica, son infectadas con un tipo salvaje de MVA. Preferentemente se usa una multitud de infecciones (MOI), es decir se usa una alta cantidad de virus por célula para esta infección. Posteriormente, los virus se recolectan y nuevas células de la misma línea de células se infectan con los virus recién producidos. El procedimiento mencionado se repite (pasaje en serie) , hasta que el MVA se ha adaptado a la línea de células mencionada. Se alcanza adaptación, cuando a las 72 horas después de la infección, el nivel de anticuerpos de virus es por lo menos 1 a 9 veces, preferiblemente 10 a 99 veces, más preferiblemente 100 a 106 veces, y aún más preferible más de 107 a 1010 veces incrementada comparada con el nivel de anticuerpos de virus de entrada. Se alcanza al adaptación después de una cantidad de pasajes limitada. "Adaptado para crecimiento" quiere decir que la cantidad de virus producida de una infección (salida) es mayor comparada con la cantidad de virus usada originalmente para infectar las células (entrada) . En este
caso la proporción de salida/entrada es mayor que 1. "Derivado" del MVA depositado en ECACC, Salisbury, Reino Unido, bajo número de depósito 99101431 y/o número de acceso provisional 01021411 denota un MVA que es adaptado para crecimiento en células Vero a una razón que es esencialmente la misma razón de crecimiento de la cepa depositada, pero que lleva por lo menos una diferencia en su genoma en comparación con la cepa depositada. El término "sistema inmunológico" describe básicamente un complejo involucrado en la defensa del organismo contra substancias foráneas y microorganismos. Se divide en una parte celular comprendiendo varios tipos de célula, tales como por ejemplo, linfocitos y otras células derivadas de células blancas de la sangre, y una parte humoral comprendiendo péptidos y proteínas tales como anticuerpos, factores de complemento y citoquinas . El término "respuesta inmunológica" describe la reacción del sistema inmunológico cuando una substancia foránea o un microorganismo entra el organismo. Generalmente, la respuesta inmunológica se divide en una reacción específica y una inespecí fica, no obstante que ambos están estrechamente entrelazadas. La respuesta inmunológica inespecífica es considerada como la defensa inmediata contra una amplia variedad de substancias foráneas y agentes infecciosos. La respuesta inmunológica
especifica puede caracterizarse como un mecanismo de defensa altamente eficiente del organismo contra una substancia foránea que se genera contra la substancia mencionada después de una fase de retraso y que es altamente especifico para la substancia mencionada. La respuesta inmunológica especifica es responsable del fenómeno que un individuo que se ha recuperado de una infección especifica es protegido contra esta infección especifica en el futuro. "Activador del sistema inmunológico" denota cualquier substancia capaz de provocar o mejorar una respuesta inmunológica. "Supresor del sistema inmunológico" denota cualquier substancia capaz de reducir o inhibir una respuesta inmunológica. "Estabilizador del sistema inmunológico" denota cualquier substancia capaz de mantener la respuesta inmunológica en un nivel constante. Los inventores ofrecen dos cepas de MVA preferidas que están adaptadas a una linea de células del mono verde africano, llamada linea de células Vero (ATCC No. CCL-81). La cepa de MVA, que se ha pasado 100 veces en células Vero se llamó "Vero-MVA" y se depositó en la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino Unido, bajo el número de depósito 99101431. La cepa de MVA
después de 200 pasajes en células Vero se llamó "Vero-MVA-200" y se depositó en ECACC bajo el número de acceso provisional 01021411. El MVA obtenido de conformidad a lo precedentemente descrito se amplía más mediante cultivación de las células de la línea de células aprobada bajo condiciones adecuadas, infectando células con MVA y recolectando las partículas virales producidas por dichas células. Por lo tanto, el MVA puede ser ampliado de forma eficiente y fácil a gran escala. Sorprendentemente, el MVA de la invención no muestra una virulencia incrementada en células diferentes a células Vero, tales como líneas de células humanas, incluyendo HL, HEP-2 o HeLA. En otra materialización de la invención, el MVA contiene por lo menos una secuencia heterológica de ácido nucleico, es decir, una secuencia de ácido nucleico que no se encuentra naturalmente en el genoma del MVA (MVA recombinante) . Preferentemente, la secuencia heterológica de ácido nucleico es un gen, más preferiblemente un gen que codifica una proteína de inmunización, y la más preferida codifica una proteína de inmunización contra malaria, hidrofobia y/o hepatitis. La expresión de la secuencia heterológica de ácido nucleico mencionada es preferiblemente bajo el control transcripcional de un promotor de virus de vaccinia, más preferiblemente de un
promotor propio del MVA. En otra materialización preferida de la invención, la secuencia heterológica de ácido nucleico se inserta en un sitio de supresión que ocurre naturalmente en el genoma del MVA (manifestado en PCT/EP96/02926) . El MVA recombinante se usa para la introducción de una secuencia de ácido nucleico en una célula meta, siendo que la secuencia de ácido nucleico mencionada es homologa o heterologa a la célula meta. La introducción de una secuencia de ácido nucleico heterologa en una célula meta puede usarse para producir ácido nucleicos heterólogos, péptidos y/o polipéptidos y/o proteínas codificados por la secuencia de ácido nucleico in vitro. Este método comprende la infección de células huésped con MVA recombinante, el cultivo de la célula huésped infectada bajo condiciones adecuadas y opcionalmente el aislamiento y/o enriquecimiento del péptido y/o de la proteína producidos por la célula huésped mencionada. Adicionalmente, la introducción de una secuencia homologa o heterologa puede aplicarse a la terapia genética in vitro y preferiblemente in vivo. Para terapia genética in vitro y ex vivo respectivamente, las células se aislan del individuo por ser tratado, se transforman con MVA recombinante y se reintroducen al individuo del cual las células se habían tomado. Para terapia genética in vivo, el
MVA recombinante se administra directamente al cuerpo viviente del animal incluyendo el cuerpo humano. En una materialización preferida de la invención, el MVA recombinante expresa un antigén o un epitope antigénico. De forma más preferida, el vector mencionado expresa un determinante antigénico de Plasmodium falciparum, Mycobacteria, virus de herpes, virus de influenza, hepatitis, o el virus de inmunodeficiencia humana. Ya el MVA de conformidad con esta invención es -sorprendentemente - aún altamente atenuado, el MVA es ideal para inmunizar una gama amplia de mamíferos incluyendo humanos. Consecuentemente, la presente invención ofrece también una vacuna comprendiendo el MVA para la inmunización del cuerpo animal viviente incluyendo una humano, contra infecciones de pox, preferentemente de orthopox. La vacuna puede contener adicionalmente al MVA uno o más aditivos tales como un antibiótico, un conservador, o un estabilizador. La vacuna se puede aplicar particularmente en el campo veterinario, por ejemplo, para la inmunización de animales contra infecciones de orthopox tales como gatos contra la viruela de gatos, ratones contra ectromelia o camellos contra la viruela de camellos. La inmunización se hace preferentemente de manera parenteral. El efecto de inmunización de un determinante antigénico en una vacuna se mejora muchas veces adicionando
un asi llamado auxiliar. Un auxiliar co-estimula el sistema inmunológica de una manera inespecifica provocando una reacción inmunológica especifica más fuerte contra el determinante antigénico de la vacuna. De conformidad con otra materialización de la invección, el MVA se usa como un auxiliar para co-estimular la respuesta inmunológica contra el determinante antigénico de la vacuna. En este caso es preferido que el MVA es desactivado. La desactivación del MVA puede efectuarse, por ejemplo, mediante calor o substancias químicas. Preferentemente, el MVA se desactiva por ß-propiolactona . De conformidad con esta materialización de la invención, el MVA desactivado puede añadirse a la vacuna contra numerosas enfermedades infecciosas para incrementar la inmunidad contra esa enfermedad. En el caso de una infección, el sistema inmunológico, nervioso, hormonal y vascular de un individuo colaboran de manera estrecha. Estas interacciones pueden regularse mediante elementos del sistema inmunológico inespecífico, por ejemplo, citoquinas tales como interferones y interleucinas . Los pox-virus pueden influenciar la regulación del sistema inmunológico (Swiss Vet 11/99, 13-17). A consecuencia, en una materialización más de la invención, el MVA y preferiblemente el MVA desactivado se usa en mamíferos incluyendo humanos para
regular los elementos celulares y humorales del sistema inmune (innato) inespecifico . Preferentemente se usa el MVA como bioregulador, siendo que disfunciones del sistema inmunológico se eliminan y las defensas propias de cuerpo se activan, estabilizan y/o suprimen. De manera más preferida, el MVA se usa como bioregulador en el caso de una infección viral con, por ejemplo, herpes, virus de hepatitis B o C, en el caso de una enfermedad de inflamación crónica y/o para apoyar terapia tumoral. El MVA puede usarse también para estabilizar el sistema inmunológico en una situación de susceptibilidad incrementada a infecciones como en el caso de stress o en recién nacidos. El MVA activo o preferiblemente desactivado puede aplicarse sistemáticamente, por ejemplo, de manera intramuscular y/o local, por ejemplo, a través de membranas mucosas y/o la piel. En conclusión, la invención presente ofrece cepas de MVA que pueden usarse en general para las mismas aplicaciones que el tipo salvaje de MVA, pero elimina los problemas causados por la amplificación del MVA de tipo salvaje en fibroblastos de embrión de pollo. Resumen de la invención La invención, entre otros, comprende lo siguiente, solo o en combinación: Un virus de vaccinia Ankara modificado (MVA)
adaptado para el crecimiento en células de una línea de células continua, siendo que la línea de células mencionada está aprobada para la producción de una substancia terapéutica . El MVA de conformidad a lo precedente para cultivación en células de una línea de células de mamíferos . El MVA de conformidad a lo precedente, siendo que la línea de células está aprobada para la producción de una vacuna. El MVA de conformidad a lo precedente, siendo que la línea de células aprobada es una línea de células Vero. El MVA de conformidad a lo precedente, siendo que la linea de células aprobada es la línea de células Vero ATCC No. CCL-81. El MVA de conformidad a lo precedente, depositado en la Colección Europea de Cultivos de Células, Salisbury, Reino Unido bajo No. de depósito 99101431 y/o sus derivados . El MVA de conformidad a lo precedente, depositado en la ECACC, Salisbury, Reino Unido, bajo el número de acceso provisional 01021411 y/o sus derivados. El MVA de conformidad a lo precedente, comprendiendo por lo menos una secuencia de ácido nucleico heteróloga.
El MVA de conformidad a lo precedente comprendiendo una secuencia de ácido nucleico heteróloga codificando, por ejemplo, para una proteina terapéutica y/o un determinante antigénico tal como un péptido inmunizando contra infección con malaria, hepatitis y/o hidrofobia. Una célula huésped infectada por el MVA descrito precedentemente . Una composición, preferentemente una composición farmacéutica, comprendiendo el MVA descrito precedentemente y/o el ADN del MVA . La composición farmacéutica de conformidad a lo precedentemente descrito, siendo que la composición farmacéutica es una vacuna. La vacuna precedentemente descrita para la inmunización de un cuerpo de animal vivo incluyendo un humano . La vacuna de conformidad a lo precedente para la inmunización contra una infección con orthopox. La vacuna de conformidad a lo precedente para la inmunización de gatos contra la infección con viruela de gato, ratones contra infección con ectromelia y/o camellos contra infección con viruela de camellos. La composición farmacéutica de conformidad a lo precedentemente descrito, siendo que el MVA es un activador, supresor y/o estabilizador del sistema
inmunológico inespecífico . Una composición farmacéutica comprendiendo el MVA descrito precedentemente y/o el ADN del MVA como un auxiliar . Una composición farmacéutica comprendiendo el MVA recombinante precedentemente descrito y/o el ADN del MVA recombinante . La composición farmacéutica de conformidad a lo precedentemente descrito para el uso en terapia genética. Un método para introducir una secuencia homologa y/o heteróloga de ácido nucleico en una célula meta comprendiendo la infección de la célula meta con el MVA precedentemente descrito. Un método para obtener una cepa de MVA de conformidad a lo precedentemente descrito, comprendiendo a) la infección de células de una linea aprobada de células con un MVA de tipo salvaje, preferentemente el MVA depositado en ECACC bajo el No. de depósito V94012707, b) recolectar los virus, c) la infección de células nuevas de la misma linea de células con los virus recién producidos, y, opcionalmente, d) repetición de b) y c) hasta que el virus está adaptado al cultivo en las células de la linea de células mencionada. Un método para la producción de partículas virales del MVA precedentemente descrito, comprendiendo la
cultivación de las células de una línea de células aprobada bajo condiciones adecuadas, infectando la línea de células mencionada con el MVA mencionado, y recolectando las partículas virales producidas por las células mencionadas. El método de conformidad con lo precedentemente descrito, siendo que la línea de células mencionada se infecta con el MVA depositado en ECACC bajo el No. de depósito 99101431 y/o el MVA depositado en ECACC bajo el número de acceso provisional 01021411 o un derivado de uno de estas sepas. Un método para producir una secuencia de ácido nucleico, un péptido polipéptido y/o una proteína, comprendiendo la infección de una célula huésped con el MVA recombinante precedentemente descrito, la cultivación de la célula de huésped infectada bajo condiciones adecuadas, y, opcionalmente, aislamiento y/o enriquecimiento de la secuencia de ácido nucleico, péptido y/o proteína producidos por la célula huésped mencionada. Uso del MVA descrito precedentemente para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o un trastorno sensible al MVA mencionado. Uso del MVA precedentemente descrito para la producción de una vacuna para la inmunización de un cuerpo de animal vivo incluyendo un humano.
Uso del MVA descrito precedentemente para la producción de un activador, supresor y/o estabilizador del sistema inmunologico inespecifico . El uso de conformidad a los precedentemente descrito para la fabricación de un auxiliar. Uso del MVA descrito precedentemente como una vacuna . uso del MVA descrito precedentemente como un auxiliar . Uso del MVA descrito precedentemente como un activador, supresor y/o estabilizador del sistema inmunologico inespecifico . Un método para la inmunización de un cuerpo de animal vivo incluyendo un humano, siendo que el método mencionado comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica precedentemente descrita a una persona que lo requiere. Un método para introducir una secuencia de ácido nucleico a una célula meta comprendiendo infectar la célula meta con el MVA precedentemente descrito y/o el ADN del MVA. Un método para la activación, supresión y/o estabilización del sistema inmunologico de un cuerpo de animal vivo incluyendo un humano, siendo que el método mencionado comprende la administración de la composición
farmacéutica precedentemente descrita a un cuerpo de animal vivo incluyendo un humano. ün método para mejorar la respuesta inmunológica especifica contra un determinante antigénico en una vacuna, comprendiendo la administración del MVA precedentemente descrito como un auxiliar a un cuerpo de animal vivo incluyendo un humano. Un virus Vaccinia Ankara modificado adaptado para cultivo en células de una linea de células continua mediante un procedimiento comprendiendo los siguientes pasos: infectar células de una linea de células estando aprobada para la producción de una substancia terapéutica, recolectar las partículas virales producidas por las líneas de células mencionadas y opcionalmente, repetir los pasos precedentes hasta obtener las características de crecimiento deseadas del MVA mencionado en las células mencionadas . Ejemplos Los siguientes ejemplos ilustrarán la presente invención más de cerca. Será bien comprendido para una persona experta en el estado de la técnica que los ejemplos ofrecidos de ninguna manera pueden interpretarse de una manera que limita la aplicabilidad de la tecnología ofrecida por la presente invención a estos ejemplos. Ejemplo 1: Adaptación del MVA a células Vero y
caracterización de la cepa MVA mencionada 1. Adaptación del MVA a células Vero El MVA de tipo salvaje desarrollado por Antón Mayr que es un virus de Vaccinia Ankara modificado se depositó en ECACC bajo el N. de depósito V 94012707. El MVA de tipo salvaje fue adaptado para crecimiento en células Vero mediante pasaje en serie en virus en células vero (tabla 1) . El clon de célula ATCC-No. CCL-81 de la linea de células Vero estacionaria (WHO depósito de siembra ECACC No. 88020401) se usó en los pasajes No. 148 a 165 (WHO lote de siembra, banco maestro y de trabajo) . Las células se propagaron en un medio consistiendo de MEM de Eearle (ICN), pH 7.4 - 7.6 y 5% del sustituto de suero BMS (Biochrom) . De conformidad con una técnica conocida a la gente experta en el estado de la técnica, siempre se sembraron las mismas células del banco de trabajo dividiendo las células 1:2 a 1:4. El medio contenia aproximadamente 250 000 células por mi. Las células se propagaron respectivamente en tubos (2ml) , platos Roux (100ml) y platos de plástico ( 6 y 40ml respectivamente). En general, las células formaron una capa cofluyente simple después de 16 a 24h. Posteriormente, el medio se reemplazó por MEM de Earle simple sin aditivos algunos. Para la adaptación del MVA de tipo salvaje se usó un sistema de cultura de tubo. El resultado de los pasajes
se resume en las tablas 1 y 2. Las células Vero se infectaron con 10 MOI (multiplicidad de infección) del VA de tipo salvaje, es decir en promedio, 10 partículas virales por cada célula Vero. El MVA de tipo salvaje para empezar era un MVA genéticamente homogéneo, purificado de placa después de 575 pasajes en fibroblastos de embrión de pollo (nivel de anticuerpos: 107"75 KID5o/ml) . Después de 24h, 90% de las células Vero de la capa confluyente sencilla estaban destruidas por procesos tóxicos (50% por toxicidad, 40% por descomposición) . El medio más el dedritus de las células después de congelamiento y descongelación de las células, conteniendo los virus producidos, se recolectó y 0.2ml de esta mezcla se sembró en la capa sencilla de células Vero en el tubo de cultivo (2° pasaje). Este procedimiento se repitió 200 veces. Después del tercer pasaje, ya no se observó efecto tóxico alguno, mientras se vio un efecto ligeramente citopático (CPE) caracterizado por la redondez de las células y descomposición en un período de 4 a 6 días posterior a la infección (p.inf.). El nivel de anticuerpos de virus era 101'0 KIDso/ml. Se concluyó que la proliferación del MVA en células Vero había iniciado, sin embargo, de manera muy ineficiente. Después del quinto pasaje, un CPE típico se observó que se completó después de 4 o 5 días p.inf. El nivel de anticuerpos del virus incrementó de 101'0 KIDso/ml
después del tercer pasaje a 104-0 KID50/ml después del quinto pasaje. Por lo tanto, el virus se amplió de manera más eficiente en las células Vero. En los pasajes 5 a 11, un completo CPE se observó más y más temprano y el nivel de anticuerpos del virus incrementó en cada pasaje. En el pasaje 11 se alcanzó un nivel estable a 107'5 KID50/ml. Consecuentemente, después de once pasajes la adaptación del MVA a las células Vero se había logrado. En los siguientes 30 pasajes adicionales, el resultado era el mismo para todos los pasajes y altamente reproducible : El CPE inició ya 24h p.inf. y todas las células estaban afectadas después de tres días p.inf. En ese momento, 20% de las células Vero estaban redondas y 80% estaban descompuestos. Después de 3 días p.inf., el nivel de anticuerpos de virus era siempre alrededor de 107"75 KID50/ml. Después del pasaje décimo quinto, los virus se recolectaron siempre después de dos o tres días p.inf., y se usó solamente 1 MOI en lugar de 10 para infectar las células (tabla 2) . En los pasajes siguientes adicionales las características de crecimiento del MVA cambiaron solamente de forma ligera. Notablemente, el nivel de anticuerpos óptima del virus incrementó más y alcanzó 1010 KIDso/ml en el pasaje 200. En conclusión, el virus crece reproduciblemente de forma exponencial en células Vero. La característica de crecimiento mencionada es sorprendentemente diferente de
las características del MVA de tipo salvaje. Consecuentemente, una nueva cepa del MVA se obtuvo mediante los pasajes en serie. La nueva cepa mencionada se llamó "Vero-MVA" y después del pasaje 200 en células de vero "Vero-MVA-200". Los Vero-MVA y Vero-MVA-200 se cultivaron en cantidades mayores. Para almacenaje, el Vero-MVA se concentró mediante centrifugación, se resuspendió en 2.5% poligelina y se liofilizó en frascos de 2ml . El nivel de anticuerpos después de la liofilación aún era de por lo menos 108'5 KID50/ml. Los Vero-MVA y Vero-MVA-200 liofilizados se verificaron respecto a contaminación y toxicidad y se almacenaron a +4°C. 2. Caracterización de las propiedades biológicas del Vero-MVA Las características biológicas de Vero-MVA
(pasaje 100) y Vero-MVA-200 (pasaje 200) se compararon con las características del MVA de tipo salvaje (tabla 3 y tabla 5) . Para esto se aplicaron las técnicas conocidos por los profesionistas expertos. Los inventores mostraron que no se cambiaron ni la gama de huésped del virus, con excepción de las células de vero, ni se incrementó la virulencia para humanos o animales. El Vero-MVA se caracteriza aún por la propagación abortiva en células huésped no admitidas. La identidad principal de las partículas virales
del Vero-MVA en comparación con las partículas virales de la cepa Elstree del virus de vaccinia se mostró por reactividad cruzada de anticuerpos generados contra la cepa Elstree. La cepa Elstree es una cepa de vaccinia recomendada por la WHO para la vacunación de viruela. El suero policlonal hiperinmune de conejos generada contra la cepa Elstree se adicionó al Vero-MVA. 100 KID50/ml del Vero MVA se neutralizaron completamente en una dilusión del suero de 1:512. Una dilusión doble de suero era necesaria para neutralizar la misma cantidad de la cepa de vaccinia Elstree (1:256). Consecuentemente, el Vero-MVA todavía puede neutralizarse eficientemente con el suero inmune de vaccinia . El Ver-MVA, el Vero.MVA-200 y el MVA de tipo salvaje se compararon con un número de ensayos adicionales según se indica en las tablas 3, 4 y 5. Los inventores mostraron que la virulencia del Vero-MVA y Vero-MVA-200 para mamíferos incluyendo humanos no se incrementó en comparación con el MVA de tipo salvaje. Se mostró además que el Vero-MVA y Vero-MVA-200 no son contagiosos o tóxicos para mamíferos incluyendo humanos. Sorpresivamente, la especificidad de célula del Vero-MVA era más o menos idéntica a la especificidad del MVA de tipo salvaje excepto para las células vero: El Vero-MVA se amplifica casi tan ineficientemente en células de líneas de células humanas
(ver tabla 4: células HL, HEP-2 y HeLa) como el MVA de tipo salvaje. Consecuentemente, no obstante que células humanas y células del mono verde de Africa son filogenéticamente relacionados de forma cercana, el Vero-MVA no obtuvo la habilidad de amplificarse en células humanas. En otros ensayos tampoco se vieron diferencias significativas. Además las características físicas, químicas y biológicas del MVA de tipo salvaje y del Vero-MVA-200 se compararon (tabla 500) . Mientras el MVA de tipo salvaje cultivado en cultivos celulares de fibroblasto de embrión de pollo tiene 3 supresiones en la región terminal izquierda invertida, el Vero-MVA-200 tiene 4 supresiones en la región terminal izquierda comparado con el genoma del pox-virus tal como se aisló originalmente en Ankara. Consecuentemente, pasando el MVA de tipo salvaje por células Vero dio como resultado una supresión adicional. El Vero-MVA se usó para inmunizar animales domésticos contra infecciones con orthopox. El suero de los animales se recolectó y se llevó a cabo un ensayo de neutralización. Los inventores mostraron que los animales produjeron anticuerpos en altas dosificaciones. Las dosificaciones de anticuerpos estaban estables sobre un período de por lo menos 111 días. Se mostró también que los anticuerpos estaban capaces de neutralizar in vitro partículas virales del MVA en un ensayo de reducción de
placas. En conclusión, el Vero-MVA puede usarse como una vacuna contra infecciones con Orthopox en animales domésticos y en humanos. Tabla 1 : Adaptación del MVA a células Vero
* solamente 1 MOI en lugar de 10 MOI son sembrados después del onceavo pasaje.
Tabla 2 : Canibio de los niveles de anticuerpos virus durante la adaptación del MVA a células Vero. No. de Pasaje Recolectado después Nivel de anticuerpos [días p. inf . ] por mi [loqio/ml]
1 1 <2.0 2 3 2.0 3 5 1.0 5 5 4.0 8 4 6.5 11 3 7.5 18 2 8.0 19 2 7.75 20 3 8.0 25 2 7.75 29 2 7.75 30 3 7.75 31 3 8.0 45 2 7.75 51 3 7.75 60 2 8.0 66 2 7.75 68 2 8.0 75 3 8.0 100 2 8.0 200 2 10.0
Tabla 3 : Comparación de las caracterxsticas de MVA tipo salvaje y Vero-MVA Marcador MVA de tipo Vero-MVA (100' Vero-MVA-200 salvaj e pasaje CPE en cultivos de redondear y desc . redondear y desc. de redondear y desc. de capa sencilla (1 MOIde células desp. células desp. de 5 células desp. de 3 a sembrado de 5 días (90% días (100% CPE) 5 días (100% CPE) CPE) Nivel de anticuerpos 8.0 KID50/ml 107·75 KIDso/ml 1010·0 KIDso/ml de rendimiento óptimo Reproducción aborSi Si tiva en sistemas
celulares no admitidas o
Virulencia reducida Si Si: no virulento para humanos y absoluto animales Contagiosidad No No No Carácter de la placa No hay nodos de No hay nodos de No hay nodos primaria en la proliferación sinproliferación sin proliferación membrana chorion necrosis necrosis necrosis allantois hemglutinación negativo negativo negativo ((eritrocitos de pollo) inactivacioón por ß cinéteico de cinéteico de primer cinéteico de primer primer orden paraórden para orden para
propiolactona 0.05% 0.05% 0.04-0.05%
Efecto protectivo S Sí Sí en ensayo de reto de VSV de ratón bebé toxicidad para N No No humanos y animales estimulación de Interferón a, IL-2 Interferón a, IL-2 Interferón a y ?, citoquinas y 12, CSA y 12, CSA IL-2 y 12, CSA
Activación de Sí Sí Si, incrementado fagositosis, células destructoras naturales y T-linfocitos
Tabla 4: Cuota de reproducción en KID50/ml de Vero-MVA y el MVA de tipo salvaje en diferentes sistemas de cultivo celular [logio/ml] Sistema de cultivo Vero-MVA MVA tipo salvaje celular 31° pasaje Vero (575° pasaje en fobroblastos primarios de embrión de pollo)
1)Vero (células de 8.0 4.5 riñon del mono verde de Africa fibroblastos 4.5 8.5 primarios de embrión de pollo '2) HL (pulmón 3.0 2.5 humano) 1,2)HEP-2 (carcinoma 3.0 2.5 de epidermis humana) 1,2)HeLA (carcinoma 2.75 2.75 de cervix humana) 1,2)BHK (células de 5.75 5.25 riñon de Hámster) 1,2)MDBK (células de 3.5 3.5 riñon bovinas) 1,2)PK-15 (células 3.25 3.5 de riñon porcinas) 1) Línea de células continua derivada de tejido y especies indicados en paréntesis 2) Línea de células obtenida de colección del instituto para microbiología médica en Munich, Alemania.
Tabla 5: Comparación de MVA de tipo salvaje (572° pasaje en fobroblastos de embrión de pollo (CEF) ) con Vero-MVA-200 (200° pasaje en células Vero) Marcador MVA de tipo salvaje Vero-MVA-200 Marcadores 3 supresiones en la 4 supresiones en la genéticos región terminal región terminal
(comparación con izquierda izquierda cepa de pox-virus (repetición según aislado en terminal invertida) Ankara tamaño del genoma Adicional reducción reducido de 208 a del tamaño del 178 kb genoma a 172kb pérdida de 15% del Pérdida de 20% del peso molecular del peso molecular del genoma original genoma orignal Pérdida del pérdida adicional receptor de de receptores, p.e. interferón para IL-?ß marcadores activación de activación celulares células auxiliares incrementada de T- T (CD4 , CD8, CD25) linfocitos citotóxicos activación de actividad células NK incrementada de células NK reproducción reducción adicional abortiva en células en gama de de mamíferos huéspedes en (excepto células sistemas de cultivo BHK) celular citoquina interferon a, IL-2, interferon a y y, IL-12 IL-1,2, IL-12 nivel de CEF: 109-5KID5o/ml CEF: 109-5KID50/ml anticuerpos del células Vero: 104·0 células Vero: 109·5 virus KID50/ml KIDso/ml sistema Reducción de actividad mejorada inmunológico actividad del del sistema sistema inmunológico inmunológico inespecífico específico virulencia para baja ninguna humanos y animales
REIVINDIC CIONES 1. Un virus de vaccinia Ankara modificado (MVA) , caracterizado porque es adaptado para el crecimiento en células de una linea de células continua, siendo que la linea de células mencionada está aprobada para la producción de una substancia terapéutica. 2. El MVA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es adaptado para el crecimiento en células de una linea de células de mamíferos. 3. El MVA de conformidad con la reivindicación 1 o
2, caracterizado porque la línea de células está aprobada para la producción de una vacuna. 4. El MVA de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la línea de células aprobada es una línea de células Vero. 5. El MVA de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la línea de células aprobada es la línea de células Vero ATCC No. CCL-81. 6. El MVA de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque es depositado en la Colección Europea de Cultivos de Células, Salisbury, Reino Unido bajo No. de depósito 99101431 y/o sus derivados. 7. El MVA de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque es depositado en la ECACC, Salisbury, Reino Unido, bajo el número de acceso provisional 01021411
y/o sus derivados. 8. El MVA de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende por lo menos una secuencia de ácido nucleico heterologa. 9. El MVA de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico heterologa, por ejemplo, un gen codificando para una proteina terapéutica y/o un determinante antigénico.
10. Una célula huésped infectada por el MVA de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes 1 a
9. 11. Una composición, preferentemente una composición farmacéutica, de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes 1 a 9, caracterizada porque comprende el MVA y/o el ADN del MVA. 12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la composición farmacéutica es una vacuna. 13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque es para la inmunización de un cuerpo de animal vivo incluyendo un humano . 14. La composición de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterizada porque es para la inmunización contra una infección con orthopox.
15. La composición de conformidad con las reivindicaciones 12 a 14, caracterizada porque es para la inmunización de gatos contra la infección con viruela de gato, ratones contra infección con ectromelia y/o camellos contra infección con viruela de camellos. 16. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el MVA es un activador, supresor y/o estabilizador del sistema inmunológico inespecifico . 17. Una composición, preferentemente una composición farmacéutica, de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes 1 a 9, caracterizada porque comprende el MVA y/o el ADN del MVA como un auxiliar. 18. Una composición, preferentemente una composición farmacéutica, de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizada porque comprende el MVA recombinante y/o el ADN del MVA recombinante. 19. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque es para el uso en terapia genética. 20. Un método para introducir una secuencia homologa y/o heteróloga de ácido nucleico en una célula meta de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizado porque comprende la infección de la célula meta con un MVA. 21. Un método para obtener una cepa de MVA de
conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 7 precedentes, caracterizado porque comprende a) la infección de células de una linea aprobada de células con un MVA de tipo salvaje, preferentemente el MVA depositado en ECACC bajo el No. de depósito V94012707, b) recolectar los virus, c) la infección de células nuevas de la misma linea de células con los virus recién producidos, y, opcionalmente, d) repetición de b) y c) hasta que el virus está adaptado al cultivo en las células de la linea de células mencionada . 22. Un método para la producción de partículas virales del MVA de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9 precedentes, caracterizado porque comprende a) la cultivación de las células de una línea de células aprobada bajo condiciones adecuadas, b) infectando la línea de células mencionada con el MVA mencionado, y c) recolectando las partículas virales producidas por las células mencionadas. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la línea de células mencionada se infecta con el MVA de conformidad con la reivindicación 6 o 7.
24. Un método para producir una secuencia de ácido nucleico, un péptido polipéptido y/o una proteína, caracterizado porque comprende a) la infección de una célula huésped con el MVA recombinante de conformidad con las reivindicaciones 8 o 9, b) la cultivación de la célula de huésped infectada bajo condiciones adecuadas, y, opcionalmente, c) aislamiento y/o enriquecimiento de la secuencia de ácido nucleico, péptido y/o proteína producidos por la célula huésped mencionada. 25. Uso del MVA de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9 precedentes, caracterizado porque es para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o un trastorno sensible al MVA mencionado. 26. El uso de conformidad a la reivindicación 25, caracterizado porque es para la producción de una vacuna para la inmunización de un cuerpo de animal vivo incluyendo un humano. 27. El uso de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque es para la producción de un activador, supresor y/o estabilizador del sistema inmunológico inespecífico . 28. El uso de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque es para la fabricación de un auxiliar.
29. Uso del MVA de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9 como una vacuna. 30. Uso del MVA de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9 como un auxiliar. 31. Uso del MVA de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 9 como un activador, supresor y/o estabilizador del sistema inmunológico inespecifico . 32. Un método para introducir una secuencia de ácido nucleico a una célula meta de conformidad a las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado porque comprende infectar la célula meta con el MVA y/o el ADN del MVA. 33. Un virus Vaccinia Ankara modificado (MVA) adaptado para cultivo en células de una linea de células continua mediante un procedimiento caracterizado porque comprende los siguientes pasos: a) infectar células de una linea de células estando aprobada para la producción de una substancia terapéutica, b) recolectar las partículas virales producidas por las líneas de células mencionadas y opcionalmente, c) repetir los pasos precedentes hasta obtener las características de crecimiento deseadas del MVA mencionado en las células mencionadas.