ES2334335T3 - Mva que expresa genes de envoltura, gag y pol de vih modificados. - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica que comprende un virus MVA recombinante que codifica Gag/Pol de HXB2 de MVA 48 (SEQ ID NO: 5) y la envoltura de ADA truncada (SEQ ID NO: 3).
Description
MVA que expresa genes de envoltura, gag y
pol de VIH modificados.
La invención proporciona un virus vaccinia
Ankara modificado (MVA), una cepa del virus vaccinia de replicación
deficiente, que expresa los genes env, gag y
pol del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
La inmunidad celular juega un papel importante
en el control de las infecciones con virus de inmunodeficiencia (P.
J. Goulder et al. 1999 AIDS 13:S121). Recientemente, una
vacuna de ADN diseñada para aumentar la inmunidad celular por
aumento de citoquina incluyó satisfactoriamente un virus de
provocación de la inmunodeficiencia altamente virulento (D.H.
Barouch et al. 2000 Science 290-486). Otra
aproximación prometedora para aumentar la inmunidad celular es la
inducción (priming) con ADN seguida de la potenciación
(boosting) con poxvirus recombinantes. (H.L. Robinson et
al. 2000 AIDS Rev 2:105). Este régimen de inducción/potenciación
heterólogo induce frecuencias de células T de 10 a 100 veces más
altas que la inducción/potenciación con ADN o las vacunas de
poxvirus recombinantes en solitario. Anteriormente, los
investigadores demostraron que la potenciación con un poxvirus de
una respuesta inducida con ADN era superior que la potenciación con
ADN o proteína para el control de un virus de inmunodeficiencia no
patógeno (H.L. Robinson et al. 1999 Nat Med 5:526). Moss
et al describen composiciones de vacunas que comprenden un
MVA recombinante que contiene los genes gag-pol del
virus de la inmunodeficiencia de simios (VIS) y el gen env de VIH
truncado para la inducción de una respuesta inmune protectora en
monos (Moss et al: Retroviruses of human AIDS and related
animal diseases, Colloque des Cent Gardes, 12 th 25 October
1999-27 October 1999, París, Francia, paginas
105-107). Existe la necesidad de controlar el virus
patógeno de la inmunodeficiencia.
Se describe aquí que la inducción con ADN
seguida de una potenciación con un virus vaccinia Ankara modificado
recombinante (rMVA) ha controlado un virus de provocación de la
inmunodeficiencia altamente patógeno en un modelo de macaco rhesus.
Tanto el componente ADN como el componente rMVA de la vacuna
expresaban múltiples proteínas del virus de la inmunodeficiencia.
Dos inoculaciones de ADN en las semanas 0 y 8 y un único refuerzo
de rMVA en la semana 24 controlaron eficazmente una prueba de
provocación intrarectal administrada siete meses después de la
potenciación. Estos descubrimientos se prevén como la indicación de
que una vacuna relativamente simple de ADN/MVA que libera múltiples
proteínas puede ayudar a controlar la epidemia del síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA). También se describe que las
inoculaciones de rMVA inducen respuestas inmunes buenas incluso sin
el estímulo de ADN.
Figura I. Las relaciones filogenéticas del
VIH-1 y VIH-2 se basan en la
identidad de las secuencias del gen pol. VIS _{cpz} y VIS
_{smm} son lentivirus de primates subhumanos recuperados de un
chimpancé y de un mono magabeye gris, respectivamente.
Figura II. Las relaciones filogenéticas de los
grupos M, N y O del VIH-1 con cuatro aislados
diferentes de VIS _{cpz} se basan en la secuencias completas del
gen pol. La barra indica una distancia genética de 0,1
(divergencia del 10% de los nucleótidos) y el asterisco sitúa
los aislados de grupo N del VIH-1 en base a las
secuencias de env.
Figura III. Propiedades biológicas y trópicas de
los aislados de VIH-1.
Figura IV. Proteínas codificadas por VIH. Se
indica la localización de los genes de VIH, los tamaños de los
productos primarios de traducción (en algunos casos poliproteínas) y
las proteínas virales maduras procesadas.
Figura V. Representación esquemática de un
virión de VIH-1 maduro.
Figura VI. Representación lineal de la
glicoproteína Env de VIH-1. La flecha indica el
sitio de escisión gp160 para gp120 y gp41. In gp120, las áreas de
entramado representan los dominios variables (V_{1} a
V_{5}), las casillas en blanco indican las secuencias conservadas
(C_{1} a C_{5}). En el ectodominio gp41 se indican varios
dominios: el péptido de fusión N-terminal, y los dos
ectodominios helicoidales (hélice-N y C). El dominio
de transmembrana se representa por una casilla negra. En el dominio
citoplásmico gp41, se indica el motivo de endocitosis
Tyr-X-X-Leu (YXXL)
(SEQ ID NO: 9) y dos motivos helicoidales predichos
(hélices-1 y 2). Se indica la numeración de los
aminoácidos.
Figura 1. Frecuencias temporales de las células
T específicas para Gag. (A) respuestas de las células T CD8
específicas para Gag provocadas por inmunizaciones por inducción
con ADN y potenciación con rMVA. El esquema presenta el promedio de
los datos del tetrámero-CM9-Gag
generados en animales inmunizados i.d. con dosis de ADN alta. (B)
ELISPOT de IFN-\gamma específico para Gag en
macacos A*01 (barras en blanco) y
no-A*01 (barras con entramado) en diversos
momentos antes de la prueba de provocación y dos semanas después de
la prueba de provocación. Los números que están encima de las barras
de datos representan el promedio aritmético \pm la DS para el
resultado de ELISPOT dentro de cada grupo. Los números en la parte
superior de los gráficos designan animales individuales. *,
datos no disponibles; #, ELISPOT <20 por 1x10^{6} células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Los datos temporales para células T específicas para el tetrámero Gag-CM9-Mamu-A*01 se pueden encontrar en la Figura 6.
datos no disponibles; #, ELISPOT <20 por 1x10^{6} células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Los datos temporales para células T específicas para el tetrámero Gag-CM9-Mamu-A*01 se pueden encontrar en la Figura 6.
Figura 2. Las cargas virales temporales, el
recuento de CD4, y la supervivencia después de la prueba de
provocación en animales vacunados y control. (A) El promedio
geométrico de las cargas virales y (B) el promedio geométrico del
recuento de CD4. (C) La curva de supervivencia para animales
vacunados y control. La línea de puntos representa a todos los 24
animales vacunados. (D) Cargas virales. (E) Recuento de CD4 para
animales individuales en los grupos vacunados y control. La clave de
los números de los animales se presenta en (E). Los ensayos para las
primeras 12 semanas después de la prueba de provocación tenían un
nivel de detección de 1000 copias de ARN por milímetro de plasma.
Los animales con cargas inferiores a 1000 se puntuaron con una carga
de 500. Durante las semanas 16 y 20, el nivel de detección fue de
300 copias de ARN por milímetro. Los animales con niveles de virus
inferiores a 300 se puntuaron con 300.
Figura 3. Las repuestas de las células T post
provocación en grupos vacunados y control. (A) células
tetrámero^{+} temporales (línea discontinua) y cargas virales
(línea continua). (B) ensayos de citoquinas intracelulares para la
producción de IFN-\gamma en respuesta frente a la
estimulación con péptidos Gag-CM9 dos semanas
después de la provocación. Este ensayo ex vivo permite la
evaluación del estatus funcional del pico de las células
tetrámero^{+} representadas en la Figura 1A. (C) El ensayo de
proliferación a las doce semanas de la provocación. Se utilizaron
para estimulación Gag-Pol-Env
(barras en blanco) y Gag-Pol (barras con entramado)
producidas por transfección transitoria. Los sobrenadantes de los
cultivos que simulan transfección sirvieron como antígeno control.
Los índices de estimulación son el crecimiento de los cultivos en
presencia de antígenos virales dividido por el crecimiento de los
cultivos en presencia de antígeno simulado.
Figura 4. La histomorfología del nódulo
linfático a las doce semanas de la provocación. (A) El nódulo
linfático típico de un macaco vacunado que muestra evidencia de una
hiperplasia caracterizada por la presencia de numerosos folículos
secundarios con centros germinales expandidos y zonas discretas
oscuras y claras. (B) Nódulo linfático típico de un animal control
infectado que muestra una depleción folicular y una atrofia
linfocelular paracortical. (C) Un nódulo linfático representativo de
macacos del mismo grupo de edad, no infectados que presentan centros
germinales no reactivos. (D) El porcentaje del área total de nódulos
linfáticos ocupada por los centros terminales se midió para dar un
indicador no específico de la hiperplasia folicular. Los datos para
los controles no infectados son para macacos rhesus de cuatro grupos
de edad.
Figura 5. Respuestas temporales de anticuerpos.
Se determinaron los microgramos totales de anticuerpos Gag (A) o Env
(B) con ELISA. Los títulos de los anticuerpos neutralizantes para
VIHS-89,6 (C) y VIHS-89,6P (D) se
determinaron con células asesinas MT-2 y tinción con
rojo neutro. (D.C. Montefiori el al 1988 J Clin Microbiol 26:231).
Los títulos son recíprocos con la dilución del suero dando un 50% de
neutralización de los virus indicados que crecen en PCBM de humanos.
Los símbolos para los animales son los mismos que en la Figura
2.
Figura 6. Células T específicas para el
tetrámero
Gag-CM9-Mamu-A*01 en
macacos Mamu-A*01 vacunados y control en
varios momentos antes de la provocación y a las dos semanas de la
provocación. El número de la esquina derecha superior de cada trama
representa la frecuencia de las células T CD8 específicas para el
tetrámero como un porcentaje % del total de células T CD8. Los
números encima de cada columna de datos FAC designan animales
individuales.
Figura A. Mapa y secuencia del plásmido vector
de transferencia pLW-48.
Figura B. Secuencias del plásmido vector de
transferencia pLW-48, del promotor Psy II (que
controla la expresión de la envoltura ADA), envoltura ADA truncada,
promotor PmH5 (que controla la expresión de pol gag de HXB2) y
gag pol de HXB2 (con mutaciones seguras, integrasa
\Delta).
Figura C. Vector plásmidico de transferencia
pLW-48 y preparación del virus recombinante MVA
MVA/IHV 48.
Figura D. Un gag pol de la estirpe B.
Figura E. Secuencia de un nuevo promotor Psyn
II.
El virus vaccinia, un miembro del género
Orthopoxvirus de la familia de los Poxviridae, se utilizó como
vacuna de virus vivo para inmunizar contra la enfermedad de la
viruela humana. La vacunación mundial exitosa con el virus vaccinia
culminó con la erradicación del virus de la viruela, el agente
causante de la viruela. (The global eradication of smallpox. Final
report of the global commission for the certification of smallpox
eradication. History of Public Health, No 4, Ginebra: Organización
Mundial de la Salud, 1980). Desde la declaración de la OMS, la
vacunación universal ha sido interrumpida excepto para la población
con alto riesgo de infecciones con poxvirus (p. ej. trabajadores de
laboratorio).
Mas recientemente, el virus vaccinia se ha
utilizado también para construir vectores virales para expresión de
genes recombinantes y para el uso potencial como vacunas
recombinantes de virus vivos (Mackett, M. et al. 1982 PNAS
EE.UU. 79:7415-7419; Smith, G.L. et al. 1984
Biotech Genet Engin Rev 2:282-407). Esto implica
secuencias de ADN (genes) que codifican antígenos extraños que son
introducidos, con la ayuda de técnicas de recombinación de ADN, en
el genoma del los virus vaccinia. Si el gen se integra en un lugar
del ADN viral que no es esencial para el ciclo vital del virus, es
posible que el nuevo virus vaccinia recombinante producido sea
infeccioso, es decir capaz de infectar células extrañas y por lo
tanto expresar la secuencia de ADN integrada (Solicitudes de
Patentes Europeas Nº 83.286 y Nº 110.385). Los virus vaccinia
recombinantes preparados de esta manera pueden ser utilizados, por
un lado como vacunas de virus vivos para la profilaxis de
enfermedades infecciosas, por otro lado para la preparación de
proteínas heterólogas en células eucariotas.
Para las aplicaciones como vectores los riesgos
para la salud se disminuirían utilizando una cepa del virus
vaccinia altamente atenuada. Se desarrollaron varias de estas cepas
del virus vaccinia para evitar los efectos secundarios no deseados
de la vacunación contra la viruela. De este modo, se han generado
los virus vaccinia Ankara modificados (MVA) mediante pases seriados
de larga duración de la cepa Ankara del virus vaccinia (CVA) en
fibroblastos embrionarios de pollo (para revisión véase Mayr, A.
et al. 1975 Infection 3:6-14; Patente Suiza
Nº 568.392). El virus MVA esta disponible públicamente en la
Colección Americana de cultivos Tipo como ATCC n1
Vr-1508. El virus MVA se distingue por su gran
atenuación, es decir su virulencia disminuida y su capacidad para
replicar en células de primates manteniendo una buena
inmunogenicidad. Se ha analizado el virus MVA para determinar
alteraciones en el genoma en relación con la cepa parental CVA. Se
han identificado 6 deleciones mayores del ADN genómico (deleción I,
II, III, IV, V, y VI) en total 31.000 pares de bases (Meyer, H.
et al. 1991 J gen Virol 72:1031-1038). El
virus MVA resultante llegó a estar fuertemente restringido a células
de aves como células huéspedes.
Además, MVA se caracteriza por su atenuación
extrema. Cuando se probó en varios modelos animales, MVA resultó
ser avirulento incluso en animales inmunodeprimidos. Aún más
importante, se han demostrado las excelentes propiedades de la
cepa MVA en ensayos clínicos extensos (Mayr A. et al. 1978
Zentralbl Bakteriol [B] 167:375-390; Stickl et
al. 1974 Dtsch Med Wschr 99:2386-2393). Durante
estos estudios en aproximadamente 120.000 seres humanos,
incluyendo pacientes de alto riesgo, no se asociaron efectos
secundarios con el uso de la vacuna
de MVA.
de MVA.
Resultó que la replicación de MVA en seres
humanos se bloqueaba al final de la infección evitando el ensamblaje
con viriones infecciosos maduros. Sin embargo MVA fue capaz de
expresar genes virales y recombinantes a niveles altos incluso en
células no permisivas y se propuso para servir como un vector de
expresión génica eficaz y excepcionalmente seguro (Sutter, G. and
Moss, B. 1992 PNAS EE.EE 89:10847-10851).
Adicionalmente, se establecieron nuevas vacunas de vectores
vaccinia sobre la base de MVA que tiene secuencias extrañas de ADN
insertadas en el sitio de deleción III dentro del genoma de MVA.
(Sutter, G. et al. 1994 Vaccine
12:1032-1040).
Los virus vaccinia MVA recombinantes se pueden
preparar como se establece a continuación. Una construcción de ADN
que contiene una secuencia de ADN que codifica un polipéptido
extraño flanqueado por secuencias de ADN de MVA adyacentes a una
deleción natural, p. ej. la deleción III, u otros sitios no
esenciales, dentro del genoma de MVA, se introduce en células
infectadas con MVA, para permitir una recombinación homóloga. Una
vez que la construcción de ADN se ha introducido en la célula
eucariota y que el DNA extraño se ha recombinado con el ADN viral,
es posible aislar el virus vaccinia recombinante deseado de manera
conocida, preferiblemente con la ayuda de un marcador. La
construcción de ADN que se va a insertar puede ser lineal o
circular. Se prefiere un plásmido o el producto de una reacción en
cadena de la polimerasa. La construcción de ADN contiene secuencias
que flanquean los lados izquierdo y derecho de una deleción natural,
p. ej., la deleción III, dentro del genoma de MVA. La secuencia de
ADN extraña se inserta entre las secuencias que flanquean la
deleción natural. Para la expresión de una secuencia de ADN o de un
gen, se necesita que estén presentes en el ADN secuencias
reguladoras, que se requieren para la transcripción del gen. Tales
secuencias reguladoras (denominadas promotores) son conocidas por
el experto en la técnica, e incluyen por ejemplo las del gen de
11kDa de vaccinia descritas en
EP-A-198,328, y las del gen de 7,5
kDA (EP-A-119.385). La construcción
de ADN puede ser introducida en las células MVA infectadas por
transfección, por ejemplo por medio de precipitación con fosfato de
calcio (Graham et al. 1973 Virol 52:456-467;
Wigler et al. 1979 Cell 16:777-785) mediante
electroporación (Neuman et al 1982 EMBO J
1:841-845), por medio de microinyección (Graessmann
et al. 1983 Meth Enzymol 101:482-492), por
medio de liposomas (Straubinger et al. 1983 Meth Enzimol
101:512-527) por medio de esferoplastos (Schaffner
1980 PNAS EE.UU. 77:2163-2167) o por medio de otros
métodos conocidos por los expertos en la técnica.
\vskip1.000000\baselineskip
Es reconocido que el agente etiológico de
síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es un retrovirus que
exhibe características típicas del género lentivirus, denominado
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Las relaciones
filogenéticas de los lentivirus humanos se indican en la Figura I.
El VIH-2 está más estrechamente relacionado con el
VIS _{smm}, un virus aislado del mono magabeye gris salvaje, que
con el VIH-1. Actualmente se cree que el
VIH-2 representa una transmisión zoonótica del VIS
_{smm} al hombre. Una serie de aislados de lentivirus de
chimpancés en cautividad, designados V1S_{cpz} son parientes
genéticamente cercanos al VIH-1.
\newpage
Los primeros análisis filogenéticos de aislados
de VIH se centraron en muestras de Europa/América del Norte y
África: se identificaron grupos discretos de virus de estas dos
zonas del mundo. Posteriormente se definieron y clasificaron los
distintos subtipos genéticos o estirpes de VIH-1 en
tres grupos.: M (cepas principales); O (cepas externas); y N (no
perteneciente a los grupos M ni O) (Fig. II). El grupo M de VIH, que
incluye mas del 95% de los aislados globales del virus, consiste en
hasta ocho estirpes diferenciadas (A, B, C, D, F, G, H y J), en
base a la secuencia completa de los genomas virales. Se han
recuperado miembros del grupo O del VIH-1 de
individuos que viven en Camerún, Gabón, y Guinea Ecuatorial; sus
genomas comparten una identidad inferior al 50% en la secuencia de
nucleótidos con los virus del grupo M. Las cepas de
VIH-1 del grupo N descubiertas más recientemente se
han identificado en camerunenses infectados, no reaccionan
serologicamente en ensayos estándar con virus completos por
inmunoabsor-
ción ligada a enzimas (ELISA), sin embargo son detectables fácilmente por análisis Western Blot convencionales.
ción ligada a enzimas (ELISA), sin embargo son detectables fácilmente por análisis Western Blot convencionales.
La mayoría de los conocimientos actuales sobre
la variación genética del VIH-1 proceden de estudios
de virus del grupo M de origen geográfico diverso. Los datos
recogidos durante la década pasada indican que la población de
VIH-1 presente en un individuo infectado puede
variar de 6% a 10% en la secuencia de nucleótidos. Los aislados de
VIH-1 dentro de una misma estirpe pueden presentar
distancias de nucleótidos en las secuencias codificantes de un 15%
en gag y de hasta un 30% en gp120. La variación genética
entre estirpes puede variar entre un 30% y un 40% dependiendo del
gen analizado.
Todos los subtipos M del grupo
VIH-1 se pueden encontrar en África. Los virus de la
estirpe A son los más divergentes genéticamente y fueron el subtipo
más común en África al principio de la epidemia. Con la rápida
propagación del VIH-1 al sur de África durante
mediados y finales de los años 1990, los virus de la estirpe C han
llegado a ser el subtipo dominante y ahora representan el 48% de las
infecciones de VIH-1 en todo el mundo. Los virus de
la estirpe B, el subtipo de VIH-1 mas extensamente
estudiado, sigue siendo el aislado mas frecuente en Europa y América
del Norte.
Las altas tasas de recombinación genética son el
sello de los retrovirus. Inicialmente se creía no era probable que
se produjesen infecciones simultáneas por cepas de virus
genéticamente diferentes en los individuos con riesgo de
VIH-1. En 1995 sin embargo, se hizo evidente que una
fracción significativa de la diversidad global del grupo M del
VIH-1 incluía recombinantes virales entre estirpes.
Ahora se considera que los recombinantes de VIH-1
se pueden encontrar en zonas geográficas como África, América del
Sur, y el Sudeste Asiático, donde coexisten múltiples subtipos de
VIH-1 y que pueden explicar más del 10% de las cepas
de VIH-1 circulantes. Molecularmente, los genomas
de estos virus recombinantes recuerdan a mosaicos desorganizados,
con segmentos de subtipos diferentes de VIH-1
yuxtapuestos, que reflejan los episodios de cruzamiento que
contribuyen a su generación. La mayoría de los recombinantes de
VIH-1 han surgido en África y una mayoría contienen
segmentos derivados originalmente de los virus de la estirpe A. En
Tailandia, por ejemplo, la composición de la cepa circulante
predominante consiste en gag de la estirpe A más un segmento
del gen pol y un gen env de la estirpe. A causa de
que el gen env de la estirpe E de la cepa Thai de
VIH-1 está estrechamente relacionado con
env de la estirpe E presente en los aislados de virus
procedentes de la República Centroafricana, se cree que el suceso
de recombinación original ocurrió en África, con la introducción
posterior de un virus descendiente en Tailandia. Curiosamente no se
ha presentado hasta la fecha ningún aislado completo del subtipo E
de VIH-1 (es decir, con genes gag, pol y
env del subtipo E).
El descubrimiento de que los receptores de
quimioquina \alpha y \beta funcionan como correceptores para la
fusión de virus y la entrada en células susceptibles CD4^{+} ha
llevado a un esquema de clasificación revisado para el
VIH-1 (Fig. III). Los aislados pueden agruparse
ahora en base a la utilización de los receptores de quimioquina en
los ensayos de fusión en los que VIH-1 gp120 y las
proteínas correceptoras de CD4^{+} se expresan en células
separadas. Como se indica en la Figura III, los aislados de
VIH-1 que utilizan receptores CXCR4 (denominados
ahora virus x4) son normalmente cepas inductoras de sincitio (SI) de
las líneas celulares T, (TLC)-trópicas, mientras
que los que utilizan exclusivamente el receptor CCR5 (virus R5) son
predominantemente no inductores sincitios (NSI) y macrófago
(M)-trópicos. La cepas dual-trópicas
R5/X4, que pueden incluir la mayoría de los aislados de pacientes y
que exhiben una serie continua de fenotipos trópicos, son
frecuentemente SI.
Como es el caso de todos los retrovirus de
replicación competente, los tres productos primarios de la
traducción de VIH-1, todos codificantes de
proteínas estructurales, se sintetizan inicialmente como precursores
de poliproteínas, las cuales son posteriormente procesadas por
proteasas virales o celulares a proteínas maduras asociadas a
partículas (Fig. IV). El precursor de 55-kd de Gag,
Pr55^{Gag}, se escinde en las proteínas de la matriz (MA),
cápsida (CA), nucleocápsida (NC) y proteína P6. La autocatálisis de
la poliproteína Gag-Pol de 160-kd,
Pr160^{Gag-Pol}, da lugar a las proteínas proteasa
(PR), transcriptasa inversa heterodimerica (RT), e integrasa (IN),
mientras que la digestión proteolítica con una enzima/s celular/es
convierte el precursor glicosilado de 160-Kd de
Env, gp160, en los productos de escisión de superficie gp120 (SU) y
de transmembrana (TM) gp41. Las seis proteínas codificadas por
VIH-1 restantes (Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu, y Nef) son
los productos primarios de la traducción de los ARNm cortados y
empalmados.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas Gag del VIH, así como las de otros
retrovirus, son necesarias y suficientes para la formación de
partículas similares a virus no infecciosas. Las proteínas
retrovirales Gag se sintetizan generalmente como precursores de
proteínas; el precursor de Gag de VIH-1 se ha
denominado Pr55^{Gag} en base a su masa molecular aparente. Como
se ha señalado anteriormente, el ARNm para Pr55^{Gag} es el
transcrito de 9,2-kb cortado y empalmado (Fig. IV)
que requiere a Rev para su expresión en el citoplasma. Cuando el ORF
de pol está presente, la proteasa viral (PR) escinde a Pr55^{Gag}
durante o poco después de su gemación de la célula para generar
las proteínas de Gag maduras p17 (MA), p24 (CA), p7 (NC), y p6
(véase Figura. IV). En el virión, MA se localiza inmediatamente
dentro de la bicapa lipídica de la envoltura viral, CA forma la
porción exterior de la estructura central en forma de cono en el
centro de la partícula, y la NC está presente en la parte central
en un complejo de la ribonucleoproteína con el genoma del ARN viral
(Fig. V).
El precursor Pr55^{Gag} de VIH oligomeriza
después de la traducción y se dirige a la membrana plasmática,
donde se ensamblan partículas de tamaño y densidad suficiente como
para ser visibles por ME. La formación por Pr55^{Gag} de
partículas similares a los virus es un proceso de auto ensamblaje,
con interacciones Gag-Gag críticas que tienen
lugar entre los múltiples dominios a lo largo del precursor de Gag.
El ensamblaje de partículas similares a los virus no requiere la
participación del ARN genómico (aunque la presencia de ácido
nucleico parece ser esencial), ni de las enzimas codificadas por
pol, ni de las glicoproteínas Env, sino que la producción de
viriones infecciosos requiere la encapsidación del genoma del ARN
viral y la incorporación de las glicoproteínas Env y del precursor
Pr160^{Gag-Pol} de la poliproteína de
Gag-pol.
\vskip1.000000\baselineskip
Aguas abajo de gag se encuentra la región
mas altamente conservada, el gen pol que codifica tres
enzimas: PR, RT e IN (véase Fig. IV). RT e IN se requieren,
respectivamente, para la transcripción inversa del genoma del ARN
viral a una copia de ADN de doble hebra, y para la integración del
ADN viral en el cromosoma de la célula hospedadora. PR juega un
papel crítico posteriormente en el ciclo vital mediando en la
producción de viriones infecciosos maduros. Los productos del gen
pol se derivan por escisión enzimática de una proteína de
fusión de 160-kd de Gag-Pol.,
denominada Pr160^{Gag-Pol}. Esta proteína de
fusión se produce por un mecanismo de cambio de marco ribosómico
durante la traducción de Pr55^{Gag} (véase Fig. IV). El mecanismo
de cambio de marco para la expresión de Gag-Pol,
utilizado también por muchos otros retrovirus, asegura que las
proteínas derivadas de pol se expresen a niveles bajos,
aproximadamente del 5% al 10% que las de gag. Al igual que
Pr55^{Gag}, el extremo N-terminal de
Pr160^{Gag-Pol} se miristila y se dirige a la
membrana plasmática.
\vskip1.000000\baselineskip
Los estudios tempranos de radio marcado y
seguimiento efectuados con retrovirus indicaron claramente que las
proteínas retrovirales Gag se sintetizan inicialmente como
precursores de poliproteínas que se escinden para generar productos
más pequeños. Los estudios posteriores demostraron que la función de
procesado se lleva a cabo por una enzima viral en lugar de por una
enzima celular, y que la digestión proteolítica de los precursores
de Gag y Gag-Pol es esencial para la infectividad
del virus. El análisis de secuencia de las PR retrovirales indicaba
que están relacionadas con proteasas "aspárticas" celulares
como pepsina y renina. Al igual que estas enzimas celulares, las PR
retrovirales utilizan dos restos de Asp añadidos en el sitio activo
para coordinar con una molécula de agua que cataliza la hidrólisis
de un péptido unido a la proteína diana. A diferencia de las
proteasas aspárticas celulares, que funcionan como seudo dímeros,
(utilizando dos pliegues de la misma molécula para generar el sitio
activo), las PR retrovirales funcionan como verdaderos dímeros. Los
datos de la cristalografía de rayos X de las PR de
VIH-1 indican que los dos monómeros se mantienen
juntos en parte mediante una lámina-\beta
antiparalela de cuatro cadenas derivada de ambos extremos N- y
C-terminales de cada monómero. El sitio de unión
del substrato se localiza dentro de una surco formado entre los dos
monómeros. Como sus homólogos celulares, los dímeros de PR de VIH
contienen "hojas" que sobresalen del sitio de unión y que
pueden estabilizar el substrato en el interior del surco; los restos
de Asp del sitio activo se encuentran en el centro del dímero.
Curiosamente aunque se observa alguna homología limitada en los
aminoácidos que se encuentran alrededor de los restos del sitio
activo, la secuencia primaria de las PR de retrovirales es altamente
divergente, aunque sus estructuras son notablemente similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Por definición, los retrovirus poseen la
habilidad de convertir sus genomas ARN de hebra sencilla en ADN de
doble hebra durante las primeras fases del proceso de infección. La
enzima que cataliza esta reacción es la TR, conjuntamente con su
actividad ARNsaH (endonucleasa) asociada. Las RTS retrovirales
tienen tres actividades enzimáticas: (a) polimerización de ADN
dirigida por ARN (para la síntesis de hebras de ADN
complementarias), (b) actividad ARNasaH (para la degradación del
cebador de ARNt y del ARN genómico presente en los intermediarios
híbridos ADN-ARN), (c) polimerización de ADN
dirigida por ADN (para la síntesis de la hebra segunda o
sentido).
La holoenzima RT madura de VIH-1
es un heterodímero de subunidades de 66 y 51 kd. La subunidad de
51-kd (p51) se deriva de la subunidad de
66-kd (p66) por eliminación proteolítica del dominio
ARNsaH de 15-kd del C terminal de P66 por PR (véase
Fig. IV). La estructura cristalina de RT de VIH-1
revela un pliegue altamente asimétrico en el que las orientaciones
de las subunidades p66 y p51 difieren substancialmente. La subunidad
p66 puede visualizarse como la subunidad derecha, con el sitio
activo de la polimerasa en la palma, y un surco profundo que se une
al molde formado por los subdominios palma, dedos y pulgar. El
dominio polimerasa se une a la ARNsaH por un subdominio de
conexión. El sitio activo, localizado en la palma, contiene tres
restos Asp críticos (110, 185 y 186) muy próximos, y dos iones
Mg^{2+} coordinados. La mutación de estos restos Asp anula la
actividad polimerizante de TR. La orientación de los tres restos Asp
del sitio activo es similar a la que se observaba en otras ADN
polimerasas (p. ej., el fragmento Klenow de la pol I de E.
coli). La subunidad p51 parece ser rígida y no forma un surco
polimerizante; los Asp 110, 185 y 186 de esta subunidad están
enterrados dentro de la molécula. Aproximadamente 18 pares de
bases del dúplex cebador-molde se encuentran en el
surco de unión del ácido nucleico, extendiéndose desde el sitio
activo de la polimerasa hasta el domino ARNsaH.
En la estructura
RT-cebador-molde-dNTP,
la presencia de un didesoxinucleótido en el extremo 3' del cebador
permite la visualización del complejo catalítico atrapado justo
antes del ataque del dNTP entrante. La comparación con la
estructuras obtenidas previamente sugiere un modelo donde los dedos
se cierran para atrapar al molde y al dNTP antes del ataque
nucleofílico del OH-3' del cebador del dNTP
entrante. Después de la adición del dNTP entrante a la cadena que
crece, se ha propuesto que los dedos adoptan una configuración mas
abierta, liberando así el pirofosfato y permitiendo que la RT se
una al dNTP siguiente. La estructura de la ARNasaH del
VIH-1 se ha determinado también por cristalografía
de rayos-X; este dominio presenta un pliegue global
similar al ARNasaH de E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
Una característica que distingue la replicación
de los retrovirus es la inserción de una copia de ADN de genoma
viral en el cromosoma de la célula hospedadora siguiendo la
transcripción inversa. EL ADN viral integrado (el provirus) sirve
como molde para la síntesis de ARN virales y se mantiene como parte
del genoma de la célula hospedadora durante toda la vida de la
célula infectada. Los retrovirales mutantes deficientes en la
habilidad de integrar generalmente fallan al establecer una
infección productiva.
La integración del ADN viral se cataliza por
integrasa, una proteína de 32-kd generada por la
escisión mediada por PR de la porción del C-terminal
de la poliproteína Gag-Pol de
VIH-1(véase Fig. IV).
Las proteínas retrovirales IN se componen de
tres dominios estructural y funcionalmente distintos: Un dominio
N-terminal que contiene un dedo de zinc, un dominio
central, y un dominio C-terminal relativamente no
conservado. Debido a su baja solubilidad, no ha sido posible
todavía cristalizar la proteína completa de
288-amino ácidos de VIH-1. Sin
embargo, la estructura de todos los tres dominios se ha resuelto
independientemente por cristalografía de rayos x o por métodos de
RMN. La estructura del cristal del dominio central de la IN del
virus del sarcoma de las aves ha sido también determinada. El
domino N-terminal (restos 1-55),
cuya estructura se ha resuelto por espectroscopia de RMN, se
compone de cuatro hélices con un zinc coordinado por los aminoácidos
His-12, His-16,
Cys-40, y Cys-43. La estructura del
dominio N-terminal recuerda a las proteínas
helicoidales de unión a ADN que contienen el denominado motivo de
hélice-vuelta-hélice; sin embargo,
en la estructura del VIH-1 este motivo contribuye a
la formación del dímero. Inicialmente, la baja solubilidad
obstaculizó los esfuerzos para resolver la estructura del dominio
central. Sin embargo, los intentos de cristalografía tuvieron éxito
cuando se observó que el cambio de Phe a Lys en el resto 185 de IN
incrementaba considerablemente la solubilidad sin perturbar la
actividad catalítica in vitro. Cada monómero del dominio
central de IN del VIH-1 (restos 50 a 212 de IN) se
compone de \beta-láminas de cinco hebras
flanqueadas por hélices; esta estructura se parece
sorprendentemente a otras polinucleotidiltransferasas incluyendo
ARNasaH y la transposasa del bacteriófago MuA. Tres restos
altamente conservados se encuentran en posiciones análogas en otra
polinuclotidiltransferasas; en las IN de VIH-1
estos son el Asp-64, ASp-116 y
Glu-152, el denominado motivo
D,D-35-E. Las mutaciones en estas
posiciones bloquean la función de IN en VIH-1 tanto
in vivo como in vitro. La estrecha proximidad de
estos tres aminoácidos en la estructura del cristal tanto en el
virus del sarcoma de las aves como en los dominios centrales del
VIH-1 apoya la hipótesis de que estos restos juegan
un papel central en la catálisis de reacción de transferencia de
polinucleotidos que es esencial en el proceso de integración. El
domino C-terminal, cuya estructura se ha resuelto
por métodos de RMN, adopta una topología de plegado
barril-\beta de cinco hebras que recuerda al
dominio de homología Scr 3 (SH3\cdot). Recientemente, se han
resuelto las estructuras de rayos X de VIS y de fragmentos de
proteínas IN del virus del sarcoma de Rous que abarcan tanto los
dominios central como C-terminal.
\vskip1.000000\baselineskip
Las glicoproteínas Env de VIH juegan un papel
importante en el ciclo de la vida del virus. Contienen los
determinantes que interaccionan con el correceptor y receptor CD4,
y catalizan la reacción de fusión entre la bicapa lipídica de la
envoltura del virus y la membrana plasmática de la célula
hospedadora. Además, las glicoproteínas Env de VIH contienen los
epítopos que provocan las respuestas inmunes que son importantes
tanto desde las perspectivas de diagnostico como de desarrollo de
vacunas.
Las glicoproteínas Env de VIH se sintetizan a
partir del ARNm bicistrónico de 4,3-kb de Vpu/Env
separado y empalmado (véase Fig. IV); la traducción ocurre en los
ribosomas asociados con el retículo endoplásmico rugoso (RE). El
precursor de la poliproteína de 160-kd (gp160) es
una proteína integral de la membrana que está anclada en las
membranas celulares por una señal hidrófoba de
parada-transferencia en el dominio destinada a ser
la glicoproteína Env madura de TM, gp41 (Fig. VI). La gp160 se
glicosila cotraduccionalmente, forma enlaces disulfuro, y se somete
a la oligomerización en el RE. La forma oligomérica predominante
parece ser un trímero, aunque también se han observado dímeros y
tetrámeros. La Gp160 se transporta al Golgi, donde, como otras
proteínas precursoras de la envoltura retroviral, es cortada
proteoliticamente por enzimas celulares hasta obtener la
glicoproteína gp120 madura de SU y la glicoproteína gp41 de TM
(véase Fig. VI). La enzima celular responsable de la escisión de
los precursores Env de los retrovirales siguiendo un motivo
altamente conservado
Lys/Arg-X-Lys/Arg-Arg
es la furina o una proteasa similar a la furina, aunque también
otras enzimas pueden catalizar también el procesado de gp160. La
escisión de gp160 es necesaria para la actividad de fusión inducida
por Env y para la infectividad del virus. Con posterioridad a la
escisión de gp160, gp120 y gp141 forman una asociación no covalente
que es crítica para el transporte del complejo Env desde el Golgi a
la superficie de la célula. La interacción
gp120-gp41 es bastante débil y una cantidad
importante de gp120 se elimina de la superficie de las células que
expresan Env.
El complejo de glicoproteína Env de VIH, en
particular el dominio SU (gp120), está fuertemente glicosilado;
aproximadamente la mitad de la masa molecular de gp160 se compone de
cadenas laterales de oligosacáridos. Durante el transporte de Env
desde su lugar de síntesis en el RE a la membrana plasmática, muchas
de la cadenas laterales se modifican por la adición de azucares
complejos. Las numerosas cadenas laterales de oligosacáridos forman
lo que podría imaginarse como una nube de azúcar que oculta gran
parte de gp120 al reconocimiento inmune del hospedador. Como se
indica en la Fig. VI, gp120 contiene dominios conservados (C_{1} a
C_{5}) y variables (V_{1} a V_{5}) intercalados. Los restos
Cys presentes en las gp120s de diferentes aislados están altamente
conservadas y forman enlaces disulfuro que unen las cuatro primeras
regiones variables en grandes bucles.
Una función primaria de las glicoproteínas Env
virales es promover una reacción de fusión de membrana entre las
bicapas lipídicas de las envolturas virales y las membranas de las
células hospedadoras. Este episodio de fusión de membrana permite
que el núcleo viral consiga entrar en el citoplasma de la célula
hospedadora. Una serie de regiones tanto en gp120 como en gp41 han
estado implicadas, directa o indirectamente, en la fusión de
membrana mediada por Env. Los estudios de la proteína hemaglutinina
HA_{2} de los ortomyxovirus y de la proteína F de los
paramixovirus indican que el dominio altamente hidróbofo en el
extremo N-terminal de esta proteína, denominado el
péptido fusión, juega un papel critico en la fusión de la membrana.
El análisis de las mutaciones demostró que un dominio análogo
estaba localizado en el extremo N-terminal de las
glicoproteínas de VIH-1, VIH2, y VIS (véase Fig.
VI). Las substituciones no hidrófobas dentro de esta región de gp41
reducen o bloquean en gran medida la formación del sincitio y
tienen como resultado la producción de una progenie de viriones no
infecciosa. El C-terminal del péptido de fusión gp41
se compone de dos dominios helicoidales anfipáticos (véase Fig. VI)
que juegan un papel central en la fusión de la membrana. Las
mutaciones en la hélice N-terminal (denominada
hélice N), que contiene un motivo de héptada repetitiva tipo
cremallera de Leu, deterioran la infectividad y la actividad de
fusión de la membrana, y los péptidos derivados de esas secuencias
exhiben una actividad antiviral potente en el cultivo. La estructura
del ectodominio de gp41 de VIH-1 y de VIS, los dos
motivos helicoidales en particular, ha sido el centro de los
análisis estructurales en los últimos años. La estructuras se
determinaron por cristalografía de rayos X o espectroscopia RMN
bien para las proteínas de fusión que contienen dominios
helicoidales, para una mezcla de los péptidos derivada de hélices C-
y N-, o en el caso de la estructura de VIS, para la secuencia
intacta del ectodominio de gp41 desde el resto 27 al 149. Estos
estudios obtuvieron fundamentalmente estructuras diméricas
similares, en las que los dos dominios helicoidales se empaquetan
de un modo antiparalelo para generar un empaquetamiento de seis
hélices. Las hélices-N forman una espiral enrollada
en el centro del empaquetamiento, con las hélices-C
empaquetadas dentro de los surcos hidrófobos de la parte
exterior.
En los pasos que conducen a la fusión de la
membrana la unión de CD4 induce cambios conformacionales en Env
que facilitan la unión de correceptor. Después de la formación de un
complejo ternario gp120/CD4/correceptor, gp41 adopta una
conformación hipotética que permite que el péptido de fusión se
inserte en la bicapa lipídica diana. La formación del paquete de
seis hélices de gp41 (que implica interacciones antiparalelas entre
las hélices C y N de Gp41) reúne las membranas virales y celulares y
se lleva a cabo la fusión de las membranas.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a la generación
de una respuesta inmune de las células T CD8^{+} frente a un
antígeno y también a provocar la respuesta de los anticuerpos. Más
concretamente, la presente invención se refiere a regímenes de
inmunización inducción/potenciación (prime/boost) en los que
la respuesta inmune inducida por la administración de una
composición inductora se estimula mediante la administración de una
composición potenciadora. La presente invención se basa en la
demostración experimental de los inventores de que el estímulo
eficaz se puede conseguir utilizando vectores modificados del virus
vaccinia Ankara (MVA), después de la estimulación con cualquiera de
una variedad de diferentes tipos de composiciones estimuladoras
incluida la del propio MVA recombinante.
Un componente importante de protección de la
respuesta inmune frente a gran número de patógenos es la mediada
por los linfocitos T del tipo CD8^{+}, también conocidos como
linfocitos T citotóxicos (CLT). Una función importante de las
células T CD8^{+} es la secreción de interferón gamma
(IFN\gamma), y esto proporciona una medida de la respuesta inmune
de las células T CD8^{+}. Un segundo componente de la respuesta
inmune es el anticuerpo dirigido a las proteínas del patógeno.
La presente invención emplea un MVA, que tal y
como muestran los experimentos que se indican a continuación, ha
resultado ser un medio eficaz para proporcionar una potenciación de
la respuesta inmune de las células T CD8^{+} inducida por
antígeno utilizando cualquiera de una variedad de diferentes
composiciones inductoras y también despertando una respuesta de los
anticuerpos.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Es digno de mención que los trabajos
experimentales descritos a continuación indican que el uso de las
realizaciones de la presente invención permite que los virus
recombinantes MVA que expresan un antígeno VIH potencien una
respuesta inmune de las células T CD8^{+} estimulada por una
vacuna de ADN y despierten también provocando una respuesta de los
anticuerpos. Se descubrió que el MVA induce la respuesta inmune de
las células T CD8^{+} después de inmunización intradérmica,
intramuscular o mucosa. El MVA recombinante también ha demostrado
que induce una respuesta inmune potenciada por una o mas
inoculaciones de MVA recombinante.
Los primates no humanos inmunizados con un
plásmido de ADN y potenciados con MVA estaban protegidos
eficazmente frente a la provocación intramucosa con virus vivo.
Ventajosamente, los inventores encontraron que se puede emplear un
régimen de vacunación utilizando inmunización intradérmica,
intramuscular o mucosa tanto para la inducción como para la
potenciación, constituyendo un régimen general de inmunización
adecuado para inducir las células T CD8^{+} y también para
despertar una respuesta de los anticuerpos, p. ej. en humanos.
La presente invención emplea en varios aspectos
y realizaciones un vector de MVA que codifica un antígeno de VIH
como se define en las reivindicaciones anexas para la potenciación
de la respuesta inmune de las células CD8^{+} frente a un
antígeno inductor por la administración previa de un ácido nucleico
que codifica el antígeno y también despertando una respuesta de
anticuerpos.
Un aspecto general de la presente invención
proporciona el uso de un vector de MVA como se define en las
reivindicaciones anexas para potenciar una respuesta inmune celular
frente a un antígeno de VIH y también para despertar una respuesta
de anticuerpos.
Un aspecto de la presente invención proporciona
el uso de un vector de MVA que incluye un ácido nucleico que
codifica el antígeno que se define en las reivindicaciones anexas
unido operativamente a secuencias reguladoras para la producción
del antígeno en el individuo por expresión del ácido nucleico, con
lo que una respuesta inmune de la célula T CD8^{+} frente al
antígeno previamente inducida en el individuo, se potencia para la
preparación de una vacuna para potenciar una respuesta inmune de las
células T CD8^{+} frente a un antígeno VIH en un individuo y
también despertar una respuesta de los anticuerpos.
Se puede inducir una respuesta inmune a un
antígeno de VIH por inmunización con un ADN plasmídico o por
infección con un agente infeccioso.
Un aspecto adicional de la invención establece
el uso de una composición inductora que comprende el ácido nucleico
que codifica el antígeno y una composición potenciadora que
comprende un vector de MVA que incluye un ácido nucleico que
codifica el antígeno unido operativamente a secuencias reguladoras
para la producción del antígeno en un individuo por expresión del
ácido nucleico, para la preparación de una vacuna para inducir una
respuesta inmune de la célula T CD8^{+} frente a un antígeno VIH
en un individuo y también despertar una respuesta de anticuerpos
donde la composición inductora se va a administrar antes que la
composición potenciadora.
Un aspecto adicional establece el uso de un
vector de MVA, como se ha descrito, en la fabricación de un
medicamento para administrar a un mamífero para potenciar la
respuesta inmune de las células T CD8^{+} frente un antígeno de
VIH, y también despertar una respuesta de anticuerpos. Tal
medicamento se administra generalmente después de una
administración previa de una composición inductora que comprende un
ácido nucleico que codifica el antígeno.
La composición inductora puede comprender
cualquier vector viral, del tipo del vector del virus vaccinia,
tal como una cepa deficiente para la replicación como el virus
vaccinia Ankara modificado (MAV) o NYVAC (Tartaglia et al.
1992 Virology 118:217-232), un vector de la viruela
aviar del tipo de la viruela de aves de corral o del canario., p.
ej. la cepa conocida como ALVAC (Paoletti et al. 1994 Dev
Biol Stand 82: 65-69), o un vector de un adenovirus
o un vector de virus de la estomatitis vesicular o un vector de
alfavirus.
La composición inductora puede comprender el ADN
que codifica el antígeno, tal como ADN en la forma de un plásmido
circular que no es capaz de replicarse en células de mamíferos. El
marcador de selección no será la resistencia a un antibiótico de
uso clínico, así por ejemplo la resistencia a la Kanamicina es
preferible a la resistencia a la Ampicilina. La expresión del
antígeno debe ser dirigida por un promotor que sea activo en
células de mamíferos, por ejemplo el promotor precoz inmediato de
citomegalovirus (CMV IE).
En realizaciones particulares de diversos
aspectos de la presente invención, la administración de una
composición inductora va seguida de potenciación con una
composición potenciadora, o de una primera y una segunda
composiciones potenciadoras, siendo la primera y la segunda
composiciones potenciadoras iguales o diferentes una de la otra. Se
pueden utilizar aún composiciones potenciadoras adicionales sin
apartarse de la presente invención. En una realización, un régimen
de inmunización triple emplea ADN, después adenovirus como una
primera composición potenciadora, a continuación MVA como segunda
composición potenciadora, y a continuación opcionalmente una
(tercera) composición potenciadora adicional o composiciones
potenciadoras posteriores de uno u otro o ambos vectores iguales o
diferentes. Otra opción es ADN, después MVA, después adenovirus,
seguido de posteriores administraciones opcionales de uno u otro o
de ambos vectores iguales o diferentes.
El antígeno que va a ser codificado en las
respectivas composiciones inductora y potenciadora (aunque pueden
utilizarse muchas composiciones potenciadoras) no necesita ser
idéntico, pero debe compartir al menos un epítopo de la célula T
CD8^{+}. El antígeno puede corresponder a un antígeno completo, o
a un fragmento del mismo. Pueden utilizarse epítopos peptídicos o
cadenas artificiales de los epítopos, cortando más eficazmente la
secuencia innecesaria de la proteína en el antígeno y la secuencia
codificante en el vector o en los vectores. Se pueden incluir uno o
más epítopos adicionales, por ejemplo epítopos que son reconocidos
por las células T colaboradoras (helper), especialmente
epítopos reconocidos en individuos con tipos de HLA diferentes.
Un antígeno de VIH codificado por un virus MVA
recombinante como se define en las reivindicaciones posteriores
incluye polipéptidos que tienen actividad inmunogénica despertada
por una secuencia de aminoácidos de Env, Gag, Pol, Vif, Vpr, Tat,
Rev, Vpu, o Nef de VIH similar a al menos un epítopo de la célula T
CD8^{+}. Esta secuencia de aminoácidos corresponde de forma
substancial al menos a un fragmento de 10-900
aminoácidos y/o a una secuencia consenso de un Env o Pol de VIH
conocido; o al menos a un fragmento de 10-450
aminoácidos y/o a una secuencia consenso de un Gag de VIH conocido;
o al menos a un fragmento de 10-100 aminoácidos y/o
a una secuencia consenso de un Vif, Vpr, Tat, Rev, Vpu o Nef de VIH
conocido.
Aunque se presenta una secuencia completa del
precursor Env para su uso en la presente invención, Env se suprime
opcionalmente de las subsecuencias. Por ejemplo, los productos de
escisión de las regiones de superficie gp120 y de transmembrana
gp41 se pueden suprimir.
Aunque se presenta una secuencia completa del
precursor de Gag para su uso en la presente invención, Gag se
suprime opcionalmente de las subsecuencias. Por ejemplo, se pueden
suprimir las regiones de la proteína matriz (p17), las regiones de
la proteína de la cápsida (p24), las regiones de la proteína de la
nucleocápsida (p7) y las regiones de p6 (péptido
C-terminal de la poliproteína Gag).
Aunque se presenta una secuencia completa del
precursor Pol para su uso en la presente invención, Pol se suprime
opcionalmente de las subsecuencias. Por ejemplo, se pueden suprimir
las regiones de la proteína proteasa (p10), las regiones de la
proteína transcriptasa inversa (p66/p51), y las regiones de la
proteína integrasa (p32).
Estas Env, Gag, o Pol de VIH pueden tener una
identidad total de hasta 50% con las secuencias de aminoácidos de
las proteínas Env, Gag, o Pol conocidas, del orden de
50-99% de identidad, o cualquier intervalo o valor
incluido en el mismo, mientras que provoquen una respuesta inmune
frente al menos una cepa de VIH.
El porcentaje de identidad se puede determinar,
por ejemplo, comparando la información de la secuencia utilizando
el programa de ordenador GAP, versión 6.0, puesto a disposición por
el Grupo de Genética Computerizada de la Universidad de Wisconsin
(UWGCG). El programa GAP utiliza el método del alineamiento de
Needleman y Wunsch (J. Mol Biol 1970 48:443), revisado por Smith y
Waterman (Adv Appl Math 1981 2:482). En resumen, el programa GAP
define la identidad como el número de símbolos alineados (p. ej.
nucleótidos o aminoácidos) idénticos, divididos por el numero total
de símbolos en la más corta de dos secuencias. Los parámetros
preferidos por defecto para el programa GAP incluyen: (1) Una
matriz unitaria de comparación (que contiene un valor 1 para
identidades y 0 para no identidades) y la matriz ponderada de
comparación de Gribskov y Burgues (Nucl Acids Res 1986 14:6745),
descrita por Schwartz and Dayhoff (eds., Atlas of Protein Sequence
and Structure, Nacional Biomedical Research Foundation, Washington,
D.C. 1979, pp. 353-358); (2) una penalización de 3,0
para cada diferencia y una penalización de 0,10 para cada símbolo
en cada diferencia; y (3) ninguna penalización para las diferencias
en los extremos.
En una realización preferida, una Env de la
presente invención es una forma variante de por lo menos una
proteína de la envoltura de VIH. Preferiblemente, la Env está
compuesta por gp120 y los dominios de transmembrana y el ectodominio
de gp141 pero carece de parte o de todos los dominios citoplásmicos
de gp41.
Las subsecuencias de VIH conocidas ya están
disponibles en las bases de datos de secuencias de VIH comerciales e
institucionales, como GENBANK, o como publicaciones de
compilaciones, como Myers, Vol. I y II, Theoretical Biology and
Biophysics, Los Alamos, N. Mex. (1993), o
http://hiv-web.lanl.gov/.
Las substituciones o inserciones de una Env, Gag
o Pol de VIH para obtener una Env, Gag o Pol adicional, codificada
por un ácido nucleico para su uso en los virus MVA recombinantes de
la presente invención, pueden incluir substituciones o inserciones
de por lo menos un resto de aminoácido (p. ej. 1-25
aminoácidos). Como alternativa, se puede eliminar al menos un
aminoácido (p. ej. 1-25 aminoácidos) de la secuencia
de Env, Gag o Pol de VIH. Preferiblemente, estas substituciones,
inserciones o deleciones se identifican en base a sus
características de seguridad, niveles de expresión, inmunogenicidad
y compatibilidad con tasas altas de replicación de MVA.
Las variaciones en la secuencia de aminoácidos
en una Env, Gag o Pol de VIH de la presente invención pueden
prepararse p. ej. por mutaciones en el ADN. Estas Env, Gag o Pol de
VIH incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones o substituciones
de nucleótidos que codifican restos de aminoácidos diferentes en la
secuencia de aminoácidos. Obviamente, la mutaciones que se
efectuarán en los ácidos nucleicos que codifican Env, Gag o Pol de
VIH no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y
preferiblemente no crearán dominios complementarios que pudiesen
producir estructuras secundarias de ARNm.
El ácido nucleico que codifica las Env, Gag o
Pol de VIH de la presente invención puede también prepararse por
amplificación o mutagénesis dirigida de nucleótidos en el ADN o ARN
que codifica una Env, Gag o Pol y por lo tanto sintetizar o
transcribir inversamente el ADN codificante para producir el ADN o
el ARN que codifica una Env, Gag o Pol de VIH, sobre la base de las
enseñanzas y orientaciones presentadas aquí.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los virus MVA recombinantes que expresan las
Env, Gag o Pol de VIH de la presente invención, incluyen un grupo
limitado de secuencias codificantes de Env, Gag o Pol de VIH como
substituciones de nucleótidos que pueden obtenerse rutinariamente
por el experto en la técnica, sin experimentación indebida, sobre la
base de las enseñanzas y orientaciones presentadas aquí. Para una
descripción detallada de la química y estructura de las proteínas,
véase Schulz, G.E. et al., 1978 Principles of Protein
Structure, Springer-Verlag, Nueva York, N.Y., y
Creighton, T.E., 1993 Proteins: Structure and Molecular Properties,
W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA. Para una presentación
sobre substituciones en secuencias de nucleótidos, p. ej.
preferencias de codones, véase Ausubel et al. eds. Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publidhing Assoc., Nueva
York, N.Y. 1994 en \NAK\NAK A.1.1-A.1.24, y
Sambrook, J et al. 1989 Molecular Cloning:A Laboratoty
Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, N.Y. en apéndices C y D.
Por lo tanto, un experto en la técnica, con las
enseñanzas y orientaciones presentadas aquí, sabrá como substituir
otros restos de aminoácidos en otras posiciones de un ADN o ARN de
env, gag o pol de VIH para obtener Env, Gag o
Pol de VIH alternativas, incluyendo variantes con substituciones,
delecciones o inserciones.
En el vector MVA, las secuencias reguladoras de
la expresión del antígeno codificado incluirán promotores de
poxvirus naturales, modificados o artificiales. Por "promotor"
se entiende una secuencia de nucleótidos a partir de la cual se
puede iniciar la transcripción del ADN unido operativamente aguas
abajo (es decir, en la dirección 3' de la hebra sentido de un ADN
de doble hebra). "Unido operativamente" significa unido como
parte de la misma molécula de ácido nucleico, situado adecuadamente
y orientado para que se inicie la transcripción desde el promotor.
Un ADN unido operativamente a un promotor está "bajo la
regulación de la iniciación de la transcripción" del promotor.
Se pueden incluir, si es adecuado, otras secuencias reguladoras que
incluyan fragmentos de terminación, secuencias de poliadenilación,
marcadores genéticos y otras secuencias, de acuerdo con los
conocimientos y práctica de un experto en la técnica habitual:
véase, por ejemplo, Moss, B. (2001). Poxviridae: the viruses and
their replication. En Fields Virology, D.M. Knipe, y P.M. Howley,
eds. (Philadelphia, Lippincott Williams & Williams), pp.
2849-2883. Muchas de las técnicas conocidas y de los
protocolos de manipulación del ácido nucleico, por ejemplo en la
preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis,
secuenciación, introducción de ADN en las células y expresión
génica, y del análisis de proteínas, están descritas detalladamente
en Current Protocols in Molecular Biology, 1998 Ausubel et
al. eds., John Wiley & Sons.
Los promotores que se usan en los aspectos y
realizaciones de la presente invención deben ser compatibles con los
sistemas de expresión de los poxvirus e incluir secuencias
naturales, modificadas o artificiales.
Cada una o ambas composiciones inductora y
potenciadora pueden incluir un coadyuvante, p. ej un factor
estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos
(GM-CSF) o el ácido nucleico que lo codifica.
La administración de una composición
potenciadora se produce generalmente entre 1 y 6 meses
aproximadamente después de la administración de la composición
inductora, preferiblemente entre 1 y 3 meses aproximadamente.
Preferiblemente, la administración de la
composición inductora, de la composición potenciadora, o de ambas
composiciones inductora y potenciadora, es inmunización
intradérmica, intramuscular o mucosa.
La administración de vacunas de MVA se puede
llevar a cabo utilizando una aguja para inyectar una suspensión del
virus. Una alternativa es el uso de dispositivos de inyección sin
aguja para administrar la suspensión del virus (usando, p. ej. el
inyector sin aguja Biojector^{tm}) o un polvo liofilizado
resuspendido que contenga la vacuna, proporcionados para fabricar
dosis preparadas individualmente que no necesitan almacenaje en
frío. Esto seria una gran ventaja para una vacuna que se necesite en
las áreas rurales de África.
El MVA es un virus con un excelente historial de
seguridad en las inmunizaciones de seres humanos. La generación de
virus recombinantes puede producirse fácilmente, y éstos pueden ser
fabricados de forma reproducible en grandes cantidades. La
administración intradérmica, intramuscular o mucosa del virus MVA
recombinante es por lo tanto altamente adecuada en la vacunación
profiláctica o terapéutica de seres humanos contra el SIDA que se
puede controlar por una respuesta de las células T CD8^{+}.
El individuo puede contraer el SIDA de tal
manera que la distribución del antígeno y la generación de una
respuesta inmune de las células T CD8^{+} frente al antígeno sea
beneficiosa o tenga un efecto terapéutico beneficioso.
Más probablemente, la administración tendrá el
fin profiláctico de generar una respuesta inmune contra el VIH o el
SIDA antes de la infección o del desarrollo de los síntomas.
Los componentes que se administran según la
presente invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas.
Estas composiciones pueden comprender un excipiente
farmacéuticamente aceptable, un vehículo, un tampón, un
estabilizante u otros materiales bien conocidos por el experto en la
técnica. Tales materiales no deben ser tóxicos y no deberían
interferir en la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza
precisa del vehículo o de otro material puede depender de la vía de
administración, p. ej. vía intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal,
intramuscular o intraperitoneal.
Como se ha señalado, la administración es
preferiblemente intradérmica, intramuscular o mucosa.
Puede incluirse una disolución salina
fisiológica, dextrosa u otras disoluciones de sacáridos, o glicoles
como etilenglicol, propilenglicol, o polietilenglicol.
Para la inyección intravenosa, cutánea,
subcutánea, intramuscular o mucosa, o para la inyección en el lugar
del dolor, el ingrediente activo estará en forma de una disolución
acuosa aceptable por vía parenteral que este libre de pirógenos y
tenga el pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos en
la técnica pueden preparar disoluciones adecuadas utilizando, por
ejemplo, vehículos isotónicos como Inyección de Cloruro Sódico,
Inyección de Ringer, Inyección de Ringer Lactato. Se pueden incluir
conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros
coadyuvantes si fuese necesario.
Se puede utilizar una formulación de liberación
lenta.
Después de la producción de las partículas de
MVA y la formulación opcional de tales partículas en composiciones,
las partículas se pueden administrar a un individuo, en particular a
seres humanos u otro primate. Se puede administrar a otro mamífero,
p. ej. a roedores como el ratón, rata o hámster, cobaya, conejo,
oveja, cabra, cerdo, caballo, vaca, burro, perro o gato.
La administración se realiza preferiblemente en
una "cantidad efectiva para la profilaxis" o en una "cantidad
terapéuticamente efectiva" (según el caso, aunque la profilaxis
puede considerarse terapia), siendo ésta la suficiente para obtener
beneficio en el individuo. La cantidad real o efectiva administrada,
la velocidad y la duración del tratamiento, dependerá de la
naturaleza y gravedad de lo que se está tratando. La prescripción
del tratamiento, p. ej. las decisiones sobre la dosificación etc.,
son responsabilidad del médico general o de otros médicos, o en un
contexto veterinario del veterinario, y normalmente se tiene en
cuenta la enfermedad que se va a tratar, el estado del paciente
individual, el lugar de distribución, el método de administración y
otros factores conocidos por los profesionales. Se pueden encontrar
ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente en
Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, 1980, Osol, A.
(ed.).
En un régimen preferido, el ADN se administra en
una dosis de 250 \mug a 2,5 mg/inyección, seguida de MVA en una
dosis comprendida de 10^{6} a 10^{9} partículas de virus
infeccioso/inyección.
Una composición se puede administrar a solas o
en combinación con otros tratamientos, bien simultáneamente o
secuencialmente dependiendo de la enfermedad que va ser tratada.
La administración a un mamífero no humano no es
necesariamente para uso terapéutico, sino que puede ser para uso en
un contexto experimental, por ejemplo en la investigación de
mecanismos de respuestas inmunes a un antígeno de interés, p. ej.
protección contra VIH o SIDA.
Otros aspectos y realizaciones de la presente
invención se consideran obvios para un experto en la materia a la
vista de la descripción anterior y de los siguientes ejemplos
experimentales, incluidos para ilustrar y no para limitar y
referidos a las figuras adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayó la capacidad de un proceso de
inducción con ADN y potenciación con poxvirus para proteger contra
una provocación mucosa altamente patógena. Se utilizó la quimera
89,6 de los virus de la inmunodeficiencia humana y de simios
(VIHS-89,6) para la construcción de inmunógenos, y
su derivado altamente patógeno, VIHS-89,6P, para la
provocación (G.B. Karlsson et al. 1997 J Virol 71: 4218).
VIHS-89,6 y VIHS-89,6P no generan
anticuerpos neutralizantes cruzados (D.C... Montefiori et
al. 1998 J. Vir 72: 3427) y nos permiten dirigir la capacidad
del las células T y de los anticuerpos no neutralizantes
incrementados por la vacuna para controlar un virus de provocación
de la inmunodeficiencia. Se utilizó vaccinia Ankara modificado (MVA)
para la construcción de un poxvirus recombinante. MVA ha resultado
altamente efectivo en la potenciación de células T CD8 inducidas
por ADN y goza de la característica de seguridad de no replicarse
eficazmente ni en células humanas o ni de monos (H.L. Robinson et
al 2000 AIDS Reviews 2:105).
Para asegurar una respuesta inmune amplia ambos
componentes ADN y MVA recombinante (rMVA) de la vacuna expresaron
múltiples proteínas del virus de la inmunodeficiencia. El ADN
inductor (ADN/89,6) expresó Gag, Pol, Vif, Vpx y Vpr del virus de
la inmunodeficiencia del simio (VIS) y Env, Tat y Rev del virus I de
la inmunodeficiencia humana (VIH-1) a partir de un
solo transcrito (R.J. Gorelick et al. 1999 Virology 253:259;
M.M. Sauter et al 1996 J Cell Biol 132:795).
Las secuencias de VIHS-89,6
clonadas molecularmente se clonaron en el vector pGA2 utilizando los
sitios ClAI y RsrII. Esta clonación eliminó las repeticiones
terminales largas (LTRS) y nef. Las secuencias
VIHS-89,6 también sufrieron mutaciones en el
interior en una región de 12 pares de bases que codifica los
primeros cuatro aminoácidos del segundo dedo de zinc de la
nucleocápsida. Esta mutación produce virus VIHS no infecciosos
(R.J. Gorelick et al. 1999 Virology 253:259). Una mutación de
gp41 convierte la tirosina de la posición 710 en cisteína para
conseguir una expresión mejor de Env en la membrana plasmática de
las células que expresan el ADN. (M.M. Sauter et al 1996 J
Cell Biol 132:795). pGA2 utiliza el promotor temprano inmediato de
CMV sin el intrón A y la secuencia de poliadenilación de la hormona
del crecimiento bovina para expresar los insertos de la vacuna. El
ADN de la vacuna fue producido por Althea (San Diego, CA). En
transfecciones transitorias de las células 293T, el ADN/89,6 produjo
aproximadamente 300 ng de Gag y 85 ng de Env por 1x10^{6}
células.
El potenciador rMVA (MVA/89,6) expresó Gag, Pol
de VIS y Env de VIH-1 bajo el control de los
promotores tempranos y tardíos del virus vaccinia.
El virus recombinante doble de MVA expresó tanto
Env de VIH 89,6 como Gag-Pol 239 de VIS, que fueron
insertadas en la deleción II y la deleción III de MVA
respectivamente. La proteína Env de 89,6 fue truncada en los 115
aminoácidos del COOH terminal de gp41. El promotor H5 modificado
controló la expresión de ambos genes extraños.
La vacunación se llevo a cabo mediante inducción
con ADN en las semanas 0 y 8 y potenciación con rMVA a las 24
semanas (Fig. 1A).
Las inmunizaciones con ADN intradérmicas e
intramusculares se administraron en una disolución salina tamponada
con fosfato (PBS) con un inyector sin aguja (Bioject, Portland, OR)
para administrar cinco inyecciones intradérmicas de
100-ul en cada cara externa del muslo para la dosis
de 2,5 mg de ADN o una inyección intradérmica de 100 \mul en la
cara externa del muslo derecho para la dosis de 250 \mug de
plásmido. Las administraciones intramusculares de ADN se realizaron
con una inyección de 0,5 ml de ADN en PBS en cada cara externa del
muslo para la dosis de 2,5 mg y una inyección de 100 \mul en la
cara externa del muslo derecho la dosis de 250 \mug. Se
administraron 1x10^{8} pfu de MVA/89,6 con una aguja tanto
intradérmica como intramuscularmente. Se administró una dosis de
100 \mul a cada cara externa del muslo para la dosis intradérmica
y una dosis de 500 \mul a cada cara externa del muslo para la
dosis intramuscular. Los animales control recibieron 2,5 mg del
vector de pGA2 sin inserto de vacuna con un dispositivo Bioject
para administrar cinco dosis de 100 \mul intradérmicas a cada
cara externa del muslo. El control de la inmunización del
potenciador MVA consistió en 2x10^{8} pfu de MVA sin inserto
distribuidas intradérmica e intramuscularmente como se describió
para MVA/89,6.
Cada uno de los cuatro grupos de seis macacos
rhesus fue inducido bien con 2,5 mg (dosis alta) o 250 \mug
(dosis baja) de ADN por ruta intradérmica (i.d.) o intramuscular
(i.m.) usando un dispositivo de inyección sin aguja a alta presión
(Bioject, Portland, OR) (T.M. Allen et al. 2000 J Immunol
164:4968).
Los macacos rhesus adultos jóvenes de la colonia
de cría de Yerkes fueron cuidados según las directrices establecidas
por el "Animal Welfare Act y la NIH Guide for the Care and Use of
Laboratoy Animals" con los protocolos aprobados por el Comité
Institutional para el cuidado y utilización de animales de la
"Universidad de Emory (Emory University Institucional Animal Care
and Use Committee". Los macacos se clasificaron según el alelo
Mamu-A*01 por análisis de la reacción de
cadena de la polimerasa (PCR) (M.A. Egan et al. 2000 J Virol
74:7485; I. Ourmanov et al. 2000 J Virol 74:2740. Dos o más
animales que contenían al menos un alelo Mamu-A*01
fueron asignados a cada grupo. Los números de los animales son los
que siguen: 1, RBr-5*; 2, Rlm-5*; 3,
RQf-5*; 4, RZe-5*; 5,
ROm-5; 6, RDm-5; 7,
RAj-5*; 8, RJi-5*; 9,
RAl-5*; 10, RDe-5*; 11,
RAi-5; 12, RPr-5; 13,
RKw-4*; 14, RWz-5*; 15,
RGo-5; 16, RLp-4; 17,
RWd-6; 18, RAt-5; 19,
RPb-5*; 20, Rli-5*; 21,
Rlq-5; 22, RSp-4; 23,
RSn-5; 24, RGd-6; 25,
RMb-5*; 26, RGy-5*; 27,
RUs-4; y 28, RPm-5. Los animales con
el alelo A*01 se indican con asteriscos.
No se utilizó la administración de genes con
pistolas porque habían inducido respuestas inmunes no protectoras
en un ensayo en 1996-98 (H. L. Robinson et
al. 1999 Nat Med 5:526). El potenciador de inmunización MVA/89,6
(2x10^{8} unidades formadoras de placas, pfu) se inyectó con una
aguja tanto intradérmica como intramuscularmente. Un grupo de
control incluyó dos animales que simulaban inmunización y dos
animales sin tratamiento previo. El virus de provocación se
administró siete meses después de la potenciación con rMVA para
comprobar la generación de inmunidad de larga duración. Puesto que
la mayoría de las infecciones de VIH-1 se trasmiten
a través de superficies mucosas, se administró una provocación
intrarectal.
La inducción con ADN seguida de la potenciación
con rMVA generó frecuencias altas de células T específicas para el
virus que alcanzaban un pico máximo a la semana siguiente de la
potenciación con rMVA (Fig. 1.). Las frecuencias de las células T
que reconocen el epítopo de Gag-CM9 se evaluaron por
medio de los tetrámeros de Mamu-A*01, y las
frecuencias de las células T que reconocen los epítopos a lo largo
de Gag se evaluaron con grupos de péptidos que solapan y con un
ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISPOT) (C.C. Power
et al. 1999 J Immunol Methods 227:99).
Para el análisis de tetrámeros, aproximadamente
1x10^{6} células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron
marcadas en la superficie con anticuerpos de CD3 conjugados con
isocianato de fluoresceína (FITC) (FN-18; Biosource
Internacional, Camarillo, CA), con CD8 conjugadas con la proteína
clorofila peridinina (PerCP) (SKI; Becton Dickinson, San Jose, CA),
y con el tetrámero Gag-CM9
(CTPYDINQM)-Mamu-A*01 (SEQ ID NO: 6)
conjugado con aloficocianina (APC), en un volumen de 100 \mul a
entre 8 y 10ºC durante 30 minutos. Las células se lavaron dos
veces con PBS que contiene un 2% de suero fetal bovino (FBS), se
fijaron con paraformaldehido al 1% en PBS, y se analizaron a las 24
horas con un FACScaliber (Becton Dickinson, San Jose, CA). Las
células fueron inicialmente acotadas en poblaciones de linfocitos
con dispersión hacia delante y dispersión lateral y posteriormente
en células CD3. Las células CD3 se analizaron después para CD8 y
para células de unión al tetrámero. Se adquirieron aproximadamente
150.000 linfocitos para cada muestra. Los datos se analizaron
utilizando el software FloJo (Tree Star, San Carlos, CA).
Para el ELISPOT del
interferón-\gamma (IFN-\gamma),
se recubrieron las placas de filtración MULTISCREEN de 96 pocillos
(Millipore Inc. Bedford, MA) durante la noche con un anticuerpo
frente a IFN-\gamma humano (Clon B27, Pharmingen,
Sandiego, CA) a una concentración de 2 \mug/ml en un tampón de
bicarbonato de sodio (pH 9,6) a entre 8º y 10ºC. Las placas se
lavaron dos veces con un medio RPMI y después se bloquearon durante
1 hora con un medio completo (RPMI que contiene 10% de FBS) a 37ºC.
Las placas se lavaron otras cinco veces con un medio RPMI sin
enriquecer, y las células se sembraron en 100 \mul de un medio
completo duplicado en cantidades que variaban de 2x10^{4} a
5x10^{5} células por pocillo. Los grupos de péptidos se añadieron
a cada pocillo a una concentración final de 2\mug/ml de cada
péptido en un volumen de 100 \mul de medio completo. Las células
se hicieron crecer a 37ºC durante 36 horas con un 5% de CO_{2}.
Las placas se lavaron seis veces con un tampón (PBS con 0,05% de
Tween-20) y se incubaron después con 1\mug de
anticuerpo biotilinado frente a IFN-\gamma por
mililitro (clon 7-86-1; Diapharma
Group, West Chester, OH) diluido en un tampón que contiene 2% de
FBS. Las placas se incubaron durante 2 horas a 37ºC y se lavaron
seis veces con el tampón de lavado. Se añadió avidina/peroxidasa de
rábano picante (Vector Laboratorie, Burlingame, CA) a cada pocillo
y se incubó entre 30 y 60 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron seis
veces con tampón y las manchas se revelaron utilizando como
substrato DAB estable (Research Genetics, Huntsville. AL). Se hizo
un recuento de las manchas con un microscopio de disección estéreo.
Se incluyó un péptido de ovoalbúmina (SIINFEKL) (SEQ ID NO: 7) como
control en cada análisis. Las manchas de fondo para el péptido de
ovoalbúmina fueron generalmente <5 por 5X10^{5} PBMC. Cuando
este fondo se normalizó para 1x10^{6} PBMC fueron <10. Solo se
consideraron significativos los recuentos de ELISPOT dobles que el
fondo (\pm20). Las frecuencias resultado del ensayo de ELISPOT
son aproximadas porque soluciones diferentes de células tienen
eficiencias diferentes de formación de manchas en ausencia de
células alimentadoras (feeder). (C.A. Power et al. 1999 J
Immunol Methods 227:99). Se utilizó la misma dilución de células
para todos los animales en el mismo momento, pero se utilizaron
diferentes diluciones para detectar el recuerdo y las respuestas
agudas.
El análisis de los tetrámeros
Gag-CM9 se restringió a los macacos que expresaban
el tipo de incompatibilidad Mamu-A*01
mientras que las respuestas de ELISPOT no dependían de un tipo de
histocompatibilidad específico. Como se esperaba, las
inmunizaciones con ADN alcanzaron niveles bajos de células de
recuerdo que se expandieron a frecuencias altas en la primera
semana de la potenciación con rMVA (Fig. 1 y 6). En los macacos
Mamu-A*01, las células CD8 específicas para
el epítopo de Gag-CM9 se expandieron a frecuencias
de hasta 19% del total de las células CD8T (Fig. 6.). Este pico de
células específicas experimentó una contracción de 10 a 100 veces
en el grupo de recuerdo con ADN/MVA. (Fig. 1A y 6). El resultado del
ensayo de ELISPOT para los tres grupos de péptidos Gag también
experimentó una expansión importante (frecuencias de hasta 4000
manchas por 1x10^{6} PBMC) antes de contraerse de 5 a 20 veces en
el respuesta de recuerdo con ADN/MVA (Fig. 1B). Las frecuencias de
ELISPOT fueron las mismas en macacos con y sin el tipo de
incompatibilidad A01* (P>0,2).
Se utilizó la regresión lineal simple para
estimar las correlaciones entre las respuestas obtenidas de ELISPOT
post-potenciación y
post-provocación, entre las respuestas de recuerdo y
post-provocación del ensayo de ELISPOT, entre las
cargas virales transformadas logarítmicamente y las frecuencias de
ELISPOT. Las comparaciones entre grupos vacunados y control y
macacos A*01 y no A*01 se llevaron a cabo por medio de
ensayos t de dos muestras con cargas virales transformadas
logarítmicamente y respuestas del ensayo de ELISPOT. Se utilizaron
dos análisis de varianza para examinar los efectos de la dosis y de
la ruta de administración en el pico de los resultados del ensayo
de ELISPOT de ADN/MVA, en los resultados del ensayo de ELISPOT de
recuerdo con ADN/MVA y en los datos de los anticuerpos frente a Gag
transformados logarítmicamente.
Tanto en los picos como en las fases de recuerdo
de respuesta a la vacuna, el orden de preferencia para los
resultados de ensayo de ELISPOT en los grupos vacunados fue 2,5 mg
i.d. >2,5 mg i.m. >250 \mug i.d. >250 \mug i.m. (Fig.
1B). Los ensayos de ELISPOT de INF-\gamma
incluían tanto células CD4 como CD8. Las células CD8 específicas
para Gag-CM9 tenían una buena actividad lítica
después de la estimulación con el péptido.
El virus de provocación altamente patógeno
VIHS-89,6 se administró por vía intrarectal siete
meses después de la potenciación con rMVA cuando las células T
producidas por la vacuna estaban en recuerdo (Fig. 1).
La reserva del virus de provocación (5,7 x
10^{9} copias de ARN viral por milímetro) se produjo mediante un
paso intravenoso seguido de otro intrarectal en macacus rhesus de la
reserva de VIHS-89,6P original (G.B. Karlsson et
al. 1997 J Virol 71:4218). Las células linfoides se recolectaron
del animal infectado por vía intrarectal en el pico de viremia,
empobrecido en CD8 y estimulado con mitógeno para la producción de
la reserva. Antes de la provocación intrarectal, los animales en
ayunas fueron anestesiados (ketamina, 10 mg/kg) y apoyados en sus
estómagos con la región pélvica ligeramente elevada. Se les insertó
una sonda de alimentación (8Fr (2,7 m.m.) x 16 pulgadas (41 cm);
Sherwood Medical, St. Louis, MO) en el recto un recorrido de 15 a 20
cm. Después de la inserción de la sonda de alimentación, se colocó
en la sonda una jeringa que contiene 20 dosis intrarectales
infecciosas en 2 ml de RPMI-1640 más FBS al 10% y se
inyectó el inóculo lentamente en el recto. Después de la
distribución del inóculo, la sonda se enjuagó con 3,0 ml de RPMI
sin PBS y después se retiró lentamente. Los animales permanecieron
en el sitio, con las regiones pélvicas ligeramente elevadas, durante
un período de diez minutos después de la provocación.
\newpage
La prueba de provocación infectó a todos los
animales vacunados y controles (Fig.2.). Sin embargo, a las dos
semanas de la provocación los títulos de ARN viral del plasma fueron
diez veces inferiores en los grupos vacunados (promedios
geométricos de 1x10^{7} a 5x10^{7}) que en los animales control
(promedio geométrico de 4x10^{8}) (Fig. 2A) (S. Staprans et
al. en : Viral Genome Methods K. Adolph, ed. CRC Press, Boca
Raton, FL, 1996 pp. 167-184; R.
Hofmann-Lehmann et al 2000 AIDS Res Hum
Retroviruses 16:1247).
Para la determinación del número de copias de
VIHS, se extrajo el ARN viral directamente de 150 \mul de plasma
ACD anticoagulado con el kit de ARN viral QIAamp (Qiagen), eluido en
60 \mul de tampón AVE, y congelado a -80ºC hasta que se realizó
la cuantificación del ARN de VIHS. Se efectuó la transcripción
inversa de cinco microlitros de plasma de ARN purificado en un
volumen final de 20 \mul que contenían KCl 50 mM,
Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 4 mM, 1mM de
cada desoxinucleotido trifosfato (dNTP), hexámeros al azar 2,5
\muM, 20 unidades de RT MultiScribe, y 8 unidades de inhibidor de
ribonucleasa. Las reacciones se incubaron a 25ºC durante 10 min,
seguida de incubación a 42ºC durante 20 minutos, e inactivación de
la transcriptasa inversa a 99ºC durante 5 min. La mezcla de
reacción se ajustó a un volumen final de 50 \mul que contenía KCl
50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 4 mM,
desoxinucleotidos trifosfato (dNTP) 0,4 mM de cada, cebador
sentido 0,2 \muM, cebador antisentido 0,2 \muM, sonda 0,1
\muM, y 5 unidades de ADN polimerasa AmpliTaq Gold (todos los
reactivos de PerkinElmer Applied Biosystems, Foster City, CA). Las
secuencias del cebador con una región conservada del gen gag
de VIS son las mismas que las descritas anteriormente (S. Staprans
et al. en: Viral Genome Methods K. Adolph, ed. CRC Press,
Boca Raton, FL, 1996 pp. 167-184). Se utilizó el
Sistema de Detección de Secuencias 7700 de PerkinElmer Applied
Biosystems con el perfil de PCR siguiente: 95ºC durante 10 min,
seguido de 40 ciclos a 93ºC durante 30 s y 59,5ºC durante 1 min. El
producto acumulado de PCR se monitorizó con el detector de
secuencias 7700 y una sonda para la secuencia interna conservada del
gen gag:
6FAM-CTGTCTGCGTCATTTGGTGC-Tamra (SEQ
ID NO: 8), donde FAM y TamRa se refieren al agente fluorescente
(reporter) y al colorante inhibidor de fluorescencia
(quencher). El número de copias de ARN se determinó por
comparación con una curva estándar externa que consistía en el ARN
de VISmac239 derivado del virión cuantificado por el método bADN
VIS (Bayer Diagnostics, Emeryville, CA). Todos los especímenes se
extrajeron y amplificaron por duplicado, con información del
promedio de los resultados. Con una entrada de 0,15 ml de plasma, el
ensayo tiene una sensibilidad de 10^{3} copias de ARN por
milímetro de plasma y un intervalo dinámico lineal de 10^{3} a
10^{8} copias de ARN (R^{2} = 0,995). El coeficiente de
variación entre ensayos fue < 20% para muestras que contienen
<10^{4} copias de ARN VIHS por milímetro, y < 25% para
muestras que contiene de 10^{3} a 10^{4} copias de ARN VIHS
por milímetro. Para cuantificar más precisamente el bajo número de
copias de ARN VIHS en los animales vacunados en las semanas 16 y 20,
hacemos las siguientes modificaciones para aumentar la sensibilidad
del ensayo de ADN de VIHS: (i) Los viriones de \leq 1 ml de
plasma se concentraron por centrifugación a 23.000 g y 10ºC durante
150 minutos antes de la extracción del ARN viral, y ii) se utilizó
un método PCR con transcriptasa inversa de una sola etapa (R.
Hofmann-Lehmann et al. 2000 AIDS Res Hum
Retoviruses 16:1247). Estos cambios proporcionaron un límite de
cuantificación fiable de 300 copias de ARN de VIHS por mililitro, y
dieron valores para ARN de VIHS que están altamente correlacionados
con los obtenidos por el primer método usado (r = 0,91, P<
0,0001).
A las 8 semanas de la provocación, tanto los
grupos inducidos con dosis de ADN alta como el grupo inducido con
dosis intradérmica de ADN baja redujeron sus cargas el promedio
geométrico de sus cargas a aproximadamente 1000 copias de ARN viral
por milímetro. En ese momento, el grupo inducido con dosis
intramuscular de ADN baja tenía un promedio geométrico de
6x10^{3} copias de ADN viral y los controles no vacunados tenían
un promedio geométrico de 2x10^{6}. A las 20 semanas de la
provocación, incluso el grupo de dosis intramuscular baja redujo el
promedio geométrico de las copias de ARN viral a 1000. Entre los
animales vacunados, sólo un animal, el animal número 22 de grupo de
dosis intramuscular baja, tenia cargas virales intermitentes
superiores a 1x10^{4} por milímetro (Fig. 2D).
A las 5 semanas de la provocación, todos los
controles no vacunados habían sufrido una reducción profunda de
células CD4 (Fig. 2B) Todos los animales vacunados mantuvieron sus
niveles de CD4, con la excepción del animal 22 del grupo de dosis
intramuscular baja (véase mas arriba), que sufrió una disminución
suave de CD4 (Fig. 2E). A las 23 semanas de la provocación, tres de
los cuatro animales control sucumbieron al SIDA (Fig. 2C). Estos
animales tuvieron distintos grados de enterocolitis con diarrea,
criptosporidiosis, coliciscitis, infección entérica por
campilobacter, esplenomegalia, linfoadenopatia, y neumonía de
células gigantes asociada al VIH. Por el contrario, todos los 24
animales vacunados mantenían su salud.
La contención de la provocación viral se asoció
con una irrupción de células T antivirales (Fig. 1 y 3A). Una
semana después de la provocación, la frecuencia de las células
tetrámero^{+} en la sangre periférica había disminuido,
reflejando en potencia el reclutamiento de las células T específicas
para el sitio de infección (Fig. 3A). Sin embargo, a las dos
semanas de la provocación, las células tetrámero^{+} en la sangre
periférica se habían incrementado a frecuencias tanto o más altas
que las de después de la potenciación con rMVA (Fig. 1 y 3A). La
mayoría de las células tetrámero^{+} produjeron
IFN-\gamma en respuesta a una estimulación con
péptidos de 6 horas (Fig. 3B) (S.L. Waldrop et al 1997 J Clin
Invest 99:1739) y no tenían el "asombroso" fenotipo
IFN-\gamma negativo observado a veces en las
infecciones virales (F. Lechner et al. 2000 J Exp Med
191:1499).
Para los ensayos de citoquina intracelular, se
estimularon aproximadamente 1x10^{6} PBMC durante 1 hora a 37ºC
en tubos de polipropileno con 100 \mug del péptido
Gag-CM9 (CTPYDINQM)(SEQ ID NO:6) por mililitro en
un volumen de 100 \mul de RPMI que contenía 0,1% de albumina de
suero bovino (BSA) y 1 \mug de anticuerpo frente a CD28 humano y
1 \mug de anticuerpo frente a CD49d (Pharmingen, San Diego, CA)
por mililitro. Después, se añadieron 900 \mul de RPMI que
contenían un 10% de FBS y monensin (10 \mug/ml), y las células se
hicieron crecer durante 5 horas adicionales a 37ºC con un ángulo de
5ºcon 5% de CO_{2.} Las superficies de las células se marcaron
con anticuerpos de CD8 conjugados con PerPC (clon SK1, Becton
Dickinson) a entre 8 y 10ºC durante 30 minutos, se lavaron dos
veces con PBS frío que contenía 2% de FBS, y se fijaron y
permeabilizaron con una disolución de Cytofix/Cytoperm (Pharmigen).
Después las células se incubaron con anticuerpos de CD3 (clon
FN-18 y ficoeritrina, respectivamente, en una
disolución de lavado Perm (Pharmigen) durante 30 minutos a 4ºC. Las
células se lavaron dos veces con la disolución de lavado Perm, una
vez con PBS sencillo, y fueron resuspendidas en formaldehído al 1%
en PBS. Se adquirieron aproximadamente 150.000 linfocitos de
FACScaliber y se analizaron con el software FloJo.
El incremento post provocación de las células T
se contrajo concomitantemente con la disminución de la carga viral.
A las doce semanas de la provocación, las células T específicas para
virus estaban presentes en aproximadamente una décima parte de su
valor máximo (Figs, 1A y 3A). En contraste con la respuesta
secundaria vigorosa en los animales vacunados, los animales no
infectados tuvieron una respuesta primaria modesta (Fig. 1B y 3A).
Las células tetrámero^{+} alcanzaron un máximo por debajo del 1%
de las células CD8 totales (Fig. 3A), y los ELISPOT producidos por
el IFN-\gamma estaban presentes con una frecuencia
promedio de aproximadamente 300 en contraposición a las frecuencias
más altas de entre 1000 y 6000 en los grupos vacunados (Fig. 1B)
(P< 0,05).
Las células tetrámero^{+} del grupo control,
así como las del grupo de vacunados, produjeron
IFN-\gamma después de estimulación con péptido
(Fig. 3B). A las 12 semanas de la provocación, tres de los cuatro
controles tenían niveles no detectables de ELISPOT producidos por
el IFN-\gamma. Esta pérdida rápida de células T
antivirales en presencia de cargas virales altas puede reflejar la
falta de ayuda de CD4.
Las respuestas proliferativas de las células T
demostraron que las células CD4 específicas para virus habrían
sobrevivido a la provocación y eran capaces de soportar la respuesta
inmune antiviral (Fig. 3C).
Se estimularon por triplicado aproximadamente
0,2 millones de PBMC durante cinco días con el antígeno indicado en
200 \mul de RPMI a 37ºC en 5% de CO2. Los sobrenadantes de las
células 293T transfectadas con ADN que expresan bien Gag o Pol de
VIHS-89,6 o Gag, Pol y Env de
VIHS-89,6 se utilizaron directamente como antígenos
(concentración final de \approx 0,5 \mug de Gag por mililitro).
Los sobrenadantes de las células transfectadas con ADN simulado
(solo el vector) sirvieron como controles negativos. Al sexto día,
las células fueron pulsadas con 1 \muCi de timidina tritiada por
pocillo durante 16 a 20 horas. Las células se recogieron con un
recolector de células/TOMTEC, Recolector 96, Modelo 1010, Hamden,
CCT) y se hizo un recuento con un contador de centelleo Wallac
MICROBETA 1450 (Gaithersburg. MD). Los índices de estimulación son
los recuentos de timidina tritiada incorporada en PBMC estimuladas
con antígenos de 89,6 divididos por los recuentos de timidina
tritiada incorporada por las mismas PBMC estimuladas con antígenos
simulados.
Doce semanas después de la provocación, el
promedio de los índices de estimulación para las proteínas
Gag-Pol-Env o
Gag-Pol variaba de 35 a 14 en los grupos vacunados
pero no eran detectables en el grupo control. De acuerdo con los
ensayos de proliferación, los ensayos de citoquinas intracelulares
demostraban la presencia de células CD4 específicas para el virus
en los animales vacunados pero no en los animales control. El orden
general de clasificación para los grupos vacunados según la
magnitud de la respuesta proliferativa fue 2,5 mg i.d > 2,5 mg
i.m. > 250 \mug i.d. > 250 \mug i.m.
A las doce semanas de la provocación, los
nódulos linfáticos de los animales vacunados estaban intactos
morfológicamente y respondían a la infección, mientras que los de
los controles infectados habían sido destruidos funcionalmente
(Fig. 4). Los nódulos de los animales vacunados contenían gran
número de folículos secundarios reactivos con centros germinales
expandidos y zonas oscuras y claras diferenciadas. (Fig. 4A). Por el
contrario, los nódulos linfáticos de los animales control no
vacunados mostraban depleción paracortical y folicular (Fig. 4B),
mientras que los animales no vacunados y sometidos a provocación
mostraban números normales de centros germinales mínimamente
reactivos. (Fig. 4C). Los centros germinales ocupaban <0,05 % del
área total de los nódulos linfáticos en los controles infectados,
2% del área de los nódulos linfáticos de los controles no
infectados, y hasta el 18% del área de los nódulos linfáticos en
los grupos vacunados (Fig. 4D). La reactividad inmune más enérgica
de los animales estimulados con dosis de ADN baja frente a los de
dosis alta vino sugerida por los centros germinales más extensos de
los grupos de dosis baja (Fig. 4D). A las doce semanas de la
provocación, la hibridación in situ del ARN viral reveló
células extrañas que expresaban virus en los nódulos linfáticos de 3
de los 24 macacos vacunados, mientras que las células que
expresaban virus se detectaron fácilmente en los nódulos linfáticos
de cada uno de los animales control infectados. En los controles,
que habían sufrido una profunda disminución de las células T CD4,
la citomorfología de las células de los nódulos linfáticos
infectados era coherente con el fenotipo del macrófago.
La estrategia de inducción/potenciación despertó
niveles bajos de anticuerpo frente a Gag y niveles no detectables
de anticuerpo frente a Env (Fig. 5). Después de la provocación, los
anticuerpos frente a Env y Gag, produjeron respuestas anamnésticas
alcanzando el anticuerpo total frente a Gag niveles próximos a 1
mg/ml y el anticuerpo total frente a Env niveles de hasta 100
\mugr/ml.
Los ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas
(ELISA) para el anticuerpo total frente a Gag utilizaron gag p27 de
VIS producido bacterianamente para recubrir los pocillos (2 \mug
por mililitro en tampón bicarbonato). La prueba de anticuerpos
ELISA, frente a los anticuerpos de Env, utilizó Env de 89,6
producido en células 293T transfectadas transitoriamente y
capturado con Env contra anticuerpos de oveja (número de catálogo
6205; International Enzymes, Fairbrook CA). La curvas estándar de
los ensayos ELISA para Gag y Env se produjeron con suero de un
macaco infectado con 89,6 de VIHS con cantidades conocidas de
inmunoglobulinas G (IgG) específicas para Gag o Env. Se detectó
anticuerpo unido con anticuerpo de cabra conjugado con peroxidasa
para IgG de macaco (nº en catálogo # YNGMOIGGFCP; Accurate
Chemical, Westbury, NY) y substrato TBM (nº en catálogo # T3405;
Sigma, St. Louis, MO). Se hizo un ensayo con sueros a diluciones al
triple en pocillos duplicados. Las diluciones de los sueros de
ensayo se llevaron a cabo con un tampón de suero de leche (4% de
suero y 0,1% de tween 20 en 1x PBS). El tampón bloqueante consistía
en un tampón de suero de leche más 0,5% de leche seca desnatada.
Las reacciones se pararon con H2SO4 2M y se leyó la densidad óptica
a 450 nm. Se ajustaron las curvas estándar y las concentraciones de
las muestras fueron interpoladas como \mug de anticuerpo por ml de
suero utilizando el software SOFTmax 2,3 (Molecular Devices,
Sunnyvale, CA).
Dos semanas después de la provocación, los
anticuerpos neutralizantes para el inmunógeno 89,6, pero no así los
virus de provocación VIHS-89,6P, estaban presentes
en los grupos inducidos con dosis de ADN alta (promedio geométrico
de los títulos de 352 para los grupos i.d. y de 303 para los grupos
de i.m.) (Fig. 5C) (D.C. Montefiori et al. 1988 J Clin
Microbiolg 26:231). A las cinco semanas de la provocación, se había
generado el anticuerpo neutralizante para 89,6P (promedio
geométrico de los títulos de 200 para los grupos i.d. y de 126 para
los grupos i.m.) (Fig 5D) y el anticuerpo neutralizante de 89,6
había empezado a disminuir. En las semanas 16 a 30 después de la
provocación, los anticuerpos frente a Gag y Env habían disminuido en
la mayoría de los animales.
Estos resultados demuestran que una vacuna de
ADN/MAV que produce múltiples proteínas puede despertar una
respuesta inmune de recuerdo capaz de controlar una provocación
mucosa con un virus de la inmunodeficiencia altamente virulento.
Estos niveles de control viral fueron más favorables que habían sido
los conseguidos utilizando sólo ADN (M.V. Egan et al. 2000
J. Virol 74:7485) o vacunas rMVA (1. Ourmanov et al. 2000 J
virol 74:2740) y fueron aquí comparables a los obtenidos por
inmunizaciones con ADN coadyuvado con
interleuquina-2 (D.H. Barouch et al 2000
Science 290:486). Todos estos estudios previos habían utilizado más
de tres inoculaciones de vacunas, ninguno había utilizado
provocaciones mucosas, y la mayoría se habían provocado con
respuestas máximas del efector y no permitían un periodo
prolongado de post vacunación para valorar una eficacia a "largo
plazo".
Las dosis de ADN tuvieron resultados
estadísticos significativos tanto en respuestas celulares como
humorales (P<0,05). La administración intradérmica del ADN fue
hasta 10 veces más efectiva que las inoculaciones i.m. para la
generación anticuerpos frente a Gag (P= 0,02). Ni la vía ni la
dosis de ADN parecían tener un efecto significativo en la
protección. A las 20 semanas de la provocación, los animales
inducidos con dosis de ADN altas tenían un promedio geométrico de
los niveles de ARN viral ligeramente inferior (7x10^{2} y
5x10^{2}) al de los animales inducidos con dosis de ADN bajas.
La vacuna de ADN/MVA controló la infección,
reduciendo rápidamente las cargas virales a aproximadamente 1000
copias de ARN viral por mililitro de sangre o menos. La contención,
más que la prevención de la infección, da la oportunidad de
establecer una infección crónica (H.L. Robinson et al. 1999
Nat Med 5:526). Mediante una reducción rápida de las cargas
virales, una vacuna de ADN/MVA que libera proteínas múltiples
extenderá las expectativas de no progresión a largo plazo y
limitará la transmisión del VIH. (J. W. Mellors et al. 1996
Science 272:1167; T.C. Quinn et al. 2000 N Eng J Med
342:921).
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción describe la construcción de un
virus recombinante vaccinia Ankara modificado (MVA), del virus
recombinante MVA/VIH de la estirpe B que expresa env de ADA de la
cepa de VIH y de pol gag de HXB2 (ADA env MVA/VIH + gag pol de
HXB2). Para la amplificación, se utilizará la denominación de
laboratorio de MVA/VIH, que hace referencia al plásmido del que
procede la construcción.
Los genes gag-pol de VIH
derivaron de la estirpe infecciosa B del virus HXB2. El gen
gag-pol, se truncó de manera que la mayoría de las
secuencias codificantes de la integrasa se eliminaron y los
aminoácidos 185, 266, y 478 se mutaron para inactivar la
transcriptasa inversa, inhibiendo la actividad de transferencia de
las hebras, e inhibiendo la actividad ARNasaH, respectivamente. El
gen de la envoltura trópica de la estirpe B CCR5 se derivó del
aislado primario de ADA; las secuencias TTTTTNT mutaron sin perder
su capacidad de codificar para evitar la transcripción prematura de
la terminación y la cola citoplásmica se truncó para mejorar la
expresión de superficie, la inmunogenicidad, y la estabilidad del
vector MVA. Los genes de VIH se insertaron en un vector plasmídico
de transferencia de manera que el gen gag-pol
era regulado por el promotor temprano/tardío H5 del virus vaccinia
modificado y el gen env era regulado por el promotor
temprano/tardío PsyII diseñado recientemente para proporcionar
niveles altos de expresión similares. Se incluyó un gen marcador
(reporter) de autodeleción GUS que permite la detección y
aislamiento del virus recombinante. Los genes de VIH estaban
flanqueados por secuencias de MVA que permiten la recombinación
homóloga en el sitio de deleción 3 de manera que el MVA
recombinante permaneciera positivo para TK para la estabilidad y la
expresión alta en las células restantes. El MVA recombinante se
aisló y mostró la expresión de cantidades abundantes de
gag-pol-env y el procesado
de gag. La producción de partículas similares al VIH se
manifestó por centrifugación y por microscopia electrónica. La
presencia de env en las partículas similares a VIH se manifestó
mediante microscopia inmunoelectrónica.
El vector plasmídico de transferencia
pLW-48 (Fig. C) utilizado para fabricar el virus
recombinante MVA por recombinación homóloga, se construyó de la
siguiente forma:
1. A partir del plásmido pGem-4Z
(Promega) obtenido comercialmente, las zonas que flanquean cada lado
de la deleción III, denominadas flank1 y flank2, que contienen
respectivamente los pares de bases 926 y 520, se amplificaron por
PCR a partir de las manchas de MVA del virus vaccinia. Entre estos
flancos, se añadió un promotor, el mH5, que había sido modificado a
partir de las secuencias publicadas originalmente cambiando dos
bases que habían demostrado según el trabajo previamente publicado
que incrementaban la expresión del gen clonado.
2. Un gag pol de la estirpe B (Figure D) se
truncó de manera que se eliminó la integrasa y se clonó en el
plásmido de modo que fuese controlado por el promotor mH5. Este gen
contenía la secuencia completa de gag de HXB2. El gen pol tiene
mutaciones de seguridad para la transcriptasa inversa en el
aminoácido 185 dentro del sitio activo de TR, en el aminoácido 266
que inhibe la actividad de transferencia de las hebras, y en el
aminoácido 478 que inhibe la actividad de la ARNasaH. Además, se
eliminó el gen de la integrasa pasado el sitio de EcoRI.
3. Después del flanco 1 se añadió una repetición
directa de 280 pares de bases, que corresponden a las últimos 280
pares de bases del flanco 1 de MVA.
4. Se añadieron el promotor p11 y el gen
marcador GUS entre dos repeticiones directas del flanco 1 de modo
que este marcador de selección se pudiese utilizar inicialmente para
obtener el virus recombinante, siendo eliminado no obstante del
virus recombinante final (Scheiflinger, F. et al 1998 Arch
Virol 143:467-474; Carroll, M.V. and B. Moss 1995
BioTechniques 19:352-355).
5. Se designó un nuevo promotor, Psyn II, para
permitir el incremento de la expresión del env de ADA. La secuencia
de este nuevo promotor temprano/tardío se indica en la Figura E.
6. Se obtuvo una versión truncada de la
envoltura de ADA con una mutación silenciosa 5TNT obtenida por PCR
e insertada en el plásmido bajo el control del promotor Psyn II. La
envoltura se truncó en la cola citoplásmica del gen gp41,
eliminando 115 aminoácidos de la cola de citoplásmica. Este
truncamiento produjo un incremento de la cantidad de proteína de la
envoltura en la superficie de las células infectadas e incrementó la
inmunogenicidad de la envoltura proteica en los ratones, y la
estabilidad de los virus recombinantes en el cultivo de tejidos.
\vskip1.000000\baselineskip
1. El virus MVA, que puede obtenerse de ATCC con
el número VR-1568, se purifico tres veces en las
placas mediante diluciones terminales en fibroblastos de embriones
de pollo (CEF), preparados a partir de huevos fertilizados de
gallina SPAFAS SPF Premium de 9 días, distribuidos por B y E Eggs,
Stevens, PA.
2. Las células secundarias de CEF se infectaron
a una MOI de MVA de 0,05 y se transfectaron con 2 \mug de
pLW-48, el plásmido descrito anteriormente. Después
de dos días de incubación a 37ºC, el virus se recogió, congeló y
descongeló tres veces, y se separó en placas CEF.
3. A los 4 días, los focos de infección que se
tiñeron de azul después de añadir un substrato de
X-glu, que indicaba que había tenido lugar la
recombinación entre el plásmido y el virus infectante, se recogieron
y se inocularon en placas CEF. Se recogieron de nuevo los focos
teñidos de azul.
4. Estos focos que contenían GUS (que ahora
queríamos eliminar) se separaron por triplicado y se analizaron para
la tinción de GUS, y para la expresión de la envoltura de ADA. Se
escogieron los focos individuales de la tercera placa de
replicación de aquellas muestras que tenían aproximadamente el mismo
número de poblaciones mixtas de focos teñidos y no teñidos con GUS
además de la mayoría de los focos de envoltura teñidos.
5. Estos focos se separaron otra vez por
triplicado, y se analizaron de la misma manera. Después de tres
pases, se derivó un virus que expresaba la proteína de la envoltura
pero del que se había eliminado el gen GUS a causa de la repetición
doble. Mediante inmunomarcaje, este virus expresó también la
proteína de gag pol.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Se analizaron alícuotas de lisados celulares
de MVA/VIH 48 por radioinmunoprecipitación e inmunomarcaje con
anticuerpos monoclonales para la expresión de las proteínas de la
envoltura y de gag. En estas dos pruebas, se detectaron cada una de
las dos proteínas.
2. El virus recombinante demostró producir las
partículas gag en el sobrenadante de las células infectadas mediante
el granulado de las partículas marcadas con ^{35}S en un colchón
de 20% de sacarosa.
3. Las partículas de gag se visualizaron también
en el exterior y en gemación de células así como en el interior de
las vacuolas celulares con el microscopio electrónico en secciones
finas. Estas partículas gag tenían proteína de la envoltura en su
superficie.
A no ser que se indique lo contrario, todas las
secuencias de nucleótidos resueltas por secuenciación de una
molécula de ADN aquí mencionadas se resolvieron utilizando un
secuenciador automático de ADN, y todas las secuencias de
aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de ADN
resueltas aquí mencionadas se predijeron por la traducción de las
secuencias de ADN resueltas como se indica anteriormente. Por lo
tanto, como es conocido en la técnica para cualquier secuencia de
ADN resuelta por este método automático, cada secuencia de
nucleótidos resuelta aquí mencionada puede contener algunos errores.
Las secuencias de nucleótidos resueltas de manera automática tienen
normalmente una identidad aproximada de hasta un 90%, mas
normalmente una identidad comprendida entre un 95% y un 99,9% con
la secuencia de nucleótidos real de las moléculas de ADN
secuenciadas. La secuencia real se puede resolver más concretamente
por otros métodos que incluyen métodos de secuenciación manual bien
conocidos en la técnica. Como también es sabido en la técnica, una
inserción o una deleción en una determinada secuencia de
nucleótidos comparada con la secuencia real causará un cambio de
marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos tal que la
secuencia de aminoácidos predicha codificada por una secuencia de
nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia
de aminoácidos codificada realmente por la molécula de ADN
secuenciada, que empieza en el punto de tal inserción o
deleción.
\vskip1.000000\baselineskip
En resumen, la solicitante ha preparado un virus
MVA recombinante, MVA/VIH 48, que tiene una expresión alta de la
envoltura truncada de ADA y de gag pol de HXB2. El virus MVA
recombinante se prepara utilizando un marcador GUS expresado
transitoriamente que se elimina en el virus final. La expresión alta
de la envoltura de ADA es posible gracias a un nuevo promotor
híbrido temprano/tardío, Psyn II. Además, la envoltura se ha
truncado porque se ha demostrado que el truncamiento de la envoltura
incrementa la cantidad de proteína de la superficie de las células
infectadas, y por lo tanto incrementa la inmunogenicidad; la
estabilidad del recombinante también se incrementa. El recombinante
de MVA forma partículas gag que se han descubierto por la
granulación de las partículas a través de sacarosa y por el análisis
con PAGE. Las partículas gag con la proteína de la envoltura en la
superficie se han visualizado también en el microscopio
electrónico.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diseñaron promotores modificados o
artificiales adicionales para expresión génica en MVA u otros
poxvirus. Se modificaron los promotores para permitir la expresión
temprana o tardía después de la infección y para reducir la
posibilidad de recombinación homóloga entre secuencias idénticas
cuando se utilizaban promotores múltiples en el mismo vector de MVA.
Los promotores se sitúan aguas arriba en la secuencia codificante de
la proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
Tablas
A-F
Tabla A: Inmunización MVA/48 de
cobayas
Los grupos de cobayas fueron inmunizados en los
días 0 y 30 con 1x10^{8} unidades infecciosas de MAV/48 bien por
vía intramuscular (IM) o intradérmica (ID). Se inmunizó como
control otro grupo IM con la misma dosis de MVA no recombinante. Se
analizó el suero extraído tanto antes como después de cada
inmunización para su actividad neutralizante frente a
VIH-1-MN. Los títulos son las
diluciones de suero reciprocas a las que el 50% de las células de
MT-2 estaban protegidas de la muerte inducida por
virus (killing). Se observó actividad neutralizante
significativa en todos los animales después de la segunda
inmunización con MVA/48 (día 49).
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla B: Frecuencias de células
T específicas para gag de VIH/1 después de inmunización de ratones
con
MVA/48
Los grupos de ratones BalbC fueron inmunizados
en los días 0 y 21 con 1x10^{7} unidades infecciosas de MAV/48
por una de las tres vías: intraperitoneal (IP), intradérmica (ID), o
intramuscular (IM). Un grupo control fue inmunizado con un MVA no
recombinante. A las 5 semanas de la última inmunización, se
prepararon los esplenocitos y se estimularon in vitro con un
péptido inmunodominante p24 de VIH-1 durante 7 días.
Posteriormente las células se mezclaron bien con las células p815
pulsadas con péptido o bien con péptido soluble. Las células que
produjeron interferón gamma se cuantificaron en un ensayo de
ELISPOT. Se asignó un valor >500 a los pocillos que contienen
demasiadas manchas que contar. Se habían presentado respuestas
enérgicas de las células T en los ratones inmunizados IP con otros
virus. En este experimento, la inmunización IP de ratones con MVA/48
provocó unas repuestas muy enérgicas de las células T específicas
para el gag de VIH-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla C: Inducción con ADN y
potenciación con MVA/48-ELISPOT totales por
animal
Se estimularon diez macacos rhesus (semanas 0 y
8) con una vacuna de ADN que expresaba los antígenos de
VIH-1 que incluyen la envoltura de ADA y gag pol de
HXB2. En la semana 24 los animales se llevó a cabo la potenciación
intramuscular con 1x10^{8} unidades infecciosas de MVA/48. Se
analizaron las células mononucleares de sangre periférica (PMBC)
para la producción de interferón gamma en un ensayo de ELISPOT como
se indica a continuación: las PBMC se incubaron durante
30-36 horas en presencia de grupos de péptidos
solapantes que correspondían a antígenos individuales de
VIH-1 en las vacunas. El número total de células
productoras de interferón gamma de cada animal se indica en la
tabla. Las respuestas de las células T a la vacunación con ADN
fueron limitadas (semanas 2-20). Sin embargo, la
potenciación con MVA/48 dio como resultado respuestas muy enérgicas
de las células T específicas para VIH-1 en todos los
animales (semana 25).
\vskip1.000000\baselineskip
Tablas D: La respuesta de los
anticuerpos después de la inmunización de macacos con KB9 de
MVA/VIHS
Los grupos de macacos rhesus fueron inmunizados
con 2x20^{8} unidades infecciosas de KB9-MVA/VIHS
en las semanas 0 y 4 por una de las diversas vías: Amigdalas,
intradérmica (ID), o intramuscular (IM). Otro grupo fue inmunizado
con MVA no recombinante utilizando las mismas vías. Las muestras de
suero procedentes de las dos semanas desde la segunda inmunización
se analizaron para la unión de la proteína de la envoltura de KB9
por ELISA y para la neutralización de VIHS-89,6P y
VIHS-89,6. En el ensayo ELISA, la proteína soluble
de la envoltura de KB9 se capturó en placas de 96 pocillos
utilizando un anticuerpo para el C-terminal de
gp120. Se analizaron las diluciones seriadas de los sueros y se
utilizaron para determinar los títulos de los puntos finales. Se
determinó la neutralización de VIHS-89,6P y de
VIHS-89,6 en un ensayo con células
MT-2. Los títulos son las diluciones de suero
reciprocas a las cuales el 50% de las células estaban protegidas de
la muerte inducida por virus. En los ensayos de neutralización
in vitro, VIHS-89,6P y
VIHS-89,6 eran heterólogos, p. ej. el suero de los
animales infectados con uno de los virus no neutralizaba el otro
virus. Por lo tanto, las dos inmunizaciones con
MVA/VIHS-KB9 provocaron anticuerpos que se unían
bien en ELISA en todos los animales y anticuerpos neutralizantes
frente a los virus homólogos (VIHS-89,6P) en algunos
animales. Además, se observaron anticuerpos neutralizantes
heterólogos en un subgrupo de animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla E: Las frecuencias de las
células T CD3/CD8 específicas para gag de CM-9
después de la inmunización de macacos con
MVA/VIHS-KB9
Los grupos de macacos rhesus MamuA*01 positivos
fueron inmunizados con 2x10^{8} unidades infecciosas de KB9
MVA/VIHS en las semanas 0 y 4 por una de las diversas vías:
amigdalas, intradérmica (ID), o intramuscular (IM). Otro grupo fue
inmunizado con MVA no recombinante. Las frecuencias de las células T
CD3+/CD8+ que se unen al complejo tetramérico que contiene el
péptido gag de CM9 especifico para VIS se determinaron por
citometría de flujo en varios momentos después de la inmunización.
Los intervalos de tiempo fueron los siguientes: 1a ,1b y 1d fueron
en las semanas una, dos y cuatro después de la primera inmunización
respectivamente; 2a, 2b, 2c y 2d fueron en las semanas una, dos
tres y doce después de la segunda inmunización, respectivamente. Los
valores por encima del fondo se indican en negrita. Se observaron
respuestas enérgicas específicas para gag de VIS después de una
sola inmunización con KB9-MAV/IHVS en todos los
animales inmunizados. Se observó potenciación en la mayoría de los
animales después de la segunda inmunización. Además, todavía se
encontró una unión con el tetrámero considerable doce semanas
después de la segunda inmunización.
\vskip1.000000\baselineskip
Tabla F: Las frecuencias de las
células T específicas después de la inmunización con KB9 de
MVA/VIHS
Los grupos de macacos se inmunizaron con KB9 de
MAV/VIHS como se describió anteriormente. KB9 de MAV/VIHS expresan
5 genes del virus quimérico, VIHS-89,6P: envoltura,
gag, polimerasa, tat y nef. En consecuencia se analizaron las
frecuencias de las células T específicas para cada uno de los 5
antígenos utilizando grupos de péptidos que corresponden a cada
proteína individual. Las PBMC frescas fueron estimuladas con grupos
de péptidos durante 30-36 horas in vitro.
Las células que producían interferón gamma se enumeraron en un
ensayo ELISPOT. El número total de células específicas para cada
antígeno se representa como "manchas # totales". Además, se
representa el número de animales que responden y el promedio # de
manchas por grupo. Las PMBC se analizaron una semana después de la
primera inmunización (1a) y una semana después de la segunda
inmunización (2 a). Otro grupo de 7 animales se inmunizó con un MVA
no recombinante. En estos animales, no se detectaron manchas
detectables por encima del nivel de fondo. En consecuencia, una
inmunización sencilla con KB9 de MVA/VIHS provocó una respuesta
enérgica de las células T específicas para VIHS en todos los
animales. Las respuesta frente a la envoltura y frente a gag fueron
las más fuertes; la mayoría de los animales presentaron respuesta
frente a gag, todos los animales tuvieron respuesta frente a la
envoltura. Las respuestas ELISPOT también se observaron después de
la segunda inmunización con KB9 de MVA/VIHS, aunque a niveles más
bajos. Ambas veces, el orden de preferencia de las respuestas fue:
amígdala > ID > IM. Obtuvimos una respuesta inmune buena
frente a nef y alguna respuesta inmune frente a tat.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque la presente invención se ha descrito en
detalle con el propósito de la claridad y comprensión de la misma,
un experto en la técnica entenderá que puedan realizarse diversos
cambios en las formas y detalles sin apartarse del verdadero alcance
de la invención.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> EL GOBIERNO DE LOS ESTADOS UNIDOS DE
AMÉRICA, REPRESENTADO POR EL SECRETARIO DEPARTAMENTO DE SALUD Y
SERVICIOS HUMANOS
\hskip1cmMoss, Bernard
\hskip1cmWyatt, Linda
\hskip1cmEarl, Patricia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MVA QUE EXPRESA LOS GENES
MODIFICADOS GAG Y POL DE LA ENVOLTURA EN VIH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> NIH211.001PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/274,434
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-03-08
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para la versión 4.0 de
Windows
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12225
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Plásmido pLW-48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor Psyn II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2214
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Gen env de VIH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor PmH5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3479
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Genes de VIH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de inmunodeficiencia simia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pollo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgtctgcgt catttggtgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus de la inmunodeficiencia
humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor m7,5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor Psyn III
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Promotor Psyn IV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 13
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<211> 75
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Promotor Pysn V
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<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (8)
1. Una composición farmacéutica que comprende un
virus MVA recombinante que codifica Gag/Pol de HXB2 de MVA 48 (SEQ
ID NO: 5) y la envoltura de ADA truncada (SEQ ID NO: 3).
2. Uso de una composición de la reivindicación 1
para la preparación de un medicamento para potenciar una respuesta
inmune de la célula T CD8+ frente a un antígeno de Env, Gag, o Pol
de VIH en un primate, por lo que se potencia en un primate una
respuesta inmune de la célula T CD8+ frente al antígeno previamente
inducido.
3. Uso de una composición de la reivindicación 1
para la preparación de un medicamento para inducir una respuesta
inmune de la célula T CD8+ frente a un antígeno de Env, Gag, o Pol
de VIH en un primate, por lo que se induce una respuesta inmune de
la célula T CD8+ frente al antígeno en un primate.
4. Uso de una composición inductora que
comprende un ácido nucleico que codifica un antígeno Env, Gag o Pol
de VIH y una composición potenciadora que comprende una composición
de la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para
inducir una respuesta inmune de la célula T CD8+ frente a un
antígeno de Env, Gag o Pol de VIH en un primate, por lo que se
induce una respuesta inmune de la célula T CD8+ frente al
antígeno.
5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
2 a 4, donde el primate es un ser humano.
6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
2 a 4, donde el virus recombinante MVA se administra mediante
inyección sin aguja.
7. El uso de la reivindicación 4, donde la
composición inductora comprende un plásmido de ADN que codifica
dicho antígeno.
8. Un método para preparar una composición de la
reivindicación 1 que comprende:
- -
- preparar un vector plasmídico de transferencia que codifica Gag/Pol de HXB2 de MVA 48 (SEQ ID NO: 5) y la envoltura ADA truncada de MVA 48 (SEQ ID NO: 3); y
- -
- recombinar dicho vector plasmídico de transferencia con un virus MVA para producir una composición de la reivindicación 1.
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