DE602004009743T2

DE602004009743T2 - Promotoren zur Expression in modifiziertem Vaccinia Virus Ankara

Info

Publication number: DE602004009743T2
Application number: DE602004009743T
Authority: DE
Inventors: Sonja Dr. Leyrer
Original assignee: Bavarian Nordic AS
Current assignee: Bavarian Nordic AS
Priority date: 2003-11-24
Filing date: 2004-01-17
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2024-01-18
Also published as: EP1845164A2; IL199128A; EP1956094B1; WO2005054484A1; ATE420191T1; US20110014242A1; CN1898390A; EP1956094A1; DK1845164T3; JP2007512009A; KR20060109873A; IL199126A; EA200601043A1; NZ547405A; BRPI0416916A; DE602004027767D1; EP1845164B1; EP1689872A1; DE602004009743D1; EP1536015A1

Description

Die Erfindung betrifft Promotoren, insbesondere für die Expression von Genen und/oder codierenden Sequenzen in Vacciniaviren, wie beispielsweise dem modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA). Ferner betrifft die Erfindung den Promotor enthaltende Expressionskassetten, die Expressionskassetten enthaltende Vektoren ebenso wie pharmazeutische Zusammensetzungen und Impfstoffe.
Stand der Technik
Rekombinante Poxviren finden breite Anwendung bei der Expression von Fremdantigenen in infizierten Zellen. Zudem werden rekombinante Poxviren zur Zeit als sehr vielversprechende Impfstoffe getestet, um eine Immunantwort gegen das von dem Poxvirenvektor exprimierte Fremdantigen zu induzieren. Am beliebtesten sind dabei einerseits Avipoxviren und andererseits Vacciniaviren, insbesondere das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA). MVA ist mit dem Vacciniavirus, einem Mitglied der Gattung Orthopoxvirus in der Familie Poxviridae, verwandt. MVA wurde durch 516 aufeinanderfolgende Passagierungen des Ankara-Stamms von Vacciniavirus auf Hühnerembryofibroblasten (CVA) erzeugt (für eine Übersicht siehe Mayr, A., et al. Infection 3, 6–14 [1975]). Als Folge dieser Langzeitpassagierungen sind im erhaltenen MVA-Virus etwa 31 Kilobasen seiner genomischen Sequenz deletiert, und daher wurde dieses Virus als stark wirtszellenbeschränkt (auf Vogelzellen) beschrieben (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031–1038 [1991]). In verschiedenen Tiermodellen konnte gezeigt werden, daß das erhaltene MVA in signifikanter Weise avirulent war (Mayr, A. & Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41: 225–34]. Darüber hinaus wurde dieser MVA- Stamm in klinischen Versuchsreihen als Impfstoff zur Immunisierung gegen die menschliche Pockenkrankheit getestet (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375–390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392 [1974]).
Aus US 5,736,368 und US 6,051,410 ist der rekombinante Vacciniavirusstamm Wyeth bekannt, der HIV-Antigene und -proteine exprimiert. Aus der US 5,747,324 ist ein rekombinanter Vacciniavirusstamm, NYCBH, bekannt, der Lentivirusgene exprimiert. Aus der EP 0 243 029 ist ein rekombinanter Vacciniavirusstamm, Western Reserve, bekannt, der menschliche Retrovirusgene exprimiert. Aus der WO 02/42480 sind besonders sichere und abgeschwächte MVA-Stämme bekannt. Rekombinante MVA sind unter anderem in WO 98/13500 und WO 03/048184 offenbart.
Für die Expression heterologer Gene in Poxviren sind dem Fachmann nur wenige Promotoren bekannt, wie beispielsweise die 30K- und 40K-Promotoren (siehe z. B. US 5,747,324 ), ein starker synthetischer früher/später Promotor (siehe z. B. Sutter et al., Vaccine (1994), 12, 1032–40), der P7.5-Promotor (siehe z. B. Endo et al., J. Gen. Virol. (1991) 72, 699–703) und der aus dem ATI (A-Type Inclusion)-Gen des Kuhpockenvirus stammende Promotor (Li et al., J. Gen. Virol. (1998) 79, 613). Alle diese Promotoren wurden in rekombinanten Vacciniaviren eingesetzt, um heterologe Gene zu exprimieren, wobei gezeigt werden konnte, daß sie diese Gene exprimieren, was zur Produktion des von dem heterologen Gen codierten Proteins führte. Da nur wenige Promotoren für die Expression von Genen in Vacciniavirus-Expressionssystemen zur Verfügung stehen, besteht ein allgemeiner Bedarf an alternativen Promotoren in Vacciniaviren. Darüber hinaus handelt es sich bei allen bislang bekannten Promotoren um ziemlich starke späte Promotoren, d. h. mit Eignung zur Expression von Genen nach erfolgter Replikation des Vacciniavirus-Vektors. Bei einigen Anwendungen ist es wünschenswert, im Besitz von Promotoren zu sein, die die Expression von Genen unmittelbar nach der Infektion der Zellen gestatten, d. h. dort besteht ein Bedarf an frühen Vacciniavirus-Promotoren.
Zudem handelt es sich, wie oben erläutert, bei MVA um ein sehr vielversprechendes Virus für die Expression heterologer Gene, und zwar aufgrund seines verbesserten Sicherheitsprofils. Allerdings wurden alle bislang für die Expression heterologer Gene in MVA bekannten Promotoren aus anderen Vacciniaviren isoliert, oder es handelt sich dabei um synthetische Promotoren für die Expression in einem anderen Vacciniavirus. Somit besteht ebenso ein Bedarf an für die Expression in MVA optimierten Promotoren.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft aus dem Genom des modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) stammende Promotoren. Bislang waren noch keine MVA-Promotoren im Fachgebiet bekannt.
Insbesondere betrifft die Erfindung einen Promotor, umfassend oder bestehend aus einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe:

(i) die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3. Als Beispiele sind auch andere aus dem Genom des modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) stammende Promotorsequenzen aufgeführt.
(ii) Teilsequenzen der Sequenz gemäß einer der SEQ ID NO: 3.
(iii) Sequenzen mit einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen in Bezug auf die Sequenzen mit der in (i) oder (ii) angegebenen Bedeutung.

SEQ ID NO: 1 bis 6 sind natürlicherweise Bestandteil des MVA-Genoms und stromaufwärts zu den Leserastern A42R, J6R, F6R, I2R, C7L bzw. B9R lokalisiert.
Die Promotoren gemäß der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise als Vacciniavirus-Promotoren aktiv oder als Promotoren in mit Vacciniavirus infizierten Zellen aktiv. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vacciniavirus um MVA, insbesondere einen der MVA-Stämme, wie sie unten aufgeführt sind. "Aktiv als Vacciniavirus-Promotor" bedeutet, daß der Promotor in der Lage ist, die Expression eines Gens, mit dem er in einem Vacciniavirus in operativer Verknüpfung steht, nach der Infektion von Zellen mit dem Virus zu steuern. Bei den Zellen handelt es sich vorzugsweise um Zellen, die die späte und/oder frühe Expression des Vacciniavirus gestatten. Zu "einem in mit Vacciniavirus infizierten Zellen aktiven Promotor" zählt auch die Situation, bei der der Promotor nicht Bestandteil eines Vacciniavirusgenoms ist und beispielsweise Teil eines Plasmids oder eines viralen Nicht-Vacciniavirusgenoms ist; in einer solchen Situation ist der Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung" aktiv, falls die den Promotor enthaltende Zelle auch ein Vacciniavirusgenom umfaßt, z. B. falls die Zelle mit einem Vacciniavirus infiziert ist. Unter diesen Umständen erkennt die virale RNA-Polymerase den Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung, und die Expression des Gens bzw. der codierenden Sequenz, das bzw. die mit dem Promotor verknüpft ist, wird aktiviert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung besteht die Möglichkeit, den Promotor, wie er in der SEQ ID NO: 3 angegeben ist, zu verwenden. Der Promotor der tatsächlich zur Steuerung der Expression des Gens bzw. der codierenden Sequenz verwendet wird, kann aus der SEQ ID NO: 3 bestehen oder es kann sich dabei um eine größere Struktur handeln, die die SEQ ID NO: 3 umfaßt. Als Alternative liegt es im Umfang der vorliegenden Erfindung, ein Derivat dieser Promotoren zu verwenden, wobei es sich um eine Teilsequenz der Sequenzen mit der in SEQ ID NO: 1 bis 6 angegebenen Bedeutung handeln kann. Der Begriff "Teilsequenz der Sequenzen gemäß einer der SEQ ID NO: 1 bis 6" bezieht sich auf kürzere Fragmente einer der SEQ ID NO: 1 bis 6, die noch als Promotor aktiv sind, insbesondere als Promotor in Vacciniavirus oder in mit Vacciniavirus infizierten Zellen. Wiederum handelt es sich bei dem Vacciniavirus vorzugsweise um MVA, wie beispielsweise einen der unten angegebenen Stämme. Eine typische Teilsequenz einer der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 weist eine Länge von wenigstens 15 Nukleotiden, stärker bevorzugt von wenigstens 20 Nukleotiden, noch stärker bevorzugt von wenigstens 25 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt von wenigstens 30 Nukleotiden, einer der Sequenzen der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 auf.
Eine Teilsequenz der SEQ ID NO: 1 ist die SEQ ID NO: 7. Eine Teilsequenz der SEQ ID NO: 2 ist die SEQ ID NO: 8. Bevorzugte Teilsequenzen und/oder Derivate der Teilsequenzen der SEQ ID NO: 3 sind die SEQ ID NO: 9 und die SEQ ID NO: 10. Teilsequenzen der SEQ ID NO: 4 sind die SEQ ID NO: 11 und die SEQ ID NO: 12. Die Sequenzen der SEQ ID NO: 6 bis 12 sind im Beispielteil aufgeführt.
Bei dem Derivat des eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 3 oder Teilsequenzen davon umfassenden oder daraus bestehenden Promotors, insbesondere dem Derivat der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 12, kann es sich auch um eine Sequenz handeln, die eine oder mehrere Nukleotidsubstitionen, -deletionen und/oder -insertionen in Bezug auf die Sequenz SEQ ID NO: 3 oder Teilsequenzen davon, insbesondere der Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10, aufweist. Die Derivate gemäß der vorliegenden Erfindung sind dabei noch als Promotor, insbesondere als Vacciniavirus-Promotor, stärker bevorzugt als MVA-Promotor, aktiv. Bei einer Sequenz mit einer oder mehreren Nukleotidsubstitionen handelt es sich um eine Sequenz, bei der ein oder mehrere Nukleotide der Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 3 oder von Teilsequenzen davon, wie beispielsweise der Sequenzen gemäß der SEQ ID NO: 9 oder 10, durch unterschiedliche Nukleotide substituiert sind. Bei einer Sequenz mit einer oder mehreren Nukleotidinsertionen handelt es sich um eine Sequenz, bei der ein oder mehrere Nukleotide an einem oder mehreren Orten der SEQ ID NO: 3 oder Teilsequenzen davon, insbesondere der Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 9 oder 10, inseriert sind. Bei einer Sequenz mit einer oder mehreren Nukleotiddeletionen handelt es sich um eine Sequenz, bei der ein oder mehrere Nukleotide der Sequenz gemäß der SEQ ID NO: 3 oder von Teilsequenzen davon, insbesondere der Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO: 9 oder 10, deletiert sind. Bei den Derivaten gemäß der vorliegenden Erfindung können Deletionen, Substitutionen und Insertionen kombiniert in einer Sequenz vorliegen.
Ein Beispiel für ein Derivat einer Teilsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung ist die SEQ ID NO: 10, bei der es sich um eine Teilsequenz der SEQ ID NO: 3 mit einem zusätzlichen Nukleotidaustausch in Bezug auf die entsprechende Nukleotidsequenz in der SEQ ID NO: 3 handelt.
Vorzugsweise weist das Derivat beim Vergleich mit der Sequenz der SEQ ID NO: 3 oder Teilsequenzen davon, insbesondere den Sequenzen gemäß der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10, eine Homologie von wenigstens 40%, stärker bevorzugt von wenigstens 60%, noch stärker bevorzugt von wenigstens 80%, am stärksten bevorzugt von wenigstens 90% auf. Gemäß der am stärksten bevorzugten Ausführungsform sind in der Sequenz einer der SEQ ID NO: 9 oder SEQ ID NO: 10 nicht mehr als 10 Nukleotide, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 5 Nukleotide, substituiert, deletiert und/oder inseriert.
Eine Reihe von Dokumenten des Standes der Technik gestattet dem Fachmann, vorherzusagen, welche Derivate oder Teilsequenzen einer der SEQ ID NO: 1 bis 12 noch die biologische Aktivität in Form der Aktivität als ein Vacciniavirus-Promotor, insbesondere als ein in MVA aktiver Promotor, aufweisen. In diesem Zusammenhang wird auf Chakrarbarti et al., Biotechniques (1997) 23, 1094–1097 und Davison und Moss, J. Mol. Biol. (1989) 210, 771–784 Bezug genommen. Zudem läßt sich vom Fachmann leicht beurteilen, ob ein Fragment noch als Vacciniavirus-Promotor, insbesondere als MVA-Promotor, aktiv ist. Insbesondere läßt sich das Sequenzderivat stromaufwärts eines Reportergens in einem Plasmidkonstrukt klonieren. Dieses Konstrukt kann in eine eukaryontische Zelle oder Zellinie, wie z. B. CEF- oder BHK-Zellen, die mit MVA infiziert wurde, transfiziert werden. Die Expression des Reportergens wird bestimmt und mit der Expression des von dem Promotor gemäß einer der SEQ ID NO: 1 bis 6 kontrollierten Reportergens verglichen. Ein Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung ist dabei ein Derivat mit einer Promotoraktivität in dem Testsystem von wenigstens 10%, vorzugsweise von wenigstens 30%, stärker bevorzugt von wenigstens 50%, noch stärker bevorzugt von wenigstens 70%, am stärksten bevorzugt von wenigstens 90%, im Vergleich mit der Aktivität der Promotorsequenz einer der SEQ ID NO: 3. Ebenso liegen diejenigen Derivate einer der SEQ ID NO: 3, 9 oder 10 im Umfang der vorliegenden Erfindung, die eine höhere Promotoraktivität aufweisen.
Die Promotoren gemäß der vorliegenden Erfindung eignen sich insbesondere für die Expression codierender Sequenzen in MVA. Ebenso werden andere Promotorsequenzen, die aus dem Genom des modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) stammen, als Beispiel beschrieben. Der Promotor gemäß der SEQ ID NO: 1 weist eine sehr starke Aktivität auf, insbesondere als später Promotor. Doch kann er auch als früher Promotor eingesetzt werden. Die gleichen Überlegungen gelten für die entsprechenden Teilsequenzen wie beispielsweise die Sequenz der SEQ ID NO: 7, welche sich allerdings besonders als später Promotor eignet.
Der Promotor gemäß der SEQ ID NO: 2 weist ebenso eine ziemlich starke Aktivität auf, insbesondere als später Promotor. Er läßt sich ebenso als früher Promotor einsetzen. Die gleichen Überlegungen gelten für die entsprechenden Teilsequenzen, wie beispielsweise die Sequenz der SEQ ID NO: 8, die sich allerdings besonders als später Promotor eignet.
Der Promotor gemäß der SEQ ID NO: 3 eignet sich insbesondere als früher Promotor und weist die höchste frühe Promotoraktivität aller gestesteten Promotoren auf. Allerdings läßt er sich ebenso als später Promotor einsetzen. Die gleichen Überlegungen gelten für die entsprechenden Teilsequenzen, wie beispielsweise die Sequenzen der SEQ ID NO: 9 bzw. 10. Von diesen Teilsequenzen eignet sich die SEQ ID NO: 9 besonders als früher Promotor und die SEQ ID NO: 10 besonders als später Promotor.
Der Promotor gemäß der SEQ ID NO: 4 eignet sich insbesondere dann, falls man vorhat, eine verknüpfte codierende Sequenz früh und spät zu exprimieren, da dieser Promotor eine ziemlich hohe Aktivität sowohl unter frühen als auch unter späten Bedingungen aufweist. Die gleichen Überlegungen gelten für die entsprechenden Teilsequenzen, wie beispielsweise die Sequenzen der SEQ ID NO: 11 bzw. 12. Von diesen Teilsequenzen eignet sich die SEQ ID NO: 11 besonders als früher Promotor und die SEQ ID No: 12 besonders als später Promotor.
Die Promotoren gemäß der SEQ ID NO: 5 und 6 eignen sich insbesondere dann, falls man vorhat, verknüpfte codierende Sequenzen in eher geringen Mengen zu exprimieren. Dies ist manchmal wünschenswert, wenn die verknüpfte codierende Sequenz für ein toxisches Genprodukt codiert und/oder wenn man vorhat, eine Immunantwort mit hoher Avidität zu induzieren.
Der Begriff "früher Promotor" bezieht sich auf Promotoren, die in Vacciniavirus oder in mit Vacciniavirus infizierten Zellen aktiv sind, bevor die virale DNA-Replikation stattgefunden hat. Dem Fachmann sind dabei Verfahren bekannt, wie sich überprüfen läßt, ob es sich bei einem Promotor um einen frühen Promotor handelt. Insbesondere läßt sich der interessierende Promotor stromaufwärts eines Reportergens inserieren. Das den Promotor und das Reportergen umfassende Konstrukt wird in Zellen eingeführt, die mit einem Vacciniavirus infiziert werden. Um die Aktivität als früher Promotor zu beurteilen, werden die Zellen mit einer Substanz inkubiert, die die DNA-Replikation hemmt, wie beispielsweise AraC. Die DNA-Replikation ist eine Vorbedingung für die späte Promotoraktivität. Somit liegt eine eventuell in diesem Testsystem gemessene Promotoraktivität an Elementen, die als früher Promotor aktiv sind. Dementsprechend bezieht sich der Begriff "später Promotor" auf alle Promotoren, die aktiv sind, nachdem die DNA-Replikation stattgefunden hat. Die späte Aktivität läßt sich auch mit dem Fachmann bekannten Verfahren messen. Aus Gründen der Einfachheit bezieht sich der Begriff "später Promotor" wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, auf die Aktivität eines Promotors, die dann bestimmt wird, wenn keine Substanz, die die DNA-Replikation blockiert, zugegeben wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Expressionskassette, die den Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung sowie eine codierende Sequenz umfaßt, wobei die Expression der codierenden Sequenz von dem Promotor kontrolliert wird. Bei der codierenden Sequenz kann es sich um eine beliebige codierende Sequenz handeln. Vorzugsweise kann die codierende Sequenz für wenigstens ein antigenes Epitop oder Antigen, therapeutische Peptide oder Proteine, Antisense-RNA oder Ribozyme codieren. Falls die codierende Sequenz für ein antigenes Epitop oder Antigen codiert, so kann die Expressionskassette zur Expression des Antigens nach Einführung der Expressionskassette in Zellen in einem Organismus, z. B. einem Säugetier, einschließlich dem Menschen, verwendet werden. Die Präsentierung des Antigens/Epitops kann eine Immunantwort in dem Organismus hervorrufen, die zu einer Impfung des Organismus gegen das Agens, aus dem das Antigen/Epitop stammt, führen kann. Insbesondere kann das Epitop/Antigen Teil einer größeren Aminosäuresequenz, wie beispielsweise eines Polyepitops, Peptids oder Proteins sein. Mögliche Beispiele für solche Polyepitope, Peptide oder Proteine sind aus (i) Viren, wie z. B. HIV, HTLV, Herpesvirus, Denguevirus, Poliovirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Rubellavirus, Hepatitisviren usw., (ii) Bakterien, (iii) Pilzen stammende Polyepitope, Peptide oder Proteine.
Als Alternative kann die codierende Sequenz für eine therapeutische Verbindung wie beispielsweise Interleukine, Interferone, Ribozyme oder Enzyme codieren.
Falls der Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung zu einem natürlich vorkommenden Promotor identisch ist, unterscheiden sich die codierende Sequenz und/oder die zwischen dem Promotor und der codierenden Sequenz liegenden Sequenzen von den entsprechenden Sequenzen, mit denen der Promotor natürlicherweise verknüpft ist. Der Begriff "unterscheiden" bezieht sich in diesem Zusammenhang auf Sequenzen, die wenigstens einen Nukleotidunterschied in der Sequenz zeigen. Besonders bevorzugt ist es die codierende Sequenz, die wenigstens einen Nukleotidunterschied aufweist. Am stärksten bevorzugt codiert die codierende Sequenz für ein Peptid/Protein mit einem Unterschied von wenigstens einer Aminosäure im Vergleich mit dem von der codierenden Sequenz codierten natürlich vorkommenden Protein.
Allgemeiner gesagt, betrifft die Erfindung eine beliebige Nukleinsäuresequenz, die den Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder die Expressionskassette gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt. Bei der Nukleinsäure kann es sich um RNA handeln, beispielsweise wenn der Promotor Teil eines Retrovirusgenoms ist. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Nukleinsäure um DNA. Diese kann eine beliebige Art von DNA sein, wie beispielsweise lineare, zirkuläre, einzelsträngige oder doppelsträngige DNA.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der Promotor und/oder die Expressionskassette gemäß der vorliegenden Erfindung Teil eines Vektors sein. Dabei bezieht sich der Begriff "Vektor" auf alle dem Fachmann bekannten Vektoren. Ein Vektor kann ein Plasmidvektor, wie beispielsweise pBR322 oder ein Vektor der pUC-Reihe sein. Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Vektor um einen Virusvektor. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "viraler Vektor" oder "Virusvektor" auf ein infektiöses Virus, das ein virales Genom umfaßt. In diesem Fall ist die DNA der vorliegenden Erfindung Teil des viralen Genoms des jeweiligen viralen Vektors. Das rekombinante virale Genom wird verpackt, wobei sich die erhaltenen rekombinanten Vektoren zur Infektion von Zellen und Zellinien, insbesondere zur Infektion von lebenden Tieren, einschließlich dem Menschen verwenden lassen. Typische Virusvektoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind adenovirale Vektoren, retrovirale Vektoren oder Vektoren auf der Basis des adeno-assoziierten Virus 2 (AAV2). Am stärksten bevorzugt sind Poxvirusvektoren. Bei dem Poxvirus kann es sich vorzugsweise um ein Canarypoxvirus, ein Fowlpoxvirus oder ein Vacciniavirus handeln.
Stärker bevorzugt ist das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) (Sutter, G et al. [1994], Vaccine 12: 1032–40; Antoine G. et al. [1998], Virology 244: 365–396). Der Begriff "MVA", wie er in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf einen beliebigen, im Stand der Technik bekannten MVA-Stamm. Ein Beispiel für einen MVA-Stamm stellt die Hinterlegung VR-1508, hinterlegt bei der American Type Culture collection (ATCC), Manassas, VA 20108, USA dar. Weitere Beispiele für gemäß der vorliegenden Erfindung verwendetet MVA-Virusstämme sind die Stämme MVA 572 und 575, hinterlegt bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK) mit der Hinterlegungsnummer ECACC V94012707 bzw. ECACC V00120707, MVA-BN mit der Hinterlegungsnummer ECACC V00083008.
Der am stärksten bevorzugte MVA-Stamm ist MVA-BN oder ein Derivat davon. Die Merkmale von MVA-BN, die Beschreibung der biologischen Tests, die eine Beurteilung darüber gestatten, ob es sich bei einem MVA-Stamm um MVA-BN oder ein Derivat davon handelt, sowie Verfahren, mit denen sich MVA-BN oder ein Derivat davon gewinnen läßt, sind in der WO 02/42480 offenbart. Der Gehalt dieser Anmeldung ist in der vorliegenden Anmeldung durch Bezugnahme aufgenommen. In dieser Literaturstelle wird auch offenbart, wie MVA und andere Vacciniaviren vermehrt werden können. Kurz gesagt werden dabei eukaryontische Zellen mit dem Virus infiziert. Bei den eukaryontischen Zellen handelt es sich um Zellen, die für eine Infektion mit dem jeweiligen Poxvirus anfällig sind und die Replikation und Produktion von infektiösem Virus gestatten. Bei MVA sind diese Art von Zellen beispielsweise Hühnerembryofibroblasten (Chicken Embryo Fibroblasts, CEF) sowie BHK-Zellen (Drexler I., Heller K., Wahren B., Erfle V. und Sutter G. "Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells" J. Gen. Virol. (1998), 79, 347–352). CEF-Zellen lassen sich unter Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, kultivieren. Vorzugsweise werden dabei die CEF-Zellen in serumfreiem Medium in ruhenden Kolben oder Rollerflaschen kultiviert. Die Inkubation findet vorzugsweise über einen Zeitraum von 48–96 Stunden bei 37°C ± 2°C statt. Für die Infektion wird das MVA vorzugsweise mit einer MOI (Multiplicity of Infection) von 0,05 bis 1 TCID₅₀ eingesetzt, und die Inkubation erfolgt vorzugsweise über einen Zeitraum von 48–72 Stunden bei 37°C ± 2°C. Dem Fachmann sind Verfahren dazu bekannt, wie die Expressionskassette oder der Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung in ein virales Genom, insbesondere in das Genom eines Vacciniavirus, am stärksten bevorzugt in das Genom von MVA, inseriert werden kann. Beispielsweise kann die Expressionskässette oder der Promotor oder das Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung in das Genom von MVA durch homologe Rekombination inseriert werden. Hierzu wird eine Nukleinsäure in eine permissive Zellinie wie z. B. CEF- oder BHK-Zellen transfiziert, wobei die Nukleinsäure die Expressionskassette oder den Promotor oder das Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung, flankiert von Nukleotidabschnitten, die zum Bereich des MVA-Genoms, in das die Expressionskassette oder der Promotor oder das Derivat davon gemäß der vorliegenden Erfindung inseriert werden soll, homolog sind, umfaßt. Die Zellen werden mit MVA infiziert, wobei in den infizierten Zellen eine homologe Rekombination zwischen der Nukleinsäure und dem viralen Genom stattfindet. Als Alternative besteht auch die Möglichkeit, die Zellen zunächst mit MVA zu infizieren und danach die Nukleinsäure in die infizierten Zellen zu transfizieren. Wiederum findet eine Rekombination in den Zellen statt. Das rekombinante MVA wird anschließend mit im Stand der Technik bekannten Verfahren selektioniert. Die Konstruktion von rekombinantem MVA ist dabei nicht auf dieses bestimmte Verfahren beschränkt. Statt dessen können hierzu alle dem Fachmann bekannten geeigneten Verfahren verwendet werden.
Die Expressionskassette oder der Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einen beliebigen geeigneten Teil des Vektors, insbesondere in ein virales Genom, eingeführt werden. Im Falle von Vacciniaviren kann die Insertion in nicht essentielle Teile des viralen Genoms oder in einen Zwischengenbereich des viralen Genoms erfolgen. Der Begriff "Zwischengenbereich" bezieht sich vorzugsweise auf diejenigen Teile des zwischen zwei benachbarten Genen liegenden viralen Genoms, die keine codierenden Sequenzen umfassen. Falls es sich bei dem Vektor um MVA handelt, kann die Insertion auch in eine natürlich vorkommende Deletionsstelle des viralen Genoms erfolgen. Der Begriff "natürlich vorkommende Deletionsstelle" bezieht sich dabei auf diejenigen Teile des viralen Genoms, die im Bezug auf das Genom des Vacciniavirusstamms Copenhagen deletiert sind. Allerdings sind die Insertionsstellen nicht auf diese bevorzugten Insertionsstellen im Vacciniavirus-Genom und dem MVA-Genom beschränkt, da es im Umfang der vorliegenden Erfindung liegt, daß die Expressionskassette irgendwo im viralen Genom inseriert werden kann, solange es möglich ist, Rekombinanten zu gewinnen, die sich in wenigstens einem Zellkultursystem, wie beispielsweise CEF-Zellen (Chicken Embryo Fibroblasts), amplifizieren und vermehren lassen.
Der Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung kann zur Expression eines Gens verwendet werden, das bereits Teil des Vektors, beispielsweise des Genoms von MVA, ist. Bei einem solchen Gen kann es sich um ein Gen handeln, das natürlicherweise Teil des viralen Genoms ist, oder um ein Fremdgen, das bereits in den Vektor inseriert wurde. In diesen Fällen wird der Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung im Vektor stromaufwärts von dem Gen, dessen Expression von dem Promotor kontrolliert werden soll, inseriert. Ein eine Expressionskassette gemäß der vorliegenden Erfindung umfassender MVA-Vektor läßt sich auch herstellen, indem das offene Leseraster F6R durch eine codierende Sequenz, deren Expression von dem natürlicherweise die Expression des offenen Leserasters kontrollierenden Promotor kontrolliert werden soll, ersetzt wird. In dem erhaltenen Konstrukt wird die codierende Sequenz von einem Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung kontrolliert. Diese Expressionskassetten liegen ebenso im Umfang der vorliegenden Erfindung.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung den Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung als Impfstoff oder Arzneimittel. Allgemeiner gesagt betrifft die Erfindung einen Impfstoff oder eine pharmazeutische Zusammensetzung, der bzw. die eine Expressionskassette, eine DNA oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt. Dem Fachmann sind dabei Verfahren bekannt, wie der Impfstoff bzw. die pharmazeutische Zusammensetzung dem tierischen oder menschlichen Körper verabreicht werden kann. Im Falle von DNA und Plasmidvektoren lassen sich die DNA bzw. der Vektor einfach durch Injektion verabreichen. Falls es sich bei dem Vektor um einen viralen Vektor wie beispielsweise einen Vacciniavirus-Vektor, insbesondere einen MVA-Vektor, handelt, so kann dieser ebenfalls dem tierischen oder menschlichen Körper nach dem Wissen des Fachmanns, beispielsweise mittels intravenöser, intramuskulärer, intranasaler, intradermaler oder subkutaner Verabreichung verabreicht werden. Weitere Einzelheiten über die Menge an verabreichtem Virus sind unten angegeben.
Die pharmazeutische Zusammensetzung bzw. der Impfstoff kann allgemein einen oder mehrere pharmazeutisch unbedenkliche und/oder zugelassene Trägerstoffe, Zusatzstoffe, Antibiotika, Konservierungsstoffe, Adjuvantien, Verdünnungsmittel und/oder Stabilisatoren zusätzlich zum Promotor, zur Expressionskassette oder zum Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten. Bei derartigen Hilfsstoffen kann es sich um Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Ethanol, Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen oder dergleichen handeln. Als Trägerstoffe sind typischerweise große, langsam metabolisierte Moleküle, wie beispielsweise Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäurencopolymere, Lipidaggregate oder dergleichen geeignet.
Zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Impfstoffen wird die DNA, die Expressionskassette oder der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere ein rekombinantes Vacciniavirus, wie z. B. rekombinantes MVA, in eine physiologisch unbedenkliche Form überführt. Bei Vacciniaviren, insbesondere MVA läßt sich dies anhand der Erfahrung bei der Herstellung von für die Impfung gegen die Pockenkrankheit verwendeten Poxvirusimpfstoffen (wie bei Stickl, H. et al. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386–2392 beschrieben) durchführen. Beispielsweise wird das aufgereinigte Virus bei –80°C mit einem Titer von 5 × 10⁸ TCID₅₀/ml, formuliert in etwa 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7,4. Für die Herstellung von Impfstoffinjektionen werden beispielsweise 10¹·10⁹ Teilchen des rekombinanten Virus gemäß der vorliegenden Erfindung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Phosphate-buffered saline, PBS) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% Humanalbumin in einer Ampulle, vorzugsweise einer Glasampulle, lyophilisiert. Als Alternative lassen sich die Impfstoffinjektionen durch schrittweises Gefriertrocknen des Virus in einer Formulierung herstellen. Dabei kann diese Formulierung zusätzliche Zusatzstoffe wie beispielsweise Mannit, Dextran, Zucker, Glycin, Lactose oder Polyvinylpyrrolidon, oder andere Zusatzstoffe, wie beispielsweise Antioxidantien oder Inertgas, Stabilisatoren oder rekombinante Proteine (z. B. Humanserumalbumin), die sich zur In-vivo-Verabreichung eignen, enthalten. Eine typische virushaltige, für die Gefriertrocknung geeignete Formulierung umfaßt 10 mM Tris-buffer, 140 mM NaCl, 18,9 g/l Dextran (MW 36000–40000), 45 g/l Saccharose, 0,108 g/l L-Glutaminsäure, Monokaliumsalz-Monohydrat, pH 7,4. Die Glasampulle wird anschließend verschlossen und kann zwischen 4°C und Raumtemperatur mehrere Monate lang gelagert werden. Allerdings wird die Ampulle, falls kein Bedarf besteht vorzugsweise bei Temperaturen unterhalb von –20°C gelagert.
Zur Impfung oder Therapie kann das Lyophilisat oder das gefriergetrocknete Produkt in 0,1 bis 0,5 ml einer wäßrigen Lösung, vorzugsweise Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder Tris-Puffer, gelöst und entweder systemisch oder lokal, d. h. über den parenteralen, intramuskulären oder einen beliebigen anderen, dem Fachmann bekannten Verabreichungsweg verabreicht werden. Die Art der Verabreichung, die Dosis sowie die Anzahl an Verabreichungen läßt sich vom Fachmann in bekannter Weise optimieren. Somit betrifft die Erfindung gemäß einer verwandten Ausführungsform ein Verfahren zur Beeinflussung, vorzugsweise Induzierung, einer immunologischen Antwort in einem lebenden Tierkörper, einschließlich dem Menschen, wobei man die Expressionskassette, die DNA, den Vektor, die pharmazeutische Zusammensetzung oder den Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung dem zu behandelnden Tier oder Menschen verabreicht. Falls es sich bei dem Impfstoff um ein Vacciniavirus handelt, insbesondere MVA, umfaßt eine typische Impfstoffinjektion für den Menschen wenigstens 10², vorzugsweise wenigstens 10⁴, stärker bevorzugt wenigstens 10⁶, noch stärker bevorzugt 10⁷ oder 10⁸, TCID₅₀ (Tissue Culture Infectious Dose) des Virus.
Falls es sich bei dem Impfstoff um ein rekombinantes MVA, insbesondere rekombinantes MVA-BN und seine Derivate, handelt, so kann das Virus für eine "Prime-Boost"-Verabreichung verwendet werden. Somit betrifft die Erfindung ferner ein Verfahren, wobei es sich bei dem Vektor um MVA, insbesondere um MVA-BN und seine Derivate handelt, und wobei der Vektor oder die den Vektor umfassende Zusammensetzung bzw. der den Vektor umfassende Impfstoff einem Tier, einschließlich dem Menschen, der dessen bedarf, in therapeutisch wirksamen Mengen in einer ersten Inokulation ("Priming Inoculation") und in einer zweiten Inokulation ("Boosting Inoculation") verabreicht wird.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Einführung einer codierenden Sequenz in eine Zielzelle, bei dem man den Vektor, die Expressionskassette oder die DNA gemäß der vorliegenden Erfindung in die Zielzelle einführt. Falls es sich bei dem Vektor um ein Vacciniavirus, insbesondere MVA, wie z. B. MVA-BN, handelt, so kann es sich bei der Zielzelle um eine Zelle handeln, in der das Virus replizieren kann, wie beispielsweise CEF- oder BHF-Zellen, oder es kann sich um eine Zelle handeln, die mit MVA infiziert werden kann, in der das Virus jedoch nicht repliziert (wie beispielsweise alle Arten von menschlichen Zellen für MVA-BN).
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids, Proteins und/oder Virus, wobei man in dem Verfahren eine Wirtszelle mit einem Virusvektor gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert, anschließend die infizierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert und wiederum anschließend das von der Wirtszelle produzierte Peptid und/oder Protein und/oder die von der Wirtszelle produzierten Viren isoliert und/oder anreichert. Falls das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung produziert, d. h. amplifiziert, werden soll, muß es sich bei der Zelle um eine Zelle handeln, in der das Virus in der Lage ist zu replizieren. Für Vacciniaviren, insbesondere MVA, geeignete Zellen sind CEF- oder BHK-Zellen. Falls ein von dem Virusvektor gemäß der vorliegenden Erfindung codiertes Peptid/Protein produziert werden soll, so kann es sich bei der Zelle um eine beliebige Zelle handeln, die mit dem Virusvektor infiziert werden kann und die die Expression der viruscodierten Proteine/Peptide gestattet.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids, Proteins und/oder Virus, wobei man in dem Verfahren eine Zelle mit der Expressionskassette, der DNA oder dem Plasmidvektor gemäß der vorliegenden Erfindung transfiziert und anschließend die Zelle mit einem Vacciniavirus infiziert. Dabei wird die infizierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert. Ein weiterer Schritt umfaßt die Isolierung und/oder Anreicherung des von der Wirtszelle produzierten Peptids und/oder Proteins und/oder der von der Wirtszelle produzierten Viren. Der Schritt der Infektion der Zellen mit einem Vacciniavirus kann dabei vor oder nach dem Schritt der Transfektion der Zellen erfolgen.
Die Erfindung betrifft ferner Zellen, die einen Promotor, eine DNA, eine Expressionskassette oder einen Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten. Insbesondere betrifft die Erfindung Zellen, die mit dem Virusvektor gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert sind.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: GUS-Aktivität nach Expression mit unterschiedlichen Promotoren. Zellen wurden mit MVA-BN infiziert und mit den entsprechenden Plasmiden transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen extrahiert, und die GUS-Aktivität wurde indirekt durch Messen der Extinktion bei 415 nM nach einer enzymatischen Reaktion, die zur Entwicklung von gelber Farbe führt, bestimmt. Zex = Negativkontrolle (MVA-BN-infizierte Zellen).
2: GUS-Aktivität nach früher und früher/später Expression. Zellen wurden mit MVA-BN infiziert und mit den entsprechenden Plasmiden transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen extrahiert, und die GUS-Aktivität wurde indirekt durch Messen der Extinktion bei 415 nM nach einer enzymatischen Reaktion, die zur Entwicklung von gelber Farbe führt, bestimmt. Zex = Negativkontrolle (MVA-BN-infizierte Zellen). Für diese enzymatische Reaktion mußten Proben ohne (frühe + späte) AraC-Expression 5 Stunden und diejenige mit AraC (frühe Expression) über Nacht inkubiert werden, um eine Farbreaktion zu erhalten.
3: GUS-Aktivität nach Expression mit unterschiedlichen Promotoren. Zellen wurden mit MVA-BN infiziert und mit den entsprechenden Plasmiden transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen extrahiert, und die GUS-Aktivität wurde indirekt durch Messen der Extinktion bei 415 nM nach einer enzymatischen Reaktion, die zur Entwicklung von gelber Farbe führt, bestimmt. Kontrolle = Negativkontrolle (MVA-BN-infizierte Zellen).
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch das folgende Beispiel bzw. die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht. Dem Fachmann ist dabei gut ersichtlich, daß das bereitgestellte Beispiel bzw. die bereitgestellten Beispiele in keiner Weise so interpretiert werden dürfen, daß dadurch *0die Anwendbarkeit der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Technologie auf dieses Beispiel bzw. diese Beispiele beschränkt ist.
Beispiel 1: Analyse von Promotoren zur Expression codierender Sequenzen im MVA-BN-Genom
1.1 Ziel des Experiments:

Das Ziel dieser Analyse bestand darin, Promotoren zu identifizieren, die sich zur Expression codierender Sequenzen im MVA-Genom, vorzugsweise codierender Sequenzen, die zum natürlichen MVA-Genom heterolog sind, eignen. Vor allem für die Insertion von zwei oder mehr Genen in einer einzelnen Insertionsstelle ist es vorteilhaft, unterschiedliche Promotoren für die Expression der einzelnen Gene zu verwenden, um das Risiko von Rekombinationsereignissen, die zur Deletion eines der Fremdgene führen könnten, zu reduzieren. Weiterhin ist es wünschenswert, Promotoren unterschiedlicher Stärke zur Verfügung zu haben, um die Möglichkeit zu besitzen, die in rekombinantem MVA-BN inserierten Fremdgene in variablen Mengen, je nach der Stärke des Promotors zu exprimieren. Insgesamt wurden 11 mutmaßliche Promotoren isoliert. Diese mutmaßlichen Promotorsequenzen wurden in ein Plasmidrückgrat (pBSKS+) kloniert. Um ihre potentielle Aktivität zu analysieren, wurden die Promotoren mit dem GUS (E. coli-β-Glucuronidase)-Reportergen fusioniert. BHK (Baby Hamster Kidney)-Zellen wurden mit MVA-BN infiziert und mit den die mit dem GUS-Gen fusionierten mutmaßlichen Promotoren enthaltenden Plasmiden transfiziert. War der Promotor funktionell, so wurde GUS exprimiert und konnte über eine enzymatische Reaktion für GUS quantifiziert werden. Als Positivkontrolle sowie als Referenz wurden die gut charakterisierten Vacciniavirus-Promotoren p7.5 und Ps mit GUS fusioniert und parallel analysiert. Über die Messung der GUS-Expression wurden die mutmaßlichen Promotoren hinsichtlich Aktivität, Stärke und früher/später Expression durchmustert. Die frühe/späte Expression wurde durch Zugabe von AraC (Arabinosid Cytosin) zum Kulturmedium überprüft. Die Promotoren, bei denen gezeigt werden konnte, daß sie funktionell sind, nämlich der Ps, p7.5-, 7.5L- und ATI-Promotor, die bereits im Stand der Technik bekannt waren, ebenso wie die neu identifizierten Promotorsequenzen, die natürlicherweise an der Expressionskontrolle der MVA-ORF's, A42L, B9R, C7L, F6R, I2R, J6R, beteiligt sind, lassen sich vorzugsweise für die Expression von Fremdgenen in rekombinanten MVA-Konstrukten (recMVA-BN) einsetzen. 1.2 Material

Zellen:	BHK-Zellen
Virus:	MVA-BN-Standard rohe Stammlösung (7,5 × 10⁷ TCID₅₀)
DNA:	pAB.GUS (Ps-Promotor + GUS)
	pBNX71 (pBluescript + Vacciniavirus pr7.5 + GUS)
	pBNX73 (pBluescript + Kuhpockenvirus ATI-Promotor + GUS)
	pBN81 (pBluescript + modifizierter H5R-Promotor + GUS1)
	pBN61 (pBluescript + MVA B1R-Promotor + GUS)
	pBN62 (pBluescript + MVA B2R-Promotor + GUS)
	pBN63 (pBluescript + MVA B3R-Promotor + GUS)
	pBN60 (pBluescript + MVA A30R-Promotor + GUS)
	pBN82 (pBluescript + Vacciniavirus 7.5 L-Promotor + GUS)
	pBN83 (pBluescript + MVA C7L-Promotor (SEQ ID NO: 5 + GUS)
	pBNX49 (pBluescript + MVA A42R-Promotor (SEQ ID NO: 1) + GUS)
	pBNX69 (pBluescript + MVA I2R-Promotor (SEQ ID NO: 4) + GUS)
	pBNX72 (pBluescript + MVA K5L-Promotor + GUS)
	pBN83 (pBluescript + MVA F6R-Promotor (SEQ ID NO: 3) + GUS)
	pBN84 (pBluescript + MVA B9R-Promotor (SEQ ID NO: 6 + GUS)
Transfektionskit:	pBN85 (pBluescript + MVA J6R-Promotor (SEQ ID NO: 2 + GUS)
	Effectene-Transfektionskit (Qiagen)
Medien und Zusätze:	DMEM (Gibco BRL) mit 10% FCS (Gibco BRL)
Chemikalien und Puffer: Lysepuffer	(PBS + 0,1 + 1 mM Proteaseinhibitor)
AraC (Sigma, Kat. Nr. C1768)
GUS-Substrat 1 mM (p-Nitrophenyl-beta-(D)-glucuronid; Sigma, Kat. Nr. N1627)
Stopplösung 2,5 M (2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol; Sigma, Kat. Nr. A9754

1.3 Methoden
Aussaat von Zellen
5 × 10⁵ BHK-Zellen wurden pro Transfektionsreaktion in eine Vertiefung einer 6-Loch-Platte ausgesät und über Nacht bei 37°C und 5% CO₂ in DMEM/10% FCS gehalten.
Infektion/Transfektion
Zellen wurden mit MVA-BN (MOI 0,1) in 0,5 ml DMEM/10% FCS pro Vertiefung infiziert und 1 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert. Die Transfektion wurde wie in der Vorschrift des Herstellers beschrieben durchgeführt. 2 μg Plasmid wurden in Puffer EB verdünnt (Gesamtvolumen: 100 μl). Nach Zugabe von 3,2 μl Enhancer-Lösung wurde die Lösung gemischt und 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 10 μl Effectene-Reagens zugegeben, die Suspension wurde gemischt und 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Virussuspension wurde von den Zellen abgetrennt und 1,6 ml DMEM/10% FCS wurden zugegeben. Zu dem DNA-Effectene-Gemisch wurden 0,6 ml DMEM/10% FCS zugegeben und unter Drehen der Kulturplatte auf die Zellen aufgegeben. Anschließend wurden die Zellen je nach Analyse 7, 24 oder 48 Stunden inkubiert. Zur Analyse der frühen/späten Expression wurde das Medium während der Infektion und Transfektion mit AraC (40 μg/ml) versetzt.
Ernten der Zellen
Medium wurde von den Zellen abgetrennt, die dann mit 0,5 ml Lysepuffer versetzt wurden. Nach 15 Min. Schütteln bei RT wurden die Zellen im Lysepuffer abgeschabt, in ein 1,5 ml-Reaktionsröhrchen überführt und am Vortex-Mischer kräftig aufgewirbelt. Die lysierten Zellen wurden 1 Min. bei 500 rcf und 4°C zentrifugiert, und der klare Überstand wurde in ein frisches Röhrchen überführt und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
Bestimmung der GUS-Aktivität
10 μl Zellextrakt (=Protein aus 2 × 10⁴ Zellen) wurden zu 1 ml vorgewärmter Substratlösung (37°C) gegeben und bei 37°C inkubiert, bis sich eine gelbe Farbe entwickelte. Anschließend wurden die Proben sofort auf Eis gegeben und mit 0,4 ml Stopplösung versetzt. Die Extinktion bei 415 nm wurde bestimmt und mit der GUS-Aktivität gleichgesetzt, da die Extinktionswerte zwischen 0,05 und 2,0 in einem linearen Bereich liegen. Die Substratlösung wurde als Referenz und ein Zellextrakt von mit MVA-BN infizierten Zellen als Negativkontrolle verwendet.
1.4 Experimente und Ergebnisse
Experiment 1: Bestimmung der Funktion mutmaßlicher Promotoren
Für das erste Experiment wurden alle Plasmide, die einen mutmaßlichen MVA-Promotor oder einen mit dem GUS-Gen fusionierten gut charakterisierten Promotor enthalten, analysiert. Zellen wurden mit MVA-BN (MOI 0,1) infiziert und mit dem entsprechenden Plasmid transfiziert. Die Zellen wurden nach 48 Stunden geerntet, lysiert, und die GUS-Aktivität wurde bestimmt. Dieses Experiment wurde durchgeführt, um zu bestimmen, welche Promotoren funktionell sind. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Die Negativkontrolle (Extrakt aus mit MVA-BN infizierten Zellen) zeigte eindeutig keine GUS-Aktivität (Zex; Extinktion: 0,001). Der gut charakterisierte starke synthetische Ps-Promotor erwies sich als sehr effizient (PS; Extinktion: 0,87), da eine große Menge an GUS nach 48 Stunden Expression nachweisbar war. Der ebenso gut bekannte natürlich vorkommende Vacciniavirus-pr7.5-Promotor zeigte ebenso eine ziemlich hohe Aktivität (p7.5; Extinktion: 0,41). Ebenso zeigt der späte Anteil von 2R7.5 (7.5L; Extinktion: 0,25) eine deutlich nachweisbare Aktivität. Der Kuhpocken-ATI-Promotor erwies sich eindeutig als sehr effizient für die Expression von Fremdgenen durch MVA-BN (ATI; Extinktion: 0,76). Für die mutmaßlichen Promotorbereiche des MVA-BN-Genoms konnte gezeigt werden, daß A42R (A42; Extinktion: 0,48), B9R (B9; Extinktion: 0,06), C7L-(C7; Extinktion: 0,055), F6R (F6, Extinktion: 0,208), I2S (I2, Extinktion: 0,130) und J6R (J6, Extinktion: 0,290) funktionsfähige Promotoren sind. Die Promotoren, die sich im ersten vorläufigen Experiment eindeutig als aktiv erwiesen (Extinktion: > 0,05), wurden ausführlicher charakterisiert (Experiment 2).
Experiment 2: Charakterisierung der Expression von Promotoren
Die Promotoren, die Aktivität in Experiment 1 zeigten, wurden bezüglich ihres Expressionsmusters charakterisiert. Zu diesem Zweck wurden die mit MVA-BN infizierten und mit dem entsprechenden Plasmid transfizierten Zellen mit AraC inkubiert. AraC hemmt die DNA-Replikation, die eine essentielle Vorraussetzung für die späte Expression von Genen während des MVA-Replikationszyklus ist. Das gleiche Experiment wurde parallel ohne Zugabe von araC durchgeführt. Infizierte und transfizierte Zellen wurden nach 24 Stunden geerntet, und die GUS-Aktivität wurde in Dreifachbestimmung gemessen. In 2 ist die mittlere Extinktion für jede Probe dargestellt.
Nach Inkubation ohne AraC (–AraC) über 24 Stunden ist die gesamte GUS-Expression (früh + spät) bei allen Promotoren deutlich nachweisbar (2: rechte Spalten). Die Stärke der neu identifizierten Promotoren ist in absteigender Reihenfolge: 12R (12) > A42R (A42) > F6R (F6) > J6R (J6) > B9R (B9) = C7L (C7).
Es konnte gezeigt werden, daß die Promotoren B9, C7 und J6 hauptsächlich an der späten Expression während des Lebenszyklus von MVA beteiligt sind, da die Inkubation mit AraC (+AraC), das die späte Expression hemmt, zu einem GUS-Expressionsniveau führt, das mit dem der Negativkontrolle (Zex) vergleichbar ist. Zwar schien der C7L-Promotor relativ schwach zu sein, doch gibt es mehrere Hinweise darauf, daß er eine wichtige Rolle während der frühen Expression spielt.
Die Promotoren A42R, I2R und F6R zeigen eindeutig eine sehr effiziente frühe Expression. Wie bei der Bestimmung der frühen Expression mußten die Proben über Nacht inkubiert werden, um eine nachweisbare Farbreaktion zu erhalten. Diese Ergebnisse können mit den Werten der frühen + späten Expression (2: –AraC) nicht direkt verglichen werden, da sie nur über einen Zeitraum von 5 Stunden inkubiert wurden. Die Promotoren, die eine frühe Expression zeigten, wurden wiederum nach 7 Stunden Expression analysiert, wobei die Ergebnisse nach 24 Stunden bestätigt werden konnten (Daten nicht gezeigt).
1.5 Schlußfolgerung
Es konnte eindeutig gezeigt werden, daß Promotoren unterschiedlicher Stärke erhalten werden konnten und daß nun ein Spektrum unterschiedlicher Promotoren zur Verfügung steht, die je nach Inkubationszeitraum und der Möglichkeit für MVA-BN zur Replikation unterschiedliche Expressionsmuster zeigen. Ist die frühe + späte Expression bevorzugt, so werden vorzugsweise die Promotoren A42R, I2R und F6R eingesetzt. Sollte die frühe Expression vermieden werden (z. B. bei Fremdgenen, die das Stoppsignal TTTTTNT für die frühe Expression enthalten), so werden die Promotoren B9R, J6R oder C7L vorzugsweise eingesetzt.
Beispiel 2: Analyse von aus SEQ ID NO: 1 bis 4 abgeleiteten Minimalpromotorelementen
In Beispiel 1 konnten mehrere Sequenzen identifiziert werden, die sich besonders zur Expression von Fremdgenen im MVA-Genom eignen. Um zu überprüfen, ob kürzere Fragmente den gleichen Zweck erfüllen, wurden zusätzliche Experimente durchgeführt. Dabei wurden kürzere Fragmente der SEQ ID NO: 1 bis 4 mittels PCR isoliert und in ein Plasmidrückgrat (pBSKS+) kloniert. Insgesamt wurden 6 mutmaßliche Minimalpromotoren getestet. Um deren potentielle Aktivität zu analysieren, wurden die Promotoren mit dem GUS-Reportergen fusioniert. BHK-Zellen wurden mit MVA-BN infiziert und mit die mit dem GUS-Gen fusionierten mutmaßlichen Minimalpromotoren enthaltenden Plasmiden transfiziert. Über die Messung der GUS-Expression wurden die mutmaßlichen Promotoren auf Aktivität und Stärke der Expression durchmustert (siehe Beispiel 1). Als Positivkontrolle und als Referenz wurde der gut charakterisierte späte Vacciniavirus-Promotor Ps mit GUS fusioniert und parallel analysiert. Die MinimalPromotorelemente von etwa 30 Bp lassen sich zur Expression von Fremdgenen in rekombinanten MVA-Konstrukten (recMVA-BN) einsetzen, ohne daß die Gefahr einer homologen Rekombination zwischen den homologen Sequenzen des ursprünglichen und des zusätzlich klonierten Promotors besteht.
2.1 Material und Methode
Falls nicht anders angegeben entsprechen die in Beispiel 2 verwendeten Materialien und Methoden den Methoden in Beispiel 1. Die PCR wurde nach Standardtechniken ausgeführt.
2.2 Experimente und Ergebnisse
Fusion von Promotoren mit dem GUS-Gen mittels PCR Die PCR-Reaktionen führten zur Fusion der folgenden MinimalPromotorsequenzen mit dem GUS-Gen:
Alle mutmaßlichen, mit dem GUS-Gen fusionierten Minimalpromotoren wurden in pBSKS+ kloniert und sequenziert.
Bestimmung der Funktion der mutmaßlichen Minimalpromotoren
Um die Funktionalität der mutmaßlichen Minimalpromotorelemente zu analysieren, wurden die BHK-Zellen mit MVa-BN (MOI 1,0) infiziert und mit dem entsprechenden Plasmid transfiziert. Die Zellen wurden nach 24 Stunden geerntet, lysiert, und die GUS-Aktivität wurde bestimmt (3).
Die Negativkontrolle (Extrakt aus mit MVA-BN infizierten Zellen) zeigte eindeutig keine GUS-Aktivität (Kontrolle; mittlere Extinktion: 0,00167). Der gut charakterisierte starke synthetische Ps-Promotor erwies sich als sehr effizient (Ps; mittlere Extinktion: 2,05267), da eine große Menge an GUS nach 24 Stunden Expression nachweisbar war. Für die mutmaßlichen Promotor-Minimalpromotorelemente des MVA-BN-Genoms konnte gezeigt werden, daß F6R short early, F6R short late, I2R short early, I2 short late, A42R short late und JR6 short late alle funktionsfähige Promotoren darstellen.
Insgesamt wurden sechs funktionsfähige MinimalPromotorelemente isoliert. Dabei eignen sich zwei für die schwächere frühe Transkription (I2R short early: mittlere Extinktion: 0,06933; FR6 short early: mittlere Extinktion 0,189) und vier für die späte Expression auf unterschiedlichen Niveaus (FR6 short late: mittlere Extinktion 0,09833; I2R short late: mittlere Extinktion 0,391; J6R short late: mittlere Extinktion: 0,80167 und A42R short late: mittlere Extinktion 2,07).
2.3 Schlußfolgerung
Es konnte eindeutig gezeigt werden, daß Promotoren unterschiedlicher Stärke isoliert werden konnten und daß nun ein Spektrum unterschiedlicher Promotoren zur Verfügung steht. Ist die frühe Expression bevorzugt, so wird vorzugsweise der Minimalpromotor F6R short early oder I2R short early eingesetzt. Ist die späte Expression bevorzugt und sollte die frühe Expression vermieden werden (z. B. bei Fremdgenen, die das Stoppsignal TTTTTNT für die frühe Expression enthalten), so werden vorzugsweise die MinimalPromotorelemente F6R short late, I2R short late, J6R short late und A42R short late eingesetzt. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Promotor, umfassend oder bestehend aus einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe: (i) die Nukleotidsequenz einer der SEQ ID NO: 3, 9 oder 10, (ii) eine Nukleotidsequenz mit einer Länge von wenigstens 15 Nukleotiden der SEQ ID NO: 3 und (iii) Derivate der SEQ ID NO: 9 oder 10, bei denen in bezug auf die Sequenzen der SEQ ID NO: 9 oder 10 nicht mehr als 10 Nukleotide substituiert, deletiert und/oder inseriert sind, wobei der Promotor in Form von Vacciniavirus-Promotoren und/oder in mit Vacciniavirus infizierten Zellen aktiv ist.
Expressionskassette, umfassend einen Promotor nach Anspruch 1 sowie eine codierende Sequenz, wobei die Expression der codierenden Sequenz von dem Promotor gesteuert wird.
Expressionskassette nach Anspruch 2, wobei die codierende Sequenz für therapeutische Proteine oder Peptide, Antigene, antigene Epitope, Antisense-RNA oder Ribozyme codiert.
DNA, umfassend den Promotor nach Anspruch 1 oder die Expressionskassette nach einem der Ansprüche 2 und 3, wobei es sich bei der DNA nicht um das natürlich vorkommende Genom des modifizierten Vacciniavirus Ankara handelt.
Vektor, umfassend den Promotor nach Anspruch 1 oder die Expressionskassette nach einem der Ansprüche 2 und 3.
Vektor nach Anspruch 5, ausgewählt aus Plasmid vektoren und Virusvektoren.
Vektor nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Virusvektor um ein Vacciniavirus handelt.
Vektor nach Anspruch 7, wobei es sich bei dem Vacciniavirus um Modifiziertes Vacciniavirus Ankara (MVA), vorzugsweise den bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC) unter der Nummer V00083008 hinterlegten Stamm MVA-BN oder ein Derivat davon, den bei der ECACC unter der Nummer VA94012707 hinterlegten Stamm MVA 572 oder den bei der ECACC unter der Nummer V00120707 hinterlegten Stamm MVA 575 handelt.
Vektor nach Anspruch 8, wobei der Promotor nach Anspruch 1 oder die Expressionskassette nach einem der Ansprüche 2 und 3 in einer natürlich vorkommenden Deletionsstelle des MVA-Genoms inseriert ist.
Vektor nach Anspruch 8, wobei der Promotor nach Anspruch 1 oder die Expressionskassette nach einem der Ansprüche 2 und 3 in einen nicht essentiellen Teil des Virusgenoms oder in einen intergenischen Bereich des Virusgenoms inseriert wird.
Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 10 als Impfstoff oder Arzneimittel.
Impfstoff oder pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 2 bis 3, eine DNA nach Anspruch 4 oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 10.
Impfstoff oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, umfassend wenigstens 10² TCID₅₀ (Tissue Culture Infectious Dose) des Virusvektors nach einem der Ansprüche 7 bis 10.
Verwendung einer Expressionskassette nach einem der Ansprüche 2 bis 3, einer DNA nach Anspruch 4 oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 5 bis 10 zur Herstellung eines Impfstoffs oder Arzneimittels.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei der Virusvektor in therapeutisch wirksamen Mengen in einer ersten Inokulation ("Priming Inoculation") und einer zweiten Inokulation ("Boosting Inoculation") verabreicht wird.
Verfahren zur Einführung einer codierenden Sequenz in eine Zielzelle, bei dem man einen Vektor nach einem der Ansprüche 5 bis 10, eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 2 bis 3 oder eine DNA nach Anspruch 4 in die Zielzelle einführt, wobei es sich bei der Zielzelle nicht um eine Zelle im menschlichen und/oder tierischen Körper handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids, Proteins und/oder Virus, wobei man in dem Verfahren eine Wirtszelle mit dem Virusvektor nach einem der Ansprüche 6 bis 10 infiziert, die infizierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert und das von der Wirtszelle produzierte Peptid und/oder Protein und/oder die von der Wirtszelle produzierten Viren isoliert und/oder anreichert, wobei es sich bei der Wirtszelle nicht um eine Zelle im menschlichen und/oder tierischen Körper handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids, Proteins und/oder Virus, wobei man in dem Verfahren Zellen mit einer Expressionskassette nach einem der Ansprüche 2 bis 3, der DNA nach Anspruch 4 oder dem Plasmidvektor nach Anspruch 6 transfiziert, die Zelle mit einem Vacciniavirus infiziert, die infizierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert und das von der Wirtszelle produzierte Peptid und/oder Protein und/oder die von der Wirtszelle produzierten Viren isoliert und/oder anreichert, wobei der Schritt des Infizierens der Zellen mit einem Vacciniavirus vor oder nach dem Schritt der Transfektion der Zellen ausgeführt werden kann, wobei es sich bei der Zelle nicht um eine Zelle im menschlichen und/oder tierischen Körper handelt.
Zelle mit der Expressionskassette nach einem der Ansprüche 2 bis 3 oder dem Virusvektor nach einem der Ansprüche 6 bis 10.
Verwendung des Promotors nach Anspruch 1 zur In-vitro-Expression einer codierenden Sequenz.
Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach einem der Ansprüche 5 bis 10, wobei man in einem Verfahrensschritt die Expressionskassette nach einem der Ansprüche 2 bis 3 in das Vektorgenom inseriert.