-
Die
Erfindung betrifft Promotoren, insbesondere für die Expression von Genen
und/oder codierenden Sequenzen in Vacciniaviren, wie beispielsweise
dem modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA). Ferner betrifft die
Erfindung den Promotor enthaltende Expressionskassetten, die Expressionskassetten
enthaltende Vektoren ebenso wie pharmazeutische Zusammensetzungen
und Impfstoffe.
-
Stand der Technik
-
Rekombinante
Poxviren finden breite Anwendung bei der Expression von Fremdantigenen
in infizierten Zellen. Zudem werden rekombinante Poxviren zur Zeit
als sehr vielversprechende Impfstoffe getestet, um eine Immunantwort
gegen das von dem Poxvirenvektor exprimierte Fremdantigen zu induzieren.
Am beliebtesten sind dabei einerseits Avipoxviren und andererseits
Vacciniaviren, insbesondere das modifizierte Vacciniavirus Ankara
(MVA). MVA ist mit dem Vacciniavirus, einem Mitglied der Gattung
Orthopoxvirus in der Familie Poxviridae, verwandt. MVA wurde durch
516 aufeinanderfolgende Passagierungen des Ankara-Stamms von Vacciniavirus
auf Hühnerembryofibroblasten
(CVA) erzeugt (für
eine Übersicht
siehe Mayr, A., et al. Infection 3, 6–14 [1975]). Als Folge dieser
Langzeitpassagierungen sind im erhaltenen MVA-Virus etwa 31 Kilobasen seiner
genomischen Sequenz deletiert, und daher wurde dieses Virus als
stark wirtszellenbeschränkt
(auf Vogelzellen) beschrieben (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol.
72, 1031–1038
[1991]). In verschiedenen Tiermodellen konnte gezeigt werden, daß das erhaltene
MVA in signifikanter Weise avirulent war (Mayr, A. & Danner, K. [1978]
Dev. Biol. Stand. 41: 225–34].
Darüber
hinaus wurde dieser MVA- Stamm
in klinischen Versuchsreihen als Impfstoff zur Immunisierung gegen
die menschliche Pockenkrankheit getestet (Mayr et al., Zbl. Bakt.
Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375–390
[1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392 [1974]).
-
Aus
US 5,736,368 und
US 6,051,410 ist der rekombinante
Vacciniavirusstamm Wyeth bekannt, der HIV-Antigene und -proteine
exprimiert. Aus der
US 5,747,324 ist
ein rekombinanter Vacciniavirusstamm, NYCBH, bekannt, der Lentivirusgene
exprimiert. Aus der
EP 0 243
029 ist ein rekombinanter Vacciniavirusstamm, Western Reserve,
bekannt, der menschliche Retrovirusgene exprimiert. Aus der
WO 02/42480 sind besonders sichere
und abgeschwächte
MVA-Stämme
bekannt. Rekombinante MVA sind unter anderem in
WO 98/13500 und
WO 03/048184 offenbart.
-
Für die Expression
heterologer Gene in Poxviren sind dem Fachmann nur wenige Promotoren
bekannt, wie beispielsweise die 30K- und 40K-Promotoren (siehe z.
B.
US 5,747,324 ), ein
starker synthetischer früher/später Promotor
(siehe z. B. Sutter et al., Vaccine (1994), 12, 1032–40), der
P7.5-Promotor (siehe z. B. Endo et al., J. Gen. Virol. (1991) 72,
699–703)
und der aus dem ATI (A-Type Inclusion)-Gen des Kuhpockenvirus stammende
Promotor (Li et al., J. Gen. Virol. (1998) 79, 613). Alle diese
Promotoren wurden in rekombinanten Vacciniaviren eingesetzt, um
heterologe Gene zu exprimieren, wobei gezeigt werden konnte, daß sie diese
Gene exprimieren, was zur Produktion des von dem heterologen Gen
codierten Proteins führte.
Da nur wenige Promotoren für
die Expression von Genen in Vacciniavirus-Expressionssystemen zur
Verfügung
stehen, besteht ein allgemeiner Bedarf an alternativen Promotoren
in Vacciniaviren. Darüber
hinaus handelt es sich bei allen bislang bekannten Promotoren um
ziemlich starke späte
Promotoren, d. h. mit Eignung zur Expression von Genen nach erfolgter
Replikation des Vacciniavirus-Vektors. Bei einigen Anwendungen ist
es wünschenswert,
im Besitz von Promotoren zu sein, die die Expression von Genen unmittelbar
nach der Infektion der Zellen gestatten, d. h. dort besteht ein
Bedarf an frühen
Vacciniavirus-Promotoren.
-
Zudem
handelt es sich, wie oben erläutert,
bei MVA um ein sehr vielversprechendes Virus für die Expression heterologer
Gene, und zwar aufgrund seines verbesserten Sicherheitsprofils.
Allerdings wurden alle bislang für
die Expression heterologer Gene in MVA bekannten Promotoren aus
anderen Vacciniaviren isoliert, oder es handelt sich dabei um synthetische
Promotoren für
die Expression in einem anderen Vacciniavirus. Somit besteht ebenso
ein Bedarf an für
die Expression in MVA optimierten Promotoren.
-
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
-
Die
Erfindung betrifft aus dem Genom des modifizierten Vacciniavirus
Ankara (MVA) stammende Promotoren. Bislang waren noch keine MVA-Promotoren
im Fachgebiet bekannt.
-
Insbesondere
betrifft die Erfindung einen Promotor, umfassend oder bestehend
aus einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe:
- (i) die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3.
Als Beispiele sind auch andere aus dem Genom des modifizierten Vacciniavirus
Ankara (MVA) stammende Promotorsequenzen aufgeführt.
- (ii) Teilsequenzen der Sequenz gemäß einer der SEQ ID NO: 3.
- (iii) Sequenzen mit einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen,
-deletionen und/oder -insertionen in Bezug auf die Sequenzen mit
der in (i) oder (ii) angegebenen Bedeutung.
-
SEQ
ID NO: 1 bis 6 sind natürlicherweise
Bestandteil des MVA-Genoms und stromaufwärts zu den Leserastern A42R,
J6R, F6R, I2R, C7L bzw. B9R lokalisiert.
-
Die
Promotoren gemäß der vorliegenden
Erfindung sind vorzugsweise als Vacciniavirus-Promotoren aktiv oder
als Promotoren in mit Vacciniavirus infizierten Zellen aktiv. Vorzugsweise
handelt es sich bei dem Vacciniavirus um MVA, insbesondere einen
der MVA-Stämme, wie
sie unten aufgeführt
sind. "Aktiv als
Vacciniavirus-Promotor" bedeutet,
daß der
Promotor in der Lage ist, die Expression eines Gens, mit dem er
in einem Vacciniavirus in operativer Verknüpfung steht, nach der Infektion
von Zellen mit dem Virus zu steuern. Bei den Zellen handelt es sich
vorzugsweise um Zellen, die die späte und/oder frühe Expression
des Vacciniavirus gestatten. Zu "einem
in mit Vacciniavirus infizierten Zellen aktiven Promotor" zählt auch
die Situation, bei der der Promotor nicht Bestandteil eines Vacciniavirusgenoms
ist und beispielsweise Teil eines Plasmids oder eines viralen Nicht-Vacciniavirusgenoms
ist; in einer solchen Situation ist der Promotor gemäß der vorliegenden
Erfindung" aktiv,
falls die den Promotor enthaltende Zelle auch ein Vacciniavirusgenom
umfaßt,
z. B. falls die Zelle mit einem Vacciniavirus infiziert ist. Unter
diesen Umständen
erkennt die virale RNA-Polymerase den Promotor gemäß der vorliegenden
Erfindung, und die Expression des Gens bzw. der codierenden Sequenz,
das bzw. die mit dem Promotor verknüpft ist, wird aktiviert.
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung besteht die Möglichkeit,
den Promotor, wie er in der SEQ ID NO: 3 angegeben ist, zu verwenden.
Der Promotor der tatsächlich
zur Steuerung der Expression des Gens bzw. der codierenden Sequenz
verwendet wird, kann aus der SEQ ID NO: 3 bestehen oder es kann
sich dabei um eine größere Struktur
handeln, die die SEQ ID NO: 3 umfaßt. Als Alternative liegt es
im Umfang der vorliegenden Erfindung, ein Derivat dieser Promotoren
zu verwenden, wobei es sich um eine Teilsequenz der Sequenzen mit
der in SEQ ID NO: 1 bis 6 angegebenen Bedeutung handeln kann. Der
Begriff "Teilsequenz
der Sequenzen gemäß einer
der SEQ ID NO: 1 bis 6" bezieht
sich auf kürzere
Fragmente einer der SEQ ID NO: 1 bis 6, die noch als Promotor aktiv
sind, insbesondere als Promotor in Vacciniavirus oder in mit Vacciniavirus infizierten
Zellen. Wiederum handelt es sich bei dem Vacciniavirus vorzugsweise
um MVA, wie beispielsweise einen der unten angegebenen Stämme. Eine
typische Teilsequenz einer der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 weist
eine Länge
von wenigstens 15 Nukleotiden, stärker bevorzugt von wenigstens
20 Nukleotiden, noch stärker
bevorzugt von wenigstens 25 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt von wenigstens
30 Nukleotiden, einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID
NO: 6 auf.
-
Eine
Teilsequenz der SEQ ID NO: 1 ist die SEQ ID NO: 7. Eine Teilsequenz
der SEQ ID NO: 2 ist die SEQ ID NO: 8. Bevorzugte Teilsequenzen
und/oder Derivate der Teilsequenzen der SEQ ID NO: 3 sind die SEQ
ID NO: 9 und die SEQ ID NO: 10. Teilsequenzen der SEQ ID NO: 4 sind
die SEQ ID NO: 11 und die SEQ ID NO: 12. Die Sequenzen der SEQ ID
NO: 6 bis 12 sind im Beispielteil aufgeführt.
-
Bei
dem Derivat des eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 oder Teilsequenzen
davon umfassenden oder daraus bestehenden Promotors, insbesondere
dem Derivat der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO:
12, kann es sich auch um eine Sequenz handeln, die eine oder mehrere
Nukleotidsubstitionen, -deletionen und/oder -insertionen in Bezug
auf die Sequenz SEQ ID NO: 3 oder Teilsequenzen davon, insbesondere
der Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10, aufweist.
Die Derivate gemäß der vorliegenden
Erfindung sind dabei noch als Promotor, insbesondere als Vacciniavirus-Promotor,
stärker bevorzugt
als MVA-Promotor,
aktiv. Bei einer Sequenz mit einer oder mehreren Nukleotidsubstitionen
handelt es sich um eine Sequenz, bei der ein oder mehrere Nukleotide
der Sequenz gemäß der SEQ
ID NO: 3 oder von Teilsequenzen davon, wie beispielsweise der Sequenzen
gemäß der SEQ
ID NO: 9 oder 10, durch unterschiedliche Nukleotide substituiert
sind. Bei einer Sequenz mit einer oder mehreren Nukleotidinsertionen
handelt es sich um eine Sequenz, bei der ein oder mehrere Nukleotide
an einem oder mehreren Orten der SEQ ID NO: 3 oder Teilsequenzen
davon, insbesondere der Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 9 oder
10, inseriert sind. Bei einer Sequenz mit einer oder mehreren Nukleotiddeletionen
handelt es sich um eine Sequenz, bei der ein oder mehrere Nukleotide
der Sequenz gemäß der SEQ
ID NO: 3 oder von Teilsequenzen davon, insbesondere der Nukleotidsequenzen
der SEQ ID NO: 9 oder 10, deletiert sind. Bei den Derivaten gemäß der vorliegenden
Erfindung können
Deletionen, Substitutionen und Insertionen kombiniert in einer Sequenz
vorliegen.
-
Ein
Beispiel für
ein Derivat einer Teilsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung
ist die SEQ ID NO: 10, bei der es sich um eine Teilsequenz der SEQ
ID NO: 3 mit einem zusätzlichen
Nukleotidaustausch in Bezug auf die entsprechende Nukleotidsequenz
in der SEQ ID NO: 3 handelt.
-
Vorzugsweise
weist das Derivat beim Vergleich mit der Sequenz der SEQ ID NO:
3 oder Teilsequenzen davon, insbesondere den Sequenzen gemäß der SEQ
ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10, eine Homologie von wenigstens 40%,
stärker
bevorzugt von wenigstens 60%, noch stärker bevorzugt von wenigstens
80%, am stärksten
bevorzugt von wenigstens 90% auf. Gemäß der am stärksten bevorzugten Ausführungsform
sind in der Sequenz einer der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 nicht
mehr als 10 Nukleotide, noch stärker
bevorzugt nicht mehr als 5 Nukleotide, substituiert, deletiert und/oder
inseriert.
-
Eine
Reihe von Dokumenten des Standes der Technik gestattet dem Fachmann,
vorherzusagen, welche Derivate oder Teilsequenzen einer der SEQ
ID NO: 1 bis 12 noch die biologische Aktivität in Form der Aktivität als ein
Vacciniavirus-Promotor, insbesondere als ein in MVA aktiver Promotor,
aufweisen. In diesem Zusammenhang wird auf Chakrarbarti et al.,
Biotechniques (1997) 23, 1094–1097
und Davison und Moss, J. Mol. Biol. (1989) 210, 771–784 Bezug
genommen. Zudem läßt sich
vom Fachmann leicht beurteilen, ob ein Fragment noch als Vacciniavirus-Promotor,
insbesondere als MVA-Promotor, aktiv ist. Insbesondere läßt sich
das Sequenzderivat stromaufwärts
eines Reportergens in einem Plasmidkonstrukt klonieren. Dieses Konstrukt kann
in eine eukaryontische Zelle oder Zellinie, wie z. B. CEF- oder BHK-Zellen,
die mit MVA infiziert wurde, transfiziert werden. Die Expression
des Reportergens wird bestimmt und mit der Expression des von dem
Promotor gemäß einer
der SEQ ID NO: 1 bis 6 kontrollierten Reportergens verglichen. Ein
Derivat gemäß der vorliegenden
Erfindung ist dabei ein Derivat mit einer Promotoraktivität in dem
Testsystem von wenigstens 10%, vorzugsweise von wenigstens 30%,
stärker
bevorzugt von wenigstens 50%, noch stärker bevorzugt von wenigstens
70%, am stärksten
bevorzugt von wenigstens 90%, im Vergleich mit der Aktivität der Promotorsequenz
einer der SEQ ID NO: 3. Ebenso liegen diejenigen Derivate einer
der SEQ ID NO: 3, 9 oder 10 im Umfang der vorliegenden Erfindung,
die eine höhere
Promotoraktivität
aufweisen.
-
Die
Promotoren gemäß der vorliegenden
Erfindung eignen sich insbesondere für die Expression codierender
Sequenzen in MVA. Ebenso werden andere Promotorsequenzen, die aus
dem Genom des modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) stammen,
als Beispiel beschrieben. Der Promotor gemäß der SEQ ID NO: 1 weist eine
sehr starke Aktivität
auf, insbesondere als später
Promotor. Doch kann er auch als früher Promotor eingesetzt werden.
Die gleichen Überlegungen
gelten für
die entsprechenden Teilsequenzen wie beispielsweise die Sequenz
der SEQ ID NO: 7, welche sich allerdings besonders als später Promotor
eignet.
-
Der
Promotor gemäß der SEQ
ID NO: 2 weist ebenso eine ziemlich starke Aktivität auf, insbesondere als
später
Promotor. Er läßt sich
ebenso als früher
Promotor einsetzen. Die gleichen Überlegungen gelten für die entsprechenden
Teilsequenzen, wie beispielsweise die Sequenz der SEQ ID NO: 8,
die sich allerdings besonders als später Promotor eignet.
-
Der
Promotor gemäß der SEQ
ID NO: 3 eignet sich insbesondere als früher Promotor und weist die höchste frühe Promotoraktivität aller
gestesteten Promotoren auf. Allerdings läßt er sich ebenso als später Promotor
einsetzen. Die gleichen Überlegungen
gelten für
die entsprechenden Teilsequenzen, wie beispielsweise die Sequenzen
der SEQ ID NO: 9 bzw. 10. Von diesen Teilsequenzen eignet sich die
SEQ ID NO: 9 besonders als früher
Promotor und die SEQ ID NO: 10 besonders als später Promotor.
-
Der
Promotor gemäß der SEQ
ID NO: 4 eignet sich insbesondere dann, falls man vorhat, eine verknüpfte codierende
Sequenz früh
und spät
zu exprimieren, da dieser Promotor eine ziemlich hohe Aktivität sowohl
unter frühen
als auch unter späten
Bedingungen aufweist. Die gleichen Überlegungen gelten für die entsprechenden
Teilsequenzen, wie beispielsweise die Sequenzen der SEQ ID NO: 11
bzw. 12. Von diesen Teilsequenzen eignet sich die SEQ ID NO: 11
besonders als früher
Promotor und die SEQ ID No: 12 besonders als später Promotor.
-
Die
Promotoren gemäß der SEQ
ID NO: 5 und 6 eignen sich insbesondere dann, falls man vorhat,
verknüpfte
codierende Sequenzen in eher geringen Mengen zu exprimieren. Dies
ist manchmal wünschenswert, wenn
die verknüpfte
codierende Sequenz für
ein toxisches Genprodukt codiert und/oder wenn man vorhat, eine
Immunantwort mit hoher Avidität
zu induzieren.
-
Der
Begriff "früher Promotor" bezieht sich auf
Promotoren, die in Vacciniavirus oder in mit Vacciniavirus infizierten
Zellen aktiv sind, bevor die virale DNA-Replikation stattgefunden
hat. Dem Fachmann sind dabei Verfahren bekannt, wie sich überprüfen läßt, ob es
sich bei einem Promotor um einen frühen Promotor handelt. Insbesondere
läßt sich
der interessierende Promotor stromaufwärts eines Reportergens inserieren.
Das den Promotor und das Reportergen umfassende Konstrukt wird in
Zellen eingeführt,
die mit einem Vacciniavirus infiziert werden. Um die Aktivität als früher Promotor
zu beurteilen, werden die Zellen mit einer Substanz inkubiert, die
die DNA-Replikation hemmt, wie beispielsweise AraC. Die DNA-Replikation
ist eine Vorbedingung für die
späte Promotoraktivität. Somit
liegt eine eventuell in diesem Testsystem gemessene Promotoraktivität an Elementen,
die als früher
Promotor aktiv sind. Dementsprechend bezieht sich der Begriff "später Promotor" auf alle Promotoren,
die aktiv sind, nachdem die DNA-Replikation stattgefunden hat. Die
späte Aktivität läßt sich auch
mit dem Fachmann bekannten Verfahren messen. Aus Gründen der
Einfachheit bezieht sich der Begriff "später
Promotor" wie er
in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, auf die Aktivität eines
Promotors, die dann bestimmt wird, wenn keine Substanz, die die
DNA-Replikation
blockiert, zugegeben wird.
-
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung eine Expressionskassette, die
den Promotor gemäß der vorliegenden
Erfindung sowie eine codierende Sequenz umfaßt, wobei die Expression der
codierenden Sequenz von dem Promotor kontrolliert wird. Bei der
codierenden Sequenz kann es sich um eine beliebige codierende Sequenz
handeln. Vorzugsweise kann die codierende Sequenz für wenigstens
ein antigenes Epitop oder Antigen, therapeutische Peptide oder Proteine,
Antisense-RNA oder Ribozyme codieren. Falls die codierende Sequenz
für ein
antigenes Epitop oder Antigen codiert, so kann die Expressionskassette
zur Expression des Antigens nach Einführung der Expressionskassette
in Zellen in einem Organismus, z. B. einem Säugetier, einschließlich dem
Menschen, verwendet werden. Die Präsentierung des Antigens/Epitops
kann eine Immunantwort in dem Organismus hervorrufen, die zu einer
Impfung des Organismus gegen das Agens, aus dem das Antigen/Epitop
stammt, führen
kann. Insbesondere kann das Epitop/Antigen Teil einer größeren Aminosäuresequenz,
wie beispielsweise eines Polyepitops, Peptids oder Proteins sein. Mögliche Beispiele
für solche
Polyepitope, Peptide oder Proteine sind aus (i) Viren, wie z. B.
HIV, HTLV, Herpesvirus, Denguevirus, Poliovirus, Masernvirus, Mumpsvirus,
Rubellavirus, Hepatitisviren usw., (ii) Bakterien, (iii) Pilzen
stammende Polyepitope, Peptide oder Proteine.
-
Als
Alternative kann die codierende Sequenz für eine therapeutische Verbindung
wie beispielsweise Interleukine, Interferone, Ribozyme oder Enzyme
codieren.
-
Falls
der Promotor gemäß der vorliegenden
Erfindung zu einem natürlich
vorkommenden Promotor identisch ist, unterscheiden sich die codierende
Sequenz und/oder die zwischen dem Promotor und der codierenden Sequenz
liegenden Sequenzen von den entsprechenden Sequenzen, mit denen
der Promotor natürlicherweise
verknüpft
ist. Der Begriff "unterscheiden" bezieht sich in
diesem Zusammenhang auf Sequenzen, die wenigstens einen Nukleotidunterschied
in der Sequenz zeigen. Besonders bevorzugt ist es die codierende Sequenz,
die wenigstens einen Nukleotidunterschied aufweist. Am stärksten bevorzugt
codiert die codierende Sequenz für
ein Peptid/Protein mit einem Unterschied von wenigstens einer Aminosäure im Vergleich
mit dem von der codierenden Sequenz codierten natürlich vorkommenden
Protein.
-
Allgemeiner
gesagt, betrifft die Erfindung eine beliebige Nukleinsäuresequenz,
die den Promotor gemäß der vorliegenden
Erfindung und/oder die Expressionskassette gemäß der vorliegenden Erfindung
umfaßt. Bei
der Nukleinsäure
kann es sich um RNA handeln, beispielsweise wenn der Promotor Teil
eines Retrovirusgenoms ist. Besonders bevorzugt handelt es sich
bei der Nukleinsäure
um DNA. Diese kann eine beliebige Art von DNA sein, wie beispielsweise
lineare, zirkuläre,
einzelsträngige
oder doppelsträngige
DNA.
-
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
kann der Promotor und/oder die Expressionskassette gemäß der vorliegenden
Erfindung Teil eines Vektors sein. Dabei bezieht sich der Begriff "Vektor" auf alle dem Fachmann
bekannten Vektoren. Ein Vektor kann ein Plasmidvektor, wie beispielsweise
pBR322 oder ein Vektor der pUC-Reihe sein. Besonders bevorzugt handelt
es sich bei dem Vektor um einen Virusvektor. Im Zusammenhang mit
der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "viraler Vektor" oder "Virusvektor" auf ein infektiöses Virus,
das ein virales Genom umfaßt.
In diesem Fall ist die DNA der vorliegenden Erfindung Teil des viralen
Genoms des jeweiligen viralen Vektors. Das rekombinante virale Genom
wird verpackt, wobei sich die erhaltenen rekombinanten Vektoren
zur Infektion von Zellen und Zellinien, insbesondere zur Infektion
von lebenden Tieren, einschließlich
dem Menschen verwenden lassen. Typische Virusvektoren, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
sind adenovirale Vektoren, retrovirale Vektoren oder Vektoren auf
der Basis des adeno-assoziierten Virus 2 (AAV2). Am stärksten bevorzugt
sind Poxvirusvektoren. Bei dem Poxvirus kann es sich vorzugsweise
um ein Canarypoxvirus, ein Fowlpoxvirus oder ein Vacciniavirus handeln.
-
Stärker bevorzugt
ist das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) (Sutter, G et al.
[1994], Vaccine 12: 1032–40;
Antoine G. et al. [1998], Virology 244: 365–396). Der Begriff "MVA", wie er in der vorliegenden
Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf einen beliebigen, im
Stand der Technik bekannten MVA-Stamm. Ein Beispiel für einen
MVA-Stamm stellt die Hinterlegung VR-1508, hinterlegt bei der American
Type Culture collection (ATCC), Manassas, VA 20108, USA dar. Weitere
Beispiele für
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendetet MVA-Virusstämme sind die Stämme MVA
572 und 575, hinterlegt bei der European Collection of Animal Cell
Cultures (ECACC), Salisbury (UK) mit der Hinterlegungsnummer ECACC
V94012707 bzw. ECACC V00120707, MVA-BN mit der Hinterlegungsnummer
ECACC V00083008.
-
Der
am stärksten
bevorzugte MVA-Stamm ist MVA-BN oder ein Derivat davon. Die Merkmale
von MVA-BN, die Beschreibung der biologischen Tests, die eine Beurteilung
darüber
gestatten, ob es sich bei einem MVA-Stamm um MVA-BN oder ein Derivat
davon handelt, sowie Verfahren, mit denen sich MVA-BN oder ein Derivat
davon gewinnen läßt, sind
in der
WO 02/42480 offenbart.
Der Gehalt dieser Anmeldung ist in der vorliegenden Anmeldung durch
Bezugnahme aufgenommen. In dieser Literaturstelle wird auch offenbart,
wie MVA und andere Vacciniaviren vermehrt werden können. Kurz
gesagt werden dabei eukaryontische Zellen mit dem Virus infiziert.
Bei den eukaryontischen Zellen handelt es sich um Zellen, die für eine Infektion
mit dem jeweiligen Poxvirus anfällig
sind und die Replikation und Produktion von infektiösem Virus
gestatten. Bei MVA sind diese Art von Zellen beispielsweise Hühnerembryofibroblasten
(Chicken Embryo Fibroblasts, CEF) sowie BHK-Zellen (Drexler I.,
Heller K., Wahren B., Erfle V. und Sutter G. "Highly attenuated modified vaccinia
Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host
for virus propagation, but not in various human transformed and
primary cells" J.
Gen. Virol. (1998), 79, 347–352).
CEF-Zellen lassen sich unter Bedingungen, die dem Fachmann bekannt
sind, kultivieren. Vorzugsweise werden dabei die CEF-Zellen in serumfreiem
Medium in ruhenden Kolben oder Rollerflaschen kultiviert. Die Inkubation
findet vorzugsweise über
einen Zeitraum von 48–96
Stunden bei 37°C ± 2°C statt.
Für die
Infektion wird das MVA vorzugsweise mit einer MOI (Multiplicity of
Infection) von 0,05 bis 1 TCID
50 eingesetzt,
und die Inkubation erfolgt vorzugsweise über einen Zeitraum von 48–72 Stunden
bei 37°C ± 2°C. Dem Fachmann
sind Verfahren dazu bekannt, wie die Expressionskassette oder der
Promotor gemäß der vorliegenden
Erfindung in ein virales Genom, insbesondere in das Genom eines Vacciniavirus,
am stärksten
bevorzugt in das Genom von MVA, inseriert werden kann. Beispielsweise
kann die Expressionskässette
oder der Promotor oder das Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung
in das Genom von MVA durch homologe Rekombination inseriert werden.
Hierzu wird eine Nukleinsäure
in eine permissive Zellinie wie z. B. CEF- oder BHK-Zellen transfiziert,
wobei die Nukleinsäure
die Expressionskassette oder den Promotor oder das Derivat davon
gemäß der vorliegenden
Erfindung, flankiert von Nukleotidabschnitten, die zum Bereich des
MVA-Genoms, in das die Expressionskassette oder der Promotor oder
das Derivat davon gemäß der vorliegenden
Erfindung inseriert werden soll, homolog sind, umfaßt. Die
Zellen werden mit MVA infiziert, wobei in den infizierten Zellen
eine homologe Rekombination zwischen der Nukleinsäure und
dem viralen Genom stattfindet. Als Alternative besteht auch die
Möglichkeit,
die Zellen zunächst
mit MVA zu infizieren und danach die Nukleinsäure in die infizierten Zellen
zu transfizieren. Wiederum findet eine Rekombination in den Zellen
statt. Das rekombinante MVA wird anschließend mit im Stand der Technik
bekannten Verfahren selektioniert. Die Konstruktion von rekombinantem
MVA ist dabei nicht auf dieses bestimmte Verfahren beschränkt. Statt
dessen können
hierzu alle dem Fachmann bekannten geeigneten Verfahren verwendet
werden.
-
Die
Expressionskassette oder der Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung
kann in einen beliebigen geeigneten Teil des Vektors, insbesondere
in ein virales Genom, eingeführt
werden. Im Falle von Vacciniaviren kann die Insertion in nicht essentielle
Teile des viralen Genoms oder in einen Zwischengenbereich des viralen
Genoms erfolgen. Der Begriff "Zwischengenbereich" bezieht sich vorzugsweise
auf diejenigen Teile des zwischen zwei benachbarten Genen liegenden
viralen Genoms, die keine codierenden Sequenzen umfassen. Falls
es sich bei dem Vektor um MVA handelt, kann die Insertion auch in
eine natürlich
vorkommende Deletionsstelle des viralen Genoms erfolgen. Der Begriff "natürlich vorkommende
Deletionsstelle" bezieht
sich dabei auf diejenigen Teile des viralen Genoms, die im Bezug
auf das Genom des Vacciniavirusstamms Copenhagen deletiert sind.
Allerdings sind die Insertionsstellen nicht auf diese bevorzugten
Insertionsstellen im Vacciniavirus-Genom und dem MVA-Genom beschränkt, da
es im Umfang der vorliegenden Erfindung liegt, daß die Expressionskassette
irgendwo im viralen Genom inseriert werden kann, solange es möglich ist,
Rekombinanten zu gewinnen, die sich in wenigstens einem Zellkultursystem,
wie beispielsweise CEF-Zellen (Chicken Embryo Fibroblasts), amplifizieren
und vermehren lassen.
-
Der
Promotor gemäß der vorliegenden
Erfindung kann zur Expression eines Gens verwendet werden, das bereits
Teil des Vektors, beispielsweise des Genoms von MVA, ist. Bei einem
solchen Gen kann es sich um ein Gen handeln, das natürlicherweise
Teil des viralen Genoms ist, oder um ein Fremdgen, das bereits in den
Vektor inseriert wurde. In diesen Fällen wird der Promotor gemäß der vorliegenden
Erfindung im Vektor stromaufwärts
von dem Gen, dessen Expression von dem Promotor kontrolliert werden
soll, inseriert. Ein eine Expressionskassette gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassender MVA-Vektor läßt sich auch herstellen, indem
das offene Leseraster F6R durch eine codierende Sequenz, deren Expression
von dem natürlicherweise
die Expression des offenen Leserasters kontrollierenden Promotor
kontrolliert werden soll, ersetzt wird. In dem erhaltenen Konstrukt
wird die codierende Sequenz von einem Promotor gemäß der vorliegenden
Erfindung kontrolliert. Diese Expressionskassetten liegen ebenso
im Umfang der vorliegenden Erfindung.
-
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung den Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung
als Impfstoff oder Arzneimittel. Allgemeiner gesagt betrifft die
Erfindung einen Impfstoff oder eine pharmazeutische Zusammensetzung,
der bzw. die eine Expressionskassette, eine DNA oder einen Vektor
gemäß der vorliegenden
Erfindung umfaßt.
Dem Fachmann sind dabei Verfahren bekannt, wie der Impfstoff bzw.
die pharmazeutische Zusammensetzung dem tierischen oder menschlichen
Körper
verabreicht werden kann. Im Falle von DNA und Plasmidvektoren lassen
sich die DNA bzw. der Vektor einfach durch Injektion verabreichen. Falls
es sich bei dem Vektor um einen viralen Vektor wie beispielsweise
einen Vacciniavirus-Vektor, insbesondere einen MVA-Vektor, handelt,
so kann dieser ebenfalls dem tierischen oder menschlichen Körper nach
dem Wissen des Fachmanns, beispielsweise mittels intravenöser, intramuskulärer, intranasaler,
intradermaler oder subkutaner Verabreichung verabreicht werden.
Weitere Einzelheiten über
die Menge an verabreichtem Virus sind unten angegeben.
-
Die
pharmazeutische Zusammensetzung bzw. der Impfstoff kann allgemein
einen oder mehrere pharmazeutisch unbedenkliche und/oder zugelassene
Trägerstoffe,
Zusatzstoffe, Antibiotika, Konservierungsstoffe, Adjuvantien, Verdünnungsmittel
und/oder Stabilisatoren zusätzlich
zum Promotor, zur Expressionskassette oder zum Vektor gemäß der vorliegenden
Erfindung enthalten. Bei derartigen Hilfsstoffen kann es sich um Wasser,
Kochsalzlösung,
Glycerin, Ethanol, Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen
oder dergleichen handeln. Als Trägerstoffe
sind typischerweise große,
langsam metabolisierte Moleküle,
wie beispielsweise Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere
Aminosäuren,
Aminosäurencopolymere,
Lipidaggregate oder dergleichen geeignet.
-
Zur
Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Impfstoffen
wird die DNA, die Expressionskassette oder der Vektor gemäß der vorliegenden
Erfindung, insbesondere ein rekombinantes Vacciniavirus, wie z.
B. rekombinantes MVA, in eine physiologisch unbedenkliche Form überführt. Bei
Vacciniaviren, insbesondere MVA läßt sich dies anhand der Erfahrung
bei der Herstellung von für
die Impfung gegen die Pockenkrankheit verwendeten Poxvirusimpfstoffen
(wie bei Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392 beschrieben)
durchführen.
Beispielsweise wird das aufgereinigte Virus bei –80°C mit einem Titer von 5 × 108 TCID50/ml, formuliert
in etwa 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7,4. Für die Herstellung von Impfstoffinjektionen
werden beispielsweise 101·109 Teilchen des rekombinanten Virus gemäß der vorliegenden
Erfindung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Phosphate-buffered saline,
PBS) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% Humanalbumin in einer Ampulle,
vorzugsweise einer Glasampulle, lyophilisiert. Als Alternative lassen
sich die Impfstoffinjektionen durch schrittweises Gefriertrocknen
des Virus in einer Formulierung herstellen. Dabei kann diese Formulierung
zusätzliche
Zusatzstoffe wie beispielsweise Mannit, Dextran, Zucker, Glycin,
Lactose oder Polyvinylpyrrolidon, oder andere Zusatzstoffe, wie
beispielsweise Antioxidantien oder Inertgas, Stabilisatoren oder
rekombinante Proteine (z. B. Humanserumalbumin), die sich zur In-vivo-Verabreichung
eignen, enthalten. Eine typische virushaltige, für die Gefriertrocknung geeignete
Formulierung umfaßt
10 mM Tris-buffer, 140 mM NaCl, 18,9 g/l Dextran (MW 36000–40000),
45 g/l Saccharose, 0,108 g/l L-Glutaminsäure, Monokaliumsalz-Monohydrat,
pH 7,4. Die Glasampulle wird anschließend verschlossen und kann
zwischen 4°C
und Raumtemperatur mehrere Monate lang gelagert werden. Allerdings
wird die Ampulle, falls kein Bedarf besteht vorzugsweise bei Temperaturen
unterhalb von –20°C gelagert.
-
Zur
Impfung oder Therapie kann das Lyophilisat oder das gefriergetrocknete
Produkt in 0,1 bis 0,5 ml einer wäßrigen Lösung, vorzugsweise Wasser,
physiologischer Kochsalzlösung
oder Tris-Puffer, gelöst
und entweder systemisch oder lokal, d. h. über den parenteralen, intramuskulären oder
einen beliebigen anderen, dem Fachmann bekannten Verabreichungsweg
verabreicht werden. Die Art der Verabreichung, die Dosis sowie die
Anzahl an Verabreichungen läßt sich
vom Fachmann in bekannter Weise optimieren. Somit betrifft die Erfindung
gemäß einer
verwandten Ausführungsform
ein Verfahren zur Beeinflussung, vorzugsweise Induzierung, einer
immunologischen Antwort in einem lebenden Tierkörper, einschließlich dem
Menschen, wobei man die Expressionskassette, die DNA, den Vektor,
die pharmazeutische Zusammensetzung oder den Impfstoff gemäß der vorliegenden
Erfindung dem zu behandelnden Tier oder Menschen verabreicht. Falls
es sich bei dem Impfstoff um ein Vacciniavirus handelt, insbesondere
MVA, umfaßt
eine typische Impfstoffinjektion für den Menschen wenigstens 102, vorzugsweise wenigstens 104,
stärker
bevorzugt wenigstens 106, noch stärker bevorzugt
107 oder 108, TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose) des Virus.
-
Falls
es sich bei dem Impfstoff um ein rekombinantes MVA, insbesondere
rekombinantes MVA-BN und seine Derivate, handelt, so kann das Virus
für eine "Prime-Boost"-Verabreichung verwendet
werden. Somit betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren, wobei
es sich bei dem Vektor um MVA, insbesondere um MVA-BN und seine
Derivate handelt, und wobei der Vektor oder die den Vektor umfassende
Zusammensetzung bzw. der den Vektor umfassende Impfstoff einem Tier,
einschließlich
dem Menschen, der dessen bedarf, in therapeutisch wirksamen Mengen
in einer ersten Inokulation ("Priming
Inoculation") und
in einer zweiten Inokulation ("Boosting
Inoculation") verabreicht
wird.
-
Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Einführung einer codierenden Sequenz
in eine Zielzelle, bei dem man den Vektor, die Expressionskassette
oder die DNA gemäß der vorliegenden
Erfindung in die Zielzelle einführt.
Falls es sich bei dem Vektor um ein Vacciniavirus, insbesondere
MVA, wie z. B. MVA-BN, handelt, so kann es sich bei der Zielzelle
um eine Zelle handeln, in der das Virus replizieren kann, wie beispielsweise
CEF- oder BHF-Zellen, oder es kann sich um eine Zelle handeln, die
mit MVA infiziert werden kann, in der das Virus jedoch nicht repliziert
(wie beispielsweise alle Arten von menschlichen Zellen für MVA-BN).
-
Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids,
Proteins und/oder Virus, wobei man in dem Verfahren eine Wirtszelle
mit einem Virusvektor gemäß der vorliegenden
Erfindung infiziert, anschließend
die infizierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert
und wiederum anschließend
das von der Wirtszelle produzierte Peptid und/oder Protein und/oder
die von der Wirtszelle produzierten Viren isoliert und/oder anreichert.
Falls das Virus gemäß der vorliegenden
Erfindung produziert, d. h. amplifiziert, werden soll, muß es sich
bei der Zelle um eine Zelle handeln, in der das Virus in der Lage
ist zu replizieren. Für Vacciniaviren,
insbesondere MVA, geeignete Zellen sind CEF- oder BHK-Zellen. Falls
ein von dem Virusvektor gemäß der vorliegenden
Erfindung codiertes Peptid/Protein produziert werden soll, so kann
es sich bei der Zelle um eine beliebige Zelle handeln, die mit dem
Virusvektor infiziert werden kann und die die Expression der viruscodierten
Proteine/Peptide gestattet.
-
Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids,
Proteins und/oder Virus, wobei man in dem Verfahren eine Zelle mit
der Expressionskassette, der DNA oder dem Plasmidvektor gemäß der vorliegenden
Erfindung transfiziert und anschließend die Zelle mit einem Vacciniavirus
infiziert. Dabei wird die infizierte Wirtszelle unter geeigneten
Bedingungen kultiviert. Ein weiterer Schritt umfaßt die Isolierung und/oder
Anreicherung des von der Wirtszelle produzierten Peptids und/oder
Proteins und/oder der von der Wirtszelle produzierten Viren. Der
Schritt der Infektion der Zellen mit einem Vacciniavirus kann dabei
vor oder nach dem Schritt der Transfektion der Zellen erfolgen.
-
Die
Erfindung betrifft ferner Zellen, die einen Promotor, eine DNA,
eine Expressionskassette oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung
enthalten. Insbesondere betrifft die Erfindung Zellen, die mit dem
Virusvektor gemäß der vorliegenden
Erfindung infiziert sind.
-
Kurze Beschreibung der Figuren
-
1:
GUS-Aktivität
nach Expression mit unterschiedlichen Promotoren. Zellen wurden
mit MVA-BN infiziert und mit den entsprechenden Plasmiden transfiziert.
Nach 48 Stunden wurden die Zellen extrahiert, und die GUS-Aktivität wurde
indirekt durch Messen der Extinktion bei 415 nM nach einer enzymatischen
Reaktion, die zur Entwicklung von gelber Farbe führt, bestimmt. Zex = Negativkontrolle
(MVA-BN-infizierte Zellen).
-
2:
GUS-Aktivität
nach früher
und früher/später Expression.
Zellen wurden mit MVA-BN infiziert und mit den entsprechenden Plasmiden
transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen extrahiert, und
die GUS-Aktivität
wurde indirekt durch Messen der Extinktion bei 415 nM nach einer
enzymatischen Reaktion, die zur Entwicklung von gelber Farbe führt, bestimmt.
Zex = Negativkontrolle (MVA-BN-infizierte Zellen). Für diese enzymatische
Reaktion mußten
Proben ohne (frühe
+ späte)
AraC-Expression 5 Stunden und diejenige mit AraC (frühe Expression) über Nacht
inkubiert werden, um eine Farbreaktion zu erhalten.
-
3:
GUS-Aktivität
nach Expression mit unterschiedlichen Promotoren. Zellen wurden
mit MVA-BN infiziert und mit den entsprechenden Plasmiden transfiziert.
Nach 24 Stunden wurden die Zellen extrahiert, und die GUS-Aktivität wurde
indirekt durch Messen der Extinktion bei 415 nM nach einer enzymatischen
Reaktion, die zur Entwicklung von gelber Farbe führt, bestimmt. Kontrolle =
Negativkontrolle (MVA-BN-infizierte Zellen).
-
Beispiele
-
Die
vorliegende Erfindung wird durch das folgende Beispiel bzw. die
folgenden Beispiele weiter veranschaulicht. Dem Fachmann ist dabei
gut ersichtlich, daß das
bereitgestellte Beispiel bzw. die bereitgestellten Beispiele in
keiner Weise so interpretiert werden dürfen, daß dadurch *0die Anwendbarkeit
der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Technologie
auf dieses Beispiel bzw. diese Beispiele beschränkt ist.
-
Beispiel 1: Analyse von Promotoren zur
Expression codierender Sequenzen im MVA-BN-Genom
-
1.1 Ziel des Experiments:
-
Das
Ziel dieser Analyse bestand darin, Promotoren zu identifizieren,
die sich zur Expression codierender Sequenzen im MVA-Genom, vorzugsweise
codierender Sequenzen, die zum natürlichen MVA-Genom heterolog
sind, eignen. Vor allem für
die Insertion von zwei oder mehr Genen in einer einzelnen Insertionsstelle ist
es vorteilhaft, unterschiedliche Promotoren für die Expression der einzelnen
Gene zu verwenden, um das Risiko von Rekombinationsereignissen,
die zur Deletion eines der Fremdgene führen könnten, zu reduzieren. Weiterhin
ist es wünschenswert,
Promotoren unterschiedlicher Stärke
zur Verfügung
zu haben, um die Möglichkeit
zu besitzen, die in rekombinantem MVA-BN inserierten Fremdgene in
variablen Mengen, je nach der Stärke
des Promotors zu exprimieren. Insgesamt wurden 11 mutmaßliche Promotoren
isoliert. Diese mutmaßlichen
Promotorsequenzen wurden in ein Plasmidrückgrat (pBSKS+) kloniert. Um
ihre potentielle Aktivität
zu analysieren, wurden die Promotoren mit dem GUS (E. coli-β-Glucuronidase)-Reportergen
fusioniert. BHK (Baby Hamster Kidney)-Zellen wurden mit MVA-BN infiziert
und mit den die mit dem GUS-Gen fusionierten mutmaßlichen Promotoren
enthaltenden Plasmiden transfiziert. War der Promotor funktionell,
so wurde GUS exprimiert und konnte über eine enzymatische Reaktion
für GUS
quantifiziert werden. Als Positivkontrolle sowie als Referenz wurden
die gut charakterisierten Vacciniavirus-Promotoren p7.5 und Ps mit
GUS fusioniert und parallel analysiert. Über die Messung der GUS-Expression wurden
die mutmaßlichen
Promotoren hinsichtlich Aktivität,
Stärke
und früher/später Expression
durchmustert. Die frühe/späte Expression
wurde durch Zugabe von AraC (Arabinosid Cytosin) zum Kulturmedium überprüft. Die
Promotoren, bei denen gezeigt werden konnte, daß sie funktionell sind, nämlich der
Ps, p7.5-, 7.5L- und ATI-Promotor, die bereits im Stand der Technik bekannt
waren, ebenso wie die neu identifizierten Promotorsequenzen, die
natürlicherweise
an der Expressionskontrolle der MVA-ORF's,
A42L, B9R, C7L, F6R, I2R, J6R, beteiligt sind, lassen sich vorzugsweise
für die Expression
von Fremdgenen in rekombinanten MVA-Konstrukten (recMVA-BN) einsetzen. 1.2 Material
Zellen: | BHK-Zellen |
Virus: | MVA-BN-Standard
rohe Stammlösung
(7,5 × 107 TCID50) |
DNA: | pAB.GUS
(Ps-Promotor + GUS) |
| pBNX71
(pBluescript + Vacciniavirus pr7.5 + GUS) |
| pBNX73
(pBluescript + Kuhpockenvirus ATI-Promotor + GUS) |
| pBN81
(pBluescript + modifizierter H5R-Promotor + GUS1) |
| pBN61
(pBluescript + MVA B1R-Promotor + GUS) |
| pBN62
(pBluescript + MVA B2R-Promotor + GUS) |
| pBN63
(pBluescript + MVA B3R-Promotor + GUS) |
| pBN60
(pBluescript + MVA A30R-Promotor + GUS) |
| pBN82
(pBluescript + Vacciniavirus 7.5 L-Promotor + GUS) |
| pBN83
(pBluescript + MVA C7L-Promotor (SEQ ID NO: 5 + GUS) |
| pBNX49
(pBluescript + MVA A42R-Promotor (SEQ ID NO: 1) + GUS) |
| pBNX69
(pBluescript + MVA I2R-Promotor (SEQ ID NO: 4) + GUS) |
| pBNX72
(pBluescript + MVA K5L-Promotor + GUS) |
| pBN83
(pBluescript + MVA F6R-Promotor (SEQ ID NO: 3) + GUS) |
| pBN84
(pBluescript + MVA B9R-Promotor (SEQ ID NO: 6 + GUS) |
Transfektionskit: | pBN85
(pBluescript + MVA J6R-Promotor (SEQ ID NO: 2 + GUS) |
| Effectene-Transfektionskit
(Qiagen) |
Medien
und Zusätze: | DMEM
(Gibco BRL) mit 10% FCS (Gibco BRL) |
Chemikalien
und Puffer: Lysepuffer | (PBS
+ 0,1 + 1 mM Proteaseinhibitor) |
AraC (Sigma,
Kat. Nr. C1768) |
GUS-Substrat
1 mM (p-Nitrophenyl-beta-(D)-glucuronid; Sigma, Kat. Nr. N1627) |
Stopplösung 2,5
M (2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol; Sigma, Kat. Nr. A9754 |
-
1.3 Methoden
-
Aussaat von Zellen
-
5 × 105 BHK-Zellen wurden pro Transfektionsreaktion
in eine Vertiefung einer 6-Loch-Platte ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5%
CO2 in DMEM/10% FCS gehalten.
-
Infektion/Transfektion
-
Zellen
wurden mit MVA-BN (MOI 0,1) in 0,5 ml DMEM/10% FCS pro Vertiefung
infiziert und 1 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert.
Die Transfektion wurde wie in der Vorschrift des Herstellers beschrieben
durchgeführt.
2 μg Plasmid
wurden in Puffer EB verdünnt
(Gesamtvolumen: 100 μl).
Nach Zugabe von 3,2 μl
Enhancer-Lösung
wurde die Lösung
gemischt und 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden
10 μl Effectene-Reagens
zugegeben, die Suspension wurde gemischt und 10 Min. bei Raumtemperatur
inkubiert. Die Virussuspension wurde von den Zellen abgetrennt und 1,6
ml DMEM/10% FCS wurden zugegeben. Zu dem DNA-Effectene-Gemisch wurden 0,6 ml DMEM/10%
FCS zugegeben und unter Drehen der Kulturplatte auf die Zellen aufgegeben.
Anschließend
wurden die Zellen je nach Analyse 7, 24 oder 48 Stunden inkubiert.
Zur Analyse der frühen/späten Expression
wurde das Medium während
der Infektion und Transfektion mit AraC (40 μg/ml) versetzt.
-
Ernten der Zellen
-
Medium
wurde von den Zellen abgetrennt, die dann mit 0,5 ml Lysepuffer
versetzt wurden. Nach 15 Min. Schütteln bei RT wurden die Zellen
im Lysepuffer abgeschabt, in ein 1,5 ml-Reaktionsröhrchen überführt und
am Vortex-Mischer kräftig
aufgewirbelt. Die lysierten Zellen wurden 1 Min. bei 500 rcf und
4°C zentrifugiert, und
der klare Überstand
wurde in ein frisches Röhrchen überführt und
bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
-
Bestimmung der GUS-Aktivität
-
10 μl Zellextrakt
(=Protein aus 2 × 104 Zellen) wurden zu 1 ml vorgewärmter Substratlösung (37°C) gegeben
und bei 37°C
inkubiert, bis sich eine gelbe Farbe entwickelte. Anschließend wurden
die Proben sofort auf Eis gegeben und mit 0,4 ml Stopplösung versetzt.
Die Extinktion bei 415 nm wurde bestimmt und mit der GUS-Aktivität gleichgesetzt,
da die Extinktionswerte zwischen 0,05 und 2,0 in einem linearen
Bereich liegen. Die Substratlösung
wurde als Referenz und ein Zellextrakt von mit MVA-BN infizierten
Zellen als Negativkontrolle verwendet.
-
1.4 Experimente und Ergebnisse
-
Experiment 1: Bestimmung der Funktion
mutmaßlicher
Promotoren
-
Für das erste
Experiment wurden alle Plasmide, die einen mutmaßlichen MVA-Promotor oder einen mit
dem GUS-Gen fusionierten
gut charakterisierten Promotor enthalten, analysiert. Zellen wurden
mit MVA-BN (MOI 0,1) infiziert und mit dem entsprechenden Plasmid
transfiziert. Die Zellen wurden nach 48 Stunden geerntet, lysiert,
und die GUS-Aktivität
wurde bestimmt. Dieses Experiment wurde durchgeführt, um zu bestimmen, welche
Promotoren funktionell sind. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
-
Die
Negativkontrolle (Extrakt aus mit MVA-BN infizierten Zellen) zeigte
eindeutig keine GUS-Aktivität (Zex;
Extinktion: 0,001). Der gut charakterisierte starke synthetische
Ps-Promotor erwies sich als sehr effizient (PS; Extinktion: 0,87),
da eine große
Menge an GUS nach 48 Stunden Expression nachweisbar war. Der ebenso
gut bekannte natürlich
vorkommende Vacciniavirus-pr7.5-Promotor zeigte ebenso eine ziemlich
hohe Aktivität
(p7.5; Extinktion: 0,41). Ebenso zeigt der späte Anteil von 2R7.5 (7.5L;
Extinktion: 0,25) eine deutlich nachweisbare Aktivität. Der Kuhpocken-ATI-Promotor
erwies sich eindeutig als sehr effizient für die Expression von Fremdgenen
durch MVA-BN (ATI; Extinktion: 0,76). Für die mutmaßlichen Promotorbereiche des MVA-BN-Genoms
konnte gezeigt werden, daß A42R
(A42; Extinktion: 0,48), B9R (B9; Extinktion: 0,06), C7L-(C7; Extinktion:
0,055), F6R (F6, Extinktion: 0,208), I2S (I2, Extinktion: 0,130)
und J6R (J6, Extinktion: 0,290) funktionsfähige Promotoren sind. Die Promotoren,
die sich im ersten vorläufigen
Experiment eindeutig als aktiv erwiesen (Extinktion: > 0,05), wurden ausführlicher
charakterisiert (Experiment 2).
-
Experiment 2: Charakterisierung der Expression
von Promotoren
-
Die
Promotoren, die Aktivität
in Experiment 1 zeigten, wurden bezüglich ihres Expressionsmusters charakterisiert.
Zu diesem Zweck wurden die mit MVA-BN infizierten und mit dem entsprechenden
Plasmid transfizierten Zellen mit AraC inkubiert. AraC hemmt die
DNA-Replikation, die eine essentielle Vorraussetzung für die späte Expression
von Genen während
des MVA-Replikationszyklus ist. Das gleiche Experiment wurde parallel
ohne Zugabe von araC durchgeführt.
Infizierte und transfizierte Zellen wurden nach 24 Stunden geerntet,
und die GUS-Aktivität
wurde in Dreifachbestimmung gemessen. In 2 ist die
mittlere Extinktion für
jede Probe dargestellt.
-
Nach
Inkubation ohne AraC (–AraC) über 24 Stunden
ist die gesamte GUS-Expression (früh + spät) bei allen Promotoren deutlich
nachweisbar (2: rechte Spalten). Die Stärke der
neu identifizierten Promotoren ist in absteigender Reihenfolge:
12R (12) > A42R (A42) > F6R (F6) > J6R (J6) > B9R (B9) = C7L (C7).
-
Es
konnte gezeigt werden, daß die
Promotoren B9, C7 und J6 hauptsächlich
an der späten
Expression während
des Lebenszyklus von MVA beteiligt sind, da die Inkubation mit AraC
(+AraC), das die späte
Expression hemmt, zu einem GUS-Expressionsniveau führt, das
mit dem der Negativkontrolle (Zex) vergleichbar ist. Zwar schien
der C7L-Promotor relativ schwach zu sein, doch gibt es mehrere Hinweise
darauf, daß er
eine wichtige Rolle während
der frühen
Expression spielt.
-
Die
Promotoren A42R, I2R und F6R zeigen eindeutig eine sehr effiziente
frühe Expression.
Wie bei der Bestimmung der frühen
Expression mußten
die Proben über
Nacht inkubiert werden, um eine nachweisbare Farbreaktion zu erhalten.
Diese Ergebnisse können
mit den Werten der frühen
+ späten
Expression (2: –AraC) nicht direkt verglichen
werden, da sie nur über
einen Zeitraum von 5 Stunden inkubiert wurden. Die Promotoren, die
eine frühe
Expression zeigten, wurden wiederum nach 7 Stunden Expression analysiert, wobei
die Ergebnisse nach 24 Stunden bestätigt werden konnten (Daten
nicht gezeigt).
-
1.5 Schlußfolgerung
-
Es
konnte eindeutig gezeigt werden, daß Promotoren unterschiedlicher
Stärke
erhalten werden konnten und daß nun
ein Spektrum unterschiedlicher Promotoren zur Verfügung steht,
die je nach Inkubationszeitraum und der Möglichkeit für MVA-BN zur Replikation unterschiedliche
Expressionsmuster zeigen. Ist die frühe + späte Expression bevorzugt, so
werden vorzugsweise die Promotoren A42R, I2R und F6R eingesetzt.
Sollte die frühe
Expression vermieden werden (z. B. bei Fremdgenen, die das Stoppsignal
TTTTTNT für
die frühe Expression
enthalten), so werden die Promotoren B9R, J6R oder C7L vorzugsweise
eingesetzt.
-
Beispiel 2: Analyse von aus SEQ ID NO:
1 bis 4 abgeleiteten Minimalpromotorelementen
-
In
Beispiel 1 konnten mehrere Sequenzen identifiziert werden, die sich
besonders zur Expression von Fremdgenen im MVA-Genom eignen. Um
zu überprüfen, ob
kürzere
Fragmente den gleichen Zweck erfüllen, wurden
zusätzliche
Experimente durchgeführt.
Dabei wurden kürzere
Fragmente der SEQ ID NO: 1 bis 4 mittels PCR isoliert und in ein
Plasmidrückgrat
(pBSKS+) kloniert. Insgesamt wurden 6 mutmaßliche Minimalpromotoren getestet.
Um deren potentielle Aktivität
zu analysieren, wurden die Promotoren mit dem GUS-Reportergen fusioniert.
BHK-Zellen wurden mit MVA-BN infiziert und mit die mit dem GUS-Gen
fusionierten mutmaßlichen
Minimalpromotoren enthaltenden Plasmiden transfiziert. Über die
Messung der GUS-Expression wurden die mutmaßlichen Promotoren auf Aktivität und Stärke der
Expression durchmustert (siehe Beispiel 1). Als Positivkontrolle
und als Referenz wurde der gut charakterisierte späte Vacciniavirus-Promotor
Ps mit GUS fusioniert und parallel analysiert. Die MinimalPromotorelemente
von etwa 30 Bp lassen sich zur Expression von Fremdgenen in rekombinanten
MVA-Konstrukten
(recMVA-BN) einsetzen, ohne daß die
Gefahr einer homologen Rekombination zwischen den homologen Sequenzen
des ursprünglichen
und des zusätzlich
klonierten Promotors besteht.
-
2.1 Material und Methode
-
Falls
nicht anders angegeben entsprechen die in Beispiel 2 verwendeten
Materialien und Methoden den Methoden in Beispiel 1. Die PCR wurde
nach Standardtechniken ausgeführt.
-
2.2 Experimente und Ergebnisse
-
Fusion
von Promotoren mit dem GUS-Gen mittels PCR Die PCR-Reaktionen führten zur
Fusion der folgenden MinimalPromotorsequenzen mit dem GUS-Gen:
-
Alle
mutmaßlichen,
mit dem GUS-Gen fusionierten Minimalpromotoren wurden in pBSKS+
kloniert und sequenziert.
-
Bestimmung der Funktion der mutmaßlichen
Minimalpromotoren
-
Um
die Funktionalität
der mutmaßlichen
Minimalpromotorelemente zu analysieren, wurden die BHK-Zellen mit MVa-BN
(MOI 1,0) infiziert und mit dem entsprechenden Plasmid transfiziert.
Die Zellen wurden nach 24 Stunden geerntet, lysiert, und die GUS-Aktivität wurde
bestimmt (3).
-
Die
Negativkontrolle (Extrakt aus mit MVA-BN infizierten Zellen) zeigte
eindeutig keine GUS-Aktivität (Kontrolle;
mittlere Extinktion: 0,00167). Der gut charakterisierte starke synthetische
Ps-Promotor erwies
sich als sehr effizient (Ps; mittlere Extinktion: 2,05267), da eine
große
Menge an GUS nach 24 Stunden Expression nachweisbar war. Für die mutmaßlichen
Promotor-Minimalpromotorelemente des MVA-BN-Genoms konnte gezeigt werden, daß F6R short
early, F6R short late, I2R short early, I2 short late, A42R short
late und JR6 short late alle funktionsfähige Promotoren darstellen.
-
Insgesamt
wurden sechs funktionsfähige
MinimalPromotorelemente isoliert. Dabei eignen sich zwei für die schwächere frühe Transkription
(I2R short early: mittlere Extinktion: 0,06933; FR6 short early:
mittlere Extinktion 0,189) und vier für die späte Expression auf unterschiedlichen
Niveaus (FR6 short late: mittlere Extinktion 0,09833; I2R short
late: mittlere Extinktion 0,391; J6R short late: mittlere Extinktion:
0,80167 und A42R short late: mittlere Extinktion 2,07).
-
2.3 Schlußfolgerung
-
Es
konnte eindeutig gezeigt werden, daß Promotoren unterschiedlicher
Stärke
isoliert werden konnten und daß nun
ein Spektrum unterschiedlicher Promotoren zur Verfügung steht.
Ist die frühe
Expression bevorzugt, so wird vorzugsweise der Minimalpromotor F6R
short early oder I2R short early eingesetzt. Ist die späte Expression
bevorzugt und sollte die frühe
Expression vermieden werden (z. B. bei Fremdgenen, die das Stoppsignal
TTTTTNT für
die frühe
Expression enthalten), so werden vorzugsweise die MinimalPromotorelemente F6R
short late, I2R short late, J6R short late und A42R short late eingesetzt. SEQUENZPROTOKOLL