CN1913919B - 基于hiv多进化枝的env的hiv疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明在一个实施方案中，提供了多进化枝HIV质粒DNA或病毒载体疫苗，包含来自Env的不同进化枝(可选Env嵌合体)和来自单个进化枝的Gag-Pol-(可选)Nef的成分。本发明的所述的疫苗还包括V，V2，V3或V4缺失或上述的组合。在另一实施方案中，本发明提供多进化枝HIV包膜免疫原。

Description

基于HIV多进化枝的ENV的HIV疫苗
相关申请
本申请要求2003年9月15日提交的美国临时专利申请第60/503,509号的利益，在此将其全文引用作为参考。
发明背景
发明领域
本发明涉及针对HIV的疫苗领域。
相关技术的描述
对抗不断突变的人类免疫缺陷病毒(HIV)的安全和有效的疫苗是非常需要的。高效AIDS疫苗的要求之一是需要诱导世界范围内流行的HIV-1多种株系的中和抗体和细胞免疫。
发明概述
在一个实施方案中，本发明提供了多进化枝HIV质粒DNA或病毒载体疫苗，该疫苗包含来自Env不同进化枝(可选Env嵌合体)和来自单个进化枝的Gag-Pol-(可选)Nef的成分。本发明的疫苗还包括V1，V2，V3或V4缺失或其组合。在另一实施方案中，本发明提供了多进化枝HIV包膜免疫原。
附图的简要描述
图1所示为具有V3区域替换部分的HIV Env载体的结构图。图A所示为按照之前的描述(Chakrabarti，B.K等人，2002 J Virol 76：5357-5368)制备的CXCR4-定向HIV HXB2，进化枝B gp140ΔCFI。包括来自HIVHXB2的V3区域的大多数分支区域都被HIV BaL的类似区域替换，从而制备成R5定向进化枝B HIV HXB/BaL。同样也如材料与方法(参见部分I)中的描述制备了进化枝A gp140ΔCFI和进化枝C gp140ΔCFI。图B所示为通过在293细胞中的转染和Western杂交分析确认的所指定的载体的表达。以1∶3000的稀释度，使用针对gp160的多克隆抗体(Intracel，Rockville，马里兰州)，通过Western杂交对Env进行了测定。
图2所示为通过具有V3区域替换的嵌合Env对中和抗体的诱导。图2A所示为用HIV HXB2/BaL gp140ΔCFI免疫的豚鼠中的中和抗体活性。检测了免疫血清对于抑制HIV IIIB(空心柱)和HIV MN(实心柱)的能力。所述中和抗体滴度定义为在MT2分析杀死中产生50％病毒中和的血清稀释度(Montefiori，D.C.等人，1988 J Clin Microbiol 26：231-5)。图2B为对图2A中所述的相同血清进行了抗HIV BaL的测定。所得数据代表了这些血清在1∶4稀释时对HIV BaL的中和百分数(％)。
图3所示为使用gp145/140ΔCFI Env免疫豚鼠之后产生的中和抗体的滴度和特异性。图A所示为使用血清样本在外周血单核细胞(PBMC)中测定的HIV BaL的V3-特异性中和，如前所述(Bures，R.等人，2000 AIDSRes Hum Retroviruses 16：2019-35)，在有无不同V3多肽的条件下对所述血清样本进行了预孵育。图B所示为与未进行处理的对照相比，在存在HIV IIIB或HIV BAL V3多肽的情况下，通过HIV MN-特异性中和抗体的滴度降低对由HIV BaL的gp145/140ΔCFI诱导的V3多肽特异性中和活性进行的测定。根据部分I中材料与方法部分的描述，在MT2细胞中进行了分析(Montefiori，D.C.等人，1988 J Clin Microbiol 26：231-5)。所述虚线对应于认为是中和阳性的50％分界点。
图4所示为在HIV HXB/BaLΔCFI Env中不同2F5/V3突变体的示意图和表达。图A所示为具有在V3中表达的2F5表位的衍生自进化枝BHIV HXB/BaL的gp145ΔCFI的示意图。如前所述，指定了功能型结构域和主要的结构基序(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-5368)。V1，V2，V3和V4是指各自的可变区域，也给出了所述相关的V3环的序列。在R5/进化枝B包膜中跨膜结构域上游的七重复(HR-2)和卷曲的卷曲多肽序列，被来自进化枝C Env中的类似区域所取代。对应于V3末端的氨基酸(GPGRA，SEQ ID NO：12)的核苷酸序列，或者被含有最小2F5表位多肽对应的核苷酸序列所取代，或者被含有延伸的2F5表位多肽对应的核苷酸序列所取代。CTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC(SEQ ID NO：1)；CTRPNNNTRKAIHIFYTTGEIIGDIRQAHC(SEQ ID NO：2)；LELDKWAS(SEQ ID NO：3)；KNEQELLELDKWAS(SEQ ID NO：4)；KNEKDLLALDSWRN(SEQ ID NO：5)。图B为2F5突变gp3140ΔCFI包膜的表达。所示为指定的gp140ΔCFI B(C-HR2)或-2F5，gp140ΔCFIΔGPGRA B(C-HR2)或-末端-2F5，gp140ΔCFI B(C-HR2)延伸2F5，V3延伸2F5和进化枝B gp140ΔCFI的表达。所指定的蛋白是通过部分I的材料与方法部分所述的免疫印记进行测定的。将不含有插入的载体进行转染产生的无细胞上清液用作对照。图C所示为2F5修饰的Env与单克隆抗体2F5和HIV-1 IgG的反应活性的分析。gp140ΔCFI指定的突变体或用载体单独转染的对照的结合是使用单克隆抗体2F5(左边)和HIV-1IgG(右边)通过ELISA进行分析的。所述值代表了每一点的平均值和标准差(误差棒)。
图5所示为在免疫的豚鼠中对2F5多肽的抗体应答。所示为用指定表达载体免疫的豚鼠中通过ELISA对抗体应答进行的比较。使用DNA(图A)和ADV加强(图B)两周后收集的血清来测定所述抗体可与2F5多肽结合。使用对照载体单独免疫的动物的血清作为阴性对照。图C所示为在1∶5抗体滴度时，在HIV HXB/BaLΔCFI Env中2F5/V3突变体对于一组HIV-1 B进化枝株系的中和百分数(％)。使用了四种来自2F5/V3突变体免疫的豚鼠的个体血清对HIV BaL，HIV IIIB和HIV SF162病毒进行了筛选。给出了中和百分数(与对应的免疫前血清相比较)。
图6所示为gp140ΔCFI与不同的单克隆抗体的相互作用或与来自不同进化枝的gp140ΔCFI的CD4相互作用。图A所示为可溶性gp140ΔCFI的抗原结构与单克隆抗体的分析。用单克隆抗体(5μg)2F5，2G12，F105和IgG1b12或5μg HIV-1 IgG对用指定的表达gp140ΔCFI的载体转染的293细胞的上清液中的Evn糖蛋白进行免疫沉淀。通过SDS-PAGE对所述蛋白进行分析，并使用来自患者混合血清中的IgG(HIV-1 IgG)通过Western印记对所述蛋白进行测定。存在有与所述抗体交叉反应的条带。图B所示为可溶性gp140ΔCFI蛋白与CD4的相互作用。在ELISA分析中，与用载体单独转染的对照与CD4结合的比较，显示了gp140ΔCFI和gp160与CD4的结合。所述值代表了每一点的平均值和标准差(误差棒)。
图7所示为由进化枝B(HXB/BaL)或者进化枝A、进化枝B和进化枝C的组合中的ΔCFI胞膜诱导的中和抗体应答的广度和效力的比较。图A和图B所示为四种个体豚鼠血清在1∶5稀释度条件下对指定病毒的中和分析。通过直接比较免疫血清和对应动物的免疫前血清计算中和百分数。之前对单轮细胞内p24-抗原流式细胞术HIV-1中和分析已有描述(Mascola，J.R.等人，2002 J Virol 76：4810-21)。图A所示为用进化枝B Env免疫原免疫四只豚鼠的结果。图B所示为用多进化枝免疫原免疫四只豚鼠的结果。所有血清都对19种病毒进行了评估(X-轴所示)。由于需要进行评估的病毒数量较大，所以所示数据来自于对每一种血清和病毒的单次实验。对任意给定病毒(DJ263，ZA12，TV1和DU151)的单进化枝血清与多进化枝血清的中和比较说明显著性差异为p＝0.029。图C所示为进化枝B HIV 89.6和BR07对于V3多肽的中和竞争性分析。以1∶5的稀释度测定用HIV HXB/BaL免疫原免疫的豚鼠血清对HIV 89.6(左)和BR07(右)进行的中和。所述血清不和多肽孵育(模拟物)，或与20μg/ml的基于HIV BaL序列的23寡肽V3多肽(BaL V3)孵育，或与来自埃博拉GP的无关多肽混合物(Ebola)孵育。由HIV 89.6和HIV BR07引起的感染可以完全被HIV BaL V3多肽抑制，但不能被对照多肽抑制。所示为来自代表性豚鼠血清的数据。图D与E，进化枝B HIV SF162中和的V3多肽竞争性分析。图D所示为来自两种代表性豚鼠的血清；一种是用进化枝BEnv免疫原(单进化枝)进行免疫的，另一种是用进化枝A，进化枝B，进化枝C Env免疫原(多进化枝)进行免疫的。以1∶5对血清进行测定，并与浓度升高的基于HIV BaL序列的23寡肽V3多肽(BaL V3)进行孵育。值得注意的是，由所述单进化枝血清，而不是多进化枝血清的中和，可以完全由HIV BaL V3多肽抑制。对照值说明混杂的V3多肽对血清中和没有作用。图E所示为以1∶5稀释度，使用相同的多进化枝豚鼠血清对HIV SF162进行中和的数据的柱状图。所述血清与20μg/ml的进化枝A，进化枝B或进化枝C V3多肽进行孵育，或与60μg/ml的所有这三种多肽的组合孵育(图E)。所述所有三种V3多肽的组合并不能逆转大部分血清介导的SF162的中和。误差棒是两次独立试验的平均值(+/-SEM)。在图C中进行的两个实验都仅使用了一种血清，但每一组(单进化枝或多进化枝)中的所有四种血清也给出了类似的结果。
图8所示为使用单基因方法与多价多质粒的免疫应答的比较。使用单独的对照载体(50μg)，Env(25μg)和作为填充DNA的对照载体(25μg)，Gag-Pol-Nef(25μg)和作为填充DNA的对照载体(25μg)，或Env(25μg)和Gag-Pol-Nef(25μg)对每组5只小鼠的四个小组进行免疫。在最后一次免疫之后10天，收集脾细胞，并使用B-env多肽池(进化枝B Env蛋白的158-多肽池)和B-gag多肽池(进化枝B Gag蛋白的122-多肽池)对其进行致敏。六小时后将细胞固定，用单克隆抗体染色，用FACS进行分析，测定CD4(上栏)和CD8(下栏)阳性类群中IFN-γ和TNF-α的阳性细胞，如图8A所示。在图8B中，收集小鼠血清，使用ELISA来测定对于Env的抗体。按照部分II中材料与方法部分的描述，使用来自进化枝B的pVRC2801(R5 gp140ΔCFI-进化枝-B)转化细胞的上清液制备和包被ELISA板。在进行测试之前，将来自不同组的小鼠血清从1∶100稀释到1∶2700。所示为用pVR1012(▲)，pVR1012-B-Gag-Pol-Nef和填充DNA(■)，pVR1012-B-gp145ΔCFI和填充DNA(●)，或1012-B-gp145ΔCFI+1012-B-Gag-Pol-Nef(◆)免疫小组的ELISA滴度。每一点都代表从每组五只动物得到的平均OD读数。
图9所示为在用Gag-Pol-Nef和进化枝B Env与Gag-Pol-Nef和进化枝A，进化枝B和进化枝C Env蛋白免疫的小鼠中T细胞和抗体应答的比较。使用总共50μg的对照载体，Gag-Pol-Nef和进化枝B Env(1∶1)，或Gag-Pol-Nef和来自进化枝A，进化枝B和进化枝C的Env(1∶0.33∶0.33∶0.33)对小鼠(n＝3)进行免疫。图A所示为，在最后一次免疫之后10天，将脾细胞收集，并使用B-env多肽池(进化枝B Env蛋白的158-多肽池对其进行致敏。对对照而言，将埃博拉糖蛋白多肽池(22多肽)或未被刺激的细胞用作阴性对照，将PMA用作阳性对照。六小时后将细胞固定，用单克隆抗体染色，用FACS进行分析，测定CD4(左图)和CD8(右图)阳性类群中IFN-γ和TNF-α的阳性细胞。所述记号代表了对每组10只小鼠的单个结果。所述较细的水平棒代表了具有标准差误差棒的十个数据点的平均值。图B所示为在第三次免疫后10天收集的三组动物的血清，并根据部分II中材料与方法部分的描述，使用ELISA测定了针对各自进化枝Env的抗体。将来自不同组的小鼠血清稀释成1∶200至1∶800进行测定。每一条横线都代表来自每组三只动物的平均OD读数。
图10所示为通过细胞内细胞因子分析得到的CD8+T细胞对不同进化枝和基因组合候选疫苗的应答。使用表1所述的对照载体(VR1012)，ABC(x4)或ABC(x6)对三组小鼠进行免疫。在最后一次免疫之后10天，将脾细胞收集，并使用下述多肽池对其进行致敏：A-Gag(125多肽)，B-Gag(122多肽)，C-Gag(105多肽)，A-Env(154多肽)，B-Env(158多肽)，C-Env(154多肽)，B-Pol-1(来自进化枝B Pol前一半的120多肽)，B-Pol-2(来自进化枝B Pol后一半的128多肽)。刺激细胞并通过FACS进行分析，使用图9所示的阳性和阴性对照图例，测定CD8+类群中的IFN-γ和TNF-α的阳性细胞。所述较细的水平棒是具有标准差棒的十个数据点的平均值。
图11所示为通过细胞内流式细胞计数和ELISA对基因和进化枝候选疫苗组合的CD4+T细胞和抗体应答的分析。使用如表1中的指定的对照或疫苗组合对三组小鼠进行免疫。在最后一次免疫之后10天，收集脾细胞，并使用图9中图例所述的指定多肽池对其进行致敏。使用标记说明单独的应答，较细的水平棒描述的是具有标准差误差棒的十个数据点的平均值。图B所示为在第三次免疫后10天收集的三组动物的血清，并根据部分II中材料与方法部分的描述，使用ELISA测定了针对包膜的抗体。将来自不同组的小鼠血清稀释成1∶100至1∶2700进行测定。每一条横线都代表来自每组十只小鼠的平均OD读数。
图12所示为包膜突变的示意图。图A所示为HIV Env中主要的结构基序，以及用于这些研究的选定的表达载体。V1，V2，V3和V4是指分别的可变区域，还给出了相关V3环的序列(SEQ ID NO：1)。图B所示为所述V3环和V3(1AB)茎缩短突变的示意图(SEQ ID NO：1)。
图13所示为所述V3环茎部的突变和多种gp145ΔCFI(HXB2/BaL嵌合体)V3缺失突变体的蛋白表达。图A所示为在来自HXB2/BaL嵌合体的Env中渐进性V3茎缺失突变的序列。图B所示为gp145ΔCFI(HXB2/BaL嵌合体)V3缺失突变体表达载体的蛋白表达。如前(Chakrabarti，B.K等人，2002 J Virol 76：5357-5368)所述的，制备gp145ΔCFI构建体中的突变体，并通过SDS-PAGE随后利用人单克隆抗体2F5进行Western印记检测分析。使用磷酸钙将编码所述指定突变体的质粒表达载体转染到293细胞中。48小时之后收集细胞裂解液。图C所示为V1和V2区域缺失的gp145(HXB2/BaL嵌合体)V3缺失突变体载体的表达。
图14所示为V3环的茎中的突变体对89.6P Env定向(tropism)的作用。图A和图B所示为在慢病毒载体颗粒中指定V3突变体的浮力密度沉降分析，所述分析是按照部分III中的材料和方法部分进行的。图C所示为利用荧光酶报告基因，89.6P Env株中V3突变对CXCR-4定向细胞系，MT-2(左)，以及CCR-5定向指示细胞系，MAGI-CCR5(右)感染的影响。在89.6P Env株中所指定的V3突变的位置与所述HXB2/BaL嵌合体的位置相同(图13A)。密码子修饰和野生型(wt)的89.6P Env株可用作阳性对照。
图15所示为不同HIV gp145(HXB2/BaL嵌合体)V区域的突变体的表达和中和抗体的诱导。图A所示为通过SDS-PAGE然后经过Western印记在转染的293细胞中测定的所述指定HXB2/Bal V区域突变体的表达。图B所示为在使用所指定的DNA/ADV表达载体免疫的豚鼠血清中对于BaL的中和活性。以1∶5稀释度对血清进行测定。所得结果是对每种构建体的四份豚鼠血清所得的平均值(+/-SD)。所得的P值是比较两个指定组的中和中值的Mann-Whitney检验的结果。
图16所示为由gp145(HXB2/BaL嵌合体)ΔV1V2和选定的V3区域突变体诱导的抗体应答的表征。图A所示为用所述指定的突变体免疫豚鼠诱导的针对BaL的中和活性，所述突变体包括ΔV1V2缺失突变体和ΔV1V2V3(1AB)茎缩短突变体。以1∶5的稀释度检测血清。所的结果是对于每种构建体的四份豚鼠血清所得的平均值(+/-SD)。显示的是两个独立试验中的一个的结果。所测定的血清与图15B中测定的血清相互独立。图B所示为在相同豚鼠血清中的总ELISA滴度，及其在不同突变体中的比较。
图17所示为选定的V区域突变体诱导的抗体应答的广度和效力的比较。图A所示为针对四种进化枝B原始分离物的IC50滴度(参见部分III中的材料与方法)。所得结果是对每种构建体的四份豚鼠血清所得的平均值±标准误。所示为ΔV1V2V3(1AB)与野生型gp140/145或gp140/145ΔCFI的统计显著性差异(Mann-Whitney检验)。图B所示为来自ΔV1V2V3(1AB)免疫豚鼠的四种单独的血清对一组10种原始病毒进行的筛选。以1∶5稀释度对血清进行测定。所示为中和(与对应的免疫前血清比较)的百分数。所示数据是两个实验的平均数。
图18所示为使用质粒和rADV疫苗构建体的HXB2/Bal和89.6 P Env的体外表达。在体外表达质粒Env[gp145ΔCFI(R5)和gp145ΔCFI(89.6 P)]和rADV[ADV-gp140ΔCFI(R5)和gp14ΔCFI(89.6 P)]疫苗构建体，用人抗-HIV IgG通过Western印记对蛋白表达进行分析。
图19所示为疫苗引起的对SIVmac Gag-Pol-Nef和HIV-1 Env的PBMC IFN-γELISPOT应答。在体外暴露于含有所述SIVmac Gag-Pol-Nef和HIV-1 Env蛋白的肽池之后，分析了新鲜分离的PBMC对于IFN-γELISPOT的应答。通过使用与所述Env免疫原匹配的多肽对所有Env-特异性应答进行了测定。术语“匹配”和“不匹配”是指所述Env免疫原与所述刺激病毒之间的关系。箭头所指为用DNA或rADV免疫原接种后的时间。所的数据为每106PBMC对于Gag-Pol-Nef和HIV-1 Env的总抗原特异性SFC应答，所示为六只猴子的平均值±标准误。
图20A和图20B所示为在rADV加强之后2周由疫苗引起的PBMCIFN-γ ELISPOT对于单独病毒蛋白应答的测定。测定了ELISPOT对于SIVmac239 Gag与Pol以及HIV-1 Env抗原的应答。使用与所述Env免疫原匹配的多肽测定Env-特异性应答，使用89.6 P多肽池对模拟Env-免疫的猴子进行了分析。使用全体PBMC(A)或CD8+T淋巴细胞缺失的PBMC(B)进行ELISPOT分析。所示数据为每106PBMC对于单独病毒蛋白的平均SFC应答，并表示为六只实验接种猴子的平均值±标准误。
图21所示为刺激后外周血CD4+T淋巴细胞计数。这些值代表了在刺激后的168天时间里所有猴子预期测定的CD3+CD4+T淋巴细胞的平均百分数。
图22所示为刺激后的血浆病毒RNA水平。这些值是采用50拷贝/ml的检测限通过超敏感bDNA扩增分析测定的。用于作图的值代表了对每组实验猴子在每一个采样时间的几何平均值±标准误。
图23所示为从接受SHIV-89.6 P刺激之后的猴子中获得的血浆样本中测定的血浆SHIV-89.6 P中和滴度。使用MT-2染色排除分析测定所述中和。
图24所示为在rADV加强后1周和SHIV-89.6P刺激后3周和10周测定的89.6P Env-特异性PBMC IFN-γ ELISPOT应答。ELISPOT应答是在PBMC(外周血淋巴细胞，PBL)在体外暴露于含有所述HIV-189.6P Env蛋白的肽池的条件下测定的。所示横杠代表了具有标准误的六只猴子的平均值。
图25A、B和C所示为在DNA引发和rAd加强免疫之后由恒河猴的PBL引起的对于HIV-1进化枝A，进化枝B，进化枝C和89.6P Env抗原的疫苗引起的细胞免疫应答。在12周(DNA引发后)(A)，27周(rAd加强后)(B)和42周(感染当天)(C)新鲜提取PBL，并且在用包括所指定的HIV-1Env蛋白的多肽池刺激之后测定IFN-γ ELISPOT的应答。所示数据是来自每组六只猴子的每106 PBL中的抗原特异性集落形成细胞(SFC)的平均数+/-SEM。
图26所示为在DNA引发/rAd加强免疫之后，由恒河猴的PBL对于SIV Gag和Pol的疫苗引起的细胞免疫应答。在免疫后27周(rAd加强后一周)新鲜分离PBL，并且在用包括所述SIV Gag和Pol蛋白的多肽池刺激之后测定IFN-γ ELISPOT的应答。所示数据是来自每组六只猴子的每106 PBL中的抗原特异性集落形成细胞(SFC)的平均数+/-SEM。
图27所示为在DNA引发/rAd加强免疫之后，恒河猴血浆中对HIV-1进化枝A，进化枝B，进化枝C Env蛋白的抗体滴度。在免疫后28周(rAd加强后2周)获取血浆样本，并且通过ELISA测定对于所指定HIV-1 Env蛋白的抗gp-145抗体滴度。所示数据是来自每组六只猴子的几何平均数。
图28A、B和C所示为在DNA引发/rAd加强免疫之后，恒河猴血浆中抗体的中和活性。血浆样本来自于免疫后28周(rAd加强后2周)的接收免疫的和对照的猴子，并且测定了对于进化枝A、进化枝B、进化枝C的HIV-1分离物组的中和活性。正如在结果部分中提到的，所述虚线代表了20％中和的参考点。所示数据是来自每组六只猴子的中和活性平均百分数+/-SEM。需要注意的是顶部进化枝A病毒组中还包括了作为对照的MuLV Env假病毒。
图29A和B所示为在SHIV-89.6P感染后免疫的和对照恒河猴PBL引起的对于HIV-1 Env和SIV Gag与Pol的细胞免疫应答。在感染后两周新鲜分离PBL，并且在用包括所指定的HIV-1 Env蛋白(A)或SIV Gag和Pol(B)蛋白的多肽池刺激之后测定IFN-γELISPOT的应答。所示数据是来自每组六只猴子的每106 PBL中的抗原特异性集落形成细胞(SFC)的平均数+/-SEM。
图30A和B所示为SHIV-89.6P感染后的血浆病毒RNA水平。在感染16天后测定每只猴子的血浆病毒RNA水平峰值(A)。将每只猴子的设定点的血浆病毒RNA水平(B)计算为感染后85天和169天之间测定值的中值。所示为个体猴子的Log病毒拷贝/ml，横线为每个实验组6只猴子的中值。虚线所示为所述分析的检测限，即125拷贝/ml。
图31所示为SHIV-89.6P感染后的外周血CD4+T淋巴细胞。在SHIV-89.6P感染后的169天全过程通过流式细胞术测定了恒河猴外周血中的CD3+CD4+T淋巴细胞百分比。所示数据是来自每组六只猴子的外周血中的CD4+T淋巴细胞百分比的平均数+/-SEM。
图32所示为VRC-4306 DNA构建体。该质粒DNA旨在表达具有修饰的HIV-1 Gag，Pol和Nef多蛋白，以降低潜在的毒性(在影响蛋白酶、RT和整合酶的区域缺失)并增加在人细胞中的表达，还具有较强的组成型CMV启动子。其含有作为选择标记整合入细菌载体骨架的卡那霉素抗性基因。
图33所示为VRC-5305 DNA构建体。该质粒DNA旨在表达具有修饰的HIV-1进化枝A Env蛋白，以降低潜在的毒性(在融合与剪切结构域以及七重复(H)1和2之间的缺失)并增加在人细胞中的表达，还具有较强的组成型CMV启动子。其含有作为选择标记整合入细菌载体骨架的卡那霉素抗性基因。
图34所示为VRC-2805 DNA构建体。该质粒DNA旨在表达具有修饰的HIV-1进化枝B Env糖蛋白，以降低潜在的毒性(在融合与剪切结构域以及七重复(H)1和2之间的缺失)并增加在人细胞中的表达，还具有较强的组成型CMV启动子。其含有作为选择标记整合入细菌载体骨架的卡那霉素抗性基因。
图35所示为VRC-5309 DNA构建体。该质粒DNA旨在表达具有修饰的HIV-1进化枝C Env糖蛋白，以降低潜在的毒性(在融合与剪切结构域以及七重复(H)1和2之间的缺失)并增加在人细胞中的表达，还具有较强的组成型CMV启动子。其含有作为选择标记整合入细菌载体骨架的卡那霉素抗性基因。
图36所示为HIV-1进化枝B Gag(VRC-4401)的质粒图谱。
图37所示为HIV-1进化枝B Pol(VRC-4409)的质粒图谱。
图38所示为HIV-1进化枝B Nef(VRC-4404)的质粒图谱。
图39所示为HIV-1进化枝A Env(VRC-5736)的质粒图谱。
图40所示为HIV-1进化枝B Env(VRC-5737)的质粒图谱。
图41所示为HIV-1进化枝C Env(VRC-5738)的质粒图谱。
图42所示为Adgp 140(A).11D腺病毒载体的图谱。
图43所示为Adgp 140(C).11D腺病毒载体的图谱。
图44所示为B287-B Adt.gp140dv12(B).11D腺病毒载体的图谱。
图45所示为GV326A Adt.GagPol(B).11D腺病毒载体的图谱。
图46所示为VRC 5747的质粒图谱。
图47所示为VRC 5753的质粒图谱。
图48所示为VRC 5754的质粒图谱。
图49所示为VRC 5755的质粒图谱。
图50所示为VRC 5766的质粒图谱。
图51所示为VRC 5767的质粒图谱。
图52所示为VRC 5768的质粒图谱。
图53所示为VRC 5769的质粒图谱。
图54所示为VRC 5770的质粒图谱。
图55所示为VRC 5771的质粒图谱。
图56所示为VRC 5772的质粒图谱。
图57所示为VRC 5773的质粒图谱。
图58所示为CMVR-gp145ΔCFIΔV1(V2ΔLR)(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图59所示为CMVR-gp145ΔCFI(V1V2ΔG)(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图60所示为CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔG)(V2ΔLR)(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图61所示为CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔG)(V2ΔM)(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图62所示为CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔG)ΔV2(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图63所示为CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔLR)(V2ΔG)(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图64所示为CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔLR)ΔV2(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图65所示为CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔM)(V2ΔG)(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图66所示为CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔM)ΔV2(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图67所示为CMVR-gp145ΔCFI(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图68所示为CMVR-gp145ΔCFIΔV1(V2ΔG)(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图69所示为CMVR-gp145ΔCFIΔV1(V2ΔM)(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图70所示为CMVR-gp145ΔCFIΔV1(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图71所示为CMVR-gp145ΔCFIΔV1V2(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图72所示为CMVR-gp145ΔCFIΔV2(V3-1AB)(Bal)的质粒图谱。
图73所示为VRC 5781的腺病毒载体图谱。
图74所示为VRC 5782的质粒图谱。
图75所示为VRC 5783的腺病毒载体图谱。
图76所示为VRC 5784的质粒图谱。
图77所示为VRC 5785的腺病毒载体图谱。
图78所示为VRC 5786的质粒图谱。
图79所示为VRC 5787的腺病毒载体图谱。
图80所示为CMVR-gp145ΔCFI(BBBB)的质粒图谱。
图81所示为VRC 5789的腺病毒载体图谱。
图82所示为VRC 5790的质粒图谱。
图83所示为VRC 5791的腺病毒载体图谱。
图84所示为VRC 5792的质粒图谱。
图85所示为VRC 5793的腺病毒载体图谱。
图86所示为VRC 5794的质粒图谱。
优选实施方案的详细描述
部分I 用多进化枝包膜HIV候选疫苗免疫后病毒中和的扩展广度
摘要
尽管1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)包膜(Env)的V3环有效地引起强烈的中和抗体应答，但是所述抗体应答的特异性通常局限于T细胞系适应的(TCLA)株和原始分离物的较小亚组，从而将其应用限制于AIDS疫苗。在本研究中，我们对具有取代V3区域的Env免疫原和来自不同进化枝的株的组合进行了比较，并测定了其扩展所述中和性抗体应答的广度的能力。当来自HIV BaL的V3区域被HIV HXB2取代时，引起了对于几种进化枝B原始分离物的有效中和抗体应答，但其依然局限于大多数进化枝B分离物的中和。在进一步扩展这种应答的尝试中，向V3中插入了广泛中和性2F5抗体识别的线性表位。V3 2F5表位被鉴定为结合于2F5，并作为免疫原引起了强烈的2F5抗体应答，但所述抗血清仅中和了实验室适应的株而不是原始分离物。相比之下，从进化枝A，进化枝B和进化枝C的Env组合能在更广泛的原始HIV-1分离物组中引起中和抗体。这些研究说明，尽管来自每种成分的V3具有局限的反应性，Env免疫原的组合还是可以用来扩展所述中和性抗体应答的广度。
引言
在引起细胞介导的免疫反应的AIDS候选疫苗发展中已取得了显著的进步，这些反应也对对抗疾病的天然和疫苗诱导的免疫保护有贡献(Letvin，N.L.和Walker，B.D的综述2003 Nat Med 9：861-6)。在同一时间，有理由期待广泛的交叉反应和强烈的中和抗体应答会在HIV的保护性免疫中起到重要作用。例如，现已鉴定了几种可以中和广谱原始分离物的人单克隆抗体(Burton，D.R.等人，1994 Science 266：1024-7；Conley，A.J.等人，1994 PNAS USA 91：3348-52；Gauduin，M.C.等人，1997 Nat Med 3：1389-93；Kessler，J.A.等人，1997 AIDS Res Hum Retroviruses 13：575-82；Muster，T.等人，1994 J Virol 68：4031-4；Trkola，A.等人，1995 J Virol 69：6609-17)。如果在病毒感染前很短的时间以高浓度给药，这些抗体是具有保护性的(Baba，T.W.等人，2000 Nat Med 6：200-6；Conley，A.J.等人，1996J Virol 70：6751-8；Mascola，J.R.等人，1999 J Virol 73：4009-18；Mascola，J.R.等人，2000 Nat Med 6：207-10；Parren，P.W.等人，1995 AIDS 9：F1-F6；Parren，P.W.等人，2001 J Virol 75：8340-7；Shibata，R.等人，1999 Nat Med5：204-10)。有多种因子都能测定是否由包膜(Env)免疫原与天然三聚Env糖蛋白反应引起的抗体足以中和病毒。已努力对这种糖蛋白进行修饰以保持其寡聚的天然结构来引发这样的抗体(Barnett，S.W.等人，2001 JVirol 75：5526-40；Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-68；Earl，P.L.等人，2001 J Virol 75：645-53；Lee，S.A.等人，201 Vaccine 20：563-76；Lund，O.S.等人，1998 AIDS Res Hum Retroviruses 14：1445-50；Schonning，K.等人，1998 AIDS Res Hum Retroviruses 14：1451-6；Schule，N.等人，2002 J Virol 76：7760-76；Srivastava，I.K.等人，2002 J Virol 76：2835-47；Srivastava，I.K.等人，2003 J Virol 77：23 10-20)。
尽管存在在不同HIV-1株中的高度保守的表位能够与抗体接触，但是依然难以引起对这些表位的抗体应答。在已确定的广泛的中和单克隆抗体中，2F5表位的本质是线性的，存在于gp41的外功能区上(Muster，T.等人，1993 J Virol 67：6642-7；Purtscher，M.等人，1994 AIDS Res HumRetroviruses 10：1651-8；Stiegler，G.等人，2001 AIDS Res Hum Retroviruses17：1757-65；Zwick，M.B.等人，2001 J Virol 75：10892-905)。在HIV-1血清阳性的个体中极少发现针对该区的抗体，说明这一表位的免疫原性较弱。此前也有将所述2F5表位插入gp120的V3环以增强Env免疫原性的尝试，但没有成功(Liang，X.等人，1999 Vaccine 17：2862-72)。我们报道了增强对于Env抗体应答的包膜糖蛋白修饰(Chakrabarti，B.IL.等人，2002 J Virol 76：5357-68)。当保持其诱导病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞的能力时，在剪接位点、融合多肽和内部螺旋区(ΔCFI)具有突变的HIV-1 Env的修饰形式表现出改善的抗体应答。在这些载体和多种蛋白免疫原中，V3区尤其具有免疫原性，并能引起强烈的，尽管是限制性的抗体应答。
在本研究中，我们测定了V3环引起广泛中和抗体应答的能力。采用两种方法：1)向V3环中引入异源序列，和2)在所述疫苗中包含来自不同进化枝的多种包膜。作为异源序列插入的模型，对2F5表位进行了分析。对多种V3 Env的包含情况，进化枝A，进化枝B和进化枝C的组合进行了分析。尽管在ΔCFI Env中定位插入的2F5表位能够引起抗线性多肽的抗体，但它并不能中和原始病毒分离物。相比较而言，所述多进化枝的Env免疫原能够帮助扩展对于来自从这些可选进化枝的所测定的几个株的免疫应答。来自不同进化枝的HIV包膜基因的组合可以诱导针对多种非相关实验室适应株和原始分离物的中和抗体。这些研究说明V3环有助于Env抗体免疫原性，组合Env免疫可以在HIV候选疫苗中扩展中和抗体应答的广度。
材料与方法
免疫原
如前所述(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-68)，在CXCR4-定向性株HIV HXB2(GenBank登录号K03455)和CCR5-定向性株HIV BaL(GenBank登录号K03455)的gp145ΔCFI和gp140ΔCFI版本的骨架上，构建了编码来自进化枝A，B和C的CCR5-定向性V3环的质粒。简言之，为了制备包膜糖蛋白(CCR5 gp160/h)的CCR5-定向性版本，用来自HIV-1的HIV BaL株的对应区(GenBank登录号M68893，采用人类偏好的密码子)取代了来自HIVHXB2 gp160的编码205-361氨基酸的区，使其成为了杂合体，HIVHXB/Bal。采用上述相同的方法，在HIV-1株92rw020(CCR5-定向性，GenBank登录号U51283)和97ZA012(GenBank登录号AF286227)的基础上，制备了进化枝A和C的gp145ΔCFI和gp140ΔCFI Env糖蛋白的合成版本。氨基酸486-519的融合区和剪切序列、以及氨基酸576-604的H1(七重复1)和H2(七重复2)之间缺失，并且在氨基酸690和664的密码子之后终止，由此分别制备了gp145ΔCFI和gp140ΔCFI的Env。氨基酸487-520的融合区和剪切序列、以及进化枝Cgp160的氨基酸577-605的H1和H2之间缺失。所述蛋白在氨基酸689和664的密码子之后终止，从而分别制备了合成的蛋白进化枝Cgp145ΔCFI/h和进化枝C gp140ΔCFI。对2F5 V3嵌合Env而言，完全缺乏2F5(-2F5)的杂合包膜gp140ΔCFI B(C-HR2)是通过用缺失2F5的来自进化枝C gp140ΔCFI对应区的氨基酸592-688来替换包括所述HR2(七重复2)和单克隆抗体2F5结合区的HIVHXB/Bal株的CCR5-定向性gp140ΔCFI的氨基酸592-680制备的。还可以通过进一步缺失GPGRA(氨基酸309-313)对HIVHXB/Bal骨架中的杂合包膜gp140ΔCFI进化枝B(C-HR2)，-2F5来生成gp140ΔCFIΔGPGRA B(C-HR2)，称为-末端-2F5。通过定点突变，将分别编码“LELDKWAS”(SEQ ID NO：3)和“KNEQELLELDKWAS”(SEQ ID NO：4)的最小和延伸的2F5表位插入到gp140ΔCFI B(C-HR2)，-2F5的V3环的GPGRA(SEQ ID NO：12)位置，分别形成了gp140ΔCFI B(C-HR2)2F5，称为V3 2F5，和gp140ΔCFI B(C-HR2)延伸的2F5或V3延伸的2F5。
转染细胞中包膜蛋白的表达分析
如前所述(Chakrabarti BK等人，2002 J Virol 76：5357-68)，在293细胞中的通过转染和Western印记确证了Envs的表达。如前所述(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-68；Karlsson，G.B.等人，1998 J Exp Med188：1159-71)，也进行了对可溶性CD4(sCD4)的结合。如前所述(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-68)，还测定了不同单克隆抗体，2F5，2G12，F105和IgG1b12与不同进化枝gp140ΔCFI的结合能力。抗体(5μg)被用于对来自100μl无膜上清液的gp140ΔCFI进行免疫沉淀，所述无膜上清液来自于表达进化枝A，进化枝B或进化枝Cgp140ΔCFI的表达载体转染的293细胞。将相同体积的用空载体转染的细胞的上清液用作对照。可从国立卫生院(National Institutes of Health)的AIDS研究和参考试剂项目得到抗体。可通过ELISA测定HIV-1 IgG与R5/B 140ΔCFI或不同突变体的结合。简言之，可用100μl/孔凝集素雪滴花(Galanthus Nivalis)(Sigma，St.Louis，MO)(10μg/rl，溶解于PBS)4℃过夜包被Immulon 2HB ELISA板(Thermo Labsystems，Franklin，MA)。用200μl含有10％FBS的PBS在室温对所述板封闭2小时，然后用含有0.2％TWEENTM-20的PBS(PBS-T)洗涤两次。加入样本，并根据如下部分II的所述进行显色。为了在免疫豚鼠的血清中测定所述2F5或V3抗体，可使用100μl 2F5多肽KNEQELLELDKWAS(10μg/ml)(SEQ ID NO：4)或100μl V3多肽“TRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAH”(SEQ IDNO：13)在4℃对ELISA板进行包被。然后将所述多肽溶液从小孔中去除，并用200μl含有10％FBS的PBS在室温对所述板封闭2小时。用含有0.2％TWEENTM-20(PBS-T)的PBS洗涤两次，然后以3倍稀释浓度加入来自不同组的免疫豚鼠血清，保持1小时。
免疫
向6周龄雌性Huntley豚鼠肌肉注射500μg编码相关免疫原gpΔ145CFI形式的纯化质粒DNA，所述纯化DNA溶于400μl生理盐水。对多进化枝A，B和C胞膜免疫而言，对每种包膜表达质粒使用总500μgDNA的1/3。对每种质粒而言，对一组四只豚鼠进行间隔为两周的三次注射。在最后一次注射后两周对豚鼠进行采血，并将血清收集并保存于4℃。如前所述(Sullivan，N.J.等人，2000 Nature 408：605-9；Xu，L.等人，199S Nat Med 4：37-42；Yang，Z.等人，1998 Science 279：1034-7)，随后所述豚鼠接受用编码相同免疫原gpΔ140CFI形式的复制缺陷性重组腺病毒(ADV)进行的加强，并且在ADV注射后2周进行采血。
HIV-1病毒
除非以下特别说明，HIV-1原始分离物，以及T-细胞系适应的HIVMN和HIV IIIB均来自国立卫生院的AIDS研究和参考试剂项目。原始分离物6101(之前称为P15)和1168是之前所述的使用CCR5的进化枝BHIV-1株(Bures，R.等人，2000 AIDS Res Hum Retroviruses 16：2019-35)。DU151，DU123和S007也是之前描述过的进化枝C病毒(Bures R等人，2002 J Virol 76：2233-44)。TV1(进化枝C)是由Estrelita Janse VanRensburg(University of Stellenbosch，南非)提供的。DJ263是由美国军事HIV研究计划的研究人员提供的进化枝A病毒。所有原始病毒储存物都是在PHA和IL-2刺激的人外周血单核细胞(PBMC)中制备和滴定的。病毒BL01和BR07是由Dana-Farber癌症研究所的Dana Gabuzda提供的(Ohagen，A.等人，2003 J Virol 77：12336-45)。两种都是NL4-3的嵌合感染性分子克隆，其含有来自所指定HIV-1株的几乎全长的env基因。在293细胞的初始质粒转染之后，如上所述，这些病毒可在PBMC中扩增。
中和抗体分析
采用了两种中和分析方法。如前所述(Bures，R.等人，2000 AIDS ResHum Retroviruses 16：2019-35)，在PBMC中利用p24 Gag抗原合成的降低测定BaL分离物的中和。简言之，将500份50％病毒的组织培养感染剂量与不同稀释度的试验样本(血清)在96孔U-型底培养板中以三重复的形式在37℃孵育1小时。加入PHA-PBMC并孵育1天。然后用生长培养液洗涤所述三次所述细胞，并重悬于200μl新鲜的生长培养液中。此后每天收集两次培养上清(25μl)并与225μl 0.5％Triton X-100混合。每天移出的25μl培养液用等量的新鲜培养基替换。根据供应商的描述(DuPont/NEN Life Sciences，Boston，MA)在抗原捕获ELISA中测定p24Gag抗原的浓度。进行收集的每天都对病毒对照孔(病毒加细胞但没有测试血清)中的p24浓度进行测定。在对应于病毒对照孔中的p24产生处于早期线性增加并超过3ng/ml的时候，即达到该分析的最适灵敏度的时候，也对当天进行收集的其他所有剩余小孔中的浓度进行了测定(Zhou，J.Y.和Montefiori，D.C.1997 J Virol 71：2512-7)。在所述p24 ELISA中的检测限是0.1ng p24/ml。给出的中和滴度相当于将来自健康、HIV-1阴性个体的阴性对照血清样本的p24合成降低了80％的最小血清稀释度的倒数。TCLA株的中和分析是通过使用中性红在MT-2细胞(HIV IIIB和HIV MN)中定量病毒诱导杀死作用的活存细胞的百分数进行的(Montefiori，D.C.等人，1988 J Clin Microbiol 26：231-5)。简言之，将500份50％病毒的组织培养感染剂量与不同稀释度的试验样本(血清)在96孔平底培养板中以三重复的形式在37℃孵育1小时。加入细胞并将所述孵育持续到病毒对照孔(病毒加细胞但没有血清样本)中的大多数而不是全部细胞都涉及到多核细胞形成为止(通常4-6天)。如前所述，根据中性红摄取对细胞活存进行定量(Montefiori，D.C.等人，1988 J Clin Microbiol 26：231-5)。
中和滴度定义为在防止50％细胞受到病毒诱导的杀死时血清稀释度(加入细胞前)的倒数。细胞杀死中50％的降低相当于在该分析中p24 Gag抗原合成的约90％降低(Bures，R.等人，2000 AIDS Res Hum Retroviruses16：2019-35)。每组分析都包括进行过多次分析且具有已知平均滴度的阳性对照血清。通过在有无V3多肽存在(50μg/ml)的情况下，将稀释的血清样本(用等量的磷酸盐缓冲液稀释，pH 7.4)在37℃孵育1小时对V3特异性中和抗体进行分析。然后如上所述，采用中性红在PBMC分析(在原始分离物的情况下)或MT-2细胞分析(HIV IIIB和HIV MN的情况下)中测定中和抗体的滴度。
此前还报道过使用单轮细胞内p24抗原流式细胞计数HIV-1中和分析的其他分析(Mascola，J.R.等人，2002 J Virol 76：4810-21)。简言之，将40μl病毒储液(感染多样性约为0.1)与10μl热灭活的豚鼠血清或10μl对照抗体孵育。37℃孵育30分钟后，向每个孔中加入20μl分裂素刺激的CD8缺失的PBMC(1.5×105细胞)。将这些T细胞保持于含有1μM茚地那韦(indinavir)的IL-2培养液中，并在第一天就用150μl IL-2培养液饲喂这些细胞。转染后一天，用KC57(Beckman Coulter，Inc.)抗p-24抗体对细胞进行细胞内p-24抗原染色，然后通过流式细胞计数定量HIV-感染的细胞。分析通过前向和侧向散射最初选定的活细胞，进行p24-Ag阳性细胞分析。在前向和侧向散射选定后，计数了50,000次事件。p24阳性PBMC的最终定量是通过减去假感染细胞(通常在每计数的50,000次事件低于10)中的背景事件得到的。中和百分数是通过计算与含有来自对应动物免疫前血清孔中的p24-Ag阳性细胞数量相比，在具有免疫血清的测试孔中p24-Ag阳性细胞数量的降低得到的。在所有分析中，包括了具有商业混合豚鼠血清(Gemini Bio-Products，Woodland，CA)的附加对照孔，以及含有具有良好表征的单克隆或多克隆中和抗体的阳性对照孔。标准操作程序描述了可接受的阳性和阴性对照值，所示的所有数据都来自满足这些条件的分析。
除了在加入病毒前30分钟向所述血清中加入V3多肽之外，以相同的分析方式进行了多肽竞争分析。所报道的多肽浓度是当多肽、血清和病毒一起孵育时的浓度。基于HIV-1株BaL、ZA12和RW20(与所述疫苗株匹配)的V3多肽和混杂的V3多肽，由SynPep(Dublin，CA)制备成23寡聚的(IGPGRATRPNNNFYTTGTRKSIH)(SEQ ID NO：14)。HIV IIIBV3多肽(24多肽寡聚物)购买自Sigma-Aldrich。在所有分析中都包括作为对照的混杂的V3多肽。为了确认V3多肽抑制的特异性，还是用了22多肽混合物(与埃博拉(Zaire)病毒糖蛋白序列有9个氨基酸重叠的15多肽寡聚物)的附加对照。
结果
V3环修饰的Env免疫原的产生
为了开发具有选择性V3特异性的HIV Env疫苗，对含有ΔCFI突变的前述进化枝B HIV-1原型株进行了修饰(Chakrabarti，B.K.等人，2002 JVirol 76：5357-68)。对V3环的替换是在C2和C4碱基的高度保守位点的接头处进行的。特别地，HIV HXB2的V3环被HIV BaL CCR5-定向性株的相同部分替换(图1A)。在转染的293细胞中通过Western印记分析的可视结果，确认了这些包膜糖蛋白的表达(图1B)。与较早的原型相同(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-68)，可轻易在该上清中检测到缺乏跨膜区的gp140ΔCFI，说明其可以为可溶性抗原。
Env免疫原HIV HXB/Bal对中和抗体应答的诱导
用HIV HXB/BaL gp140ΔCFI免疫的豚鼠血清可以将实验室适应的HIV MN株中和至较低的程度，如HIV IIIB(图2A)和CCR5-定向性HIV-1BaL(图2B)。相比较而言，用父系HIV HXB gp140ΔCFI免疫的豚鼠血清却不能中和这些病毒。因此有可能通过在存在于gp140ΔCFI免疫原的HIVHXB2 V3环处插入这种病毒的V3环产生抗HIV BaL的中和抗体。为了测定是否所述中和活性是由抗V3抗体介导的，使用与HIV BaL或HIVIIIB的V3环对应的多肽进行了竞争性分析。该分析说明抗体介导的HIVBaL的中和具有强烈的V3依赖性(图3A)，因为这是由HIV BaL而不是HIV IIIB V3多肽抑制的(图3A)。用父系HIV HXB/BaL gp140ΔCFI免疫的豚鼠血清对HIV MN的中和也具有V3依赖性(图3B)。
将2F5表位插入V3区
因为通过这些V3取代的中和广度仍然是有限的，所以我们想知道是否有可能向广泛的中和抗体能够识别的V3区中插入表位。所述的抗体线性表位2F5代表这样的良好限定的多肽序列。用缺乏2F5单克隆抗体识别序列的同源进化枝C HR2(七重复2)替换进化枝B HR2(七重复2)，对gp41的外功能区进行修饰，得到了-2F5(图4A)。采用这种方法，可以对单独的V3区中2F5的表位作用进行分析。还制备了V3环序列突变体，其中在所述V3环的末端，2F5表位的序列替换了天然的V3序列，称为V3 2F5。在另一种版本中，V3的末端、GPGRA(SEQ ID NO：8)被缺失，称为末端-2F5，被作为阴性对照(图4A)。之前定义的可被2F5抗体识别的小肽(Muster T等人，1994 J Virol 68：4031-4)，以及近来发现的延伸的氨基酸序列(Zwick MB等人，2001 J Virol 75：10892-905)，插入B(C-HR2)，称为V3延伸2F5。在转染的293细胞中通过Western印记分析验证了插入V3中的2F5表位的表达。根据所述GPGRA末端序列的存在，这些V3衍生物的表达水平各异(图4B)。在具有2F5表位的突变体V3中所表达的蛋白通过ELISA与2F5单克隆抗体反应，具有延伸的2F5表位序列的gp140ΔCFI B(C-HR2)，V3延伸2F5，表现出比父本进化枝B gp140ΔCFI高出20-30倍的反应性(图4C，左侧)。在gp140ΔCFI包膜中具有2F5表位序列的多种突变体V3与HIV-1 IgG反应是类似的(图4C，右侧)。因此，有可能通过将这些序列插入V3环的正确位置来提高2F5表位的抗原性。2F5 V3环突变体的免疫原性
用质粒DNA免疫豚鼠，用编码插入了这些2F5表位的V3的腺病毒载体进行加强。类似于B(C-HR2)，-2F5，和缺乏所述全部序列的阴性对照，野生型gp140/145 ΔCFI表达载体并不能引起抗体与含有2F5表位的多肽结合(图5A，5B)。类似地，尽管其具有结合2F5抗体的能力，但编码最少2F5表位(V3 2F5)氨基酸序列的载体并不能引起可测量的2F5样抗体应答。相反，具有2F5区延伸序列(V3延伸2F5)的gp140ΔCFI B(C-HR2)在豚鼠中诱导了能识别含有延伸的2F5表位序列多肽的抗体产生(图5A，5B)。这些结果说明在V3中插入2F5表位的适当序列能够使该表位具有免疫原性。
为了测定这些抗血清是否能够抑制不同的HIV分离物，进行了中和分析。这些抗体表现出对CXCR4-定向性HIV IIIB的几乎完全地抑制。然而，它们未能抑制CCR5-定向性HIV BaL或HIV SF162分离物的复制(图5C)，说明这些抗体并不是广泛中和的。
多进化枝Env免疫原的表达和表征
采用与进化枝B载体应用相同的修饰密码子偏好和突变，合成了编码进化枝A和进化枝C gp140/145ΔCFI蛋白的质粒表达载体。通过用诸如2F5，2G12，F105和IgG1b12的确定的广泛中和单克隆抗体的免疫沉淀，然后再通过Western印记分析，在转染的293细胞中验证了它们的表达(图6A)。正如从之前用对进化枝的这些抗体进行分析所预期的那样，这些抗体与进化枝A、B和C的反应性在识别和特异性上表现各异(图6A)(Moore，J.P.等人，1994 J Virol 68：8350-64；Trkola，A.等人，1996 J Virol70：1100-8；Kostrikis，L.G.等人，1996 J Virol 70：445-58)。来自进化枝A和B的Env能与2F5抗体反应，与进化枝C不同，其显示免疫沉淀和Western印记检测不到的活性。相反，进化枝A和C Env可以容易地与IgG1b12反应，而进化枝B Env则表现出对相同单克隆抗体的较弱的反应性。所有Env都表现出对单克隆抗体，2G12的类似结合。在上清液中可以容易地检测到缺乏跨膜区的gp140ΔCFI形式(图6A，6B)，说明它们产生了可溶性抗原。为了进一步评估这些糖蛋白是否保持了与Env功能相关的构象结构，评估了其与其受体CD4特异性互作的能力。与阴性对照上清液相比，这些Env容易与转染的293细胞中产生的可溶CD4结合(图6B)，正如之前对进化枝B进行的描述一样(Chakrabarti，B.K.等人，2002 JVirol 76：5357-68)，证实了CD4结合位点决定簇是完整的。用多进化枝Env候选疫苗进行免疫增加了所述中和抗体应答的广度
如材料与方法所述，采用这些载体的等量混合物进行免疫，分析了所述多进化枝Env候选疫苗引起中和抗体的能力，并与进化枝B Env免疫原(单进化枝)接种引发的抗体进行了比较。采用凝集素包被板上俘获的进化枝特异性胞膜，或通过使用V3多肽进行了ELISA。我们的数据说明，HxB2/BaL免疫后的抗体应答对进化枝B Env和进化枝B V3具有偏向性。相比较而言，从多进化枝免疫动物得到的血清则对进化枝A、B和C Env蛋白和V3多肽都具有反应性。对19种病毒的板进行抗血清测试(3种进化枝A，11种进化枝B和5种进化枝C)。来自用进化枝B gp140/145ΔCFI免疫原免疫的豚鼠血清能够中和几种进化枝B原始分离物(图7A)。这一单轮次的感染流式细胞计数分析列举出了HIV-1感染细胞的数量并且能够测定相当低水平的病毒中和。在全部分析中，将所述免疫血清与来自对应动物的免疫前血清直接比较。在以1∶5的豚鼠血清稀释度中和某些进化枝B病毒时，并不能中和其他的病毒。此外，观察到了极低的对于3种进化枝A和5种进化枝C病毒的中和。重要的是，用进化枝A、B和C ΔCFI Envs混合物免疫的豚鼠血清保持了其对于进化枝B病毒的中和(图7B)。因此，这三种Env质粒的混合物并没有转移进化枝B Env的免疫原性。此外，这些血清表现出了对几种非进化枝B病毒的适当水平的中和(图7B)。对每种非进化枝B病毒的两组(单进化枝对多进化枝)中值平均百分数通过非参数Mann Whitney测验进行了比较。
对于病毒分离物DJ263，ZA12，TV1和DU151的p值低于0.05。因此，对这些病毒而言，多进化枝血清引起的中和的广度明显大于单进化枝血清引起的中和的广度。需要注意的是，来自于进化枝B免疫豚鼠的血清能够中和几种具有V3环序列的进化枝B分离物，所述V3环序列在来自同源的BaL免疫原中各不相同。还观察到了进化枝B HIV BR07和HIV89.6的中和，尽管这两种病毒在所来自的HIV BaL中在V3区中分别有10个和8个氨基酸。此外，这种中和是V3介导的，因为其可被HIV BaLV3多肽所封闭，而来自Ebola GP的对照多肽则对其没有影响(图7C)。
为了测定抗V3抗体对病毒中和特异性贡献，采用HIV SF162进行了竞争性研究。之所以选择该进化枝B病毒，是因为其是可被来自进化枝B和多进化枝免疫血清的血清中和的相当敏感的原始分离物。所述HIVBaL V3多肽能够几乎完全的封闭进化枝B免疫血清的全部中和。因此，抗V3抗体极大地介导了HIV SF162的中和(图7D)。当HIV BaL V3多肽消除进化枝B诱导的中和时，用多进化枝包膜免疫的豚鼠血清对相同分离物进行的中和比用HIV BaL进化枝B V3多肽引起抑制的敏感性低得多，说明该中和是通过非V3抗体，或通过不和进化枝B BaL V3多肽竞争的V3抗体介导的。为了说明后一种可能性，我们使用匹配于疫苗株的进化枝A和进化枝C V3多肽进行了深入的竞争性研究，以无多肽或杂和V3多肽作为对照。进化枝A和C多肽，或A、B和C多肽组合的加入，在HIV SF162的中和中仅产生了微小的降低(图7E)。这些来自一只豚鼠的数据是每一组中全部四只豚鼠的的数据的代表。此外，进化枝A和C V3多肽能够封闭某些V3敏感的进化枝A和C病毒的中和。这一结果进一步支持了多进化枝免疫原诱导非V3依赖性中和抗体的观念。至于非进化枝B病毒的中和，所观察到的有限水平的中和使得难以进行V3竞争性研究，但这确是深入研究的课题。
讨论
根据CTL控制病毒血症的能力和对于HIV疾病进展的保护能力(Letvin，N.L.和Walker，B.D等人的综述，2003 Nat Med 9：861-6)，需要能够诱导强烈细胞介导免疫应答的有效AIDS疫苗。对这种高效且能诱导灭菌免疫的疫苗而言，其还有必要能够引起广泛的中和抗体。全世界有相当多样性的HIV株，其中≥90％都落在那些所谓的进化枝A、B和C的范围之内。出于这些原因，在本研究中，对编码来自这些进化枝的每一种代表性候选物的基于基因的疫苗进行分析，以了解其诱导中和抗体应答的能力。我们还表征了细胞介导的免疫应答，并且说明这些多进化枝疫苗能在小鼠中诱导对于多进化枝的Env-特异性的CD4和CD8免疫应答(参见下面的部分II)。在这里，我们发现这种多进化枝疫苗比单进化枝免疫原能够允许诱导具有更广泛反应性的抗体的天然构型Env的合成。
对于全功能性疫苗，必须产生对于来自这些进化枝的多种株的细胞和体液免疫反应。尽管保留了其刺激Env特异性CTL的能力，在此开发的基于前述Env修饰的候选物还是能够引起更强烈的抗体反应(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-68)。向进化枝A和C中引入这些ΔCFI突变，所述进化枝A和C保留了它们公知的中和抗体和CD4的反应性，以及形成三聚体的能力，由此保留了生理性相关的抗原表位(图6)。重要的是，所有三种Env构建体都是具有免疫原性的，与单进化枝免疫相比，我们并没有观察到抗原干扰。有意思的是，尽管单进化枝免疫诱导了可以与同源HIV BAL V3多肽竞争的中和活性，说明V3是引起中和抗体的主要表位，但用多进化枝Env免疫引起的抗血清却具有更广泛的反应性并且是较弱V3依赖的。因此，尽管对非进化枝B病毒的中和是相当有限的，该多进化枝疫苗途径也扩展了中和应答的广度。另一种使用广泛中和2F5抗体靶位的15个氨基酸线性表位的替换策略是较不成功的。该多肽序列是用来插入ΔCFI Env的V3区以增加其免疫原性。尽管引起了结合抗体，但这些抗体并不能中和病毒，说明2F5的其他互作才对病毒的中和有贡献。
考虑到HIV-1的流行性持续增加，已报道了数量不断增加的重组株(Kuiken.C.等人，2000 Human Retroviruses和AIDS 1999.Los Alamos，新墨西哥州：洛斯阿莫斯国家实验室)，这样的病毒持续地突变并且在整个感染中逃脱宿主的免疫应答(Barouch，D.H.等人，2002 Nature 415：335-9；Mortara，L.等人，1998 J Virol 72：1403-10)。基于偶发株的遗传相关性，关于用于候选疫苗株的选择有相当多的讨论(Korber，B.等人，2000Science 288：1789-96；Robertson，D.L.等人，2000 Science 288：55-6；Klausner，R.D.等人，2003 Science 300：2036-9)。尽管该选择仅在疫苗中使用单一Env免疫原的时候显得更加重要，但是当在疫苗中包括了主要进化枝的代表时其强迫性较弱。对用于本研究中的疫苗株而言，进化枝AEnv的氨基酸序列有86％是与祖先相比保守的，有87％是相同的进化枝A氨基酸序列，进化枝B的氨基酸序列有88％是与祖先相比保守的，有87％是相同的进化枝B序列，进化枝C的氨基酸序列有88％是与祖先相比保守的，有87％是进化枝C(hiv.lanl.gov)相同的。由此这些疫苗组分有理由代表来自主要进化枝指定的病毒。因为它们来自CCR5定向性分离物，所以有可能保留了与病毒感染相关的功能性表位，正如与中和抗体和CD4的结合所证实的(图6)。
多进化枝免疫应答启示我们可以帮助降低病毒从CTL和抗体逃脱的几率(Richman，D.D.等人，2003 PNAS USA 100：4144-9；Wei，X.等人，2003Nature 422：307-12)。
部分II多基因和进化枝HIV-1 DNA疫苗的免疫原性
摘要
引起来自不同株的人类免疫缺陷型病毒I型(HIV-1)基因产物谱的免疫应答的能力是AIDS疫苗所需要的特征。我们测定了表达来自不同进化枝的多种HIV-1基因质粒的组合在小鼠中引起体液和细胞免疫应答的能力。用修饰的Env、gp145ΔCFI与Gag-Pol-Nef融合蛋白质粒的组合进行免疫引起了类似于对任一单独载体免疫引起的CD4+和CD8+细胞应答。此外，当用来自三种进化枝A、B和C的Env的混合和Gag-Pol-Nef一起免疫小鼠时，CD4+和CD8+细胞应答对于所有病毒抗原的总的强度和平衡是类似的，同时仅注意到微小的差异。而且，与那些单独接种引起的抗体应答相比，质粒混合物也能引起抗体应答。这些发现说明，包括来自进化枝A、B，C Env的组分和Gag-Pol-Nef的多基因和多进化枝疫苗可以在不引起免疫干扰的情况下扩大抗病毒免疫应答。这些免疫原的组合提示可以帮助解决对于预期HIV-1疫苗病毒遗传多样性的问题。
引言
HIV-1的遗传变异对预防性AIDS疫苗的发展提出了挑战(van derGroen，G.等人，1998 AIDS Res Hmn Retroviruses 14 Suppl 3：S211-S221)(van der Groen，G.等人，1998 AIDS Res Hmn Retroviruses 14 Suppl 3：S211-S221)。不仅期望这些疫苗可以是安全的和具有免疫原性的，其必须能引起广谱的HIV分离物的免疫识别从而证明其高效性(Mascola，J.R.和Nabel，G..J 2001 Curr Opin lininunol 13：489-495)。尽管用亚型特异性和基于Gag或Env的HIV疫苗获得了一些进步(Bojak，A.等人，2002 Vaccine 201975-1979；Deml，L.等人，2001 J Virol 75：10991-11001；Srivastava，I.K.等人，2003 J Virol 77：2310-2320)，但替代的方法涉及对来自部分进化枝的多种病毒蛋白的利用，所述进化枝可以最大化病毒免疫应答的广度和强度。对于这些多价病毒疫苗的开发的未决问题在于是否这样的方法能够在没有交叉干扰的情况下引发对于个体基因产物的强烈免疫应答。似乎是因为在不同病毒抗原中的干扰，在先前的HIV疫苗研究中，有一些多价DNA疫苗方法可以诱导未达最佳标准的免疫应答(Kjerrstrom，A.等人，2001 Virology 284：46-61；Muthumani，K.等人，2002 Vaccine 20：1999-2003)。在该研究中，我们通过使用在之前多种不同疫苗研究中的应用的基于基因疫苗的技术对该问题做出了回答(Bonnet，M.C.等人，2000Immunol Lett 74：11-25；Moss，B.1996 PNAS USA 93：11341-11348；Nabel，G.J.2001 Nature 410：1002-1007；Ramsay，A.J.等人，1997 Immunol CellBiol 75：382-388)。
Env是体液和细胞免疫的主要靶点，而Gag，Pol和Nef的病毒基因则是CD8+免疫应答的潜在靶点。在保持其诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答下，HIV-1包膜(Env)的修饰形式，gp145ΔCFI表现出了改善的抗体应答。(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-5368)。Gag和Pol的融合蛋白已被用来从单个开放阅读框中生成蛋白，所述开放阅读框可被处理来提呈来自至少四种病毒基因产物的线性表位，这四种病毒基因产物是Gag，蛋白酶(PR)，反转录酶(RT)和整合酶(IN)(Huang，Y.等人，2001 J Virol 75：4947-4951)。为了确保pol区在体内不能行使功能，在PR，RT和IN中引入了3个点突变，称为Pol(ΔPR ΔRT ΔIN)。还包括了另一种病毒蛋白，Nef来扩展其广度，还生成了进化枝A、B和C的代表。
本研究评估了单独的Env和Gag-Pol-Nef候选疫苗及其组合的免疫原性。此外，还对来自不同进化枝分离物的这些免疫原的结合能力进行了评估。Gag-Pol-Nef和Env的组合引起了对于Env的强烈的CD8免疫，而并未包括CD4或抗体应答。此外，来自多个进化枝的Env组合可帮助扩展对这些可选进化枝的免疫应答。来自不同进化枝的多种HIV基因的组合预示着可以协助对多样性的HIV株产生免疫应答。
材料和方法
Gag-Pol-Nef免疫原
使用人类细胞期望的密码子通过逆翻译(Genetics Computer Group，Inc.，麦迪逊，威斯康星州)公开的序列合成了表达HIV基因的质粒。用于制备表达来自不同进化枝的HIV-1 Gag-Pol-Nef聚蛋白的DNA质粒的方法与之前描述的合成Gag-Pol的质粒的方法类似(Huang，Y.等人，2001J Virol 75：4947-4951)。为了进一步失活病毒蛋白，向蛋白酶(PR)、逆转录酶(RT)和整合酶(IN)中插入了其他的失活突变体。Nef蛋白的氨基酸序列没有经过修饰，但不提供其功能活性所需的NH2末端十四烷基化位点，因为其是作为融合蛋白合成的。进化枝A、B和C Gag-Pol-Nef质粒的核苷酸长度分别为9783，9790和9786，进化枝A、B和C Env质粒的核苷酸长度分别为6836，6869和6829。
如前所述(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-5368；Huang，Y.等人，2001 J Virol 75：4947-4951)，这些基因是通过制备25个碱基重叠的75碱基寡核苷酸或20个碱基重叠的60碱基寡核苷酸，用Pwo(Boehfinger Mannheim)和Turbo Pfu(Stratagene)聚合合成的。将所述cDNA克隆入表达载体pVR1012(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-5368；Yang Z等人，1998 Science 279：1034-1037)。使用在人类细胞中表达的优选密码子，可将来自适当HIV-1进化枝的每种Gag聚蛋白的蛋白序列用来构建所述gag基因(gag/h)的合成版本。所合成的gag/h基因包含了除了p1和p6(氨基酸433-500)之外的所有成熟的Gag蛋白。将来自进化枝A、B或C的合成gag/h基因与编码来自NL4-3 (GenBank登录号M19921)的氨基酸3-1003的密码子修饰的pol(pol/h)读框相连。为了进一步失活所述融合蛋白，在氨基酸553位插入(PR)突变(Arg到Gly)，在氨基酸771位插入逆转录酶(RT)突变(Asp到His)，并在氨基酸1209位插入整合酶(IN)突变(Asp到Ala)。通过PCR将基于NL4-3上氨基酸1-206位的合成的nef基因(nef/h)融合到pol/h的3’末端，从而产生了适当的Gag-Pol-Nef表达载体。
对进化枝A Gag-Pol-Nef融合蛋白而言，采用的是来自CCR5定向性进化枝A(GenBank登录号AF004885)的氨基酸1-432，并将其融合于上述的pol/h基因。在所有三种Gag-Pol-Nef质粒中，插入了相同的pol序列，因为这种病毒基因产物在不同的进化枝中在氨基酸水平上有超过90％是保守的。为了加入匹配的Nef开放阅读框，将pol中的终止密码子去除，通过PCR将合成的进化枝A nef/h(GenBank登录号AF069670)融合于pol/h的3’端，从而生成了进化枝A质粒，pVRC-4313。对进化枝BGag-Pol-Nef融合蛋白而言，采用的是来自CCR5定向性进化枝B(GenBank登录号K03455)的氨基酸1-432，并将其融合于上述的pol/h基因。为了加入进化枝B Nef蛋白，将Pol中的终止密码子去除，并融合于来自HIV-1 PV22(GenBank登录号K02083)的进化枝B合成的Neflh基因(氨基酸1到206)，从而生成了进化枝B质粒，pVRC-4306。对于进化枝C Gag-Pol-Nef融合蛋白而言，采用的是来自CCR5定向性进化枝C(GenBank登录号U52953)的氨基酸1-432，并融合于上述的pol/h基因。将Pol中的终止密码子去除，并融合于来自合成的进化枝C Nef/h(氨基酸1到206)(GenBank登录号U52953)，称为pVRC-4311。
可选择的进化枝Env质粒DNA
用于产生编码Env的DNA质粒的序列来自三种HIV-1 CCR5定向性病毒株，通过缺失融合区、剪接区和通过缩短七重复1(H1)和七重复2(H2)之间的间隔，可以对所述病毒株进行修饰从而降低其潜在的细胞毒性并提高其免疫原性，如同之前对进化枝B分离物所述得那样(Huang，Y.等人，2001 J Virol 75：4947-4951)。进化枝A Env聚蛋白(gp160)的合成蛋白序列来自于92rw020(R5定向性，GenBank登录号U51283)并称为进化枝A gp145ΔCFI/h。对所有Env表达载体在上游18核苷酸处插入了XbaI位点和公知的Kozak序列，并在ATG下游的1,912核苷酸创建了BamH1位点。将该片段克隆入pVR1012x/s位点的XbaI-BamH1位点。缺失来自氨基酸486-519的融合与剪接区以及来自氨基酸576-604的H1和H2之间的间隔。通过改变密码子以在人类细胞中更好表达，将来自HXB2(X4定向性，GenBank登录号K03455)的进化枝B Env糖蛋白(gp160)的蛋白序列用来构建该基因(X4gp160/h)的合成版本。虽然X4gp160/h的核酸序列与HXB2基因几乎没有同源性，但所编码的蛋白却与以下氨基酸替换相同：氨基酸53(Phe→Leu)，氨基酸94(Asn→Asp)，氨基酸192(Lys→Ser)，氨基酸215(Ile→Asn)，氨基酸224(Ala→Thr)，氨基酸346(Ala→Asp)和氨基酸470(Pro→Leu)。为了生成包膜糖蛋白(R5gp160/h)的R5定向性版本，用来自HIV-1 BaL株的对应区(GenBank登录号M68893，再次采用具有人类偏好的密码子)替换编码来自X4gp160/h的HIV-1包膜糖蛋白氨基酸205-361区。将来自pR5gp160/h包膜基因的全长CCR5定向性版本在氨基酸704的密码子后终止生成gp145/h。然后缺失来自氨基酸503-536的融合和剪接区以及来自氨基酸593-620的H1和H2之间的间隔。将来自97ZA012(R5定向性，GenBank登录号AF286227)的进化枝C Env聚蛋白(gp145ΔCFI)的蛋白序列用来构建该基因(进化枝C gp145ΔCFI/h)的合成版本，其缺失了来自氨基酸487-520的融合和剪接区以及来自氨基酸577-605的H1和H2之间的间隔。
免疫
在0天、14天和42天，小鼠在每条大腿上接受两次100μl的肌肉注射。在最后一次注射后10天，对小鼠采血并收集血清。然后将小鼠处死，摘除脾脏并通过细胞内细胞因子流式细胞计数(ICC)对脾细胞的CD4+和CD8+T细胞应答进行分析。
细胞内细胞因子流式细胞计数分析
通过用于伽吗干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的细胞内细胞因子流式细胞计数(ICC)对CD4+和CD8+T细胞应答进行了分析。这种敏感的分析已开发为研究对HIV-1的免疫应答(Dorrell，L.等人，2001 Eur JImmunol 31：1747-1756；Goepfert，P.A.等人，2000 J Viral 74：10249-10255；Maecker，H.T.等人，2001 J Immunol Methods 255：27-40；Migueles，S.A.和Connors，M.2001 Immunol Lett 79：141-150；Novitsky，V.等人，2001 J Virol 75：9210-9228)。将脾脏摘除，轻柔地匀浆成单细胞悬液，用PharMLyse(BD-Pharmingen)裂解红细胞，用培养基进行洗涤和在37℃用多肽池(每种多肽2.5μg/ml)刺激(107细胞/ml)1小时的条件下进行所述分析。所有用于该研究的多肽都是具有11氨基酸重叠的15寡肽，这11个氨基酸跨越了所述HIV或测试阴性对照蛋白的全部序列。为了共刺激，向培养基中加入(1μg/nl)抗CD28和抗CD49d抗体(分别为BD-Pharmingen 553294和553153)。一小时后，向所述培养基中加入(10μg/ml)布雷菲德菌素A(brefeldin A)(Sigma)，在保持5小时。在总共6小时之后，用FC封闭液(BD-Pharmingen)洗涤细胞并在冰上孵育15分钟，根据制造商手册，用Cytofix/Cytoperm(BD-Pharmingen)进行固定和渗透。然后用含有0.1％皂角苷(Sigma)的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，然后用针对CD3，CD4，CD8，IFN-γ和TNF-α(BD-Pharmingen)的指定的荧光标记的单克隆抗体在冰上染色20分钟。在用0.1％皂角苷的PBS洗涤之后，用荧光活化细胞分选(FACS)对所述细胞进行分析，从而测定在CD4+和CD8+细胞群中的IFN-γ和TNF-α阳性细胞，并且用FlowJo程序(Tree Star，Inc.)进行分析。
ELISA分析
为了测定针对不同进化枝的Env蛋白的抗体，以100μl雪滴花(Galanthus Nivalis)凝集素(Sigma，St.Louis，MO)(10μg/ml)4℃过夜包被酶联免疫分析(ELISA)板。将所述凝集素溶液移出所述小孔，用含有10％胎牛血清(FBS)的200μl PBS在室温封闭2小时。用含有0.2％TWEENTM-20的PBS(PBS-T)洗涤所述板两次，然后向每个空中加入100μl来自用pVRC5304(R5 gp140ΔCFI-进化枝-A)，pVRC2801(R5 gp140ΔCFI-进化枝-B)或pVRC5308(R5 gp140ΔCFI-进化枝-C)转染的细胞的上清液，然后将这些小孔在室温孵育1小时。用PBS-T洗涤所述板五次，然后以3倍稀释度将来自不同组的免疫小鼠的血清加入，保持1小时。用PBS-T洗涤所述板五次，加入100μl 1∶5,000稀释的二抗轭合的辣根过氧化酶(HRP)，将所述混合物孵育1小时，用PBS-T洗涤所述板五次。然后向每个小孔中加入100μl底物(Sigma Fast苯二铵二盐酸盐，目录号P-9187)，保持30分钟。通过加入100μl 1N H2SO4终止所述反应，在450nm测定所述光密度(OD)。
统计分析
对于列示于表1中较为简单的质粒组合，对三个处理组内的每个基因和进化枝组合的CD4+和CD8+应答率的总差异进行了Kruskal-Wallis检验，α为0.05。对两种组合检验(CD4+和CD8+应答)中的每一种，都是用Holm程序来调节对每种基因和进化枝组合以及不同比较的P值。如果对来自给定应答-基因-进化枝组合的Kruskal-Wallis检验的调节P值小于0.05的α，则对不同组合的所有三种可能配对(对照vs.ABC(x4)，对照vs.ABC(x6)，ABC(x4)Vs.ABC(x6))进行Wilcoxon检验。再次使用Holm程序来调节对不同比较的P值。所调节的P值小于0.05的α证实了显著性差异的存在。可以采用类似的方法对用Env和Gag-Pol-Nef质粒进行免疫的组间差异分析(图8)。
结果
类似于单独用质粒获得的结果，Env和Gag-Pol-Nef质粒的组合引起了针对Env和Gag的CD4+和CD8+应答
为了检测是否Env和Gag-Pol-Nef质粒的组合免疫能够提高或抑制抗原特异性应答，分析了针对Env的CD4，CD8和抗体应答。用单独的对照载体、含有作为填充DNA的对照载体的Env、含有作为填充DNA的对照载体Gag-Pol-Nef或具有Gag-Pol-Nef的Env对每组5只小鼠的4组小鼠进行了免疫。在最后一次DNA免疫之后10天，将动物处死，将脾细胞与重叠的Gag多肽池孵育。通过流式细胞术对刺激的CD4+或CD8+淋巴细胞中的细胞内IFN-γ和TNF-α表达进行了分析，并且计数阳性细胞。用单独的Gag-Pol-Nef和用Env和Gag-Pol-Nef组合免疫的小鼠的细胞都对Gag刺激产生相似的应答(图8A，左)。类似地，来自用单独的Env和用Env和Gag-Pol-Nef组合免疫的小鼠的白细胞也对Env多肽池的孵育产生类似的应答(图8A，右)。根据统计分析，CD4对Gag的应答在Gag-Pol-Nef组与Env和Gag-Pol-Nef组合的组中没有差异(P＝0.1746)。同样，CD4对Env的应答在Env组与Env和Gag-Pol-Nef组合的组中没有差异(P＝0.6905)。在CD8对Gag的应答的情况下，在Gag组与Env和Gag-Pol-Nef组合的组中没有差异(P＝1.0)，在CD8对Env的应答的情况下，在Env组与Env和Gag-Pol-Nef组合的组中没有差异(P＝1.0)。类似地，在两组中针对Env的抗体都表现出相似的滴度(图8B)。在所有四种稀释度中，抗体应答在Env组与Env和Gag-Pol-Nef组合的组中没有差异(P＞0.05)。这一结果说明质粒组合免疫不但没有引起免疫干扰，相反还导致了免疫应答广度的扩展。为了测定是否其他进化枝的加入也能够具有类似的免疫原性，对更多的复杂质粒组合进行了评价。
Env进化枝的组合和Gag-Pol-Nef的免疫引起了与单独进化枝免疫原所引起的相似的免疫应答
我们随后测定了是否包含多种Env免疫原的情况是否会影响免疫应答的广度和强度。采用阴性对照质粒、组合的Env和Gag-Pol-Nef(都来自进化枝B)、或含来自进化枝B的Gag-Pol-Nef的来自进化枝A、B和C的Env，称为ABC(x4)免疫小鼠。在ABC(x4)组中，三种Env蛋白的比例保持相等，所有Env蛋白与Gag-Pol-Nef蛋白的比例也保持不变(1∶1，重量/重量)。，组合的Env和Gag-Pol-Nef组与ABC(x4)组诱导CD4+和CD8+的应答类似于用进化枝B Env得到的结果(图9A)。虽然可以在组间观察到免疫应答的微小差异；但是通过流式分析，进化枝B和所述ABC(x4)都表现出了对进化枝B Env多肽刺激多肽的相当的CD4+和CD8+应答。对抗体应答而言，ABC(x4)表现出对化枝A Env刺激的可测量的应答，但是，正如所预期的，在不含有进化枝A Env的进化枝B免疫组中没有表现出来所述应答。更重要的是，类似于用ABC(x4)得到的结果，用进化枝B免疫原进行免疫产生对于进化枝B Env的滴度应答，再次说明多进化枝的混合物不会抑制对于单进化枝(B)Env组分的应答，无论所述免疫原的相对稀释度如何。无论ABC(x4)或单独的进化枝C Env都不能诱导高滴度的抗体应答，可能是因为在小鼠中缺乏高反应性的表位(图9B)。这些结果说明，向Gag-Pol-Nef中添加来自其他进化枝的多种Env蛋白并不会干扰T细胞或体液免疫，相反还扩大了免疫应答的广度。
多进化枝免疫原的不同组合的比较
我们随后对不同质粒组合引起的对多种免疫原的免疫应答进行了比较。用对照质粒和两种质粒的组合(表1)免疫小鼠，其中包括了6种质粒的组合，称为ABC(x6)，因为其包括了Gag，Nef和具有来自进化枝B的Pol的来自进化枝A、B和C的Env，或具有4种组分的ABC组，ABC (x4)，其中将来自进化枝B的Gag-Pol-Nef融合蛋白单独使用，而不是使用来自进化枝A和C的Gag-Pol-Nef蛋白。如上所述，所述三种Env进化枝在两种配方中都保持了相似的比例和数量，所有Env蛋白与所有Gag-Pol-Nef蛋白的比例也保持恒定(1∶1，重量/重量)。
表1在小鼠中对质粒组合进行分析的实验计划。
对质粒不同组合进行测验的实验设计，每组10只小鼠。
疫苗 质粒 数量
VR1012  1012  50μg
ABC×4  1012-A-gp145ΔCFI  8.3μg
 1012-B-gp145ΔCFI  8.3μg
 1012-C-gp145ΔCFI  8.3μg
 1012-B-gag-pol-nef  25μg
 ABC×6  1012-A-gp145ΔCFI  8.3μg
 1012-B-gp145ΔCFI  8.3μg
 1012-C-gp145ΔCFI  8.3μg
 1012-A-gag-pol-nef  8.3μg
 1012-B-gag-pol-nef  8.3μg
 1012-C-gag-pol-nef  8.3μg
两种质粒组合组都对来自进化枝B而不是来自其他进化枝(图10)和表2的Gag，Pol和Env具有相似的CD8应答。对ABC(x6)和ABC(x4)而言，对来自进化枝A和B的Gag产生的应答明显高于对照(pVR1012)的应答，但在两个处理组的应答比例之间的差异与这些进化枝中任意一种之间相比并没有显著性差异。对ABC(x6)和ABC(x4)而言，对来自进化枝B的Pol-1和Env产生的CD8+应答显著高于对照(pVR1012)的应答。但是仅对ABC(x6)(P＝0.0316)(图10C)和表2而言，对来自进化枝的Env的CD8+应答明显高于对照的应答。
表2对不同候选疫苗产生的T细胞和抗体应答的总结
  分析   疫苗     对各种成分的应答
  A-gag   B-gag   C-gag   A-env   B-env   C-env   B-pol-   B-pol-   A-nef   B-nef   C-nef
  ICCaCD4  ABC(x4)   + +   -   +   +   +   +   +    -   +   -
 ABC(x6)   +   +   +   +   +   ++   -   +    -   -   -
  ICCCD8  ABC(x4)   +   +   -   -   +   -   +   -    -   -   -
 ABC(x6)   +   +   +   +   +   -   +   -    -   -   -
  ELISAb   ABC(x4)   +   +   +
  ABC(x6)   +   +   +
a.对不同候选疫苗产生的CD4+和CD8+-T细胞应答。当Holm调节的Kruskal-Wallis检验给出总显著性差异时，都通过具有Holm调节的Wilcoxon检验对来自全部可能配对组的数据进行多重比较。-，与对照相比没有统计显著性差异(P＞0.05)；+，仅与对照相比具有统计显著性差异(P＜0.05)；++，与对照和所有其他处理组相比都具有统计显著性差异(P＝0.05)。
b.对不同候选疫苗的抗体应答。+，该组的平均抗体滴度高于1∶1,000。
与小鼠中的对照(pVR1012)质粒相比，ABC(x6)和ABC(x4)诱导了类似的CD4+应答。二者都能刺激对于来自进化枝A的Gag、来自进化枝B的Pol-2和来自进化枝A和B的Env的更高的CD4+应答(表2)。ABC(x6)引起了比对照(pVR1012)明显增高的对于进化枝C Gag(P＝0.0138)的CD4+应答，而对来自进化枝B的Nef和Pol-1而言，只有ABC(x4)能引起比对照显著增高的CD4+应答(对Nef而言，P＝0.0097；对Pol-1而言，P＝0.0054)。与ABC(x4)(P＝0.0418)相比，对ABC(x6)而言，对来自进化枝C的Env的CD4+应答要更高一些，尽管两组的应答都明显高于对照组的应答(pVR1012)(图11和表2)。ABC(x4)，而不是ABC(x6)表现出了对来自进化枝B的Nef的应答(表2)。综上，除了在特异性中的相对微小差异，ABC(x6)和ABC(x4)都能引起相当的细胞介导的免疫应答。在ABC(x4)、ABC(x6)和单进化枝免疫小鼠中对来自所有进化枝的Env产生的相似的抗体应答
采用凝集素捕获HIV-1 Env蛋白ELISA系统测定了来自ABC(x4)、ABC(x6)或单进化枝组的血清的抗体应答。来自两个检测组的血清表现出对所有三种进化枝的Env蛋白具有类似的应答(图11B)。ABC(x4)和ABC(x6)组的针对进化枝A Env蛋白的抗体滴度高于针对进化枝B和进化枝C Env蛋白的抗体滴度；然而，依照抗体应答的幅度，这两个组之间没有显著性差异。这一结果说明向ABC(x4)组中添加来自进化枝A和进化枝C的Gag和Nef免疫原不会干扰对来自进化枝B的Env的抗体应答。
讨论
高效AIDS疫苗的一个要求是需要诱导针对许多全世界范围内流行的HIV-1株的中和抗体和细胞免疫。在本研究中，我们评估了质粒DNA疫苗对来自其他病毒进化枝的HIV-1的多种基因产物引起的免疫应答。其目的在于引起对于来自不同进化枝的不同HIV基因的抗体应答和T细胞应答。之所以将Env，Gag，Pol和Nef选作靶点是因为它们代表了在病毒感染中的主要表达的蛋白。利用具有在剪切位点、融和区和在七重复区之间缺失的突变Env，因其具有引起更有力的体液免疫应答的能力，同时保留刺激Env特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的能力(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-5368)。
之前的多种研究已说明CTL对控制病毒血症和保护HIV疾病的发展有作用(Borrow，P.等人，1994 J Virol 68：6103-61 10；Jin，X.等人，1999 JExp Med 189：991-998；Klein，M.R.等人，1995 JExp Med 181：1365-1372；Koup，R.A.等人，1994 J Virol 68：4650-4655；Moss，P.A.H等人，1995PNAS USA 92：5773-5777；Musey，L.等人，1997 N Engl J Med 337：1267-1274；Ogg，G.S.等人，1998 Science 279：2103-2106；Rowland-Jones，S.L.等人，1998 J Clin Invest 102：1758-1765；Rowland-Jones，S.L.等人，1993 Lancet 341：860-861；Rowland-Jones，S.L.等人，1995 Nat Med 1：59-64；Schmitz，J.E.等人，1999 Science 283：857-860)。在I类MHC抗原上提呈的Gag，Pol，Nef和Env的加工形式可以作为识别和裂解HIV-1感染细胞的CTL的靶点，并通过这种方式有助于预防型疫苗的效率。如果T细胞应答足够强烈，则希望这些细胞能在病毒复制和在体内建立起传染的病原体库之前杀死HIV感染的细胞。对全面的疫苗而言，有必要引起与来自多进化枝的株反应的CTL。尽管用单进化枝免疫后会有一些交叉进化枝反应性(例如，Keating，S.M.等人，2002 AIDS Res Hum Retroviruses18：1067-1079)，但在这样的免疫应答中也有不一致的情况(例如，Dorrell，L.等人，2001 Eur J Immunol 31：1747-1756)。因此所希望的是在诱导交叉进化枝免疫的DNA疫苗中包括主要病毒族的代表。然而，对这种混合物的主要关注在于其是否会引起基因特异性免疫应答之间的干扰。对多种病毒基因的免疫应答之间的干扰在之前的鼠类HIV免疫研究中已有发现(Kjerrstrom，A.等人，2001 Virology 284：46-61；Muthumani，K.等人，2002Vaccine 20：1999-2003)。近来，对HIV DNA疫苗修饰的研究，包括病毒基因的不同组合，改变的RNA结构/密码子使用，和/或刺激性细胞因子基因，证明了在小鼠中更令人鼓舞的结果(zur Megede，J.等人，2003 J Virol77：6197-6207)。更重要的是，一些方法证明了在使用非人类灵长类动物感染研究中的可能性(Amara，R.R.等人，2001 Science 292：69-74；Barouch，D.H.等人，2000 Science 290：486-492；Kim，J.J.等人，2001 Virology 285：204-217；Letvin，N.L.2002 J Clin Invest 110：15-20；McKay，P.F.等人，2002 J Immnunol 168：332-337；Shiver，J.W等人，2002 Nature 415：331-335)，尽管很难达到对感染的全面保护。在本研究中将其他的修饰也包括在内从而对提高效率进行尝试。
当对Env和Gag-Pol-Nef的不同组合的免疫应答进行比较时，在两种质粒单独比较时，对进化枝B突变体Env质粒和Gag-Pol-Nef质粒混合时的体液和细胞应答没有降低(图8)。当复杂性升高到四种组分时，包括了来自三种进化枝的gp145ΔCFI和来自进化枝B的Gag-Pol-Nef，在对于其他进化枝的免疫应答增加的同时并未出现对B-env的体液应答的干扰。
当所述疫苗的复杂性升高到六种组分时，ABC(x6)，含如ABC(x4)组的来自不同进化枝的相同Env-gp145ΔCFI再加上来自进化枝A和C的Gag-Pol-Nef融合蛋白，可以见到微小的免疫原性差异。对Gag应答的分析说明ABC(x4)引起了对于进化枝A和B的CD4+和CD8+应答，而ABC(x6)提高了对于进化枝C Gag多肽的应答。在ABC(x4)中进化枝C Gag的CD4+和CD8+应答的缺乏有可能是由于进化枝A和C Gag的缺乏；然而，仅含有进化枝B Gag的ABC(x4)却可以引起对于进化枝A Gag的CD4+和CD8+应答，尽管其在氨基酸序列上仅有85％同源性。这一结果说明进化枝A和B Gag共用了某些普通的CD4+和CD8+表位，但却与小鼠中的进化枝C Gag具有更基本的区别。相比较而言，对于ABC(x4)和ABC(x6)之间的Env的CD4+和CD8+应答是类似的：两个组都引起了对于全部三种进化枝的相当的CD4+应答并产生了对于进化枝B Env的类似的CD8+应答。ABC(x6)还有到了对于来自进化枝A的Env的显著的CD8+应答。
对Pol应答而言，两个组都表现出对于来自进化枝B的Pol的CD4+和CD8+应答。所述ABC(x4)组引起了对于两种Pol多肽组合的CD4+应答，而ABC(x6)则刺激了仅对于两种Pol多肽池中的一种的CD4+应答(表2)。两个组都诱导了对于进化枝B pol的前一半的CD8+应答(图10B，左边)。对Nef而言，只有所述ABC(x4)组能够引起对于来自进化枝B的Nef的CD4+应答(表2)。较弱的抗Nef应答可能是因为Balb/c小鼠不能识别Nef表位，因为其它小组报道了在其他小鼠品系中Nef具有较高的免疫原性(Kjerrstrom，A.等人，2001 Virology 284：46-61).。
此外，我们试图测定对于多基因的CD4+和CD8+T细胞应答是否能够影响体液应答。在不同组中的ELISA滴度之间没有显著性差异(如表2所总结)。所有组都表现出对于来自进化枝A、B和C的Env蛋白的类似抗体滴度(图11B)。这些数据说明在抗体应答中Env的不同进化枝之间的没有干扰。同样重要的是，在体液应答和细胞应答之间在不同病毒基因中也没有干扰。
综上，所述ABC(x4)疫苗体系能够诱导对于来自不同进化枝的病毒抗原的几乎全部和平衡的CD4+和CD8+T细胞应答。这里的结果说明多基因HIV-1 DNA疫苗是具有可行性的，因为当相互结合时，对单独基因的免疫应答不会引起干扰。由于HIV-1的流行持续增长，对病毒变异性的关注也在逐渐的成为难以解决的问题。虽然仅有几种HIV-1亚型在世界的不同地区具有优势，最近也报道了数量正在增加的重组株(Kuiken，C.等人，2000.Human Retroviruses and AIDS 1999.洛斯阿莫斯国家实验室，洛斯阿莫斯，新墨西哥州)。这样的病毒会在感染的不同阶段持续的突变和逃脱(Barouch，D.H.等人，2002 Nature 415：335-339；Mortara，L.等人，1998 J Virol 72：1403-1410)。多表位和多进化枝免疫应答可以帮助降低病毒逃脱的可能性。在本研究中表现出的数据由此指导了对于HIV多样株的改善的疫苗的开发。
部分III可变环的选择性修饰改变了定向性并提高了HIV-1包膜的免疫原性
摘要
尽管HIV-1包膜(Env)的B进化枝包括了五种高变区，但这些区中的每一种都包含保持保守的序列亚组。对V3环引起中和抗体的能力进行了众多研究，所述中和抗体通常限制于有限数量的紧密相关的株，也可能是因为大量的抗原结构是从该区的多种氨基酸序列生成的。虽然这些株特异性的决定子，V3的亚区是高度保守的，且并未描绘Env定向性上的V3环的不同部分的效果和免疫原性。在本研究中，通过缩短V3环的茎向V3引入了选择性缺失。这些突变是在具有选择性V区的突变组合中产生的。V3茎的渐进性缩短破坏了HIV Env的免疫原性及其功能活性；然而，在V3茎的双臂上的两处小缺失改变了双定向性89.6P病毒株的定向性从而仅感染了CXCR4+细胞。当这样较小的缺失与V1和V2环的去除组合并用作豚鼠中的免疫原时，所述抗血清可以以较高的能力中和多种独立的进化枝B分离物。这些发现说明V3之中的高度保守亚区是引起中和抗体应答、影响HIV定向性和提高AIDS疫苗免疫原性的相关靶点。
引言
在HIV用来避免免疫识别和抗体中和的机理中，包膜的可变区在规避中具有重要的作用。所述包膜蛋白利用了多种机理来规避检测，包括分离物之间的糖修饰、构象适应性和遗传变异性(Burns，D.P.和Desrosiers，R.C.1994 Curr Top Microbiol Immnunol 188：185-219；Burton，D.R.2002Nat Rev Immunol 2：706-713；Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-5368；Gorny，M.K.等人，2002 J Virol 76：9035-9045；Kwong，P.D.等人，2002 Nature 420：678-682；Wei，X.等人，2003 Nature 422：307-312)。所述病毒Env蛋白的特异性片段的遗传多样性产生该区的变异性。这些区能够封闭对CD4结合区，及趋化因子受体结合位点的到达，此外还影响病毒中和的敏感性，并且负责中和抗体的株特异性(Guillon，C.等人，2002 J Virol 76：2827-2834；Parren，P.W.H.I.等人，1999 AIDS 13：S137-S162；Wyatt，R.和Sodroski，J.1998 Science 280：1884-1888)。尽管已通过在其他分离物中的遗传差异对所述可变区进行了定义，但很清楚的是在所述V环内的亚区表现出了某种程度的保守性。作为V3环的末端，在这样的区中这种序列同源性尤其明显(Korber，B.T.等人，1994 J Virol68：7467-7481)。也在多种病毒株中鉴定了其他基序(motif)。例如，特异性N-连接糖基化位点和邻近V3环底部的序列是相当保守的(Korber，B.T.等人，1994 J Virol 68：7467-7481)。在本研究中，我们更详细探索了所述可变区精细特异性。特别地，根据推测的茎结构对病毒定向性和免疫原性的贡献，我们对V3环进行了检测。我们发现，缩短所述V3环茎的特异突变可以改表HIV包膜的定向性。这一突变，以及与V1和V2环缺失的组合，进一步提高了所述包膜引起中和抗体应答的能力。
材料和方法
抗体
抗HIV-1人单克隆抗体2F5(Purtscher，M.等人，1996 AIDS 10：587-593)和人HIV免疫球蛋白G(IgG)来自国立卫生院(NIH)AIDS研究和参考试剂项目，AIDS分部，NIAID，NIH。抗HIV p24抗体KC57-RD1来自Beckman Coulter公司。
细胞和病毒储存物
人胚胎肾细胞293购买自ATCC，并保存于含有10％胎牛血清(FBS)和100μg/ml青霉素/链霉素的DMEM培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。人T细胞白血病细胞系MT-2和HeLa衍生细胞系MAGI-CCR5来自AIDS研究和参考试剂项目，AIDS分部，NIAID，国立卫生院。
HIV-1分离物(ADA，JRCSF，JRFL，Bal，SF162和89.6)来自AIDS研究和参考试剂项目，AIDS分部，NIAID，国立卫生院。原始分离物6101(之前称为P15)和1168来自杜克大学(Duke University)的David Montefiori(Bures，R.等人，2000 AIDS Res Hum Retroviruses 16：2019-2035)。所述病毒通过在植物血球凝集素(PHA)和白细胞介素(IL-2)刺激的外周血单核细胞(PBMC)中生长扩增2或3个循环。为了制备工作储存病毒，以107细胞/ml的浓度将PBMC暴露于未稀释的病毒2小时。然后加入IL-2培养液使浓度为106细胞/ml。每两天更换所述IL-2培养液，在p24表达的高峰期间收集上清液，通常是感染后的5-10天。在1,000xg离心和通过0.45μm孔径过滤器的过滤，使得所述病毒储存物不含有细胞。在某些情况下，可根据制造商的指导，使用100-kDa排阻聚醚砜过滤器(CentriconPlus Biomax filter，Millipore，Bedford，MA)将病毒储存物浓缩10倍。将病毒的等分试样储存于液氮的气相中。病毒BL01和BR07是由Dana-Farber癌症研究所的Dana Gabuzda提供的。这两种病毒都是HIV株NL4-3的嵌合感染性分子克隆，其含有来自原始HIV-1分离物的全长env基因(Ohagen，A.等人，2003 J Virol 77：12336-12345)。在初次用质粒转染293细胞之后，如上所述将这些病毒在PBMC中进行扩增。
慢病毒载体的浮力密度梯度分析
在含DMEM培养液的100mm直径的组织培养皿中用3μg每种相关的Gag和Env表达载体对293T细胞(3×106)进行转染。三天后，收集细胞的上清液，并与60％OptiPrep(碘克沙醇)(iodixanol)培养液(Invitrogen)混合；通过在VTI50转头中以45,000xg离心6小时将OptiPrep的终浓度调解为30％密度梯度(根据制造商指南进行操作；Invitrogen)，根据所指定的浓度收集每一种组分。在十二烷基磺酸钠的浓度为4-15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(4-15％SDS-PAGE)中分离慢病毒载体蛋白，然后转移至Immobilon-P膜上，再进行杂交检测Gag(人HIV IgG，以1∶5,000使用)和Env(人HIV IgG，1∶5,000使用)的表达。
重组腺病毒的构建
如前所述，构建了表达gp140(ΔCFI)的不同V环缺失的基于腺病毒5型(Ad5)的第一代(ΔE1，ΔE3)重组腺病毒(Aoki，K.等人，1999 Mol Med 5：224-231)。简言之，通过使用Cre重组酶(Novagen，Madison，WI)，将PacI-线性化的含有gp140(ΔCFI)的V环缺失与携带有Ad5基因组DNA右侧的粘粒进行重组。将所得重组子用乙醇沉淀，溶解于Tris-EDTA并对293细胞进行转染。根据转染后10-14天基于菌斑的形成，可以观察到重组腺病毒。将病毒扩增，用CsCl梯度纯化两次，并保存于-20℃的PBS+15％甘油中。
假型慢病毒的制备
根据已公开的方法(Naldini，L等人，1996 Science 272：263-267)制备了具有HIV gp160(89.6P)及其V3缺失突变体的HIV-Luc假型的。简言之，通过使用磷酸钙，将包装载体pMD 8.2，pHR-荧光素酶和包膜表达载体瞬时转染至293T细胞中。转染后48和72小时分别收集上清液，过滤后保存与-80℃。采用测定所述p24抗原(Coulter)的ELISA分析病毒浓度。将等量的所述病毒加入MT-2(X4定向性的)和MAGI-CCR5(R5定向性的)细胞，将所述细胞在37℃孵育2小时。转染48小时后收集所述细胞，并在细胞培养裂解缓冲液(Promega，Madison，威斯康星)中进行裂解。根据制造商的推荐方法(Promega，Madison，威斯康星)进行荧光素酶分析。
质粒构建
之前已对质粒pVRC1012-gp140(ΔCFI)(HXB2/BaL嵌合体)和pVRC1012-gp145(ΔCFI)(HXB2/BaL嵌合体)进行过描述(Chakrabarti，B.K等人，2002 J Virol 76：5357-5368)。为了制备gp140(ΔCFI)(ΔV1V2)和gp145(ΔCFI)(ΔV1V2)，使用引物5′-CCTCTAGACACCATGCGCGTGAAGGAGAAG-3′(SEQ ID NO：15)和5′-CCGCTAGCGTCGGTGCACTTCAGGCTCACGCACAGGGG-3′(SEQ ID NO：16)用PCR扩增了包括ATG和V1环边界的XbaI/NheI片段，并使用引物5′-CCGCTAGCACCAGCTGCAACACCAGCGTGATCACCCAG-3′(SEQ1：D NO：17)和5′-GGTGCAGGGGCCCTTGCCGTTGAACTTCTT-3′(SEQ ID NO：18)用PCR扩增了包括V2环3’边界和C3区的NheI/ApaI片段。将所述XbaI/NheI-和NheI/ApaI-消化的PCR片段克隆至XbaI/ApaI-消化的pVRC1012-gp140(ΔCFI)和pVRC1012-gp145(ΔCFI)上。所得质粒pVRC1012-gp140(ΔCFI)(ΔV1V2)和pVRC1012-gp145(ΔCFI)(ΔV1V2)具有V1和V2环的缺失，即CTDASTSC(SEQ ID NO：19)。由于NheI位点的引入，产生了两个额外的氨基酸(AS)。类似的方法可用来制备gp145DCFI(HXB2/BaL嵌合体)和gp140ΔCFI(HXB2/BaL嵌合体)的V环缺失突变体。缺失的V环的氨基酸序列为：ΔV1，CTDASKNC(SEQ ID NO：34)；ΔV2，CSFASTSC(SEQ ID NO：35)；ΔV3，CTRASAHC(SEQ ID NO：36)和ΔV4，CNSASLPC(SEQ ID NO：37)。
可根据制造商的指南，使用基于PCR的快速改变(Stratagene，La Jolla，加拿大)方法制备V3缺失突变体。采用双株测序对每一个突变体进行确认。用pVRC1012-gp140(ΔCFI)(ΔV1V2)和pVRC1012-gp145(ΔCFI)(ΔV1V2)中对应的片段，对含有每种确认V3缺失突变的ApaI/SexAI片段进行交换。使用人类优选的密码子人工合成编码gp160(89.6P)的cDNA(Karlsson，G.B等人，1997 J Virol 71：4218-4225)。类似地制备了表达gp160(89.6P)不同V3缺失突变体的质粒，如图12所示。每种V3突变体的详细描述可见于图13A。
ELISA分析
采用修饰的凝集素捕获方法测定了豚鼠的抗HIV gh140(ΔCFI)ELISA滴度。简言之，以100μl雪滴花(Galanthus Nivalis)凝集素(Sigma，St.Louis，MO)(10μg/ml PBS)/孔在4℃过夜包被Immunon 2HB ELISA板(Thermo Labsystems，Franklin，MA)。用含有10％FBS的200μl PBS在室温封闭2小时，然后用含有0.2％TWEENTM-20的PBS(PBS-T)洗涤两次。向每个孔中加入100μl来自pVRC1012-gp140(ΔCFI)转染的293细胞的组织培养上清液，并在室温孵育1小时。用PBS-T洗涤所述板五次。然后重复三次加入溶于PBS的含有1％FBS的豚鼠免疫血清的连续稀释液100μl，并在室温孵育1小时。用PBS-T洗涤五次之后，向每个孔中加入100μl辣根过氧化酶(HRP)轭合的F(ab)’2驴抗豚鼠IgG(1∶5,000)(JacksonImmunoResearch Labaroatories，West Grove，PA)的PBS溶液+1％FBS，室温孵育1小时。用PBS-T洗涤所述板五次，加入100μl苯二铵二盐酸盐(phenylenediamine dihydrochloride)(Sigma，St.Louis，MO)(20ml水中的一个金色和一个银色的片)进行显色，在室温孵育30分钟。通过向每个孔中加入100μl 1N H2SO4终止所述反应。采用SPECTRAmax读板器(Molecular Devices，Synnyvale，加利福尼亚州)在450nm测定所述读数。通过挑取高于免疫前血清1∶100稀释度的读数计算所述终点稀释度。
中和分析
之前已对单轮细胞内p24-抗原流式细胞术HIV-1中和分析进行过描述(Mascola，J.R.等人，2002 J Virol 76：4810-4821)。简言之，将40μl病毒储存液与10μl热灭活的豚鼠免疫血清(感染多样性约为0.1)孵育。在37℃孵育30分钟后，向每个孔中加入20μl PBMC(1.5×105细胞)。PBMC保存于含有1μM茚地那韦(indinavir)的IL-2培养基中，所述细胞在第一天就用150μl含有茚地那韦的IL-2培养基饲喂。感染后一天，用KC57抗p-24抗体对细胞进行细胞内p-24抗原染色，然后通过流式细胞术定量HIV-感染的细胞。中和百分数定义为与对应免疫前血清孵育的孔的细胞数比较，p-24阳性细胞数的减少数。
为了获得50％抑制浓度(IC50)和IC80数据，如上所述将抗血清的连续稀释物与病毒孵育。抗血清剂量应答曲线用非线性方程拟和，通过最小二乘回归分析对中和50％和80％病毒(分别为IC50和IC80)的抑制稀释度进行计算。使用无参数的Mann-Whitney阶序检验(GraphPad Prism softwarepackage V3.0，GraphPad Software Inc.，San Diego，加利福尼亚州)对IC50滴度进行统计分析。
接种
在0周，2周和6周，用500μg(溶于400μl PBS)的gp145版本的质粒DNA对豚鼠进行肌肉内免疫。在14周，用表达所对应gp140蛋白版本的1011(溶于400μl PBS)重组腺病毒颗粒对所述豚鼠进行加强。在-2周和16周采集血清，分成等份并冻存于-20℃。
Western印记
根据制造商的指南(Invitrogen)，通过磷酸钙方法用表达每种免疫原的质粒DNA转化293细胞。转染后48小时收获细胞，用PBS洗一次，重悬于裂解缓冲液(50mM HEPES pH 7.0，150 mM NaCl，1％NP-40，1x蛋白酶抑制剂混合物)中，并在冰上孵育45分钟。将所得细胞裂解物在4℃，14,000rpm离心10分钟。收集上清液，测定蛋白含量。将20μg蛋白与2x样本上样缓冲液(100mM Tris，4％SDS，20％甘油，5％2-巯基乙醇，0.2％溴酚蓝)混合，煮沸5分钟。将所述样本用4％-15％梯度的SDS-PAGE进行分离，然后转移到硝酸纤维素膜上(Bio-Rad，Hercules，CA)。用含有0.3％TWEENTM-20，5％脱脂奶和1％牛血清白蛋白(BSA)的Tris缓冲盐水(TBS)在室温保持10分钟对所述膜进行封闭，共两次，然后在室温与溶于封闭缓冲液的2F5抗体(1∶2,500)孵育1小时。用含有0.3％TWEENTM-20的100ml TBS将所述膜洗涤两次，然后再与HRP-轭合的羊抗人IgG(Chemicon，Temecula，CA)(1∶5,000)在室温孵育30分钟。用100ml洗涤缓冲液洗涤两次之后，使用ECL Western杂交检测试剂(Amersham，Piscataway，新泽西州)对所述膜进行显色，用Hyperfilm ECL(Amersham，Piscataway，新泽西州)进行曝光。
结果
V区突变体的表达
为了提高Env引起抗体应答的能力，之前已有关于对HIV包膜的三个区、剪接位点、融合多肽和螺旋间卷曲的卷曲结构域(ΔCFI)的修饰(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-5368)说明。我们对不同V区或通过对V3的选择性修饰评估了其他的突变(图12)。在gp145ΔCFI(HXB2/BaL嵌合体)和gp140ΔCFI(HXB2/BaL嵌合体)中进行了内部的V3环缺失，并将其分别插入到DNA表达载体中进行初次免疫和插入腺病毒载体中进行加强。将这一系列突变引入株89.6P的Env(图13A)，这是一种二元定向性病毒，在功能性的假型化分析中首先对其进行分析，从而了解不同趋化因子受体对定向性的作用。通过Western印记分析对这些渐进性V3区缺失的表达进行分析。在用这些表达载体转染的293T细胞的细胞裂解液中检测到了所期望分子量的免疫反应性蛋白(图13B)。同样也向具有V1和V2区缺失的gp145ΔCFI(HX32/BaL嵌合体)中引入这些相同的突变，并且验证了蛋白表达(图13C)。
V3区突变体对Env功能的影响
为了评估V3区中渐进性缺失的作用，使用编码荧光素报道基因的HIV载体对89.6P Env突变体介导病毒进入的能力进行了分析。通过浮力密度离心验证了这些V3变异体整合入假型慢病毒的能力(图14A、14B)。因为这种Env是双定向性的，所以对CXCR4+细胞系、MT-2和CCR5+指示细胞细胞系、MAGI-CCR5进行了测定。虽然所述V3区的较长缺失阻止了89.6Env的功能，但在V3环的每一侧都缺失了三个氨基酸的最小缺失，称为1AB，却保留了Env感染CXCR4靶细胞、MT-2的能力(图14C，左边)。相比较而言，即使是V3环最小的缺失也阻止了其感染MAGI-CCR5细胞的能力(图14C，右边)。这些数据说明V3环或缺失的氨基酸的长度在确定对于其他趋化因子受体的定向性中具有重要的作用，而这种Env的CCR5定向性比CXCR4定向性更加敏感。
V区突变对免疫原性的影响
为了评估这些或其他V区突变对引起中和抗体应答的影响，对单独的或与V1-V4的组合的gp145ΔCFI(HXB2/BaL嵌合体)和gp140ΔCFI(HXB2/BaL嵌合体)中不同V区进行了缺失。通过Western印记，所述突变体的表达显示了类似的蛋白水平(图15A)。通过用DNA/ADV对豚鼠进行免疫，对这些V区突变体引起中和抗体的能力进行了评估。特异性V区的消除，尤其是V1和V3，或V1和V4的组合，显著地降低了它们诱导中和抗体应答的能力。相比较而言，包括V1和V2的具有特异性组合缺失的载体，增加了对于HIVBaL的中和抗体应答(图15B)。通过在更多的实验中使用9种其他的原始HIV-1分离物，对V1V2缺失构建体的增加的效价进行了验证；这些数据强烈地说明，这样的缺失构建体提供了比图15B中的其他构建体更好的免疫原性。基于这些分析，在V1V2缺失构建体和gp145ΔCFI包膜突变体中制备了其他的V3区突变。当对HIVBaL进行检测时，与野生型gp145相比，gp145ΔCFI免疫原引起了增加的中和，但并未达到统计显著性(图15B和16A)。之所以在图16A中看到对于V1V2 gp145 ΔCFI的较不显著的应答，是因为在四只动物一组中的单个的无应答物。在图16A中gp145ΔCFI的实际值为47、60、51和53％，而对V1V2 gp145ΔCFIΔ的实际值则为16、71、62和77％。然而，我们在众多的其他实验中确认了ΔV1V2突变体的提高的免疫原性。当在V1V2gp145ΔCFIΔ免疫原中包括1AB突变时，可以见到进一步的增加。当对V3区进行较大的缺失时，则它们较不成功地引起了中和抗体应答。相比较而言，正如通过ELISA终点有限稀释分析所测定的，所有突变体都能引起相当的抗体应答(图16B)。
V1V2和V3(1AB)缺失的比较中和情况
为了测定这些突变对中和广度和效价的影响，用选定的gp145 DNA突变体免疫豚鼠，然后用包括野生型、ΔCFI或ΔV1V2V3(1AB)ΔCFI突变的gp140腺病毒载体进行加强。对这些修饰的Env引起中和抗体应答的能力进行了比较。为了比较所述中和抗体应答的效价，将豚鼠血清的的连续稀释物对四种主要病毒(BaL，JRCSF，89.6和SF162)进行了测定，并计算了相应的IC50值。在所述修饰的Env免疫原中，ΔV1V2V3(1AB)ΔCFI突变体是抑制这四种分离物中最有效的突变体。与野生型相比，该构建体的中值IC50在统计学上高于两种病毒(对JRCSF和89.6而言，P＝0.03)，并接近于一种病毒的显著性(对BaL而言，P＝0.06)(图17A)。通过这一最佳免疫原引起的抗血清，将ΔV1V2V3(1AB)ΔCFI对十种原始HIV-1分离物的板进行了测定。该抗血清表现出对于多种HIV-1不相干株的反应性。通过1∶5稀释的豚鼠血清适当地或强烈地中和了十种病毒中的五种。三种病毒(ADA，6101和BL01)未达到50％中和，且四种豚鼠血清中的一种对两种病毒以较低水平(50％-60％)进行了中和，因此，该免疫原的广度依然是有限的。
讨论
在本研究中，我们测定了不同V区突变改变HIV包膜免疫原的能力。之前我们已证明，在剪接位点、融合结构域和螺旋间卷曲的卷曲区中的突变能够通过提高Env疫苗引起中和抗体应答的能力来增强其免疫原性(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol 76：5357-5368)。尽管观察到了具有ΔCFI突变能够具有引起针对Env的抗体的增强的能力，但所述增强在中和抗体中并不显著。本研究的目的在于通过对包括其他修饰以及对多种V区和V3亚区进行系统性贡献评估来提高中和应答的效价和扩展中和应答的广度。V3区中的缩短明显的改变了HIV89.6P Env的功能性质。在所述环的每个对侧超过三个氨基酸、总共超过6个氨基酸的突变破坏了CXCR4以及CCR5定向性病毒的功能。相反，较小的1AB缩短消除了这种包膜的CCR5定向性活性，却保留了其将CXCR4+细胞作为靶点的能力。当在豚鼠中用DNA引发和腺病毒加强对1AB突变引起中和抗体的能力进行评估之后，该突变似乎对该应答具有最高的效率。正如在gp140/145ΔCFI背景中所未观察到的，这样的影响需要其他的VI和V2缺失。在对不同免疫原的效价进行比较之后，对十种代表性进化枝B病毒分离物测定了最佳候选物的广度。该抗血清的广度有所增加，具有较高的IC50滴度和针对不同HIV分离物的增加的反应性(图17)。
此前的研究说明在多种分离物中V3的亚区是保守的并且能影响Env的功能。这样的保守在该区的特异序列中是很明显的，例如V3的末端(Korber，B.T.等人，1994 J Virol 68：7467-7481)。虽然已证明所述V3区会影响HIV对于趋化因子受体的定向性(Briggs，D.R.等人，2000 AIDS 14：2937-2939)，但之前还没有认识到在V3环中渐进性缺失的影响及其对于CXCR4靶向作用的选择性影响。近来，已证明保守的构象决定簇存在于不同分离物的V3环中，所述分离物具有对中和抗体的相似敏感性(Gorny，M.K.等人，1997 J Immunol 159：5114-5122；Krachmarov，C.P.等人，2001AIDSRes Hum Retroviruses 17：1737-1748；Schreiber，M.等人，1997 J Virol71：9198-9205)。例如，单克隆抗体447-52D和相关V3单克隆抗体对具有不同V3序列的不同株的抑制能力说明遗传不同的株可能具有共同的决定子(Gorny，M.K.等人，1997 J Immunol 159：5114-5122；8)。在本研究中，V1V2突变体提高的免疫原性说明在HIVBal中可以通过V1和V2屏蔽V3环。在之前的研究中，V2区的缺失说明了对抗体应答的提高(Srivastava，I.K.等人，2003 J Virol 77：2310-2320)，但并不能确定类似机理能够解释与V3部分缺失组合的不同株中的那些影响和所注意到的观察结果，因为在V3中的其他V1缺失和1AB突变进一步提高了其免疫原性。该应答增加的广度说明即使没有在全部的病毒中，也在进化枝B病毒中分享了共用的抗原决定子。综合起来，这些保守区反映了在不同病毒之间存在的功能需求和结构同源性。因此，V3决定子家族意味着其可作为扩展所述中和抗体应答广度的靶点。
部分IV在恒河猴中异源包膜免疫原对AIDS疫苗保护的贡献
摘要
因为还没有发现引发广泛中和的抗人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)抗体的策略，所以也并未对HIV-1候选疫苗中Env免疫原的作用进行定义。我们寻求确定来自刺激病毒Env的遗传各异的HIV-1 Env免疫原是否能够对保护性免疫有所贡献。我们用Gag-Pol-Nef免疫原单独或与所感染的病毒匹配或不匹配的Env免疫原组合对印度源的恒河猴进行了接种。然后用病原性猿-人免疫缺陷型病毒对这些动物进行感染。所述疫苗体系包括质粒DNA引发和复制缺乏的腺病毒载体加强。与不包括Env免疫原的相当体系相比，包括匹配或不匹配Env免疫原的疫苗体系具有对CD4+T淋巴细胞损失更好的保护。这种在保护性免疫中的增加与在病毒感染后早期发展的记忆性Env特异性细胞免疫相关。尽管在这些Env免疫原中存在显著的序列多样性，这些数据说明对Env的T淋巴细胞免疫可以扩展对HIV的保护型细胞免疫应答，并且对这一AIDS疫苗模型中的免疫保护有所帮助。
引言
世界范围内人免疫缺陷型病毒(HIV)分离物中包膜(Env)蛋白的多样性对有效AIDS疫苗的开发构成了挑战。为HIV感染提供保护的传统疫苗策略的失败，源于或至少部分地源于Env的遗传杂合性(Letvin，N.L.等人，2002 Annu Rev Immunol 20：73-99)。Env的多样性是与引起中和多种HIV分离物的抗体应答相关问题的根源(Mascola，J.R.2003 Curr MolMed3：209-216)。这种多样性也造成了在识别遗传各异的病毒的接种过程中产生T淋巴细胞应答的困难(Letvin，N.L.等人，2002 Annu Rev Immunol20：73-99)。实际上，与Env多样向相关的问题已经在候选HIV疫苗中引发了包括Env免疫原的利用的问题。
非人类灵长类是进行HIV疫苗策略评估的有力模型。对恒河猴的实验已经提供了在控制AIDS病毒复制中细胞免疫关键贡献的证据(Jin，X.等人，1999 J Exp Med 189：991-998；Schmitz，J.E.等人，1999 Science 283：857-860)，并说明了即使当这些疫苗不能对具有AIDS病毒分离物的感染提供明显的保护时，这些疫苗也具有对疾病的临床过程具有改善的能力(Barouch，D.H.等人，2000 Science 290：486-492；Amara，R.R.等人，2001Science 292：69-74)。此外，进入早期人类临床试验的多种疫苗形态的标准来自于对非人类灵长类的研究(Letvin，N.L.等人，1997 PNAS USA 94：9378-9383；Shiver，J.W.等人，2002 Nature 415：331-335)。
最近对非人类灵长类的研究说明疫苗引起的Env特异性免疫应答可以对猿免疫缺陷性病毒(SIV)和猿-人免疫缺陷性病毒(SHIV)的复制有所贡献(Amara，R.R.等人，2002 J Virol 76：6138-6146；Ourmanov，1.等人，2000 J Virol 74：2740-275；Polacino，P.等人，1999 J Virol 73：618-630；Polacino，P.S.等人，1999 J Virol 73：8201-8215)。然而，在用遗传匹配的免疫原的包膜和感染病毒进行的实验，产生了关于这些观察的实际相关性的问题。本研究是在SHIV-恒河猴模型中开始的，从而评估了针对HIV疫苗的质粒DNA引发重组子复制缺陷性腺病毒(ADV)加强免疫策略。此外，还进行了这些实验从而评估对来自感染病毒遗传差异体的包膜免疫原的预防的贡献。在这些研究中的发现证明了这一疫苗系统的效价，并且说明针对Env的T淋巴细胞免疫能够扩展独立于所述Env免疫原的序列的AIDS病毒分离物的细胞免疫应答。
材料与方法
抗体结合与中和分析
如前所述，通过酶联免疫吸附剂分析对HIV-1 gp120-特异性接合抗体进行定量(Crawford，J.M.等人，1999 J Virol 73：10199-10207)。用BaL-gp120(Quality Biological，Inc.，Gaithersburg，马里兰州)、IIIB-gp120(Advanced Biotechnologies，Inc.，Columbia，马里兰州)或KB9-gp120(由过敏和传染病国立研究院的Patricia Earl惠赠，Bethesda，马里兰州)包被免疫板(Immunoplates)(MaxiSorb F96)(Nunc，Roskilde，丹麦)。使用碱性磷酸盐轭合的羊抗猴免疫球蛋白G(IgG)(全分子；Sigma Chemical Co，St.Louis，密苏里州)完成了抗体测定。如前所述，在MT-2细胞中对中和抗体进行测定(Crawford，J.M.等人，1999 J Virol 73：10199-10207)。简言之，向150μl生长培养基中的多种检测血浆稀释物中加入含有500 50％组织培养物感染剂量且生长于人外周血单核细胞(PBMC)中的50μl无细胞的SHIV-89.6P病毒，重复三次。在加入5×104 MT-2细胞之前将这些混合物孵育1小时。感染导致了广泛的合胞体形成以及在缺乏中和抗体的条件下在大约6天之内病毒诱导细胞的杀死。根据通过中性红摄入测定的保护50％病毒诱导杀死的细胞所需要的血浆稀释度的倒数计算出了中和滴度。
合成SIV和HIV-1基因的构建
通过采用类似于构建之前所述HIV疫苗载体的策略制备了合成的SIVmac239 gag-pol-nef基因(Huang，Y.等人，2001 J Virol 75：4947-4951)。简言之，用人类细胞中常用的密码子，用GCG软件包(Genetics ComputerGroup，Inc.，Madison，威斯康星州)对来自SIVmac239的Gag，Pol和Nef(GenBank登录号M33262)的蛋白序列进行逆翻译。从每个含有25个核苷酸(nt)重叠的75bp长的多个片段合成了具有5′SalI和3′BamHI位点和一致Kozak序列的覆盖了理论基因5169 DNA bp的寡核苷酸。用Pwo(Boehringer Mannheim)和Turbo Pfu(Stratagene)高保真度DNA聚合酶通过PCR对密码子修饰的gag-pol-nef基因进行拼接。在梯度自动循环仪(Robocycler)(Stratagene)上使用PCR优化试剂盒(Stratagene)对所述PCR条件进行优化。将全长的合成gag-pol-nef基因克隆入哺乳动物表达载体pVR1012的SalI和BamHI位点，并通过DNA测序进行验证。
类似于之前的HIV载体，制备了合成的89.6P gp145ΔCFI Env基因(Huang，Y.等人，2001 J Virol 75：4947-4951；Xu，L.等人，1998 Nat Med 4：37-42)。简言之，如上所述对89.6P包膜(GenBank登录号U89134)的蛋白序列进行逆翻译。合成了含5′XbaI、一致Kozak序列和3′ BamHI位点、覆盖所述理论基因1,950 DNA bp的寡核苷酸(GIBCO Life Technologies)：每个片段是具有20nt重叠的60bp片段。在这一修饰的包膜基因中，相对于起始密码子ATG(A作为nt 1)的从nt1501(氨基酸501，R)到1602(氨基酸534，T)和nt 1771(氨基酸591，M)到1851(氨基酸617，V)的序列缺失。这一缺失去除了所述包膜的剪接位点和融合多肽以及两个七重复之间的部分间隔。所述蛋白在nt 2124(氨基酸702，I)处终止。由于创建了XhoI克隆位点，在617位的氨基酸从E变成了D。如前所述，通过PCR拼接了所述密码子修饰的gp145ΔCFI基因。将所合成的gp145ΔCFI基因克隆入哺乳动物表达载体pVR1012的XbaI和BamHI位点，并通过DNA测序进行验证。所合成的89.6Pgp140ΔCFI基因来自于在nt 2046(氨基酸676，W)之后引入了终止密码子的gp145ΔCFI质粒。
所合成的CCR-5定向性进化枝B免疫原来自HXB2和Bal株包膜。将来自HXB2(X4定向性；GenBank登录号K03455)的进化枝B Env糖蛋白(gp160)的蛋白序列用于构建所述基因(X4gp160/h)的合成版本。X4gp160/h的核酸序列与HXB2基因的同源性相当低，但所编码的蛋白却是相同的，具有以下氨基酸替换：氨基酸53(苯丙氨酸→亮氨酸)，氨基酸94(天冬酰胺→天冬胺酸)，氨基酸192(赖氨酸→丝氨酸)，氨基酸215(异亮氨酸→天冬酰胺)，氨基酸224(丙氨酸→苏氨酸)，氨基酸346(丙氨酸→天冬胺酸)和氨基酸470(脯氨酸→亮氨酸)。在对这些基因进行合成时，在洛斯阿莫斯序列数据库中出现了这七种氨基酸。为了生成包膜糖蛋白(R5gp160/h)的R5定向性版本，用来自HIV-1 BaL株的(GenBank登录号M68893，再次使用人偏好性密码子)的对应区替换了来自X4gp160/h中编码HIV-1包膜糖蛋白氨基酸205-361的区(VRC-3300，参见国际申请公开第WO 02/32943号)。来自pR5gp160/h包膜基因(VRC-3000，参见国际申请公开第WO 02/32943号)全长R5定向性版本在氨基酸704的密码子之后终止。该截短的包膜糖蛋白(gp145)包括全部SU蛋白和部分TM蛋白，其包括融合结构域、跨膜结构域和寡聚物形成的重要区(H1和H2及其间隔是寡聚化所必需的)。随后，将来自氨基酸503-536的融合结构域和剪接结构域缺失。还将氨基酸593-620的H1和H2之间的间隔缺失。如前所述，所述gp140 ΔCFI版本是通过向这一序列引入终止密码子得到的(Chakrabarti BK等人，2002 J Virol 76：5357-5368)。
rADV的构建和纯化
通过对之前公开的方法进行改良得到了重组ADV(rADV)(Ohno，T.等人，1994 Science 265：781-784；Sullivan，N.J.等人，2000 Nature 408：605-609)。简言之，将来自上述序列(在氨基酸1451终止的)的合成SIVmac239 gag-pol用SalI进行剪切，补平，然后用BamHI消化，然后将其亚克隆至穿梭质粒pAdAdaptCMVmcs的平端EcoRV和BamHI位点。通过使用XbaI和BamHI位点，可将来自上述序列的合成HIV-1gp140ΔCFI亚克隆至所述的穿梭载体中。将293T细胞铺种于6孔板并培养至约30％融合，然后通过磷酸钙方法用2μg经过两次氯化铯纯化和ADV粘粒线性化的穿梭质粒进行共转染。7-12天后，通过在0.6mlTris-HCl，pH 8.0中进行至少三次冻融，从细胞裂解液中收集了含有重组腺病毒的上清液。通过用含有病毒的上清液感染293T细胞，扩大了重组腺病毒的产量。用氯化铯纯化所述病毒，等分为1012颗粒/ml，并保存于-20C的含有13％甘油的磷酸盐缓冲液(PBS)中以待将来使用。
质粒和rADV Env疫苗构建体的表达
通过磷酸钙转染试剂(Invitrogen)，用2μg每种质粒转染293T细胞(在6孔板中)后，对编码gp145ΔCFI(R5)和gp145ΔCFI(89.6P)的质粒的表达进行了测定。转然后48小时，收集细胞，在细胞裂解缓冲液(50mM HEPES，150mM NaCl，1％NP-40，1×蛋白酶抑制剂混合物[Roche])中进行裂解，并用4-15％聚丙烯酰胺梯度十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行解析。将蛋白转移至硝酸纤维素膜(Bio-Rad)上，然后用人HIV IgG作为初级抗体以1∶2,000的稀释度进行Western印记分析。为了比较表达这些Env免疫原的rADV，以5,000颗粒/细胞对A549细胞进行感染。感染后48小时，如上所述制备细胞裂解液并进行Western印记。
ELISPOT分析
用100μl(每孔)5μg/ml抗人γ干扰素(IFN-γ)(B27；BD Pharmingen)在无内毒素的杜氏磷酸盐缓冲液(D-PBS)中对96孔多分析板进行过夜包被。然后用含有0.2％TWEENTM-20的D-PBS(D-PBS/Tween)洗涤两次，用含有10％胎牛血清的D-PBS封闭2小时以去除TWEENTM-20，并与多肽池和2×105PBMC在100μl反应体积中孵育，重复三次。单独的多肽池覆盖了全部SIVmac239 Gag，Nef和Pol蛋白以及HIV-1 HXB2/BaL和HIV-189.6P(KB9)Env蛋白。除了HIV-1 89.6P Env池，其包含10个氨基酸重叠的20个氨基酸多肽，每一种池都包含有11个氨基酸重叠的15个氨基酸多肽。每个池包含不超过130种多肽。池中的每种多肽浓度为1μg/ml。在37℃孵育18小时之后，将所述板用D-PBS/TWEENTM洗涤9次并用蒸馏水洗涤1次。然后将所述板与2μg/ml的生物素偶联的兔抗人IFN-γ(Biosource)在室温孵育2小时，用Coulter洗液(Beckman Coulter)洗涤6次，并与1∶500稀释的抗生物素蛋白链菌素碱性磷酸盐(SouthernBiotechnology)孵育2.5小时。再用Coulter洗液洗涤5次和用PBS洗涤1次之后，将所述板用硝基蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸色原体(Pierce)显色，然后用自来水洗涤进行终止，空气干燥，使用Image-Pro Plus图像处理软件(4.1版本)(Media Cybernetics，Des Moines，衣阿华州)用酶联免疫点阵(ELISPOT)读数器(Hitech Instruments)进行读数。计算出每106 PBMC中的点阵形成细胞数。中位背景水平持续的低于15 SFC/106 PBMC。
CD4+T淋巴细胞计数和病毒RNA水平
通过单克隆抗体染色和流式细胞术测定了CD4+T淋巴细胞的计数。通过500拷贝每毫升检测限的超敏感分支DNA(bDNA)扩增分析测定了血浆的病毒RNA水平。
统计分析
对三组或四组(或其等价的对于两组的Wilcoxon排列总数检验)进行的Kruskal-Wallis检验，可用来比较疫苗组之间的CD4 T-淋巴细胞、峰值病毒RNA、设定点病毒RNA和ELISPOT计数。对审计数据的Wilcoxon检验可用来比较在疫苗组之间可检测中和抗体的时间。Fisher准确检验可用来比较在20天或在第一个42天之内可检测中和抗体的出现。线性回归(常见的最小二乘法)可用来将中和抗体和ELISPOT计数对CD4 T淋巴细胞计数进行相关比较，以及(分别)对log10血浆病毒RNA进行相关比较；采用Wald检验获得显著水平。对Kruskal-Wallis和Wilcoxon检验的幂计算是基于这些检验对基于Gaussian检验的最不对称相关效率是0.86这一事实。
结果
将不表达主要组织相容性复合体(MHC)I类等位基因Mamu-A*01的24只印度来源的恒河猴，分成四个实验组进行分析，其接受DNA引发，之后用如下免疫原的rADV载体进行加强：(i)对照，(ii)没有Env的Gag-Pol-Nef(假的)，(iii)具有SHIV-89.6P Env的Gag-Pol-Nef(匹配的)，或(iv)具有HXB2/BaL Env的Gag-Pol-Nef(不匹配的)。用于本研究中的DNA质粒编码Gag-Pol-Nef融合蛋白，但因为rADV构建体表达Gag-Pol-Nef的不稳定性，用于本研究中的ADV载体仅表达Gag-Pol。如前所述为了优化在哺乳动物细胞中的表达，用于这些疫苗构建体的所有HIV或SIV基因都是密码子修饰的(Chakrabarti，B.K.等人，2002 J Virol76：5357-5368；Huang，Y.等人，2001 J Virol 75：4947-4951)。在所有表达载体中，使用了一种env基因的修饰形式，其在剪接位点、融合结构域和螺旋间结构域(ΔCFI)中具有突变、并显示对Env的抗体应答的增加。因为这些猴子最终都是用SHIV-89.6P进行感染的，所以我们将HIV-189.6P Env免疫原称为“匹配的”，而将HIV-1 HXB2/BaL Env免疫原称为“不匹配的”。为了制备HXB2/BaL Env，用来自HIV-1 BaL株的对应序列替换了来自HXB2 Env的编码氨基酸205-361的区域。实际上，89.6P和HXB2/BaL ΔCFI Env蛋白仅有81％是相同的。所述ADV载体含有E1中的缺失，其使该载体复制缺陷，并使E3中的部分缺失/替换，该缺失/替换破坏E3蛋白编码序列(Crawford，J.M.等人，1999 J Virol 73：10199-10207；Ourmanov，I.等人，2000 J Virol 74：2740-2751)。如前所述制备了表达HXB2/BaL或89.6P gp140ΔCFI的rADV(Polacino，P.等人，1999 J Virol 73：618-630；Polacino，P.S.等人，1999 J Virol 73：8201-8215)。如前所述，引入了相关gag-pol或相同的env cDNA插入，且所述插入与用于DNA引发的质粒中的免疫原相匹配(Amara，R.R.等人，2002 J Virol76：6138-6146；Barouch，D.H.等人，2000 Science 290：486-492)。在0、4和8周的时间，用无针的生物注射装置(Biological；Bioject MedicalTechnologies，Inc.，Beckminister，N.J.)将每种质粒DNA以4mg的接种量通过肌肉进行传送。对质粒和rADV疫苗构建体的HXB2/Bal和89.6P env基因体外表达水平进行了比较(图18)。在26周对每只猴子进行每种rADV构建体1012颗粒的单次接种肌肉给药。
通过抗体结合、病毒中和以及多肽池ELISPOT分析对这些疫苗构建体的免疫原性进行了分析。对rADV加强后2周收集的血浆进行了对BaL和89.6P gp120结合的测定以及对SHIV-89.6P感染病毒中和的测定。当Env免疫的猴子发展了对于免疫BaL or 89.6P gp120的较高滴度抗体时，来自该研究28周的血浆，在峰值ELISA滴度抗体应答的时间并没有中和所述感染病毒SHIV-89.6P。
由接受实验免疫原的全部猴子的PBMC引起的ELISPOT应答都是强烈的(图19)。在所有免疫的猴子分组中都产生了针对SIV Gag，Pol和Nef的细胞免疫，而在接受这些对应的Env免疫原的猴子中则产生了针对HIV-189.6P和HXB2/BaL Env的细胞免疫。注射了假的Env(空载体)的猴子没有发展出Env特异性的细胞免疫。在最终质粒DNA接种后2周，对所有病毒蛋白产生的平均总疫苗引起的PBMC ELISPOT应答在所述匹配Env组中是942±294 SFC(平均±标准误)，在不匹配组Env中是1,588±554 SFC，在假的Env组中是1,255±264 SFC。在用rADV载体加强后2周，在相对应的组中总ELISPOT应答分别是2,892±1,116，3,993±1,000和3,800±984 SFC，通过单独的DNA引发，引起了大于2.5倍增加的细胞免疫应答。这些应答代表了CD4+和CD8+T淋巴细胞应答，正如在未分级的和来自所述猴子的CD8+T淋巴细胞耗尽的PBMC中进行的ELISPOT分析所证明的那样(图20A和20B)。尽管在随后的几周所述应答有所降低，但在这三组猴子中，还是在病毒感染的时候测定了在猴子PBMC中的高频率应答(分别为1,58 1±535，1,908±557和1,092±400SFC)。因此，该疫苗系统引起了针对多种病毒蛋白的高频的CD4+和CD8+T淋巴细胞应答。在这三组实验免疫猴子中没有观察到总ELISPOT应答的统计显著性差异。在假的Env动物组中特别高的总的猴子PBMC的SFC应答反映了对Pol蛋白的独特的调合的高应答(图20A)。重要的是，正如在通过Mann-Whitney t检验比较测定那样，在其Gag和Pol特异性ELISPOT应答的范围上在不同组的猴子中未出现显著性差异。
在rADV加强后12周，在38周对所有猴子都进行了50 50％猴子感染剂量SHIV-89.6P的静脉感染，并检测了感染的临床、病毒学和免疫学结果。SHIV-89.6P感染导致了在具有天然免疫的恒河猴外周血中大约75％的CD4+T淋巴细胞的急剧下降，且选择性疫苗策略能够产生钝化这种CD4+T淋巴细胞降低的免疫应答(Amara，R.R.等人，2001 Science 292：69-74；Barouch，D.H.等人，2000 Science 290：486-492；Reimann，K.A.等人，1996 J Virol 70：6922-6928；Shiver，J.W.等人，2002 Nature 415：331-335)。我们由此将外周血CD4+T淋巴细胞计数作为所述猴子在SHIV-89.6P感染之后的临床状态指征进行检测(图21)。在所有对照中都观察到了CD4+T淋巴细胞的完全丧失，而在接受SIV Gag-Pol-Nef加假的Env免疫的6只猴子中，在其中4只中观察到了CD4+T淋巴细胞耗尽的几乎完全的钝化。因此，正如基于之前的研究所期望的(Amara，R.R.等人，2001 Science 292：69-74；Barouch，D.H.等人，2000 Science 290：486-492；Shiver，J.W.等人，2002 Nature 415：331-335)，疫苗介导的针对SHIV-89.6P感染临床后果的保护是可以通过含有Gag-Pol-Nef的免疫原得以完成。与仅接受SIV Gag-Pol-Nef免疫原的猴子相比，两组接受HIV-1Env和SIV Gag-Pol-Nef免疫原免疫的猴子证明了更令人吃惊的对于CD4+T淋巴细胞丧失的保护(图21)。在实验免疫猴子的分组中，刺激后168天的平均外周血CD4+T淋巴细胞计数在假的Env免疫动物中是363±100(平均值±标准误)，在匹配的Env免疫动物中是772±111，在不匹配的Env免疫动物中是706±76，说明针对CD4+T淋巴细胞丧失的统计显著性保护是由疫苗中包括的Env成分提供的(P＝0.03，Kruskal-Wallis检验)。重要的是，与那些注射了匹配的Env免疫原的猴子相比，接受了不匹配的Env免疫原的猴子表现出了相当的保护能力。
在SHIV-89.6P感染的猴子中病毒的复制是通过使用bDNA分析对其血浆中的病毒RNA进行定量来估计的(图22)。因为在感染后仅有15％具有免疫性的天然恒河猴控制该病毒在不可检测的水平，所以，在实验动物中的峰值和稳态或设定点的血浆病毒RNA水平提供了疫苗介导病毒牵制的测定。在四组猴子中峰病毒负载的中值是1×108(对照)，6×106(假的Env)，4×106(匹配的Env)和1×106(不匹配的Env)。因此对照接种动物具有比所接种的猴子具有显著更高的峰病毒负载(Kruskal-Wallis检验，P＝0.01)。然而，三组实验接种的猴子并未在其峰病毒负载上有显著性差异(P＝0.28，Kruskal-Wallis检验)。
在设定点上，接受SIV Gag-Pol-Nef加上不匹配Env免疫原的猴子分组也证明了比接受SIV Gag-Pol-Nef加假的Env免疫原的猴子更好的病毒牵制。在实验免疫猴子分组中，感染后168天的血浆病毒RNA拷贝数的对数在假的Env免疫的动物中是3.70±0.52(平均数±标准误)，在匹配的Env免疫动物中是3.61±0.35，在不匹配的Env免疫动物中是2.38±0.18，统计显著性地低于由包括在疫苗中不匹配Env组分提供的血浆病毒RNA水平(P＝0.04，Kruskal-Wallis检验)。目前已观察到了在感染前和感染后总SFC应答与感染后病毒负载之间的关联。在接受匹配Env免疫原和接受假的Env免疫原实验性免疫猴子分组之间在血浆病毒RNA水平上不存在显著差异可能反映了在匹配的Env免疫的动物中针对Gag免疫原的不寻常的较低的T细胞应答(图20)。
为了分析在Env免疫的猴子中介导对于CD4+T-淋巴细胞丧失改善的保护的机理，对抗病毒的体液免疫应答进行了评估。抗Env抗体可以通过在感染同时中和感染性的病毒对保护作出潜在的贡献。可选择地，感染后快速参与的记忆中和抗体应答能够对病毒播散的控制有所贡献。在感染的时候在免疫的猴子血浆中没有可检测的中和抗体，说明疫苗引起的预存在的中和抗体对病毒牵制没有贡献。在病毒感染之后，在免疫的猴子中，每周对中和所述感染病毒SHIV-89.6P的抗体应答的进化进行监测(图23)。在刺激后3周，在匹配的Env组中有三只动物表现出了对感染病毒的记忆应答，而在假的或不匹配的Env组中则没有动物表现出相同的应答。然而，在对中和抗体进行测定或对发展了可检测定中和抗体应答的动物数量时，在三组实验免疫猴子中没有统计学显著差异。值得注意的是，由于每个实验组中的动物数量较少，对这些数据进行的统计检验几乎不能在这些组中检测出差异。因此，有可能所述中和抗体具有我们未能测定到的效果。
为了进一步评估中和抗体应答的出现是否与SHIV-89.6P感染后的临床或病毒学事件相关，采用线性回归分析对可检测的中和抗体与血浆病毒RNA水平或外周血CDD4+T淋巴细胞计数进行了评估。事实上，无论在一段时间或在感染后第一个6周中的单次对其出现测定进行评估，这些变量都并未表现出与中和抗体发展的显著关联。因此，我们不能证明旨在针对SHIV-89.6P的中和抗体对感染后的病毒牵制有所贡献。最后，不匹配Env组似乎比匹配Env组更有效地控制血浆病毒血症的事实进一步说明中和抗体对病毒牵制几乎没有作用。
为了检测在这些猴子中Env特异性T细胞应答对保护性免疫的可能贡献，在ELISPOT分析中，在rADV加强之后1周，对来自四组实验猴子中的PBMC细胞免疫应答进行了测定，从而获知针对HIV-1 89.6P Env多肽池细胞免疫性(图24，上图)。所述平均应答在匹配的Env组中为449±122 SFC(平均值±标准误)，在不匹配的Env组中为730±306 SFC，在假的Env组中为13±8 SFC。在HXB2/Bal Env免疫的猴子中，对于89.6PEnv的PBMC SFC应答明显高于对于HXB2/BaL Env的应答，但并未达到统计显著。因此，在与所述刺激病毒的Env反应的HXB2/Bal Env免疫猴子的PBMC中，观察到了明显的细胞免疫。
因为在最初感染后的细胞免疫应答对AIDS播散的牵制有所帮助(Barouch，D.H.等人，2000 Science 290：486-492)，所以我们探究了在免疫的猴子分组中这些对于Env的应答能解释不同临床结果之间差异的原因。由此，我们评估了在SHIV-89.6P感染后3周和10周在这些猴子中的HIV-1 89.6P Env特异性T-细胞应答(图24)。令人惊异的是，接受匹配的或不匹配的Env免疫原的猴子的PBMC比接受假的Env免疫的猴子的PBMC发展了对这些Env多肽高得多的ELISPOT应答(P＝0.002，Wilcoxon秩和检验)。因此，可以观察到在感染后Env特异性T细胞应答的产生与这些猴子的疫苗系统中匹配的或不匹配的Env之间的强烈关联。
讨论
本研究证明了HIV Env对猿慢病毒感染模型中的免疫保护是有贡献的。重要的是，在所述Env免疫原与所述感染病毒株匹配或不匹配时观察到了保护作用。这些发现说明将这种基因产物包括在候选疫苗之内是明智的，即使这些疫苗并不能引起广泛的中和抗体应答。
本研究提供了能够进入人体有效试验的包含Env抗原的HIV疫苗的重要理论基础。目前对Env免疫原的设计焦点一直都集中于对能够诱导更广泛中和抗体的修饰(Mascola，J.R.2003 Curr Mol Med3：209-216)。如果成功的话，这样的修饰无疑将进一步提高疫苗的效率。然而，本研究还说明了即使其不能诱导广泛的中和抗体应答，将Env包含作为疫苗免疫原也对病毒牵制和免疫保留有所贡献。细胞免疫扩展的广度足以提高通过接种导致的临床保护。
部分V在恒河猴体内多进化枝HIV-1包膜免疫原引起了广泛的细胞和体液免疫
摘要
对于对抗全球性的AIDS蔓延来说，发展能够识别多种HIV-1株的、能够引起有效的细胞和体液免疫应答的HIV-1疫苗是至关重要的。本研究的启动是为了测定含有单种或多种遗传各异HIV-1包膜(Env)免疫原的疫苗产生的Env特异性T淋巴细胞和抗体应答的程度和广度。使用编码Gag/Pol/Nef聚蛋白的DNA引发/rAd加强疫苗与单独的Env或进化枝A、进化枝B和进化枝C Env的混合物对恒河猴进行免疫。接受多进化枝Env免疫的猴子发展出了对于所有疫苗抗原的强烈免疫应答，重要的是，发展出了比用包括单种Env免疫原疫苗免疫的猴子的更广泛的Env识别。在用病原性猿-人免疫缺陷型病毒(SHIV)-89.6P感染后，所有免疫组的猴子都表现出了同样的免疫应答。这些数据表明，编码来自多HIV-1进化枝Env蛋白的多组分疫苗能够产生广泛的Env特异性T淋巴细胞和抗体应答，而不会具有抗原性干扰。本研究证明了通过用遗传多样性的HIV-1分离物免疫产生的保护性免疫应答。
引言
人免疫缺陷型病毒1型(HIV-1)包膜(Env)的极端遗传多样性对有效AIDS疫苗的产生而言是一种难以逾越的挑战(Letvin，N.L等人，2002Annu Rev Immunol 20：73-99)。当Env是HIV-1特异性抗体应答的主要靶点时，其还可以作为有效的T细胞免疫原(参见部分IV)。理想的HIV-1疫苗应该能够引起能够识别多种病毒分离物的强烈的细胞和体液免疫(Mascola，J.R.和G.J.Nabel.2001 Curr Opin Immunol 13：489-95；Nabel，G.J.2001 Nature 410：1002-7)。然而，世界范围内的HIV-1 Env的极端的遗传变异使得不可能仅采用单一的Env基因产物来构建有效的疫苗。
当目前正在研究的多种有希望的AIDS候选疫苗在非人类灵长类或人类早期临床试验中使用来自单一HIV-1原始分离物的Env免疫原时(Graham，B.S.2002 Annu Rev Med 53：207-21)，这一方法具有明显的局限性。尽管这些疫苗能够产生针对HIV-1 Env的有效的细胞和体液免疫应答，但是由单一Env免疫原引起的免疫的广度并不会有效的影响针对多种HIV-1株的保护作用。然而，进行多国或进化枝特异性疫苗的开发并不可行。而且，这些区域特异性的疫苗也不能预防向人群中新引入的不相干株。
一种构建用于世界范围内进行使用的单一HIV-1疫苗的策略是在单一疫苗配方中使用来自HIV-1多进化枝的代表性免疫原(Nabel，G.J.等人，2002 Science 296：2335)。这样的多进化枝疫苗含有与世界范围内的大多数HIV-1感染相关的Env免疫原，并可以进行可行的试验。然而，并不清楚编码来自不同HIV-1进化枝的抗原的多组分疫苗是否能够引起比使用单一Env免疫原的疫苗更高或相等的抗病毒免疫性，同样也并不清楚免疫原的复杂混合物能够是否导致抗原性干扰和减弱免疫保护(Kjerrstrom，A.等人，2001 Virology 284：46-61)。
本研究使用了猿人免疫缺陷型病毒(SHIV)/恒河猴模型来研究DNA引发/重组腺病毒加强疫苗引起的免疫的广度和程度，该疫苗含有Gag/Pol/Nef与单一进化枝或多进化枝Env免疫原。我们的发现说明多进化枝Env疫苗能够比用单一Env免疫原进行的免疫引起更广泛的有效的细胞和体液免疫应答。
材料与方法
恒河猴的免疫和感染
根据哈佛医学院的动物饲养使用条例委员会的指南和《实验动物的饲养与使用指南》，将30只成年印度来源的恒河猴(Macaca mulatta)饲养于经过实验动物评估和鉴定协会认可的设施中。将猴子分成5组，每组6只。每个实验组中包括2只表达I类MHC等位基因Mamu-A*01的猴子。
如前所述构建了质粒DNA和重组腺病毒(rAd)疫苗载体(参见部分II和IV)，并使用无针的Biojector系统和如表3所示的3号注射器(Bipject，Portland，OR)进行肌肉注射给药。将每种质粒DNA或rAD疫苗载体分成0.5ml的两个等分，并传输入每条四头肌。用假的DNA和假的rAD载体对对照猴子进行类似的免疫。在42周，所有猴子都接受50 50％猴感染性剂量的(MID50)SHIV-89.6P的静脉感染。
IFN-γELISPOT分析
如部分IV所述进行了IFN-γ ELISPOT分析。将新鲜分离的PBL以2×105细胞/孔接种于100μl终体积的仅含有培养基或多肽池中，重复三次。多肽池含有完整的SIVmac239 Gag，Nef和Pol蛋白，以及HIV-1进化枝A，进化枝B，进化枝C和89.6P Env蛋白。每个池都包括具有11个氨基酸重叠的15个氨基酸的多肽，但对HIV-1 89.6P Env池而言，其包括具有10个氨基酸重叠的20个氨基酸的多肽。将Pol和Env多肽各自分成两个分开的池，从而使得每种池含有的多肽不超过130种。池中的每种多肽浓度为1μg/ml。对每只动物的来自三个重复小孔的斑点的平均数进行计算，并且将其调节成代表每106 PBL的斑点平均数。所示数据代表了来自每组6只猴子的每106 PBL的抗原特异性斑点的平均数。
HIV-1包膜抗体ELISA
在293细胞中表达了疫苗研究中心(VRC)的质粒5304、2801和5308(其分别编码了HIV-1 gp145进化枝A、进化枝B和进化枝C Env)(参见国际公开第WO 02/32943号)，并纯化了主要的蛋白产物。以最适的重组抗原浓度(37.5ng/孔)对Immunol-2 HB微滴定板(Thermo Labsystems，Milord，MA)在4℃包被过夜。在重复的孔中进行猴血浆的连续稀释，并在37℃孵育2小时。加入生物素标记的抗猴IgG/IgA/IgM(RocklandImmunochemicals，Gilbertsville，PA)，37℃孵育1小时。向孔中加入抗生物素蛋白链菌素-HRPO(KPL，Gaitherburg，MD)，室温保持30分钟，然后加入TMB底物(KPL)，室温保持30分钟。用免疫前的校正OD＞0.2的最终稀释，建立了每个动物的终点滴度。所示数据为来自每组6只猴子的几何平均值+/-SEM。
病毒分离物和中和分析
对总共30种HIV-1分离物进行了研究，除非以下特别指明，这些病毒是得自NIH AIDS研究和参考试剂项目，AIDS分部，NIAID，国立卫生院的11种进化枝B、11种进化枝C和8种进化枝A病毒。所有的进化枝B病毒都是原始分离物，除了T细胞系适应的HxB2，其是HIV-IIIB的分子克隆。BR07是由Dana-Farber癌症研究所的Dana Gabuzda提供的。其是嵌合的具有传染性的NL4-3的分子克隆，所述NL4-3含有从AIDS患者的脑组织中直接克隆到的近乎全长的Env基因(Ohagen，A.等人，2003J Virol 77：12336-45)。原先称为P15的进化枝B原始分离物6101(Bures，R.等人，2000 AIDS Res Hum Retroviruses 16：2019-35)和进化枝C病毒DU123、DU151、S007和S080是由David Montefiori(杜克大学医学中心)提供的。进化枝C病毒来自南非(Du前缀或马拉维(S前缀)的HIV-1感染患者，且之前已有描述(Bures，R.等人，2002 J Virol 76：2233-44)。TV1(进化枝C)是由David Montefiori和Estrelita Janse Van Rensburg(Stellenbosch大学，南非)提供的。GS14是埃塞俄比亚进化枝C病毒的传染性分子克隆，由Francine McCutchan以及来自美国军事HIV研究项目的同事提供。进化枝A病毒DJ263和44951是原始病毒分离物，由美国军事HIV研究项目提供。之前已将UG29分离物传入H9细胞，因此其被认为是T细胞系适应的病毒。
采用之前所述的方法，通过一轮感染流式细胞术分析来实施病毒中和分析(Mascola，J.R.等人，2002 J Virol 76：4810-21)。这种分析通过HIV-1p24 Gag抗原(p24-Ag)的细胞内染色对HIV-1感染的T细胞进行了测定。采用蛋白酶抑制剂来防止第二轮病毒复制。通过与含有来自对应动物免疫前血清的小孔中的p24-Ag阳性细胞数量相比，计算含有免疫血清的测试孔中p24-Ag阳性细胞数量的降低，得出由每种免疫血浆介导的病毒中和的百分数。为进行分析，还包括了来自6种假免疫猴子的血浆，这些数据可见于结果部分。为了检测非HIV-1特异性血浆效应，将所有血浆样本都进行了双向性鼠白血病病毒(MuLV)的测试。所述MuLV报告病毒编码绿色荧光蛋白(GFP)，通过GFP的表达而不是p24-Ag的表达测定了感染的T细胞(Mascola，J.R.等人，2002 J Virol 76：4810-21)。，
血浆病毒RNA水平的定量和CD4+T淋巴细胞计数
采用125拷贝/ml低检测限的超敏感分支DNA扩增分析对血浆病毒RNA水平进行了测定(Bayer Diagnostics，Berkeley，CA)。在所有接种和对照猴子中，在SHIV-89.6P感染后16天检测峰血浆病毒负载。通过测定刺激后85和169天之间6个时间点计算出测定的设定点血浆病毒RNA水平的中位值。通过单克隆抗体染色和流式细胞分析测定了被感染猴子外周血中的CD4+T淋巴细胞的百分数。简言之，用抗CD3 APC(FN18)、抗CD4 PE(19Thy5D7)和抗CD8 FITC(SKI，BD BioSciences，MountainView，CA)对新鲜提取的PBL进行标记。采用FACSCalibur流式细胞仪进行样本获取，使用CellQuest软件(BD BioSciences)进行数据分析。
统计分析
使用无参数Wilcoxon秩和检验对非免疫和免疫组的猴子体内的CD4+T淋巴细胞、峰病毒RNA和设定点病毒RNA进行了比较。所有检验都是双侧的。
结果
试验设计
将30只恒河猴分成五个实验组，每组6只猴子(表3)。在0周、4周和8周，1-4组接受三次4.5mg表达SIVmac239 Gag-Pol-Nef融合蛋白的质粒DNA载体和表达多种HIV-1 Env蛋白的质粒DNA载体的引发免疫。用单一HIV-1 Env免疫原对1-3组进行如下免疫：1)4.5mg进化枝B Env(高进化枝B)，2)1.5mg进化枝B Env(低进化枝B)和3)4.5mg进化枝CEnv(高进化枝C)。用HIV-1 Env免疫原和1.5mg的每种进化枝A Env、进化枝B Env和进化枝C Env(进化枝A+B+C)的组合对第4组猴子进行免疫。在26周，猴子接受了表达SIVmac239 Gag-Pol的载体和表达与在DNA引发中传递的多种HIV-1 Env基因一致的载体进行的单次rAd加强免疫(2.0×1012总颗粒)(表3)。1-3组接受了1)1.0×1012颗粒的进化枝B Env(高进化枝B)，2)3.3×1011颗粒的进化枝B Env(低进化枝B)，3)1.0×1012颗粒的进化枝C Env(h高进化枝C)。第4组接受了3.3×1011颗粒的每种进化枝A、进化枝B和进化枝C Env(进化枝A+B+C)。第5组猴子用假DNA和假rAd载体进行免疫。通过肌肉注射实施DNA引发和rAd加强免疫。所有的质粒DNA和rAd载体都表达了密码子修饰的SIVmac239和HIV-1基因以增加在哺乳动物细胞中的表达。所有用于这些载体中的env基因都是ΔCFI构建体，其包含在之前所述的旨在提高表达和免疫原性的在剪接区、融合区和螺旋间区的突变(Chakrabarti，B.K.等人，2002 JVirol 76：5357-68)。在HIV-1 Env免疫原中氨基酸一致性的百分比为71-76％，而进化枝B和进化枝C Env之间的差异最大。
表3试验分组和免疫流程表
    组别   SIV Gag-Pol-Nef质粒(mg)   HIV-1 Env质粒(mg)   假质粒(mg)
1)高进化枝B Env2)低进化枝B Env3)高进化枝C Env4)进化枝A+B+CEnv5)对照     4.54.54.54.5-   4.5进化枝B1.5进化枝B4.5进化枝C1.5进化枝A1.5进化枝B1.5进化枝C-     -3.0-9.0
    组别   SIV Gag-Pol rAd(颗粒)     HIV-1 Env rAd(颗粒)   假rAd(颗粒)
1)高进化枝B Env2)低进化枝B Env3)高进化枝C Env4)进化枝A+B+C Env5)对照     1.0x10121.0x10121.0x10121.0x1012-  1.0x1012进化枝B3.3x1011进化枝B1.0x1012进化枝C3.3x1011进化枝A3.3x1011进化枝B3.3x1011进化枝C-   -6.6x1011-2.0x1012
免疫引起的细胞免疫应答
使用新鲜分离的PBL，通过混合的多肽IFN-γ ELISPOT分析对免疫后猴子体内针对SIV Gag和Pol以及HIV-1 Env的细胞免疫应答进行测定。此外，可通过测量针对进化枝A、进化枝B和进化枝C Env多肽的PBL IFN-γ ELISPOT应答确定引起Env特异性细胞免疫应答的疫苗的交叉进化枝反应性的程度。因为使用SHIV-89.6P对这些猴子进行感染，我们还测定了代表进化枝B 89.6P Env的多肽池的T细胞识别。接受高剂量和低剂量进化枝B Env质粒DNA免疫原的猴子对所有检测的Env多肽池都产生了细胞免疫应答(图25A)。对进化枝B和89.6P(异源进化枝B)Env多肽池产生应答的频率高于在针对进化枝A或进化枝C Env池观察到的频率。接受高剂量进化枝C Env免疫原的猴子也发展了针对所有检测Env多肽池的细胞免疫应答，但进化枝C Env的应答要高于针对进化枝A、进化枝B或89.6P Env的应答。重要的是，在接受多进化枝质粒DNA免疫原猴子的PBL中观察到了针对进化枝A、B、C和89.6P HIV-1 Env多肽池的相当的细胞应答。
在使用rAd疫苗进行加强免疫之后，所有免疫后猴子的DNA引发的细胞免疫应答都剧烈增加(图25B)。在接受高剂量进化枝B Env rAd加强免疫的猴子中观察到了对所有Env多肽池的应答，对进化枝B和89.6P多肽的SFC应答高于对进化枝A或C多肽的应答(p＝0.06和0.04，分别的，Wilcoxon秩和检验)。接受低剂量进化枝B Env免疫的猴子的Env特异性细胞免疫应答与接受高剂量进化枝B Env免疫原的猴子的Env特异性细胞免疫应答相差无几。因此，通过将Env质粒和rAd疫苗的剂量降低三分之二也没有造成免疫原性的显著降低。用高剂量进化枝C Env rAd构建体加强的动物同样表现出了对于所有Env多肽种类的T细胞反应性升高，但对进化枝C多肽的应答却显著高于对进化枝A或B多肽的应答(p＝0.04，两者)。相反，多进化枝Env免疫的猴子在Env特异性细胞免疫应答方面并未表现出偏向性。在用进化枝A，进化枝B和进化枝C Env rAd构建体加强免疫之后，这些猴子发展了具有相当幅度的对于进化枝A、进化枝B、进化枝C和89.6P Env多肽池的应答(图25B)。此外，在这些猴子中每种单独进化枝特异性ELISPOT应答的程度与在接受单一进化枝Env免疫原的猴子中引起的最适进化枝特异性应答相当。最后，在所有组的猴子中所述疫苗引起的Env特异性T细胞应答是持续性的，可一直以较高的频率保持到病毒感染时(图25C)。
在DNA引发免疫和rAd加强免疫之后，在所有免疫的猴子体内观察到了针对SIV Gag和Pol的细胞免疫应答(图26)。重要的是，接受多进化枝Env免疫的猴子的PBL发展了对这些SIV蛋白的ELISPOT应答，其幅度与在接受单一进化枝Env免疫原猴子中的所观察到的幅度相当。因此，用复杂的SIV Gag-Pol池和多进化枝HIV-1 Env免疫原免疫的猴子引起了对于所有疫苗组分的细胞免疫应答，而没有出现抗原干扰的迹象。由免疫引起的抗体应答
在rAd给药之后，对这些猴子中由单一进化枝和多进化枝Env免疫引起的体液免疫应答的幅度和广度进行了研究。通过ELISA对血浆样本中针对进化枝A、进化枝B和进化枝C gp145 Env蛋白的抗体结合活性进行了测定。接受高剂量进化枝B Env免疫原的猴子产生了对所有三种蛋白的抗体应答(图27)；然而，最高的抗体滴度是针对进化枝B Env蛋白的(分别与进化枝A和C Env蛋白比较，p＝0.002和0.13，Wilcoxon秩和检验)。在接受低剂量进化枝B Env免疫的猴子中观察到了类似的抗体反应性模式，将所述Env免疫原的剂量降低三分之二也并未导致免疫原性的本质性降低。接受高剂量进化枝C Env免疫原的猴子也类似地发展了识别所有三种Env抗原的抗体应答，但针对进化枝C Env蛋白的滴度显著地高于对于进化枝A或B Env蛋白的滴度(p＝0.004和0.002，分别的)。相反，用进化枝A、进化枝B和进化枝C Env免疫原免疫的猴子表明了对所有三种Env蛋白相当的抗体应答。
还对经过rAd加强免疫后得到的血浆样本测定了针对具有30种进化枝A、进化枝B和进化枝C HIV-1分离物的板的中和活性(图28)。虽然来自所有免疫猴子分组的血浆表现出了对于某些HIV-1分离物的适中的中和水平，但是用单一进化枝Env免疫原免疫的猴子的抗体表现出了针对该相同进化枝病毒的最高的中和活性。因此，来自进化枝B免疫的动物的血浆几乎没有表现出针对进化枝A或C病毒的活性，而来自进化枝C免疫动物的血浆也不能中和进化枝B病毒。然而，存在一些由进化枝C疫苗血浆引起的进化枝A病毒的交叉中和。重要的是，多进化枝Env免疫的猴子发展了针对来自所有三种进化枝的某些HIV-1株的具有中和活性的抗体，并且与单一Env免疫相比没有中和效力的降低。为了证明所观察到的病毒中和的适当水平是因为HIV-1特异性抗体引起的，设定了两种对照。从假免疫猴子获得的血浆的平均中和活性一直都低于20％(图28，虚线)。此外，来自每种针对MuLV Env假病毒疫苗分组的血浆的平均活性低于20％(如图28A所示)。这些数据说明，当与用单一Env免疫引起的应答相比时，多进化枝免疫系统引起了扩大范围的体液免疫应答，而没有抗原干扰的迹象。
对于SHIV-89.6P感染的保护
在rAd加强免疫之后16周，在第42周所有猴子都接受了50 MID50SHIV-89.6P的静脉感染。在病毒感染后2周，在所有试验免疫猴子的分组而不是在对照猴子中检测到了HIV-1 Env以及SIV Gag和Pol的强烈的细胞免疫应答(图29)。在刺激后16天，在所有猴子中都观察到了峰血浆病毒RNA水平，所测定的病毒RNA拷贝数的log10中值为7.54(对照)，5.66(高进化枝B Env)，6.83(低进化枝B Env)，6.20(高进化枝C Env)和6.46(进化枝A+B+C Env)(图30A)。因此，当与未免疫的对照猴子相比时，在所有实验免疫的猴子分组中观察到了在SHIV-89.6P感染之后的峰病毒负载的显著降低(p值从0.002到0.004，Wilcoxon秩和检验)。然而，当对接受单一进化枝Env或多进化枝Env免疫的猴子进行比较时，并未在峰病毒RNA水平中观察到显著性差异。
与对照猴子相比，所有实验免疫猴子的分组还表现出了更长期的病毒牵制，在感染后85和169天中间所测定的病毒RNA拷贝数的log10设定点病毒RNA水平的中值为4.77(对照)，2.30(高剂量进化枝B Env)，2.63(低剂量进化枝B Env)，2.28(高剂量进化枝C Env)和2.69(进化枝A+B+C Env)(图30B)。在用单一或多进化枝Env免疫原免疫的猴子分组中，并未观察到在设定点病毒负载的显著性差异。
作为针对SHIV-89.6P诱导的疾病的疫苗介导的保护的评价方法，在感染的猴子中测定了外周血CD4+T淋巴计数。在感染后的头21天之内，假免疫的对照猴子发展了快速的和持续的CD4+T淋巴细胞的降低(图31)。当与对照猴子相比较时，在感染后85和169天之间所有的实验免疫猴子分组都表现出CD4+T淋巴细胞丧失的明显钝化(p值从0.015到0.026)。尽管在感染的急性和慢性期中，在免疫的猴子分组中没有CD4+T淋巴细胞数量的显著差异，在高剂量进化枝B Env和多进化枝Env疫苗组中的猴子表现出了这种淋巴类群的最佳的保存。
讨论
全面的HIV-1疫苗必须能够引起对于多样性病毒分离物的有效免疫应答。事实上，已描述了广泛的交叉反应性HIV-1特异性T细胞免疫应答。感染了HIV-1的个体发展了能够识别来自多种HIV-1进化枝的病毒序列的T淋巴细胞应答(Cao，H.et al 1997 J Virol 71：8615-23)。在用重组金丝雀痘构建体免疫的未感染的志愿者中，测定了交叉-进化枝的反应性CTL(Ferrari，G.等人，2000 AIDS Res Hum Retroviruses 16：1433-43)。然而，因为这些研究使用了CTL克隆或体外培养的PBL来测定交叉进化枝T细胞的反应性，所以这些HIV-1特异性免疫应答的真实范围是未知的。在本研究中，我们证明了与用单一Env免疫原免疫的猴子中观察到的情况相比，用包括多种Env免疫原的DNA引发/rAd加强疫苗对恒河猴的免疫引起了更广泛Env特异性识别的细胞和体液免疫应答。
来自用单一HIV-1 Env免疫原免疫的猴子的PBL表现出了针对与疫苗编码Env免疫原匹配的多肽池的高频率细胞免疫应答，同时表现出对该疫苗中未包含的Env蛋白多肽的低频率应答。这些交叉反应性的应答反应了保守病毒表位的T淋巴细胞识别，以及不同表位的交叉反应性识别，其因有限数量的氨基酸而可以不同(Charini，W.A.等人，2001 JImmunol 167：4996-5003；Keating，S.M.等人，2002 AIDS Res HumRetroviruses 18：1067-79)。在本研究中，最高程度的异源Env识别是猴子的PBL反应性，该猴子用针对代表89.6P Env、一种异源进化枝B Env的多肽池的进化枝B HXBc2/BaL Env免疫原免疫(图25)。HXBc2/BaL Env与89.6P Env具有81％氨基酸一致性，而与用于这些免疫中的进化枝A和C Env序列分别仅有75％和72％一致性。这些数据说明用单一Env免疫原进行免疫可以引起针对该相同进化枝病毒Env的最高频率的交叉反应T细胞应答。
对于包括来自HIV-1多进化枝病毒蛋白的疫苗的关注在于这些多样抗原之间的相互干扰可能会减弱免疫应答。事实上，的确在包括多种病原体蛋白的疫苗中观察到了这样的抗原干扰(Fattom，A等人，1999Vaccine 17：126-33；Insel，R.A.1995 Ann N Y Acad Sci 754：35-47)。此外，研究还表明质粒DNA疫苗的复杂混合物还可以导致体内的蛋白表达和免疫原性的降低(Kjerrstrom，A.等人，2001 Virology 284：46-61；Sedegah，M.等人，2004 Gene Ther 11：448-56)。然而，本研究中的这些发现说明在单一疫苗中包括来自HIV-1的多进化枝Env免疫原可以增加疫苗引起的Env特异性T细胞和抗体应答的广度。因此，用多进化枝Env疫苗免疫的猴子可以发展针对所有疫苗编码Env抗原的高频细胞免疫应答和高滴度抗体应答。在DNA引发和用多进化枝Env免疫原进行rAd加强之后针对进化枝B和进化枝C Env多肽池的T淋巴细胞应答程度与在接受高剂量单一进化枝B或C Env疫苗的猴子中所观察的情况相似。此外，在多进化枝Env免疫的猴子中未检测到对Gag或Pol特异性细胞免疫应答程度的有害效果。这些结果支持了在小鼠研究中所表明的多进化枝HIV-1疫苗能够引起针对所有疫苗编码抗原的强烈的细胞和体液免疫应答，而没有抗原干扰的迹象(部分I和II)。
值得引起注意的是，进化枝A、B、C Env免疫原的包括物引起了对疫苗中未包括的某些进化枝株的中和抗体。目前的数据进一步表明多进化枝Env免疫并未减弱疫苗引起的针对SHIV-89.6P感染的免疫保护。接受编码单一Env或多进化枝Env免疫原的DNA引发/rAd加强疫苗的猴子在急性和慢性感染中表现出了相等的病毒牵制作用和相当的CD4+T淋巴细胞的保留。以上我们证明了(参见部分V)DNA引起/rAd加强疫苗引起的针对SHIV-89.6P的保护与记忆性的抗原特异性细胞应答相关而不是与中和抗体应答相关。因此，在接受免疫的不同猴子分组中未出现临床保护的显著差异并不意外，因为他们都表明了对SIV Gag和Pol的强烈的预刺激细胞免疫应答，以及某种程度的针对89.6P Env细胞免疫交叉反应性。事实上，在感染之后，对89.6P Env的ELISPOT应答在所有组别的Env免疫猴子的中PBL都快速升高，这说明疫苗引起的T淋巴细胞能够识别在对复制病毒反应中扩展的89.6P Env表位(图29)。
本研究说明来自HIV-1多进化枝的病毒蛋白的包括物也是一种可行的全面IV-1疫苗的方法。
部分VI VRC-HIVDNA-009-00-VP
引言
VRC-HIVDNA-009-00-VP是由编码来自HIV-1蛋白的四种DNA质粒构成的疫苗，并旨在预防HIV-1感染。所述疫苗的设计是为了引起针对来自三种HIV-1进化枝的几种蛋白的免疫应答。质粒VRC-4306(SEQID NO：20)被设计成表达来自进化枝B的HIV-1聚蛋白(结构核心蛋白Gag，病毒聚合酶Pol和辅助蛋白Nef)，并占所述疫苗的50％(重量比)。质粒VRC-5305(SEQ ID NO：21)、VRC-2805(SEQ ID NO：22)和VRC-5309(SEQ ID NO：23)分别表达来自进化枝A、进化枝B和进化枝C的HIV-1包膜(Env)糖蛋白，并各占所述疫苗的16.67％(重量比)。
对表达HIV-1 Gag-Pol-Nef聚蛋白的DNA质粒进行了修饰，通过向影响蛋白酶、反转录酶和整合酶活性的区域中引入缺失降低了毒性。所述Nef蛋白的氨基酸序列并未被修饰。将所述Nef蛋白的氨基酸序列从起始甲硫氨酸至HIV的pol基因以读框方式融合，该序列是没有功能的。用来构建编码Env的DNA质粒的序列来自三种HIV-1 CCR5定向性的病毒株。所述基因产物的表达式通过组成型细胞巨化病毒(CMV)启动子控制的。这些DNA质粒是在卡那霉素选择的细菌细胞培养物中产生的。在所有的情况中，细菌细胞的生长都依赖于在所述质粒DNA中编码的卡那霉素抗性蛋白的表达。在含有所述质粒的细菌细胞生长之后，将所述质粒DNA从细胞组分中纯化出来。进化枝B gag-pol-nef质粒(VRC-4306)的长度为9790核苷酸对且分子量约为6.5 MDa；进化枝A、B和C env质粒(VRC-5305，VRC-2805和VRC-5309)的长度分别为6836，6869和6829核苷酸且分子量约为4.5 MDa。
药物的描述
1.药物的名称：    VRC-2805(SEQ ID NO：22)
描述：            Env糖蛋白，进化枝B
分子量：          4.5 MDa
核苷酸对：        6869
2.药物的名称：    VRC-4306(SEQ ID NO：20)
描述：            Gag-Pol-Nef，进化枝B
分子量：          6.5 MDa
核苷酸对：        9790
3.药物的名称：    VRC-5305(SEQ ID NO：21)
描述：            Env糖蛋白，进化枝A
分子量：          4.5 MDa
核苷酸对：        6836
4.药物的名称：    VRC-5309(SEQ ID NO：23)
描述：            Env糖蛋白，进化枝C
分子量：          4.5 MDa
核苷酸对：        6829
A.Gag-Pol-Nef DNA质粒的制备
VRC-4306[pVR1012 Gav-B(ΔFS) Pol(ΔPR ΔRT ΔIN)Nef/h]
为了构建如图32中所示的DNA质粒VRC-4306，使用来自HIV-1进化枝的Gag，Pol和Nef蛋白的序列构建了gag-pol-nef基因的合成聚蛋白版本，其使用了适于在人类细胞中表达的优化密码子。所合成的gag基因来自HIV-1进化枝B株HXB2(GenBank登录号K03455，氨基酸1-432)，合成的pol基因(pol/h)来自于HIV-1进化枝B NL4-3(GenBank登录号M19921)，合成的nef基因(nef/h)来自HIV-1进化枝B株PV22(GenBank登录号K02083)。所合成的gag-pol-nef/h基因的核酸序列与HIV-1基因几乎没有同源性，但所编码的蛋白却是相同的。
此外，在影响蛋白酶(R113G)、反转录酶(D341H)和整合酶(D779A)的区域中引入的突变也降低了功能活性的潜力。需要注意的是，GenBank登录号M19921在113位置有一个G，而对pol基因的诱变研究则证明在该位置的G没有功能活性(Loeb，D.D.等人，1989 Nature 340：397-400)。为了构建gag-pol-nef融合基因，将Pol的前两个氨基酸缺失。对gag和nef基因并未进行修饰。
通过将nef/h融合至gag-pol质粒(VRC-4302)的3’末端构建了质粒VRC-4306，其在国际公开第WO 02/32943号中已有描述。pol和nef之间的融合没有出现氨基酸的缺失或加入。保留了nef的ATG。然后使用SalI和BbvCI限制性位点将所述构建体插入到pVR1012骨架。所述SalI(ATG上游5nt)至BbvCI(ATG下游4917nt)片段含有5’末端，并将所述所述ATG克隆至pVR1012骨架的SalI至BbvCI位点。
表4提供了所预计的VRC-4306结构域的小结。所述质粒的长度为9790核苷酸对(np)且分子量大约为6.5MDa。将卡那霉素基因引入所述细菌载体骨架作为选择标记。VRC-4306的序列为SEQ ID NO：20。
表4  VRC-4306进化枝B gag(Δfs)polΔPR，RT，INT Nef/h预计结构域的小结
  片断名称或蛋白结构域     片段大小(bp) 预计片段位置
 pUC衍生的     247     1-247
 CMV-IE增强子/启动子     638     248-885
 CMV-IE5’非翻译区     244     886-1129
 CMV IE内含子     711     1130-1840
 人工接头     39     1841-1879
 Gag(Δfs)Pol(ΔPR，RT，INT)Nef/h     4920     1880-6799
人工接头     8     6800-6807
牛生长激素polyA     553     6808-7360
pUC衍生的     1473     7361-8833
卡那霉素抗性基因     623     8834-9456
pUC衍生的     334     9457-9790
B.Env DNA质粒的制备
这些DNA质粒被设计成表达HIV-1 Env糖蛋白，通过缺失融合区、剪接区和七重复1(H1)和七重复2(H2)之间的部分间隔区(IS)对所述糖蛋白进行修饰从而降低潜在的细胞毒性。
a.VRC-5305[pVR1012x/s CCR5定向性gp145进化枝A(ΔCFI)/h]
所述DNA质粒，VRC-5305如图33所示。采用来自92rw020(CCR5定向性，GenBank登录号U08794)的进化枝A Env聚蛋白(gp160)的蛋白序列构建了所述基因的合成版本(进化枝A gp145ΔCFI/h)，其使用了适于在人类细胞中表达的优化密码子。所述进化枝A CCR5定向性gp145ΔCFI的核酸序列与92rw020基因几乎没有同源性，但所编码的蛋白却是相同的(需要注意的是GenBank U08794序列确实在其序列的起始位置包含MR密码子，所以其是被插入到所述合成构建体中的)。
所述截短的Env聚蛋白包含完整的表面(SU)蛋白和跨膜(TM)蛋白，但缺乏融合和胞浆区。保留了对寡聚物形成较为重要的区域，尤其是两个螺旋的卷曲的卷曲区。缺失了来自氨基酸486-519的融合区域和剪接(F/CL)区域。还缺失了来自氨基酸576-603的HI和H2之间的IS。然后使用XbaI和BamHI限制性位点将所述构建体插入pVR1012x/s骨架。所述XbaI(ATG上游17nt)至BamHI(ATG下游1897nt)片段包含了位于5’末端的聚合接头，并将所述ATG克隆至pVR1012x/s骨架的XbaI至BamHI位点。
表5提供了所预计的VRC-5305结构域的小结。所述质粒的长度为6836核苷酸对(np)且分子量大约为4.5 MDa。VRC-5305的序列为SEQ IDNO：21。
表5  VRC-5305进化枝A CCR5定向性gp145ΔCFI/h预计结构域的小结
    片断名称或蛋白结构域   片段大小(bp)   预计片段位置
 pUC衍生的     247     1-247
 CMV-IE增强子/启动子     638     248-885
 CMV-IE 5’非翻译区     244     886-1129
 CMV IE内含子     711     1130-1840
 人工接头     82     1841-1922
 CCR5-定向性gp145ΔCFI/h     1881     1923-3803
 人工接头     16     3804-3819
 牛生长激素poly A     587     3820-4406
 pUC衍生的     1473     4407-5879
 卡那霉素素抗性基因     623     5880-6502
 pUC衍生的     334     6503-6836
b.VRC-2805[pVR1012x/s CCR5定向性gp145(ΔF/CLΔHIS)/h]
所述DNA质粒，VRC-2805如图34所示。采用来自HXB2(CXCR4定向性，GenBank登录号K03455)的进化枝B Env糖蛋白(gp160)的蛋白序列构建了所述基因的合成版本(CXCR4gp160/h)，其使用了适于在人类细胞中表达的优化密码子。X4gp160/h的核酸序列与HXB2基因几乎没有同源性，但所编码的蛋白却是相同的，除了以下氨基酸替换：F53L，N94D，K192S，P470L，I580T和Z653H。为了产生所述Env糖蛋白(R5gp160/h)的CCR5定向性版本，采用来自HIV-1 BaL株(GeneBank登录号M68893)的对应区域替换了来自X4gp160/h中编码HIV-1 Env聚蛋白氨基酸205-361的区域(VRC-3300，在国际公开第WO 02/32943号中已有描述)，并再次使用了人类偏好的密码子。R5gp160/h的核酸序列与CCR5基因几乎没有同源性，但所编码的蛋白却是相同的，仅有以下的氨基酸替换：I219N，L265V，N266T和S268N。
来自pR5gp160/h(VRC-3000，在国际公开第WO 02/32943中已有描述)的env基因的全长CCR5定向性版本在编码氨基酸704的密码子之后终止。所述截短的Env糖蛋白(gp145)包含完整的表面(SU)蛋白和部分跨膜(TM)蛋白，其包括融合区、跨膜区和对寡聚物形成的重要区域，尤其是两个螺旋的卷曲的卷曲基序。缺失了来自氨基酸503-536的融合区域和剪接(F/CL)区域。还缺失了来自氨基酸594-619的HI和H2之间的IS。然后使用XbaI和BamHI限制性位点将所述构建体插入pVR1012x/s骨架。所述XbaI(ATG上游18nt)至BamHI(ATG下游1937nt)片段包含了位于5’末端的聚合接头，并将所述ATG克隆至pVR1012x/s骨架的XbaI至BamHI位点。
表6提供了所预计的VRC-2805结构域的小结。所述质粒的长度为6869核苷酸对(np)且分子量大约为4-5MDa。将卡那霉素引入所述细菌载体骨架作为选择标记。VRC-2805的序列为SEQ ID NO：22。
表6进化枝B VRC-2805 CCR5定向性gp145ΔCFI/h预计结构域的小结
片断名称或蛋白结构域 片段大小(bp) 预计片段位置
pUC衍生的     247     1-247
CMV-IE增强子/启动子     638     248-885
CMV-IE5’非翻译区     244     886-1129
CMV IE内含子     711     1130-1840
人工接头     74     1841-1914
CCR5-定向性gp145ΔCFI/h     1929     1915-3843
人工接头     9     3844-3852
牛生长激素polyA     587     3853-4439
pUC衍生的     1473     4440-5912
卡那霉素抗性基因     623     5913-6535
pUC衍生的     334     6536-6869
c.VRC-5309[pVR1012x/s CCR5定向性gp145进化枝C(ΔCFI)/h]
所述DNA质粒，VRC-5309如图35所示。采用来自97ZA012(CCR5定向性，GenBank登录号AF286227)的进化枝C Env聚蛋白(gp145ΔCFI)的蛋白序列构建了所述基因的合成版本(进化枝C gp145ΔCFI/h)，其使用了适于在人类细胞中表达的优化密码子。进化枝C CCR5定向性gp145ΔCFI/h的核酸序列与97ZA012基因几乎没有同源性，但所编码的蛋白却是相同的，除了以下氨基酸替换：D605E。所述截短的Env糖蛋白包含完整的SU蛋白和TM蛋白，但缺乏融合区域和胞浆区域。保留了对寡聚物形成较为重要的区域，尤其是两个螺旋的卷曲的卷曲基序。缺失了来自氨基酸487-520的融合区域和剪接(F/CL)区域。还缺失了来自氨基酸577-604的HI和H2之间的间隔区。然后使用XbaI和BamHI限制性位点将所述构建体插入pVR1012x/s骨架。所述XbaI(ATG上游17nt)至BamHI(ATG下游1882nt)片段包含了位于5’末端的聚合接头，并将所述ATG克隆至pVR1012x/s骨架的XbaI至BamHI位点。
表6提供了所预计的VRC-5309结构域的小结。所述质粒的长度为6829核苷酸对(np)且分子量大约为4.5 MDa。将卡那霉素引入所述细菌载体骨架作为选择标记。VRC-5309的序列为SEQ ID NO：23。
表7VRC-5309进化枝C CCR5定向性gp145ΔCFI/h预计结构域的小结
    片断名称或蛋白结构域   片段大小(bp) 预计片段位置
pUC衍生的 247  1-247
CMV-IE增强子/启动子 638  248-885
CMV-IE 5’非翻译区 244  886-1129
CMV IE内含子 711  1130-1840
人工接头 82  1841-1922
CCR5-定向性gp145 ΔCFI/h 1881  1923-3803
人工接头 9  3804-3812
牛生长激素polyA 587  3813-4399
pUC衍生的 1473  4400-5872
卡那霉素抗性基因 623  5873-6495
pUC衍生的 334  6496-6829
C.VRC-HIVDNA009-00-VP质粒组分与人类基因组序列同源性的分析
由Lark Technologies对质粒VRC-2805，4306，5305和5309进行了测序，并使用搜索人类est数据库的BLASTN程序将所述序列用BLAST进行搜索。使用仅能以0.01或更低的期望值(E值)鉴定序列同源性的参数进行所述搜索。这意味着同源性发生的统计学可能性几率仅为1/100。通过所述搜索能采集到在该水平或更低水平(即低于1/100)的任意事件。所述结果表明在低于E＝0.01的多种同源性。有一个例外，所述同源性是在pUC 18质粒中的或是在所述质粒的CMV启动子部分。此外，所测定的序列与在所述质粒中的序列一致性为85-100％。可以认为这些同源性是不真实的，并来自于克隆操作的含质粒序列的人类基因组数据库的污染。
其他结果表明了与所述质粒的牛生长激素poly A终止子部分的同源性。所测定的序列与所述质粒中的序列有90-100％的一致性。和这一同源性相关的人类基因与人类生长激素或相关蛋白并不相关。经过进一步的审查，对所述克隆的描述说明它们是从表达载体(例如，pDNA3)中剪切下来的，其中所述克隆位点与牛生长激素poly A终止子紧密相连。由于具有以上所述的pUC 18同源性，可以认为这些同源性是不真实的，并来代表了来自于克隆操作具有质粒序列的所述数据库的污染。
D.药物的分析方法
体外转染和表达分析
在对所述疫苗产物进行制备之前，对单个质粒(gag-pol-nef，进化枝A包膜，进化枝B包膜和进化枝C包膜)进行了表达测定。通过比较在Western印记中反应蛋白条带的强度与在相同条件下的标准操作的强度，对单个质粒表达水平的半定量值进行了测定。一旦所述质粒组合，则采用相同的分析方法验证表达的定量水平。然而，因为抗体是交叉反应的，因此不能对所述混合物中特定进化枝包膜的表达水平进行定量。
通过对转染HEK-293(人胚胎肾)细胞中表达的Gag-Pol-Nef蛋白进行定量确定了由质粒VRC-4306编码的Gag-Pol-Nef蛋白的表达。对转染而言，使用磷酸钙方法，用1-5μg VRC-4306质粒DNA转染105-106细胞。将细胞孵育14-20小时从而允许DNA摄入。在更换培养基之后，在收获之前将细胞再生长24-48小时。采用在相似骨架中的人碱性磷酸酶载体对转染效率进行监测。
在细胞裂解后，将10-50μg总细胞蛋白上样于SDS-PAGE凝胶，从而对粗裂解物蛋白进行分离。为了进行定量，将25-250ng HIV1 gag-β-gal融合蛋白(Chemicon)与10μg来自未转染HEK293细胞的细胞裂解物混合，并上样于凝胶。电泳1-3小时后，将所述蛋白转移至硝酸纤维素膜(0.45μm)进行Western印记分析。在与初级抗体进行孵育之前，用脱脂奶对所述膜进行封闭30-60分钟以防止非特异性的结合作用。洗涤之后将所述膜与HRP-羊抗鼠IgG孵育30-60分钟。通过将所述膜与化学发光底物孵育并暴露于X光膜2-30分钟可以见到所述蛋白条带。为了进行定量，可将Gag-Pol-Nef蛋白条带的强度与HIV-1 gag-β-gal融合蛋白条带的强度进行比较。
采用对VRC-4306进行分析的类似方式，对质粒VRC-5305，VRC-2805和VRC-5309包膜蛋白表达的分析进行了测定。在用所述质粒进行转染之后，收集细胞裂解物并进行Western印记分析。为了进行免疫测定，将所述膜与抗gp160的人IgG抗血清(NIH AIDS研究和参考试剂项目)孵育。通过比较所述包膜蛋白条带的强度与纯化的gp160蛋白标准品条带的强度对蛋白表达水平进行定量。采用在相似骨架中的β-半乳糖苷酶表达载体对转染效率进行监测。
部分VII VRC-HIVDNA016-00-VP
引言
VRC-HIVDNA016-00-VP是多质粒DNA疫苗，旨在用作HIV-1的预防型疫苗。其是6种质粒等浓度的混合物。其构建是为了产生Gag，Pol，Nef和Env HIV-1蛋白，从而潜在地引起对于在人类感染中分离到的多种HIV-1亚型的广泛免疫应答。
药物的描述
药物的名称：      VRC-4401(SEQ ID NO：24)
描述：            HIV-1 Gag(进化枝B)
分子量：          3.9 MDa
核苷酸对：        5886
药物材质的名称：  VRC-4409(SEQ ID NO：25)
描述：            HIV-1 Pol(进化枝B)
分子量：          4.8 MDa
核苷酸对：        7344
药物材质的名称：  VRC-4404(SEQ ID NO：26)
描述：            HIV-1 Nef(进化枝B)
分子量：          3.3 MDa
核苷酸对：        5039
药物材质的名称：  VRC-5736(SEQ ID NO：27)
描述：            HIV-1 Env(进化枝A)
分子量：          4.2 MDa
核苷酸对：        6305
药物材质的名称：  VRC-5737(SEQ ID NO：28
描述：            HIV-1 Env(进化枝B)
分子量：          4.2 MDa
核苷酸对：        6338
药物材质的名称：  VRC-5738(SEQ ID NO：29)
描述：            HIV-1 Env(进化枝C)
分子量：          4.2 MDa
核苷酸对：        6298
A.HIV-1 DNA质粒的构建
用于VRC-HIVDNA016-00-VP的药物是6种闭合环状质粒DNA分子(VRC-4401，VRC-4409，VRC-4404，VRC-5736，VRC 5737和VRC-5738)，其产生于含有卡那霉素选择培养基的细菌细胞培养物中。在所有情况中，细菌细胞的生长都依赖于在所述质粒DNA部分中编码的卡那霉素抗性蛋白的表达。在含有所述质粒的细菌细胞生长之后，将所述质粒DNA从细胞组分中纯化出来。
使用含有病毒基因互补DNA(cDNA)的质粒将相关插入子亚克隆进入使用CMV/R启动子和牛生长基因多聚腺苷酸化序列的质粒DNA表达载体中。对所述HIV-1基因插入子进行修饰从而优化在人类细胞中的表达。为了进一步优化基因表达，所述CMV/R启动子包含了用人T细胞白血病病毒1型(HTLV-1)长末端重复(LTR)的5’非翻译HTLV-1 R-U5区取代的CMV极早区1增强子的翻译增强子区。
CMV/R-HIV-1进化枝B Gag/h(VRC-4401)
为了构建如图36所示的DNA质粒VRC-4401，采用来自HXB2(GenBank登录号K03455)的gag聚蛋白(Pr55，氨基酸1-432)的蛋白序列构建了所述gag基因的合成版本，其使用了适于在人类细胞中表达的优化密码子。所合成的gag基因的核酸序列与HXB2基因几乎没有同源性，但所编码的蛋白却是相同的。所述Gag(B)的SalI和BamHI片段剪切自VRC 3900(在国家公开第WO 02/32943中已有描述)，其含有在pVR1012骨架中的相同插入子，并将其克隆入上述CMV/R骨架的SalI/BamHI位点。
表8提供了所预计的VRC-4401结构域的小结。所述质粒的长度为5886核苷酸碱基对(bp)且分子量大约为3.9 MDa。VRC-4401的序列为SEQ ID NO：24。
表8  VRC-4401预计结构域的小结：HIV-1 Gag(进化枝B)
    片段名称或蛋白结果域     片段大小(bp)     预计片段
pUC18质粒衍生的     247     1-247
CMV-IE增强子/启动子     742     248-989
HTLV-1R区     231     990-1220
CMVIE剪接受体     123     1221-1343
人工接头     31     1344-1374
HIV-1 Gag(进化枝B)     1509     1375-2883
人工接头     23     2884-2906
牛生长激素Poly A     548     2907-3454
pUC18质粒衍生的     1311     3455-4765
卡那霉素抗性基因     816     4766-5581
pUC18质粒衍生的     305     5582-5886
CMV/R进化枝B Pol/h(VRC-4409)的构建
为了构建如图37所示的DNA质粒VRC-4409，采用来自NL4-3(GenBank登录号M19921)的pol聚蛋白(氨基酸3-1003)的蛋白序列构建了所述pol基因的合成版本，其使用了适于在人类细胞中表达的优化密码子。为了在Pol的开始就启动翻译，向所述合成聚合酶基因的5’末端加入了甲硫氨酸密码子，构建了Pol/h基因。所述蛋白酶(PR)的突变位于氨基酸553，是AGG->GGC或氨基酸R->G。所述反转录酶(RT)突变位于氨基酸771，是GAC->CAC或氨基酸D->H。如上所述将表达Pol的基因插入所述CMV/R骨架。
表9提供了所预计的VRC-4409结构域的小结。所述质粒的长度为7344核苷酸碱基对(bp)且分子量大约为4.8 MDa。VRC-4409的序列为SEQ ID NO：25。
表9 VRC-4409预计结构域的小结：HIV-1 Pol(进化枝B)
    片段名称或蛋白结果域     片段大小(bp)     预计片段
pUC18质粒衍生的     247     1-247
CMV-IE增强子/启动子     742     248-989
HTLV-1R区     231     990-1220
CMV IE剪接受体     123     1221-1343
人工接头     5     1344-1348
HIV-1 Pol(进化枝B)(Pr-，RT-，IN-)     3009     1349-4357
人工接头     7     4358-4364
牛生长激素Poly A     548     4365-4912
pUC18质粒衍生的     1311     4913-6223
卡那霉素抗性基因     816     6224-7039
pUC18质粒衍生的     305     7040-7344
CMV/R HIV-1 Nef/h(VRC-4404)的构建
为了构建如图38所示的DNA质粒VRC-4404，采用来自HIV-1NY5/BRU(LAV-1)克隆pNL4-3(GenBank登录号M19921)的Nef蛋白的蛋白序列构建了所述Nef基因(Nef/h)的合成版本，其使用了适于在人类细胞中表达的优化密码子。Nef/h的核酸序列与所述病毒基因几乎没有同源性，但所编码的蛋白却是相同的。缺失了Myristol位点(GGC-Gly，氨基酸2-3)。用XbaI/BamHI将原先插入的编码Nef的片段从pVR1012骨架上消化下来，然后将其克隆至上述CMV/R的XbaI/BamHI位点。
表10提供了所预计的VRC-4404结构域的小结。所述质粒的长度为5039核苷酸碱基对(bp)且分子量大约为3.3 MDa。VRC-4404的序列为SEQ ID N0：26。
表10 VRC-4404预计结构域的小结：HIV-1 Nef(进化枝B)
  片段名称或蛋白结果域     片段大小(bp)   预计片段
pUC18质粒衍生的     247     1-247
CMV-IE增强子/启动子     742     248-989
HTLV-1R区     231     990-1220
CMV IE剪接受体     123     1221-1343
人工接头     48     1344-1391
HIV-1 Nef(进化枝B)(Delta Myr)     615     1392-2006
人工接头     19     2007-2025
牛生长激素Poly A     548     2026-2573
pUC18质粒衍生的     1345     2574-3918
卡那霉素抗性基因     816     3919-4734
pUC18质粒衍生的     305     4735-5039
CMV/R-HIV-1进化枝A Env/h(VRC-5736)
为了构建如图39所示的DNA质粒VRC-5736，采用来自92rw020(R5定向性，GenBank登录号U08794)的包膜聚蛋白(gp160)的蛋白序列构建了所述基因(进化枝-A gp145ΔCFI)的合成版本，其使用了在人类细胞改变表达的密码子。通过采用在人类细胞中常用的密码子，使用旨在破坏限制蛋白表达的病毒RNA结构的序列，合成了表达所述HIV-1基因的质粒。R5gp145ΔCFI的核酸序列与92rw020基因几乎没有同源性，但所编码的蛋白却是相同的。所截短的包膜聚蛋白含有完整的SU蛋白和TM区，但缺乏融合区和胞浆区。对寡聚物形成较为重要的区域可能具有部分功能。七重复(H)1，七重复2和他们的间隔部分(IS)是寡聚化所必需的。缺失了来自氨基酸486-519的所述融合区和剪接(F/CL)区。还缺失了来自氨基酸576-604的七重复(H)1和2之间的间隔区域(IS)。所述XbaI(ATG上游18nt)到BamHI(ATG下游1912nt)片段含有5’末端聚合接头、Kozak序列和ATG，并将该片段克隆于上述CMV/R骨架的XbaI至BamHI位点。
表11提供了所预计VRC-5736结构域的小结。所述质粒的长度为6305核苷酸碱基对(bp)且分子量大约为4.2 MDa。VRC-5736的序列为SEQ ID NO：27。
表11 VRC-5736预计结构域的小结：HIV-1 Env(进化枝A)
    片段名称或蛋白结果域   片段大小(bp)     预计片段
pUC18质粒衍生的     247     1-247
CMV-IE增强子/启动子     742     248-989
HTLV-1R区     231     990-1220
CMV IE剪接受体     123     1221-1343
人工接头     48     1344-1391
HIV-1Env(进化枝A)，gp145(ΔCFI)/h     1881     1392-3272
人工接头     19     3273-3291
牛生长激素poly A     548     3292-3839
pUC18质粒衍生的     1345     3840-5184
卡那霉素抗性基因     816     5185-6000
pUC18质粒衍生的     305     6001-6305
CMV/R进化枝B Env/h(VRC-5737)的构建
为了构建如图40所示的DNA质粒VRC-5737，采用来自HXB2(X4定向性，GenBank登录号K03455)的包膜聚蛋白(gp160)的蛋白序列构建了所述基因(X4gp160/h)的合成版本，其使用了适于在人类细胞中表达的优化密码子。X4gp160/h的核酸序列与HXB2基因几乎没有同源性，但所编码的蛋白却是相同的，具有以下氨基酸取代：F53L，N94D，K192S，I215N，A224T，A346D和P470L。为了制备所述包膜蛋白(R5gp160/h)的R5定向性版本，采用来自HIV-1的BaL株(GeneBank登录号M68893，再次使用人偏好的密码子)的对应区域替换了X4gp160/h(VRC3300)中来自氨基酸275-361编码HIV-1包膜聚蛋白的区域。来自pR5gp160/h(VRC3000，在国际公开第WO 02/32943号中已有描述)的包膜蛋白基因的全长R5定向性版本在氨基酸704的密码子之后终止。该截短的包膜糖蛋白(gp145)包括完整的SU蛋白和部分TM蛋白，其包括融合结构域、跨膜结构域和寡聚物形成的重要区域。七重复(H)1，七重复2及其间隔(IS)是寡聚化所必需的。缺失了来自氨基酸503-536的所述融合区和剪接(F/CL)区。还缺失了来自氨基酸593-620的七重复(H)1和2之间的间隔区域(IS)。所述表达载体的骨架是CMV/R，如前所述。
表12提供了所预计的VRC-5737结构域的小结。所述质粒的长度为6338核苷酸碱基对(bp)且分子量大约为4.2 MDa。VRC-5737的序列为SEQ ID NO：28。
表12 VRC-5737预计结构域的小结：HIV-1 Env(进化枝B)
    片段名称或蛋白结果域   片段大小(bp)     预计片段
pUC18质粒衍生的     247     1-247
CMV-IE增强子/启动子     742     248-989
HTLV-1R区     231     990-1220
CMV IE剪接受体     123     1221-1343
人工接头     40     1344-1383
HIV-1Env(进化枝B)，gp145(ΔCFI)/h     1929     1384-3312
人工接头     12     3313-3324
牛生长激素Poly A     548     3325-3872
pUC18质粒衍生的     1345     3873-5217
卡那霉素抗性基因     816     5218-6033
pUC18质粒衍生的     305     6034-6338
CMV/R HIV-1进化枝C Env/h(VRC-5738)的构建
为了构建如图41所示的DNA质粒VRC-5738，采用来自97ZA012(R5定向性，GenBank登录号AF286227)的包膜聚蛋白(gp145ΔCFI)的蛋白序列构建了所述基因(进化枝-C gp145ΔCFI)的合成版本，其使用了适于在人类细胞中表达的优化密码子。R5gp145ΔCFI的核酸序列与97ZA012基因几乎没有同源性，但所编码的蛋白却是相同的。该截短的包膜糖蛋白包括完整的SU蛋白和部分TM蛋白，但缺乏融合结构区和胞浆区。对寡聚化形成具有重要作用的区域可以是具有部分功能的。七重复(H)1，七重复2及其间隔(IS)是寡聚化所必需的。缺失了来自氨基酸487-520的所述融合区和剪接(F/CL)区。还缺失了来自氨基酸577-605的七重复(H)1和2之间的间隔区域(IS)。所述XbaI(ATG上游18nt)到BamHI(ATG下游1914nt)片段含有5’末端聚合接头、Kozak序列和ATG，并将该片段克隆于CMV/R骨架的XbaI至BamHI位点。
表13提供了所预计的VRC-5738结构域的小结。所述质粒的长度为6298核苷酸碱基对(bp)且分子量大约为4.2 MDa。VRC-5738的序列为SEQ ID NO：29。
表13  VRC-5738预计结构域的小结：HIV-1 Env(进化枝C)
    片段名称或蛋白结果域   片段大小(bp)     预计片段
pUC18质粒衍生的         247     1-247
CMV-IE增强子/启动子         742     248-989
HTLV-1R区         231     990-1220
CMV IE剪接受体         123     1221-1343
人工接头         48     1344-1391
HIV-1Env(进化枝C)，gp145(ΔCFI)/h         1881     1392-3272
人工接头         12     3273-3284
牛生长激素Poly A         548     3285-3832
pUC18质粒衍生的         1345     3833-5177
卡那霉素抗性基因         816     5178-5993
pUC18质粒衍生的         305     5994-6298
B.HIV-1质粒与人类基因组序列同源性的的分析
由Lark Technologies对质粒VRC-4401，4409，4404，5736，5737和5738进行了测序，并将所述序列用人类基因组数据库的BLAST搜索。使用仅能以0.01或更低的期望值(E值)鉴定序列同源性的参数进行所述搜索。这意味着同源性发生的统计学可能性几率仅为1/100。通过所述搜索能采集到在该水平或更低水平(即低于1/100)的任意事件。
C.药物的分析方法
体外转染和表达分析
对单个质粒进行了表达测定并在所述疫苗产物释放之前进行药物产物的最终配制。通过将在Western印记中具有反应的蛋白条带与在相同条件下的标准操作的条带进行比较，对质粒蛋白的定性表达进行了验证。一旦所述质粒组合，则采用相同的分析方法验证表达。通过测定转染HEK-293人胚胎肾(HEK)细胞中的蛋白表达的测定表达。对转染而言，使用磷酸钙方法，用1-5μg VRC-4306质粒DNA转染105-106细胞。将细胞孵育14-20小时从而允许DNA摄入。在更换培养基之后，在收获之前将细胞再生长24-48小时。采用在相似骨架中的公知载体对转染效率进行监测。在细胞裂解后，将10μg适量的总细胞蛋白上样于SDS-PAGE凝胶，从而对粗裂解物蛋白进行分离。
电泳1.5小时后，将所述蛋白转移至硝酸纤维素膜(0.45μm)进行Western印记分析。在与初级抗体进行孵育之前，用脱脂牛奶对所述膜进行封闭60分钟以防止非特异性的结合作用。洗涤之后将所述膜与HRP-偶联的二抗体孵育45分钟。通过将所述膜与化学发光底物孵育并暴露于X光膜2分钟或适当的时间可以见到所述蛋白条带。通过观察在所述Western印记上的表达蛋白的强度，可以测定由转染细胞产生的蛋白的表达。可将所述分析方法进一步开发，从而允许通过疫苗质粒进行蛋白表达的半定量分析。
部分VIII  VRC NIH ADV014-00-VP
研究试剂VRC-HIV ADV014-00-VP的描述
重组腺病毒载体产物VRC-HIVADV014-00-VP(rAd)是复制缺陷型的组合疫苗，其含有4种重组血清型5的腺病毒载体。这些载体含有编码进化枝B HIV-1 Gag和Pol以及进化枝A、进化枝B和进化枝C Env蛋白的基因序列。这些载体的体内表达产生了能够诱导针对HIV免疫应答的免疫原。所述包膜基因被选为来自所述三种进化枝中每一种的代表性原始分离物。
构建所述四种VRC-HIVADV014-00-VP重组腺病毒载体的方法是基于快速载体构建系统(AdFASTTM，GenVec，Inc.)，该系统是用来构建腺病毒载体，该载体通过细胞巨化病毒(CMV)极早启动子的驱动表达四种HIV抗原gp140(A)，gp140(B)dv12，gp140(C)和GagPol(B)。所述制备是基于在293-ORF6细胞系中的生产(Brough，D.E.等人，1996 J Virol 70：6497-6501)，其产生的腺病毒载体是复制缺陷型的。使用CsCl离心对所述载体进行纯化。将所述产物制备成用于肌肉注射的无菌液体可注射剂量形式。
1.gag-pol腺病毒载体的制备
AdtGagPol(B).11D(SEQ ID NO：33)
采用来自HIV-1进化枝B的Gag和Pol蛋白的蛋白序列构建所述gag-pol基因的合成聚蛋白版本，其使用了适于在人类细胞中表达的优化密码子。所合成的gag基因来自HIV-1进化枝B株HXB2(GenBank登录号K03455)，而所合成的pol基因(pol/h)来自HIV-1进化枝B NL4-3(GenBank登录号M19921)。所述pol基因是无功能的，因为其作为了融合蛋白。向合成的蛋白酶和反转录酶基因中引入突变。所述蛋白酶修饰防止了对pol基因产物的加工，并降低了功能性蛋白酶、反转录酶和整合酶活性的潜力。用来构建AdtGagPol(B).11D的cDNA类似于HIV-1 DNA疫苗VRC-4302(在国际公开第WO 02/32943号中已有描述)，对其进行了测定并表明没有反转录酶活性。对gag未作修饰。为了构建所述腺病毒载体，采用标准重组DNA技术将所述HIV-1 DNA序列亚克隆至E1穿梭质粒的表达盒。
2.env腺病毒载体的制备
Adgp140(A).11D(SEQ ID NO：30)
采用来自92rw020(CCR5定向性，GenBank登录号U08794)的包膜聚蛋白(gp160)的蛋白序列构建了所述基因(进化枝-A gp140ΔCFI)的合成版本，其使用了在人类细胞中选择表达的密码子。通过采用在人类细胞中常用的密码子，使用旨在破坏限制蛋白表达的病毒RNA结构的序列，合成了表达所述HIV-1基因的质粒。为了构建所述腺病毒载体，采用标准重组DNA技术将所述HIV-1 DNA序列亚克隆至E1穿梭质粒的表达盒。
Adtgp140dv12(B).11D(SEQ ID NO：32)
采用来自HXB2(X4定向性，GenBank登录号K03455)的包膜聚蛋白(gp160)的蛋白序列构建了所述基因(X4gp160/h)的合成版本，其使用了适于在人类细胞中表达的优化密码子。为了构建所述包膜蛋白(R5gp160/h)的CCR5定向性版本，采用来自HIV-1的BaL株(GeneBank登录号M68893，再次使用人偏好的密码子)的对应区域替换了编码X4gp160/h(VRC3300)中HIV-1包膜聚蛋白氨基酸275-361的区域。来自pR5gp160/h(VRC3000)的包膜蛋白基因的全长CCR5定向性版本在氨基酸680的密码子之后终止。该截短的Env糖蛋白(gp140)包括完整的表面蛋白和gp41的外功能区，包括融合结构域和对寡聚物形成较为重要的区域，尤其是两个螺旋的卷曲的卷曲基序。缺失所述Env V1和V2环，从而改善在所述生产细胞系中所述载体的稳定性和产率。由于引入了限制性酶位点，在所述缺失后立即引入两个其它的氨基酸。为了构建所述腺病毒载体，采用标准重组DNA技术将所述HIV-1 DNA序列亚克隆至E1穿梭质粒的表达盒。
Adgp140(C).11D(SEQ ID NO：31)
采用来自97ZA012(CCR5定向性，GenBank登录号AF286227)的包膜聚蛋白(gp140ΔCFI)的蛋白序列构建了所述基因的(进化枝-C gp140ΔCFI)的合成版本，其使用了适于在人类细胞中表达的优化密码子。为了构建所述腺病毒载体，采用标准重组DNA技术将所述HIV-1 DNA序列亚克隆至E1穿梭质粒的表达盒。
所有四种腺病毒载体
为了产生所述腺病毒载体质粒，采用基于AdFASTTM质粒pAdE1(BN)E3(10)E4(TIS1)的GV11腺载体在大肠杆菌(E.coli)BjDE3细菌中对所述四种E1穿梭质粒进行重组。然后通过将所述腺病毒载体质粒引入包装细胞系293-ORF6，产生了复制缺陷型的腺病毒载体AdtGagPol(B).11D，Adgp140(A).11D，Adtgp140dv12(B).11D和Adgp140(C).11D。
部分IX临床数据
当通过治疗分配进行分类时，来自VRC-HIVDNA-009-00-VP疫苗临床研究(VRC-004)12周的全部初始免疫原性数据说明，在近100％受者中在全部剂量水平都检测到了CD4+应答。对CD8+应答的测定基本上折半。当针对Env时，通常可以观察到最大的应答(在频率上和幅度上)。与2mg剂量相比，4mg和8mg的剂量能观察到更大的应答，尽管在2mg剂量时受试者数量较少而没有统计显著性。与在4mg和8mg两种剂量水平的2次注射相比，3次注射之后能够观察到更大的应答，尽管其不是统计显著性的，并且也无法确定这是因为第3次注射或仅是因为在第2次之后应答的发展而来的。在6周的时间点(第二次注射后两周)，用4mg和8mg剂量最先检测到了确定的细胞免疫应答。
采用ELISA和Westetn印记对免疫的血清学反应进行分析。通过标准HIV ELISA或Western印记分析，2mg剂量的受试者没有表现出体液免疫的迹象。在用4mg剂量免疫中，在20个受试者中测定了11个受试者具有HIV ELISA反应(55％)，而在8mg的剂量中，在15个患者中测定到了3个具有HIV ELISA反应(20％)。具有免疫诱导抗体的研究受试者具有未检测到的或阴性的Western印记结果。采用在VRC 004中使用的评测进度表，研究第8周是能测定到阳性疫苗诱导HIV ELISA的最早时间点，尽管更常见的阳性ELISA通常是在研究第12周首次测定到的，有些还可在更晚的时间点首次测定到。正如在连续ELISA测量方法中所报告的降低的光密度检测所提示的，一段时间后似乎所述疫苗诱导的HIVELISA反应的强度有所降低。
部分X其他构建体
表14 V3-1AB修饰的包膜构建体
 VRC序号：       构建体 附图序号：  SEQID NO：
VRC 5747 CMV/R-进化枝B gp145(ΔCFI)(ΔV12)(V3-1AB-进化枝C-SA)/h   46     38
VRC 5753 CMV/R-gp145(ΔCFI)(ΔV1-2)(ΔV3)(1AB)(进化枝A)   47     39
VRC 5754 CMV/R-gp145(ΔCFI)(ΔV1-2)(ΔV3)(1AB)(进化枝SA-C)   48     40
VRC 5755 pAdApt LoxP CMV TbGH(+)gp140ΔCFIΔV1V2(1AB)(Bal)/h   49     41
VRC 5766 pAdApt Loxp CMV TbGH(+)gp140(ΔCFI)(V3-1AB)进化枝A/h   50     42
VRC 5767 pAdApt LoxP CMV TbGH(+)gp140(ΔCFI)(ΔV12)(V3-1AB)h进化枝A   51     43
VRC 5768 pAdApt LoxP CMV TbGH(+)gp140(ΔCFI)(ΔV1-2)进化枝B(V3-1AB-进化枝A)/h   52     44
VRC 5769 pAdApt LoxP CMV TbGH(+) gp140(ΔCFI)(V3-1AB)进化枝C(SA)/h   53     45
VRC 5770 pAdApt LoxP CMV TbGH(+) gp140(ΔCFI)(ΔV1-2)(V3-1AR)h进化枝C(SA)   54     46
VRC 5771 CMV/R gp145(ΔCFI)(V3-1AB)/h进化枝A   55     47
VRC 5772 CMV/R gp145(ΔCFI)(ΔV1-2)进化枝B(V3-1AB进化枝A)/h   56     48
VRC 5773 CMV/R gp145(ΔCFI)(V3-1AB)/h进化枝C(SA)   57     49
表15 在Bal gp145Δ(V3-1AB)骨架的V1V2区中的缺失和突变
    构建体 附图序号：   SEQ IDNO：
CMVR-gp145ΔCFIΔV1(V2ΔLR)(V3-1AB)(Bal)   58     50
CMVR-gp145ΔCFI(V12ΔG)(V3-1AB)(Bal)   59     51
CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔG)(V2ΔLR)(V3-1AB)(Bal)   60     52
CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔG)(V2ΔM)(V3-1AB)(Bal)   61     53
CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔG)ΔV2(V3-1AB)(Bal)   62     54
CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔLR)(V2ΔG)(V3-1AB)(Bal)   63     55
CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔLR)ΔV2(V3-1AB)(Bal)   64     56
CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔM)(V2ΔG)(V3-1AB)(Bal)   65     57
CMVR-gp145ΔCFI(V1ΔM)ΔV2(V3-1AB)(Bal)   66     58
CMVR-gp145ΔCFI(V3-1AB)(Bal)   67     59
CMVR-gp145ΔCFIΔV1(V2ΔG)(V3-1AB)(Bal)   68     60
CMVR-gp145ΔCFIΔV1(V2ΔM)(V3-1AB)(Bal)   69     61
CMVR-gp145ΔCFIΔV1(V3-1AB)(Bal)   70     62
CMVR-gp145ΔCFIΔV1V2(V3-1AB)(Bal)   71     63
CMVR-gp145ΔCFIΔV2(V3-1AB)(Bal)   72     64
表16嵌合构建体
 VRC序号：         构建体 附图序号：   SEQ IDNO：
 VRC 5781 pAdApt LoxP CMV TbGH(+)Bal-gp140ΔCFI(C1-V2-CSA)h     73     65
 VRC 5782 CMVR-Bal-gp145ΔCFI(C1-V2进化枝C-SA)(CBBB)     74     66
 VRC 5783 pAdAptLoxP CMV TbGH(+)Bal-gp140ΔCFI(C2-C3-CSA)h(BCBB)     75     67
 VRC 5784 CMVR-Bal-gp145ΔCFI(C2-C3-CSA)h(BCBB)     76     68
 VRC 5785 pAdApt LoxP CMV TbGH(+)Bal-gp140ΔCFI(V4-C5-CSA)/h(BBCB)     77     69
 VRC 5786 CMVR-Bal-gp145ΔCFI(V4-C5-CSA)/h(BBCB)     78     70
 VRC 5787 pAdApt LoxP CMV TbGH(+)gp140ΔCFIM383(Bal)/h(BBBB)     79     71
 VRC 5788 CMVR-Bal-gp145ΔCFIM383(Bal)(BBBB)     80     72
 VRC 5789 pAdApt LoxP CMV TbGH(+)C(SA)gp140ΔCFI(C1-V2Bal)/h(BCCC)     81     73
 VRC 5790 CMVR-C(SA)gp145ΔCFI(C1-V2进化枝B-Bal)(BCCC)     82     74
 VRC 5791 pAdApt LoxP CMV TbGH(+)C(SA)gp140ΔCFI(C2-C3Bal)/h(CBCC)     83     75
 VRC 5792 CMVR-C(SA)gp145ΔCFI(C2-C3进化枝B-Bal)(CBCC)     84     76
 VRC 5793 pAdApt LoxP CMV TbGH(+)C(SA)gp140ΔCFI(V4-C5Bal)/h(CCBC)     85     77
 VRC 5794 CMVR-C(SA)gp145ΔCFI(V4-C5进化枝B-Bal)/h(CCBC)     86     78
CMVR gp145ΔCFI(CCCC)     -     79
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Claims (3)

1.多进化枝HIV质粒DNA疫苗，包含来自进化枝A、B和C的Env和来自单个进化枝的Gag、Pol和Nef，或Gag-Pol-Nef的成分。
2.多进化枝HIV包膜免疫原，包含来自进化枝A、B和C的EnvDNA。
3.如权利要求1所述的疫苗，还包括V1，V2，V3或V4缺失或上述的组合。
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Kantakamalakul. W., et. al..,Cytotoxic T lymphocyte responses to vaccinia virus antigensbut not HIV-1 subtype E envelope protein seen in HIV-1seronegative Thais.Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology19 1.2001,19(1),摘要.
Kantakamalakul. W., et. al..,Cytotoxic T lymphocyte responses to vaccinia virus antigensbut not HIV-1 subtype E envelope protein seen in HIV-1seronegative Thais.Asian Pacific Journal of Allergy and Immunology19 1.2001,19(1),摘要. *
Leonidas stamatatos,.cecilia cheng-mayer, An envelope modification that renders aprimary, neutralization-resistant clade B humanimmunodeficiency virus type 1 isolate highly susceptible toneutralization by sera from other clades,.Journal of virology72 10.1998,72(10),7844.
Leonidas stamatatos,.cecilia cheng-mayer, An envelope modification that renders aprimary, neutralization-resistant clade B humanimmunodeficiency virus type 1 isolate highly susceptible toneutralization by sera from other clades,.Journal of virology72 10.1998,72(10),7844. *
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