CN1214083A - Hiv多包膜蛋白疫苗的重组痘苗载体混合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供多包膜蛋白疫苗,其中包括至少约4－10,000不同重组病毒的混合物,每一重组病毒表达一种不同的HIV包膜蛋白变异体或含有其保守区和变异区在内的一部分;以及制备和应用此多包膜蛋白疫苗和病毒的方法,包括其活的、减毒或灭活的形式在HIV感染的预防和治疗中的应用。本发明的病毒疫苗最适于与重组HIV包膜蛋白加强疫苗或与重组HIV包膜蛋白基因DNA初次或加强疫苗联合使用。

Description

HIV多包膜蛋白疫苗的重组痘苗载体混合物
本工作一部分由国立癌症研究所(NCI)基金R01-CA57419-03和癌症中心核心支持基金P30-CA21765，国立卫生研究院-国立艾滋病研究所(NIH-NIAD)基金AI-32529和P01-A131596-04支持。因此，美国政府拥有本发明一定的权利。
                      发明领域
本发明涉及人免疫缺损病毒(HIV)多包膜蛋白疫苗，此疫苗包括至少4-40且高达10,000种表达不同HIV包膜蛋白变异体的重组痘苗病毒混合物。此疫苗适用于接种包括人在内的哺乳动物，从而可对HIV感染产生出乎意料增强的细胞和/或体液免疫反应。另外，本发明还涉及制备和应用这些重组痘苗病毒和多包膜蛋白疫苗的方法。
                      发明背景
到2000年，艾滋病很可能要吞噬几千万人的生命，是国际上最优先关注的健康问题之一。〔见Devita等，获得性免疫缺损综合征(AIDS)，病原学，诊断，治疗和预防，第三版，J.B.Lippincott Co.Philadelphia,PA(1992)；Wong-Staal，病毒学，pp 1529-1543；及Hirsch等，病毒学，pp 1545-1570〕。设计有效的HIV疫苗对免疫学家尤其是一个挑战，因为参与HIV复制的反转录酶具高出错率。这将导致许多HIV突变株的外壳或包膜蛋白有变异的蛋白序列。这些变异的外膜蛋白常被哺乳动物免疫系统认为是不同的抗原，单为对抗外来抗原，哺乳动物免疫系统每天产生109个以上新的淋巴细胞。B细胞和T细胞分别是体液免疫反应和细胞免疫反应的组成部分。
这种免疫反应定性威力的良好实例反映于HIV感染的病人和SIV感染的恒河猴。在每一种情况下，发生连续几轮的感染，免疫和变异株HIVs或SIVs的建立。〔Wrin等，获得性免疫缺损综合征杂志7:211-219(1994)；Burns and Desrosiers，微生物学与免疫学当前论题。188:185-219(1994)〕。随着每一轮循环，HIV抗原决定簇(及相应的免疫反应)多样性增加，以致于这些免疫反应中和大范围的SIV或HIV变异株，超感染大大地受抑制。
然而，AIDS病人出现受损的免疫反应不足以抵御HIV病毒感染克服病人的免疫系统。这可能部分缘于HIV变异株的建立，其包膜变异蛋白不被病人的免疫系统识别而得以逃避毁灭〔科学的美国人1995年8月pp〕。在这些情况下，免疫系统即使能抵御从头感染(例如：病毒特别隐蔽位点的持续突变)，HIV感染最终可能会克服病人的免疫反应〔Pantaleo等，自然362:355-358(1993)；Embretson等，自然362:359-362(1993)〕。
HIV蛋白的B细胞和T细胞抗原决定簇的鉴定还不完全。HIV包膜蛋白被分为变异区(V1-V5)和保守区(C1-C5)。尽管包膜蛋白的其他区域也参与引发免疫反应，但V3区一段典型肽段被称为主要中和决定簇(PND)〔Javaherian等，美国国家科学院院报86:6768-6772(1989)〕。HIV全长包膜蛋白包含约850-900个氨基酸，其长度差异缘于超突变。〔Starcich等，细胞45:637(1986)〕。
在临床试验中评价的最初抗HIV疫苗被设计成将单个包膜蛋白或其部分呈递于免疫系统。然而，对单个或几个包膜蛋白的中和反应不能识别HIV的多种分离物，因而个体不能抵御感染〔Belshe等，美国医学协会杂志272:431-431(1994)；美国专利：No.5,169,763；PCT公开WO 87/06262；Zagury等，自然332:728-731(1988)；Kieny等，艾滋病国际会议5:541(1989)；Eichberg，艾滋病国际会议7:88(1991)；Cooney等，美国国家科学院院报90:1882-1886(1993)；Graham等，传染病杂志166:244-252(1992)；传染病杂志167:533-537(1993)；Keefer等，艾滋病研究与人类逆转录病毒10(增刊2)：S139-143(1994)；Gorse，艾滋病研究与人类逆转录病毒10(增刊2)：S139-143(1994)；Gorse，艾滋病研究与人类逆转录病毒10(增刊2)：141-143(1994)；McElrath等，传染病杂志169:41-47(1994)；Fauci，科学264:1072-1073(五月，1994)〕。
因而，发现能够引发足以治疗或预防HIV感染免疫反应的疫苗和方法是困扰人们已久而且是急需解决的问题。
                      发明概述
本发明意欲克服相关领域的一个或多个缺陷。特别地，本发明的多包膜蛋白疫苗有助于引发更强的免疫反应。本发明的威力在于它能够募集B细胞、辅助T细胞及细胞毒性T细胞的免疫反应区室(compartments of immune response)以用于有效的体液和细胞免疫。例如，本发明引发很广泛的HIV特异的抗体活性。HIV中和分析表明引发产生的抗体有很高的质量。令人惊奇地是，本发明对“新的”HIV株也能产生免疫反应，新HIV株指的是包膜蛋白不包含于多包膜蛋白鸡尾酒中的HIV菌株。
为了提供更有效的HIV疫苗，本发明提供多包膜蛋白疫苗，其中包括至少4种高到10,000种，优选地4-约1000种，更优选地约10-100种不同的重组病毒的混合物，其中每一种重组病毒表达不同的包括包膜蛋白保守区和变异区的HIV包膜蛋白变异体(EPV)(或其基本部分)。优选地，表达的包膜蛋白变异体中的每一个都具有与存在于感染细胞或HIV脂双层的原初HIV包膜蛋白如寡聚体形式相似的结构和/或免疫原性。本发明也提供了制备和使用这些重组病毒和多包膜蛋白疫苗的方法。在用作为疫苗时，每一包膜蛋白变异体优选地诱发不同B和/或T细胞亚群，每一亚群对不同的包膜蛋白反应，且因此，对多种HIV变异体反应。这些数目、型别和/或结构的包膜蛋白混合物是现在发现的方法，它可引发强而持久且具更广泛中和活性的HIV特异的免疫反应。
在一个优选的实施方案中，此重组病毒选自痘苗病毒、金丝雀痘病毒、腺病毒及腺病毒伴随病毒(AAV)。在下述的一具体实例中，痘苗病毒用于制备多包膜蛋白疫苗。在一个优选实施方案中，本发明的重组痘苗病毒疫苗为皮下方式给药。本发明的另一个优点在于痘苗病毒的皮下施用不会导致创伤的形成，因此可避免感染性痘苗病毒的释放，其中的感染性痘苗病毒对于免疫受损的人是一个很大的威胁。
优选地，本发明的重组病毒多包膜蛋白疫苗包括感染了病毒的培养细胞的裂解物，例如Vero细胞裂解物，它包括了表达的包膜蛋白变异体及感染性病毒。包含能刺激免疫反应的包膜蛋白变异体裂解物是本发明的一个特别之处，因为通常情况下病毒被从培养细胞裂解物中纯化出去。
本发明中的疫苗中，EV核酸可从一地理上隔离区域中感染了HIV病毒的病人中分离到，也可从不同的进化枝(clades)感染了HIV病毒的病人分离到，也可来自HIV的实验室分离物。
本发明者发现本发明的多包膜蛋白疫苗可通过表达和/或呈递多种包膜蛋白变异体来引发出乎意料增强的免疫反应，每一变异体都包括保守区和变异区，优选地，具有与原初HIV包膜蛋白基本相似的结构。增强的免疫反应也识别多包膜蛋白疫苗提供的能表达包膜蛋白株之外的HIV株。因此，这样疫苗的目的是对广泛的HIV株提供增强的免疫反应，此免疫反应适于治疗或预防由不同病毒株引起的感染(或由突变引起的连续感染)。
本发明也提供了编码(或互补于)包膜蛋白变异体(EPV)的至少一个抗原决定簇的包膜蛋白变异体(EV)的核酸。如在本发明中进一步提供的多包膜蛋白疫苗，EPV优选地由重组病毒编码。此变异的核酸包括向编码的EPV提供不同的抗原特性或三维结构的至少一种突变。
本发明也提供了疫苗组合物，它包括本发明的多包膜蛋白疫苗和药学上可以接受的载体或稀释剂。此疫苗组合物可进一步包括佐剂和/或细胞因子，佐剂和/或细胞因子在使用了该疫苗组合物的哺乳动物体内可以增强多包膜蛋白疫苗对于至少一种HIV株的免疫反应。本发明的多包膜蛋白疫苗能够诱发包括体液免疫反应(如，抗体)和细胞免疫反应(如：B细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞(CTLS)的活化)中的至少一种。
本发明也提供了在哺乳动物中引发具有预防HIV感染的针对HIV感染的免疫反应的方法。这种方法包括将包含有本发明的多包膜蛋白疫苗的疫苗组合物施用于哺乳动物，它对于由至少一株HIV引起的临床HIV-相关病理的哺乳动物有保护作用。
本发明也提供了在哺乳动物中引发具有治疗HIV感染的针对HIV感染的免疫反应的方法。这种方法包括将包括本发明的灭活或减毒多包膜蛋白疫苗组合物施用于哺乳动物，与对照组相比，在哺乳动物中此组合物可引发增强的免疫反应，此免疫反应可对抗由至少一株HIV感染引起的临床病毒病理。
在一个进一步的实施方案中，引发抗HIV的免疫反应的预防或治疗方法包括施用有效量的另一种(如，第二种)多包膜蛋白疫苗，这些多包膜蛋白疫苗包括至少4～约10,000种不同的重组病毒，其中的重组病毒与前一次用的疫苗中的重组病毒是不同的种类，并且多包膜蛋白中的每种重组病毒包括编码HIV包膜蛋白不同变异体的核苷酸。
由本发明的多包膜蛋白重组病毒疫苗产生的HIV特异免疫反应可由初次或加强的体液或细胞免疫反应或两者共同进一步加强，这可通过有效量的至少一种重组HIV包膜蛋白或DNA疫苗或两者共同使用来实现。优选地，重组蛋白或DNA疫苗也是多包膜蛋白疫苗。在此提供的任何疫苗策略可以任意顺序使用。例如，对一受试者，可用多包膜蛋白重组病毒疫苗初次免疫，然后用DNA疫苗加强，最后用重组蛋白疫苗加强。优选地，重组HIV包膜蛋白是与佐剂形成混合物。在下述的一具体实施方案中，重组HIV包膜蛋白以肌内方法施用。优选地，DNA疫苗以基因枪施用。
本发明前述的方法提供了用遗传工程方法构建新质粒载体的动力。因此，在理论上讲，本发明提供了既可用作DNA疫苗又可用作重组病毒载体的双功能质粒，它包括一个既在动物表达控制序列又在病毒表达控制序列下的外源插入位点。优选地，动物表达控制序列是巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子，而病毒表达控制序列是痘苗病毒早期启动子，痘苗病毒晚期启动子或两者具备。
通过下面对于有关本发明的详细描述及实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明其他目的、特征、优点、用处及实施方案将显而易见。
                      附图简述图1 HIV-1基因在痘苗病毒基因组中的方向图解。HIV-1包膜蛋白基因位于胸腺嘧啶核苷激酶座位左右两片断之间。HIV-1包膜蛋白基因的C末端有一个Hind Ⅲ位点。适当的插入产生一个大约7kb的Hind Ⅲ片段。Southern印迹带型证实了HIV-1包膜蛋白基因的位置和正确方向。图2数据图解表明哺乳动物模型中HIV特异抗体反应是长期的。ELISA检测典型的小鼠血清中HIV特异性抗体结果被显示。每个样品都在HIV-1包被的ELISA板上分析以前以1∶100(实心柱)、1∶1,000(影线柱)和1∶10,000(空心柱)的稀释度稀释。在注射了107噬斑形成单位(pfu)的表达HIV包膜蛋白的痘苗病毒构建体后，对小鼠在不同的时间取样(1个月，4个月和6个月)。用对照小鼠以不含包膜蛋白序列的痘苗病毒免疫。标准误差示于图上。图3数据图解表明痘苗病毒剂量如何影响至少免疫反应的诱导，包括HIV特异抗体的产生。在HIV-1包被板上用ELISA检测典型小鼠血清样品，血清样品取自分别注射了105、106、107pfu的表达HIV-1包膜蛋白的一种痘苗病毒。注射后约三星期检测血清，每个样品都在HIV-1包被的ELISA板上分析以前以1∶100(实心柱)、1∶1,000(影线柱)和1∶10,000(空心柱)的稀释度稀释，标准误差示于图上。图4数据图解表明，痘苗病毒构建体的混合不能损害注射的哺乳动物中HIV特异的抗体的引发。注射107pfu的表达HIV包膜蛋白的痘苗病毒约2个月后检测典型小鼠血清。“单个”代表来自注射单个痘苗病毒的小鼠样品。“混合”代表注射表达五种不同的包膜蛋白的痘苗病毒混合物的小鼠的样品。每个样品都在HIV-1包被的ELISA板上分析以前以1∶100(实心柱)、1∶1,000(影线柱)和1∶10,000(空心柱)的稀释度稀释，标准误差示于图上。图5用PCR产物代替pEvenv4 BH10序列产生新的痘苗病毒重组。序列替换的方法被列出。PCR产物在KpnⅠ和BsmⅠ单一酶切位点处替换各自的BH10包膜蛋白序列。质粒切割后与PCR产物相连接，新的质粒与野生型痘苗病毒(VV)重组产生痘苗病毒表达载体。图6免疫后Abbott ELISA中的反应。来自4只猩猩的血清都用Abbott临床分析法检测(见后面的材料与方法)。Y-轴为血清样品检测结果，X-轴为每种检测日期。用混合的痘苗病毒包膜蛋白疫苗免疫的猩猩中观察到高的反应。图7既可作为DNA疫苗又可作为痘苗病毒重组载体的双功能质粒图谱，巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子和痘苗病毒(VV)晚期和早期启动子的存在使外源基因在哺乳动物细胞或痘苗病毒感染细胞中进行表达。
                   公开内容的详细描述
对混合型HIV多包膜蛋白疫苗出乎意料地增强的免疫反应的发现。提供抗不同HIV株疫苗的先前尝试集中于gp120或gp160的一个或多个变异区。期望这些提供于疫苗中的变异区能够广泛地抵御HIV感染。然而，这样的疫苗没有成功，其中疫苗诱导的免疫反应不能识别许多不同的HIV株。所以，提供能引发针对多种HIV株产生免疫反应的疫苗是关键的、必需的，从而该疫苗适用于HIV的治疗和/或预防。
本发明者发现使用含有至少4种多至1,000种，甚至10,000种分别编码不同包膜蛋白变异体(EPV)的重组病毒混合物的多包膜蛋白疫苗可诱导产生对抗几种或多种不同HIV株的出乎意料增强的初级和次级(加强)免疫反应。这种疫苗也包括由病毒表达的包膜蛋白(EPVs)变异体，例如，由产生病毒的宿主细胞表达的蛋白。
在此应用的术语“初次”或“初级的”和“加强”或“加强的”分别指的是初始的和随后的免疫，即与免疫学中用的术语的定义是一致的。
编码EPV的核酸(包膜蛋白变异体(EV)核酸)能从相同或不同感染了HIV的人群(如地理上的)中分离到。另一种方法是，通过筛选编码序列的差异或根据已知方法，在体内体外，估计其引发的对抗多种HIV株的体液或细胞免疫反应的差异从任何来源筛选得到不同的EV核酸。
最初发现涉及重组痘苗病毒疫苗。然而本领域的技术人员很容易理解，任何重组病毒都可用于表达本发明疫苗的多包膜蛋白抗原。而且，许多病毒疫苗的使用可排除使病毒疫苗加强免疫效力降低(缘于可能的强抗病毒反应的加强)的抗病毒免疫反应。
本领域技术人员任何人很容易理解，本发明者进一步发现，用重组一种或多种HIV包膜蛋白，优选地，多种蛋白进行加强免疫，会进一步加强本发明免疫方法的效果。该一种或多种HIV包膜蛋白可与多包膜蛋白疫苗中表达的HIV包膜蛋白相一致，它们也可以不同。
相似地，正如本领域技术人员所理解，本发明的免疫方法可由于DNA疫苗的使用而加强。DNA疫苗可用于加强免疫，例如，如上有关重组HIV蛋白的描述。另一种方法是，DNA疫苗可用作初次免疫，一种或多种重组病毒疫苗用于加强抗HIV的免疫反应。如同重组包膜蛋白增强疫苗，DNA疫苗可包括一种或多种表达一种或多种HIV包膜蛋白基因的载体。另外，HIV包膜蛋白基因可与重组病毒疫苗表达的基因一致也可不同。在一优选实施方案中，制备载体用于在重组病毒疫苗和转染的哺乳动物的细胞中于表达而作为DNA疫苗的一部分。
人们发现免疫反应(体液的和/或细胞的)对传染性病毒如HIV有更广泛的毒株范围，而不局限于由多包膜蛋白疫苗中提供的表达特定的外膜蛋白变异体(EPVs)的病毒株。本发明提供了可对多种HIV株产生出乎意料地增强的免疫反应的由重组病毒疫苗编码的多种包膜蛋白变异体(EPVs)。
               多包膜蛋白癌苗和免疫
本发明一方面提供了使用包括至少4种直至10,000种不同重组痘苗病毒混合物的多包膜蛋白疫苗。其中的每一痘苗病毒都表达不同的包膜蛋白变异体或其具有抗原性的一部分。本领域任一技术人员很容易理解，4种至约1000种或优选地约10种至100种不同的重组病毒可以被应用。本领域的任何普通技术人员更容易理解其他病毒也可用作疫苗，可用作疫苗的重组病毒主体的合适的病毒的实例除了痘苗病毒外还包括金丝雀痘病毒、腺病毒和腺病毒伴随病毒。同时本发明也提供了制备和应用这种多包膜蛋白疫苗的方法。
在使用了这种多包膜蛋白疫苗的哺乳动物中，本发明的多包膜蛋白疫苗可诱发体液免疫和细胞免疫中的至少一种，但对此疫苗的反应是亚临床的，或此疫苗加强至少对一株HIV的至少一种免疫反应，由此，这种疫苗的使用适合于接种目的。
病毒疫苗    多种遗传工程病毒主体(“重组病毒”)可用于制备多包膜蛋白病毒疫苗以用作HIV多包膜蛋白抗原。病毒疫苗特别有优势，因为病毒感染成分可促进强的引发B淋巴细胞，辅助T淋巴细胞及细胞毒性T淋巴细胞活化的免疫反应。多种病毒可用作本发明疫苗的病毒主体。优选地，用于病毒疫苗的重组病毒是痘苗病毒〔国际专利公开WO 87/06262 1987年10月22日。Moss等；Cooney等：美国国家科学院院报90:1882-6(1993)；Graham等，传染病杂志166:244-52(1992),McElrath等，传染病杂志169:41-7(1994)〕。金丝雀痘病毒可用于另一实施方案〔Pialoux等，艾滋病研究与人类逆转录病毒11:373-81(1995)，艾滋病研究与人类逆转录病毒勘误11:875(1995)；Andersson等，传染病杂志，174:977-85(1996)；Fries等，疫苗14:428-34(1996)；Gonczol等，疫苗13:1080-5(1995)〕。另一种选择是缺陷型腺病毒或腺病毒〔Gilardi-Hebenstreit等，普通病毒学杂志71:2425-31(1990)；Prevec等，传染病杂志161:27-30(1990)；Lubeck等，美国国家科学院院报86:6763-7(1989)；Xiang等，病毒学219:220-7(1996)〕。其他合适的病毒载体包括反转录病毒，它可被包装入有双嗜性的宿主细胞〔见Miller人类基因治疗1:5-14(1990)；Ausubel等，当前分子生物学方法，§9〕，和减毒或缺陷型DNA病毒，如但不局限于单纯疱疹病毒(HSV)〔见如Kaplitt等，分子细胞神经科学2:320-330(1991)〕，乳头瘤病毒、EB病毒(EBV)、腺病毒伴随病毒(AAV)〔见如Samulski等，病毒学杂志61:3096-3101(1987)；Samulski等，病毒学杂志63:3822-3828(1989)〕等。
DNA疫苗是传统疫苗之外的另一种疫苗。它包括抗原和佐剂，可在体内直接将编码抗原的DNA导入受治疗者的组织，由受试者组织的细胞表达抗原，这样的疫苗在此称为“DNA疫苗”或“基于核酸的疫苗”。DNA疫苗在国际专利公开WO 95/20660和国际专利公开WO93/19183中有所描述。直接注射的编码诱导保护性免疫反应病毒蛋白的DNA的能力已在很多实验系统中表现出来〔Conry等，癌症研究54:1164-1168(1994)；Cox等，病毒学67:5664-5667(1993)；Davis，人类分子遗传学，2:1847-1851(1993)；Sedegah等，美国国家科学院院报91:9866-9870(1994)；Montgomery等，DNA细胞生物学12:777-783(1993)；Ulmer等，科学，259:1745-1749(1993)；Wang等，美国国家科学院院报90:4156-4160(1993)；Xiang等，病毒学199:132-140(1994)〕。对流感病毒中和分析。此策略的研究既用包被蛋白又用内部病毒蛋白以诱导抗体的产生，但特别集中于血凝素蛋白(HA)〔Fynan等，DNA细胞生物学，12:785-789(1993A)；Fynan等，美国自然科学院院报90:11478-11482(1993B)；Robinson等，疫苗，11:957(1993)；Webster等，疫苗，12:1495-1498(1994)〕。
直接将编码HIV包膜蛋白的DNA导入的接种可引发产生细胞介导的和体液两种保护性免疫反应。这与用活病毒的结果相类似〔Raz等，美国国家科学院院报91:9519-9523(1994)；Ulmer,1993，前述；Wang,1993，前述；Xiang,1994，前述〕。有关雪貂的研究表明抗流感病毒保守内部蛋白与表面糖蛋白的DNA疫苗，在对抗流感病毒的抗原变异体比灭活疫苗和亚病毒疫苗都更为有效〔Donnelly等，NatMedicine 6:583-587(1995)〕。实际上，对编码核蛋白DNA的重复出现的免疫反应基本上在动物的一生中都持续存在的情况在小鼠中有所报导〔Yankanckas等，DNA细胞生物学12:771-776(1993)〕。
本领域中众所周知，很多因素可影响抗原基因的表达效率和/或DNA疫苗的免疫原性。这些因素的例子包括：接种的可重复性，质粒载体的构建，驱动抗原基因表达的启动子的选择及质粒中插入基因的稳定性。依不同来源，启动子在组织特异性和起始mRNA合成的效率方面有差异〔Xiang等，病毒学，209:564-579(1994)；Chapman等，核酸研究，19:3979-3986(1991)〕。到目前为止，哺乳动物系统中大部分DNA疫苗都依赖于来自巨细胞病毒(CMV)的病毒启动子。在多种哺乳动物中，这些启动子在肌肉和皮肤接种方面有很高的效率。另外一个影响DNA免疫引发的免疫反应的已知因素是DNA运送的方法，非肠道途径的基因转移效率低并且产生很高的基因表达的变化性〔Montgomery 1993前述〕。用基因枪高速接种质粒可增强小鼠的免疫反应。〔Fynan,1993B前述；Eisenbraun等，DNA细胞生物学，12:791-797(1993)〕，可能是缘于更大的DNA转染效率和树枝状细胞其更有效的抗原呈递。包含有本发明的基于核酸的疫苗的载体也可用本领域其他方法导入预期的宿主细胞。例如：转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体(溶酶体融合)或用一DNA载体转运器〔见例Wu等，生物化学杂志，267:963-967(1992)；Wu and Wu，生物化学杂志263:14621-14624(1988)；Hartmut等，加拿大专利申请No.2.012,311,1990年3月15日提交〕。
用于病毒和DNA疫苗的双功能质粒    本发明优选的一方面是其设计了既能用作DNA疫苗又可做为重组病毒载体的双功能质粒。纯化的质粒的直接注射，即作为DNA疫苗会在受试者体内引发针对由此质粒表达的抗原的免疫反应。此质粒也可做为免疫运载体应用于活的重组病毒。
本发明的双功能质粒提供可处于两种不同的表达控制序列之下的外源基因或外源基因插入位点：一为动物表达控制序列，一为病毒的表达控制序列。术语“控制之下”使用的为其普遍意义，即可操作地与表达控制序列相关如启动子连接，提供外源基因的表达。在一个优选的实施方案中，动物表达控制序列是一个哺乳动物启动子(本发明也打算用鸟类启动子)，在一个特定的实施方案中，启动子是巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子(见图7)，在进一步的一特定实施方案中，病毒启动子是痘苗病毒早期启动子或痘苗病毒晚期启动子，优选地或两者都包括其中(见图7)。受试者可接受一个多层次的治疗方案的免疫，其中，双功能质粒以DNA使用，并且在另一时间可以任何顺序，以重组病毒疫苗使用。本发明打算单次或多次将此双功能质粒作为DNA疫苗或重组病毒疫苗或既作为DNA疫苗又作为重组病毒疫苗使用。此接种方案既可与重组蛋白疫苗(见后述)相补充运用，又可与另外的疫苗工具联合使用。
本领域普通技术人员很容易理解本发明的双功能质粒可用作多包膜蛋白疫苗载体。因此，通过将至少4至约10,000种，优选地4-1,000种，更优选地10-100种不同的HIV包膜蛋白基因插入双功能质粒就可制备出一套相应的用作多包膜蛋白疫苗的双功能质粒。
重组蛋白疫苗    根据本发明，用一种或多种HIV包膜蛋白接种引发的活性免疫性能够引起或加强细胞或体液免疫反应。一种或多种HIV包膜蛋白或其具有抗原性的片段可与一种佐剂相混合制备疫苗。
术语“佐剂”指的是能加强针对抗原的免疫反应的化合物或混合物。佐剂可作为一个组织库缓慢释放抗原并且可作为淋巴系统的激活剂能够非特异性地增强免疫反应(Hood等，免疫学，第二版1984，Benjamin/Cummings:Menlo Park Caiifornia.p384)。通常，在缺乏佐剂的情况下，单用抗原的初次激发是不能引发体液或细胞免疫。佐剂包括但不限于：完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普卢兰尼克多元醇、聚阴离子(polyanions)、肽、油或烃乳胶、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和有效的人用佐剂如BCG(卡介菌)及小棒杆菌。佐剂的选择依赖于接种的受试者。优选地，使用药物上可接受的佐剂。例如，用于人的疫苗应避免用油或烃乳胶佐剂，包括完全和不完全弗氏佐剂。适用于人的佐剂的一个实例是明矾(氧化铝胶)。在下面一特定实施方案中，重组HIV包膜蛋白与明矾联合用于肌内用药。另一种方法是，重组HIV包膜蛋白疫苗可通过皮下、皮内、腹膜内或其他可接受的疫苗用药途径施用。
疫苗的施用    根据本发明，针对HIV的免疫可单用本发明的重组病毒疫苗，或与DNA疫苗或重组蛋白疫苗或同时与两者联合使用。在一特定的实施方案中，于明矾中的重组HIV包膜蛋白通过肌肉注射加强免疫反应。
每一剂量的病毒疫苗可含有同样的4-10,000，优选地4-1000，更优选地10-100种表达不同HIV包膜蛋白基因的重组病毒。另一种方法，随后的疫苗中的病毒可表达不同HIV包膜蛋白的基因。在另外一个实施方案中，随后多包膜蛋白病毒疫苗可与前面疫苗部分相同，另一部分也可不同。例如，初次疫苗可含有表达任意标号为1-10 HIV包膜蛋白的痘苗病毒。第二次(加强)疫苗可含有表达6-15号或11-20号等HIV包膜蛋白的痘苗病毒(或优选不同的病毒，如金丝雀痘病毒或腺病毒)。
DNA疫苗或重组蛋白疫苗可包括一种或多种HIV包膜蛋白抗原。优选地，本发明使用的DNA或重组蛋白疫苗包括一种以上的HIV包膜蛋白抗原。在后面的病毒疫苗中，HIV包膜蛋白或DNA疫苗中的蛋白或重组蛋白疫苗可与多包膜蛋白病毒疫苗中表达的HIV包膜蛋白一致，它也可与任一多包膜蛋白不同。
总之，本发明的优选实施方案打算在接种方案中提供尽可能多的变化；以使接受者暴露于最大数量的HIV包膜蛋白且从而提供与新型HIV分离物产生中和交叉反应的最大机会。
                   包膜蛋白变异体
如前所述，用于本发明疫苗的EPV可以从局限于某一地理区域的分离物或进化枝(clades)或从地理上不同的分离物中得到即不同的进化枝。正如本领域技术人员很容易理解，从自然分离物中得到的包膜蛋白核苷酸(即基因)有很多优点：分离物易于得到，相当于理想免疫性的天然蛋白的EVPs和HIV突变可迅速从新的分离物中捕捉到。
EPV也包括了具有免疫原性的多肽，EPV氨基酸序列中至少可作为一个表位或抗原决定簇的氨基酸序列引发这种免疫原性。此氨基酸序列基本上与已知的HIV EPV的一段至少10-900个氨基酸片段和/或其共有序列相一致。这样的EPV与已知的包膜蛋白氨基酸可全部同源或至少有50％相同。如50-99％同源或其中的任何范围或数值，同时可引发针对至少一株HIV的免疫原反应。
例如，通过运用来自Wisconsin遗传学计算机小组(UWGCG)的计算机程序GAP,6.0版，通过比较序列信息可以测定同源百分数。GAP程序运用了Needleman和Wunsch的序列比较方法〔分子生物学杂志48:443(1970)〕，此程序由Smith和Waterman修改〔应用数学进展2:482(1981)〕。简单地说，GAP程序以序列比较符号(即核苷酸或氨基酸)的数目除以两个序列中短序列比较的符号总数来确定其相似性。GAP程序优选缺失参数包括：(1)单一的比较矩阵(1代表相同和0代表不同)和Gribskov和Burgess的加权比较矩阵核酸研究14:6745(1986),Schwartz和Dayhoff编，“蛋白质序列和结构图谱”在国家生物医学研究基金会，Washington  DC(1979)pp 353-358中做过描述。(2)一个缺口罚3.0并且一个缺口中的一个符号罚0.10且(3)末端缺口不罚分。
在一个优选实施方案中，本发明的EPV是至少一种HIV包膜蛋白的变异形式。优选地，EPV包括gp120及gp41的寡聚区，gp140〔Hallenberge等，病毒学193:510-514(1993)〕。已知的HIV包膜蛋白包含约750-900个氨基酸。从商业和研究性的HIV序列库中可容易得到这样的序列的实例，HIV序列库如GENBANK或已发表的汇编物如Myers等编，人类反转录病毒和艾滋病：核酸和氨基酸序列汇编和分析，第1、Ⅱ卷。理论生物学和生物物理(Theoretical Biologyand Biophysics)Los Alamos NM(1993)。为了得到其他的由用于本发明重组病毒或多包膜蛋白疫苗，核酸编码的EPV的EPV的替换或插入可包括至少一个氨基酸残基的替换或插入(例如1-25个氨基酸)。另一种方法，至少一个氨基酸(如1-25个氨基酸)可从EPV序列中被删除。优选地，这些替换、插入或删除基于包膜蛋白序列的测定加以确定，包膜蛋白序列测定是通过对来自感染了HIV的个体的一个以上编码EPV核酸序列的序列测定而获得的。
非限制性的替换、插入或删除优选通过从感染HIV-1的病人扩增包膜蛋白DNA或RNA序列得到。这些替换、插入或删除可用常规实验提供的包膜蛋白或包膜蛋白变异体的修饰后的结构和功能特征来确定。这样得到的EPVs优选地具有与原初EPV不同的抗原特性。这些抗原差异可通过合适的测定方法来测定。如在ELISA测定中，用一组特异的抗HIV包膜蛋白的单克隆抗体来检测。
只要最终的EPV蛋白能引发可结合于HIV包膜任何替换、插入或删除都可应用只要得到的EPV蛋白与第二种EPV有不同的引发方式的结合HIV包膜蛋白的抗体。上述每一个替代、插入或删除也包括修饰或稀有氨基酸，如在37C.F.R.§1.822(p)(2)所提供的。
下列表1提供了非限制性的可供选择的HIV包膜蛋白变异体，它们可由本发明的重组病毒编码。
                                                                 表1：HIV包膜蛋白变异体
10  20  30
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3 4 5  6  7  8  9  1  2  3 4 5  6  7 8 9
 1  K  E  O  K  T  V  A  H  R  V  K  E  S  Q  M  K  K  Q  H  L  W  R  W  G  W  R  W  G  T
 E  K  M  K A  M  G  T  R  R  N  C  P  N  W  L  K  I  T  K  G  Y  I
 T   T M  I  K  K  S  Y  N  C  R  K  G  K  M  I,  I,  M
 I  R  M  G  G  E  W  R  R  K  I   T  T  Y
 K  E  T  D  W  Q  S  S  I
 40  50    60
 1  2  3  4  5   6  7  8  9  1  2 3 4  5  6  7  8  9  1  2  3’ 4  5  6  7 8 9
 31  M  L  L  G  L  M  I C  S  A  T  E  K  L  W  V  T  V  Y  Y  G  V  P  V  W  K  E  A    T
 L  I  F  W  I  I  T  S  L  V  V  S  Q  Y  A S  I  I  E  D    E
 A  M  A  I  M  T  P  L  G  A  Q  D  A  H    V
 I  A  M  L  T  P  C  I  E  D  N    N’
 T I  A  N  K  V    A
 70  80     90
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2    3 4  5  6  7  8 9
 61  T  T  L  F  C  A  S  D  A  K  A  Y  D   T  E  V  H  N  V  W  A  T  H’ A  C  V  P  T  D     P
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 N  S  T  K  A  R  K  Q  G
 L  A  K  Q
 E  P  K
                                                       100                                                        100                                                          120
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4 5  6  7  8  9  1  2  3  4  S  6  7  8  9
 91  N  p  Q  E  V  V  L  V  N  V  T  E  N  F  N  H  W  K  N  D  M  V  E  Q  M  H  E  D  I     I
 D  H  I  L  M  G  S  G  E  D  I  R  N  I  D  Q  T  V
 S  R  L  Y  E  D  K  T  S  N
 T  Y  M  D  p  D  Y
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                                                       130                                                            140                                                          150
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 121  S  L  W  D  Q  S  L  K  p  C  V  K  L  T  P  L  C  V  S  L  K  C  T  D  L  K  N  D  T     N
 N  E  E  E  V  M  L  C  V  T  M  N  K  H  V  T  T  A  S     E
 Q  N  D  I  N  Y  G  G  M     T
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 I  G  K  F  L     S
                                                                               160                                                                            170                                                                              180
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  S  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
    151  T  S  N  N  V  T  S  S  S  W  G  R  N  I  M  E  E  G  E  I  K  N  C  S  F  N  I  S  T     S
 N  K  S  S  K  T  T  K  N  W  K  R  E  I  D  R  E  K  M  T  K  P  Y  K  V  T  K     G
 I  E  N  V  T  I  S  K  E  K  T  G  Q  A  G  V  R  T  Y  Q  P     N
 G  S  Q  W  V  I  G  S  R  R  Q  E  Q  M     I
 L  G  T  V  N  K  L  T     E
                                                        190                                                         200                                                          210
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 181  I  R  G  K  V  Q  K  E  Y  A  F  F  Y  K  L  D  I  I  P  I  D  K  G  N  D  S  N  D
 L  G  D  R  I  K  Q  D  N  S  L  L  R  N  H  V  V  Q  V  K  D  S  D I  N  P  K  D  A
 V  K  N  Q  M  H  R  V  R  T  Y  H  R  T  L  A  K  L  G  N  T     S
 R  S  E  K  E  T  A  S  T  N  T  P  M  E  E  G  S
 K  T Q  G  H  H V  S  S  N  N
                                                       220                                                       230                                                        240
 1  2  3  4  5  6  7  8 9  1  2  3  4  5  6  7  8 9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 211  T  T  S  Y  K  F  T  L  T  S  C  N  T  S  V  I  T  Q  A  C  P  K  V  S  F  E
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                                                       250                                                       260                                                         270
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 241  P  I  P  I  H  Y  C  A  P  A  G  F  A  I  L K  C  N  N  K  T  F  N  G  T  G  P  C  T     N
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                                                                         280                                                                        290                                                                        300
    1     2     3     4     5     6     7     8     9     1     2     3     4     5     6     7     8     9     1     2     3     4     5     6     7     8     9
    271     V     S     T     V     Q     C     T     H     G     I     R     P     V     V     S     T     Q     L     L     L     N     G     S     L     A     E     E     E     V    V
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    310     320     3 30
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 301  I  R  S  A  N  F  T  D  N  A  K  T  I  I  V  Q  L  N  Q  S  V  E  I  N  C  T  R  P  N  N
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    340     350     360
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8 9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 331  N  T  R  K  S  I  R  I  Q  R  G  F  G  R  A  F  V  T I  G  K  I  L  G  N  M  R  Q  A
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                                                  370                                                      380                                                         390
 1  2 3 4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 361  H  C  N  I  S  R  A  K  W  N  N  T  L  K  Q  I  D  S  K  L  R  E  Q  F  G  N  N  K  T     I
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                                                    400                                                       410                                                        420
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6 7 8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 391  I  F  K  Q  S  S  G  G  D  P  E  I  V  T  H  S  F  N  C  G  G  E  F  F  Y  C  N  S  T  Q
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                                                                          430                                                                              440                                                                               450
    1     2     3     4     5     6     7     8     9     1     2     3     4     5     6     7     8     9     1     2     3     4     5     6     7     8     9
  421     L     F     N     S     T     W     F     N     S     T     W     S     T     K     G     S     N     N     T     E     G     S     D     T     I     T     L     P     C     R
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                                                     460                                                      470                                                         480
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 451  I  K  Q  I I  N  M  W  Q  E  V  G  K  A  M  Y  A  P  P  I  S  G  Q  I  R  C  S  S  N   I
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                                                                        490                                                                         500                                                                           510
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 481  T  G  L  L  L  T  R  D  G  G  A  N  E  N  N  E  S  E  I  F  R  P  G  G  G  D  M  R  D  N
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                   550     560     570
    1     2     3     4     5     6     7    8     9     1     2     3     4     5     6     7     8     9     1     2     3     4     5     6     7     8     9
    541     E     K     R     A     V     G     E    I     G     A     L     F     L     G     F     L     G     A     A     G     S     T     M     G     A     A     S     M     T     L
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    580     590     600
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 571  T  V  Q  A  R  Q  L  L  S  G  I  V  Q  Q  Q  N  N  L  L  R  A  I  E  A  Q  Q  H  L  L  Q
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    610     620     630
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 601  L  T  V  W  G  I  K  Q  L  Q  A  R  I  L  A  V  E  R  Y  L  K  D  Q  Q  L  L  G  I  W  G
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 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 631  C  S  G  K  L  I  C  T  T  A  V  P  W  N  A  S  W  S  N  K  S  L  E  Q  I  W  N  N  M     T
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 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2 3 4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
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                                                       700                                                       710                                                         720
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 691  Q  E  L  L  E  L  D  K  W  A  S  L  W  N  W  F  N  I  T  N  W  L  W  Y  I K  L  F  I  M
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                                                      730 740                                                        750
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 721  I  V  G  G  L  V  G  L  R  I  V  F  A  V  L  S  V  V  N  R  V  R  Q  G  Y  S  P  L  S     F
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760                                                                          770                                                                        780
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 751  Q  T  H  L  P  I  P  R  G  P  D  R  P  E  G  I  E  E  E  G  G  E  R  D  R  D  R  S  I  R
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                                                                         790                                                                          800                                                                          810
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
 781  L  V  N  G  S  L     A     L     I     W     D     D     L     R     S     L     C     L     F     S     Y     H  R  L  R  D  L  L  L  I
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                                                        820                                                         830                                                           840
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2 3 4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8  9
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 841  K  N  S  A  V  S  L  L  N  A  T  A  I  A  V  A  E  G  T  D  R  V  I  E  V  V  Q  G  A     Y
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880                                                                 889
 1  2  3  4  5  6  7  8  9  1  2  3  4  5  6  7  8
 871  R  A  I  R  H  I  P  R  R  I  R  Q  G  L  E  R  I  L  L
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因此，基于以上特定的替代例子，可通过常规实验制备另一种替代以提供本发明中其它的包膜蛋白变异体，如，通过在产生不同的免疫反应包膜蛋白或多包膜蛋白变异体中制备一个或多个替代、插入或删除。
本发明中EPV氨基酸序列的变化可通过DNA突变的方法制备。这样的EPVs包括，例如，对于氨基酸序列中编码不同氨基酸残基的核苷酸进行删除、插入或替代。很明显，编码EPV核酸中制备的突变不能置于阅读框架之外且优选地也不能制造出互补区以使mRNA出现二级结构〔见如Ausubel(1995综述)前述；Sambrook(1989)，前述〕。
根据本发明的讲授和指导，本发明中编码EPV的核酸也可用对编码包膜蛋白或其突变体的DNA、RNA的核苷酸扩增或进行定点诱变来制备，且据此合成或反转录编码DNA以制备编码EPV的DNA或RNA〔见如Ausubel(1995综述)前述；Sambrook(1989)前述〕。
本发明中的表达EPVs的重组病毒，重组包膜蛋白变异体或编码它们的核酸载体包括了一套有限的EPV编码序列作为替代核苷酸，基于本发明的讲授和指导，本领域的任何普通技术人员不需过多实验，可常规得到此替代核苷酸。查询有关蛋白质化学和结构的详细描述见Schulz.G.E.等，蛋白质结构原理，Springer-Verlag,New York,NY(1978)和Creieighton T.E.，蛋白质：结构和分子特征，W.H.Freeman&Co.,San Francisco；CA(1983)。查询有关核酸序列替换，如密码子优先，见Ausubel等编，当前分子生物学方法。GreenePublishing.Assoc.New York NY(1987、1988、1989、1990、1991、1992、1993、1994、1995)(在下文，“Ausubel(1995综述)”)在§§A.1.1-A.1.24和Sambrook J．等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)Cold Spring Harbor.NY(1989)的附录(和附录1)。
因此，参照本发明的讲授和指导，本领域的技术人员将会明白如何在包膜蛋白DNA或RNA的其他位置替代其他的氨基酸以得到多种可选择的EPV，包括替代、删除或插入变异体。
                  HIV活性的筛选测定
为了从免疫了本发明疫苗的个体中筛选抗HIV活性的血清或细胞，本领域众所周知的任何已知和/或合适的筛选测定方法都可使用。如已知的HIV测定包括病毒感染性测定〔见如Chesebro等，病毒学杂志62:3779-3788(1988)；Aldovini等编，HIV研究技术pp 71-76(1990)〕；中和测定〔见如Golding等，艾滋病研究与人类逆转录病毒10:633-643(1994)；Hanson.艾滋病研究与人类逆转录病毒10:645-648(1994)；Laal等，人类反转录病毒研究9:781-785(1993)；Hanson获得性免疫缺损综合征7:211-219(1994)〕；外周单核细胞(PMN)测定〔见如Arduino等，抗微生物试剂及化学治疗(Antimicrob.Agents Chemother)37:1095-1101(1990)〕；和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)测定〔见如Hammond等，实验医学杂志176:1531-1542(1992)；McElrath等，病毒学杂志68:5074-5083(1994)；Walker等，细胞免疫学119:470-475(1989)；Winhold等，艾滋病研究与人类逆转录病毒8:1373(1992)〕。其他合适的活性单独或联合使用的方法包括但不局限于：转录、复制、翻译、病毒颗粒的掺入、毒性、病毒产量和/或形态发生的定量和/或定性。
具体实施方案：编码EPVs的重组痘苗病毒
        多包膜蛋白疫苗及其制备和应用方法概述    表达HIV包膜蛋白(如gp41、gp120和/或gp160或其一部分)的重组痘苗病毒为用于生产和检测能诱发针对病毒的体液和细胞免疫反应中至少一种的混合疫苗，以及B细胞和细胞毒性T(CTL)细胞决定簇的分析提供了材料。
本发明的多包膜蛋白疫苗由n种不同的重组痘苗病毒组成，其中“n”是一个从4-10,000(或其中的任何范围或数值)，其中每一种痘苗病毒载体构建体表达HIV包膜蛋白(EPV)的变异体(如gp41、gp120或gp160)。重组痘苗病毒功能上编码EPV，它是通过将野生型痘苗病毒与质粒重组制备的。多种不同的编码EPV的质粒能通过用一种EPV编码序列替代另一种制备，如用限制酶切片段或诱变的方法。
重组痘苗病毒的制备   制备单个质粒(每一质粒表达特定的HIV蛋白序列)的方法可利用DNA或RNA扩增将分离到的包膜蛋白变异体序列替代入一个载体(如pVenv4或pVenv1)〔Hallenberger等，病毒学193:510-514(1993)〕，此载体编码已知的HIV包膜蛋白序列(如可从NIAID AIDS Research & Reference Reagent Program,Rockville MD得到)。
根据本发明的讲授和指导不需过多试验，可应用本领域众所周知的扩增RNA或DNA的方法。已知的DNA或RNA扩增方法包括但不局限于：多聚酶链式反应(PCR)及相关的扩增方法(见如美国专利Nos.4,683,195、4,683,203、4,800,159、4,965,188 Mullis等；4,795,699和4,921,794 Taber等；5,142,033 Innis等；5,122,464 Wilson等；5,091,310 Innis等；5,066,584 Gyllensten等；4,889,818 Gelfand等；4,994,370 Silver等；4,766,067 Biswas等；4,656,134 Ringold等)和用目的基因的反义RNA做模板合成双链DNA的RNA介导的扩增(美国专利Malek等，No.5,130,238，其商品名为基于核酸序列的扩增(NASBA))。
例如，用这种途径制备的重组痘苗病毒构建体可用于接种并可诱发HIV特异的T和/或B细胞反应。引物利用HIV保守序列且可成功地从多种不同的HIV-1病人样品中扩增包膜蛋白基因。这里描述的基本技术可类似地应用于PCR或其他类型的扩增引物从而将现场分离物的较小或较大的包膜蛋白序列以编码HIV包膜蛋白的载体中相应序列替代。见如Ausubel后述，Sambrook后述。
编码EPV的核酸   此技术开始为从感染了HIV的细胞中分离DNA并且用PCR扩增包膜蛋白基因。PCR或其他扩增产物提供了分离HIV序列最简单的方法。但是，任何其他合适的和已知的方法如EPV编码核酸或蛋白的克隆和分离也可应用(见Ausubel后述；Sambrook后述)。优选地，限制性酶切位点掺入PCR或其他扩增引物序列以便于基因克隆。
分离的用于PCR的DNA可从多种病毒来源制备，包括新鲜的或冰冻的HIV阳性(HIV+)病人全血及体外感染了病毒分离物的细胞。
为了制备新的HIV包膜蛋白构建体，多聚酶链式反应(PCR)优选地用于从每个不同的HIV病人样品中扩增100-2700碱基对(bp)的包膜蛋白基因。PCR引物代表了保守性强的HIV序列，它们适于从已知包膜蛋白基因样品，分离到的HIV或不同的HIV病人样品中扩增包膜蛋白基因。此扩增的DNA优选地包括gp120和gp41(二者都是gp160的一部分)中编码10-900个(如100-400个、400-600个或600-900个或这里的任何范围或数值)氨基酸的部分。优选地，一个或多个包膜蛋白变异区(V1-V5)和保守区(C1-C5)，更优选的地，V1、C1、V2、C2、V3、C3、V4、C4和V5的绝大部分区域包含于PCR产物。另外，扩增产物能编码gp120/gp41切点以外的1-200个氨基酸。优选地，整个包膜蛋白基因的大部分或全部被扩增。任选地，扩增的编码gp160的序列缺失编码跨膜区和/或胞质末端区域的部分或全部序列。〔见如Hallenberger等，(1993)〕。
PCR引物可以设计地使痘苗病毒载体中的包膜蛋白基因序列的两侧为限制性酶切位点，从而这些限制性切点掺入扩增的DNA产物中。通过使用众所周知的替代克隆技术，表达来自1-10,000个病人的包膜蛋白变异体序列的痘苗病毒质粒衍生物可通过用病人EPV编码序列的一部分替代痘苗病毒质粒中的包膜蛋白序列的相应部分来制备，如可用限制性酶切片段来替代。例如，用KpnⅠ和BsmⅠ处理pVenv4质粒和PCR产物以获得编码截短的gp160的1-639位氨基酸，它缺乏跨膜区和gp41的胞质末端区域〔见如Halenberger等，(1993)〕。
将PCR产物和pVenv4产物连接后，通过许多本领域众所周知的方法中的任何一种，如电穿孔，将连接混合物转化入细菌宿主细胞，并通过测序挑选和鉴定重组菌落。
编码HIV包膜蛋白的重组痘苗病毒构建体编码EPV的痘苗病毒在宿主细胞中与野生型痘苗病毒重组，表达EPV的病毒噬斑被筛选出来从而制备到了病毒原种(stock)。VVenv’s的病毒原种中的每一个都包含有不同的编码EPV的序列，它们与至少4-40最多至约10,000种不同的重组病毒混合形成本发明中的多包膜蛋白疫苗。
对包含有EPV序列的重组痘苗病毒质粒，任选地测序或用HIV包膜蛋白特异的抗体筛选以确定不同的包膜蛋白变异体(EPVs)。Sanger双脱氧链终止反应法测序是优选的。该方法是从以前描述的方法中优先选用的。〔Sambrook等，(1989)后述；美国生物化学的测序酶2.0版-DNA测序试剂盒，第9版，Amsherman生命科学公司(1994)〕，从引物位置开始应读约50-300个碱基对。
制备重组痘苗病毒表达载体的方法在本领域众所周知〔见Mackett.M.等，美国国家科学院院报79:7415-7419(1982)；Panicali.D.和Paoletti E.美国国家科学院院报79:4927-4931(1982)；美国专利No.4,169,763 Mazzara,G.P.等，酶学方法217:557-581(1993)；Ausubel等，后述，§§16.15-16.19〕。以前描述过的pSC11载体〔Chakrabarti,S.等，分子细胞生物学5:3403-3409(1985)〕可优选地用于制备编码包膜蛋白质粒如pVenv4。
作为病毒载体，痘苗病毒有许多有用的特征，包括：克隆大片段外源DNA的能力(大于20kb)，外源基因插入后感染性的保留，宿主范围广泛，相对高的蛋白合成水平，表达蛋白一级结构所决定的正确地转运、分泌、加工和翻译后修饰和宿主类型的使用。例如，表达蛋白可忠实地进行N-O糖基化、磷酸化、十四烷基化、切割及装配。
痘苗病毒载体的几种变异体已开发出来并适用于本发明(如见Ausubel等，后述§§16.15-16.19)。最常见的是，得到病毒原种后(Ausubel后述§16.16)，编码EPV的核酸序列置于痘苗病毒启动子的控制之下并整合到痘苗病毒的基因组中从而保持感染性(Ausubel等，后述§16.17)。另一种方法，将含有痘苗病毒启动子控制的编码EPV基因的质粒转染到有野生型痘苗病毒感染过的细胞中进行表达。
优选地，这些细胞和痘苗病毒载体都适于并被批准用于哺乳动物和人的接种。可用已知的多种方法使这些重组病毒具有特性(Ausubel等，后述§16.18)。在进一步的一种变异体中，噬菌体T7 RNA多聚酶链可被整合到痘苗病毒基因组，这样编码EPV的序列将在T7启动子的控制下表达，无论是质粒还是重组痘苗病毒，此基因在转染细胞的胞质中表达。
因为细胞或其他病毒启动子常常不被痘苗病毒的转染装置所识别，痘苗病毒启动子被优先选用。优选地，早期/晚期启动子联合应用于用以多包膜蛋白疫苗的重组痘苗病毒，因为它可表达EPV作抗原，后者与主要组织相容性复合体Ⅰ或Ⅱ呈现于重组痘苗病毒感染细胞中。与HIV包膜蛋白复合物相关的MHC形成细胞毒性T细胞的靶子，这样初次免疫的哺乳动物会产生针对表达的HIV EPVs的细胞毒性T细胞反应和/或体液反应。这是因为痘苗病毒载体在宿主细胞中诱导MHC对这种抗原的呈递的能力在感染后期降低的缘故。起始于早期的转录在序列TTTTTNT后终止，因此导致了不充分的MHC呈递。
另一种方法是，为了增强宿主细胞中包膜蛋白抗原的MHC呈递，如果使用了痘苗病毒早期启动子，可通过诱变改变基因编码序列内的终止序列。(Earl等，后述1990)。为了模仿痘苗病毒的mRNAs，如果非翻译先导区和3′-终止序列用于掺入有HIV EPV编码序列的痘苗病毒质粒中，它们应该比较短。
优选地，设计用于制备根据本发明痘苗构建体的质粒，其具有痘苗启动子下游env基因插入的限制性酶切位点(Ausubel等，下述§16.17)。更为优选地，该质粒已经含有包膜蛋白的编码序列，其中的限制性位点特征性地出现于靠近包膜蛋白编码序列每个首尾端。然后EPV编码序列中的相同限制性片段可替代质粒中相应的序列。在这种情况，从质粒中去除大多数或所有包膜蛋白编码序列后可插入EPV编码序列的主要部分。
优选地，得到的痘苗病毒构建体(包含有EPV编码序列和痘苗病毒启动子)的两侧为痘苗病毒DNA以便于将质粒转入野生型痘苗病毒感染过的细胞中时发生同源重组。所选的痘苗病毒DNA序列不能使之在重组时破坏关键的病毒基因。
不经过选择，重组痘苗病毒与亲代痘苗病毒的比例通常约为1∶1000。尽管此比例足够高可用于噬斑杂交(见Ausubel等，后述§§6.3和6.4)或免疫筛选(Ausubel等，后述§6.7)的方法挑选重组病毒，利于确定重组病毒的许多方法已被应用。这种选择或筛选的非限制实例在本领域为已知的(见Ausubel等，后述§16.17)。通常，表达盒的两侧为痘苗病毒胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因片段，从而重组将导致TK基因失活。在5-溴-脱氧尿苷(5-Br-dU)存在时，通过感染TK阴性的细胞系，TK阴性表型的病毒可与TK阳性表型病毒区别开来，其中的5-BrdU经TK磷酸化后可致死性地掺入病毒基因组。另外一种方法或附加地，重组病毒可通过细菌抗生素抗性基因，如氨苄青霉素(amp)或鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)共表达来筛选。进一步的一个实例中，大肠杆菌lacZ基因的表达可与X-gal共同筛选重组病毒噬斑(Ausubel，后述§16.17)。
本发明中表达EPV的重组痘苗病毒可任选地根据已知方法进行减毒或灭活，如加热、低聚甲醛处理、紫外线照射、propriolactene处理、形成杂合体或嵌合体或其他已知方法。〔见如Zagury等，自然332:728-731(1988)；Ito等，癌症研究50:6915-6918(1990)；Wellis等，免疫学杂志99:1134-9(1967)；D.Honcht，疫苗10(增刊)：548-52(1992)；Selenka等，Arch Hyg Bakteriol,153:244-253(1969)；Grundwald-Bearch等，临床肿瘤学癌症研究杂志117:561-567(1991)〕。例如，60℃热灭活将很大程度地降低病毒滴度。这样的减毒技术经过了安全性检验，因为不完全的灭活有可能导致病人的死亡〔Dorozynski和Andorson科学252:501-502(1991)〕。
当病人免疫系统受损时应用减毒的或灭活重组痘苗病毒，因为使用活的痘苗病毒会导致并发症甚至死亡。
                   药物组合物
本发明中适于接种或非肠道施用或口服的药物制剂包括由至少4种多至10,000种，优选地4-1000种，更优选地约10-100种不同重组病毒的多包膜蛋白重组病毒疫苗。其中的重组病毒为细胞裂解物形式、膜结合碎片形式、部分纯化或完全纯化的形式。优选地，多包膜蛋白疫苗包括包含细胞裂解物(或其膜结合碎片)的重组病毒，细胞裂解物中进一步包括重组病毒已表达的EPV蛋白。现在发现表达的EPVs能增强初次抗体反应。
多包膜蛋白疫苗组合物可以无菌水或非水溶液、悬浮液或乳浊液形式，也可包括本领域所知的辅助剂或赋形剂。如在此讲述的至少约4-40到10,000种不同病毒的每一种都编码和表达不同的EPV。可选择编码EPVs的DNA以代表存在于特定隔离社区的艾滋病人的EPV。例如，疫苗可代表TN州孟菲斯市的序列并且此疫苗是针对此地区应用的。设计代表一地理上限定区域的疫苗也可用于靶社区以外的社区。
另外的方法，可选择代表地理上远离的社区、城市或国家如进化枝(clades)的编码EPVs的DNA。例如，在一种多包膜蛋白疫苗中可代表多个克隆。多包膜蛋白组合物可进一步包括免疫调制剂如细胞因子，它们可加强对病毒感染的免疫反应。见如Berkow等编Merk手册，第十五版，Merk and Co.,Rahway,NY(1987)；Goodman等编Goodman和Gilman’s治疗学的药物学基础，第八版，Pergamon出版公司，Elmsford,NY(1990)；Avery的药物治疗：临床药物学和治疗学的原理和实践，第二版、AIDS出版社公司，Williams和Wilkins.Baltimore,MD(1987)；Katzung编，基础和临床药物学，第五版，Appleton和Lange Norwalk CT(1992)。在此引用的文献代表了本领域的研究现状。
本领域的普通人员都可理解，本发明的多包膜蛋白疫苗提供给个体时，它可包含于可进一步包括至少盐、缓冲液、佐剂或其他有助于提高组合物效果的物质的组合物中。佐剂是能用于特异性增强至少一种免疫反应的物质。通常，佐剂和复合物在呈递于免疫系统前混合，或分别在同一免疫部位呈递。基于组成，佐剂可大致分为几类，这几类包括油类佐剂、无机盐(如硫酸铝钾(AlK(SO4)2)、硫酸铝钠(AlNa(SO4)2)、硫酸铝铵(AlNH4(SO4))、二氧化硅、高岭土和碳)、多聚核苷酸(如多聚IC和多聚AU核酸)及一些自然物质(如来自结核分枝杆菌的蜡D，存在于小棒杆菌呀百日咳杆菌及布鲁氏菌属某些成员中的物质)。在以上物质中做为佐剂尤其有用的是皂苷如Quil A,Superfos A/s,Denmark)，适合于疫苗组合物的实例公布于如Osol.A.ed.雷明顿(Remington)的药物科学，Mack出版公司Easton.PA(1980)pp1324-1341。
本发明的多包膜蛋白药物组合物可进一步或附加包括至少一种抗病毒化疗复合物：非限制性的实例可从下面的物质中选择至少一种：γ-球蛋白、金刚胺、胍、羟基苯并咪唑、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素-16(IL-16,Kwrth自然，December 8.1995)；缩氨基硫脲、甲红硫脲、利福平、ribvirin、嘧啶类似物(如AZT，和/或3TC)、嘌呤类似物、foscarnet、磷酰乙酸、无环鸟苷、双脱氧核苷、蛋白酶抑制剂(如Saquinavir(Hoffmann-La Roche)、indinavir(Merck)；ritonavir(Abbott labs)；AG1343(Agouron pharmacenticals)；VX-2/78(Glaxo Wellcome)；趋化因子如RANTES、MIP1α或MIP1β〔科学270:1560-1561(1995)〕或9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤。见如Richman艾滋病研究与人类逆转录病毒8:1065-1071(1992)；药物毒理学年评33:149-164(1993)；抗微生物试剂化疗37:1207-1213(1993)；艾滋病研究与人类逆转录病毒10:901(1994)；Katzung(1992)后述，在此引述的文献分别在798-800页和680-681页。
                      药物的应用
多包膜蛋白疫苗(或它引发的抗血清)可用于预防或治疗，更优选地，是用于预防。当用于预防时，在未检测到HIV感染时或未出现艾滋病症状时，给以多包膜蛋白活疫苗组合物，化合物的预防性施用可避免或减弱随后的HIV感染。
当用于治疗时，一检测到确实存在感染症状，就给以多包膜蛋白疫苗。只有当确定病人的免疫系统能够对多包膜蛋白活疫苗施用起反应而基本不出现不适并发症或死亡时，病人感染HIV后才可施用多包膜蛋白活疫苗，而且要施用能够减弱任何确实的HIV感染必需剂量的活疫苗。
另一种方法，当病人的免疫反应受损时，治疗性的施用优选地包括减毒的或灭活的多包膜蛋白疫苗组合物。在此，重组病毒按如上所述的方法减毒或灭活。见如Berkow(1987)后述，Goodman(1990)后述，Avery(1987)后述，Katzung(1992)后述，Dorozynski和Anderson科学252:501-502(1991)。
如果组合物的施用能被受试者忍受，就说它在药物学上是可接受的。如果施用的量生理上有意义则这种试剂被说成是以治疗和预防上有效量施用。如果本发明的疫苗或组合物存在时，使受试病人出现生理学上可检测到的变化，优选地，可加强针对HIV的体液或细胞免疫反应，则它具有生理学意义。
所谓的“保护”不一定是绝对的，即只要相对于对照来说，病人具有统计学上很明显的改善，HIV感染或艾滋病不一定是完全避免或消除。保护可限于缓和病症开始的严重性或速度。
                     药物的施用
本发明的疫苗能对一种以上的HIV株产生抵抗力。因此，本发明涉及并提供了预防或减弱至少一株HIV感染的方法。正如在此使用的，如果向个体的施用导致病症或病情全部或部分的减弱(或抑制)或导致个体对疾病有全部或部分的免疫性，则说此疫苗抵抗或减轻了疾病。
用此处描述的药物组合物，可用任何方法施用本发明的多包膜蛋白疫苗中的至少一种可达到预期的目的。
例如，使用这样的组合物可用各种非肠道途径如：皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、鼻内、经皮或口内途径。皮下施用是最优选的。非肠道用药可通过巨丸剂注射或长期缓慢灌注完成。见如Berkow(1987)后述，Goodman(1990)后述，Avery(1987)后述和Katzung(1992)后述。
用于抵御、抑制或治疗可由活动而特异的细胞免疫治疗引发的细胞免疫反应缓解疾病或状态的典型方案包括如上所述的有效数量疫苗组合物的施用，在一段包括一个星期到长达24个月的时期内，可做为一次单独治疗施用，也可重复用作增强或加强剂量。
根据本发明，疫苗组合物的“有效量”指足够达到预期生物学效应的疫苗组合物，在此情况下，指能够产生针对HIV的细胞或体液免疫反应中的至少一种。可以理解，有效剂量依赖于年龄、性别、健康状况及受试者的体重，如有的话也包括共存的治疗方式种类，治疗的频率及预期效应的本质。下面提供的有效剂量的范围并非意在限制本发明而代表优选的剂量范围。然而，最优选的剂量应根据具体的每个受试者而定，无需过多实验，本领域的技术人员很容易理解和确定这一点。见如Berkow(1987)后述，Goodman(1990)后述，Avery(1987)后述，Ebadi药物学，Little Brown和Co.Boston,MA(1985)和Katsung(1992)后述。
总的来说，成年人的剂量为每剂约105-109，优选地为106-108噬斑形成单位(pfu)/kg或集落形成单位(CFU)/kg。无论用什么样的剂量，应该是由此描述的已知方法确定安全有效的量。
                      受试者
本发明疫苗的接受者可以是能通过针对HIV的细胞或体液免疫反应获得特异免疫性的任何哺乳动物，其中，细胞反应由主要组织相容性复合物Ⅰ或Ⅱ蛋白介导。在哺乳动物中，优选的受试者是灵长目动物(包括人类、猩猩、类人猿和猴)。最优选的接受者是人类。优选的受试者感染了HIV或提供HIV感染的模型〔如Hu等，自然328:721-723(1987)〕。
已经总的描述了本发明，通过参照下面的例子，相同的内容很容易被理解，下面的实施例以说明方式提供且不意味着限制本发明的范围。
                      实施例
实施例1：HIV包膜蛋白表达的痘苗病毒载体的制备
命名，为了便于参考，重组痘苗病毒构建体在此称为VVenv构建体，特定的病毒构建体根据病人或库(构建体中envDNA的ATCC或GenBank来源)命名。例如，VVenv-Doe指具有来自病人Doe的env序列的痘苗病毒载体构建体，且VVenv-U28305指具有来自GenBank编号为U28305的env序列的痘苗病毒载体。
多包膜蛋白疫苗由4-100种不同重组病毒组成，其中每一种都表达不同的HIV-1包膜蛋白。为便于参考，每个病毒称为VVenv，最终的病毒混合物称作多包膜蛋白。
如下描述，每一种VVenv的制备使用称为pVenv4的质粒和称为NYCDH的野生型痘苗病毒。查询细节，见Ryan等，“用于HIV蛋白表达和免疫的痘苗病毒载体的制备和应用”《免疫学方法手册》Lefkovits编，学术出版社(Academic Press)(1996)。
载体和宿主细胞前述pSC11载体〔Chakrabarti S.等，分子细胞生物学5:3403-3409(1985)〕可用于将各种HIV基因重组到VV基因组中。pSC11质粒的元件包括Laz基因(是一个报告基因，通过它可将转化的细菌和VV重组体鉴定出来，因为它们具有β-半乳糖苷酶活性)，编码胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因的一部分及一个氨苄青霉素抗性基因(amp)。克隆到pSC11的基因通过野生型病毒的TK基因与pSC11中的TK基因部分的同源重组插到VV基因组中。质粒DNA插入病毒TK座位会使病毒基因失活因而重组病毒可通过在溴脱氧尿嘧啶(BudR)中生长而很容易从TK阳性病毒的背景中被筛选出来。为了使重组TK阴性病毒在选择中生存下来，它们必须生长于不能提供有活性的TK酶的细胞中，如TK-143细胞系，它是源于人细胞系R970-5的TK缺陷的骨瘤细胞系。〔Rhim,J.S.等，国际癌症杂志15:23-29(1975)〕，它能够支持痘苗病毒的生长〔Weir等，后述(1982)〕，通过将HIV基因全长插入到pSC11载体的SmaⅠ位点，HIV基因片段可以表达。全长基因可在P 7.5K启动子的控制下表达。
作为全长HIV基因克隆的替代方法，人们可用部分基因序列取代已克隆到pSC11的HIV基因。例如，称为pVenv1的构建体是由pSC11制备而来且表达BH10 HIV包膜蛋白(env)基因〔Hallerberger等，后述(1993),Kilpatrick等，生物化学杂志262:116-121(1987)〕。此构建体可用作母载体用以替代和表达来自野生HIV分离物的多种包膜蛋白区域。同样地，称为pVenv4的载体构建自pSC11以表达BH10包膜蛋白，它被截短去除了编码gp41序列的跨膜区和胞质末端区域而保留了寡聚化区域〔Hallenberger等，(1993)后述〕。本领域技术人员很容易理解，术语“寡聚化区域”功能上指“gp41的一部分能够使包膜蛋白寡聚化即有足够的结构进行寡聚化。pVenv4载体编码截短了的gp160(也即gp160t,gp140)，人们发现它能形成与呈现于HIV感染细胞的表面加工后的gp41/gp120寡聚体(二聚体、三聚体或四聚体)相似的四级结构。这种四级结构以分泌和膜结合形式存在〔Hallenberger等，(1993)〕。此载体优选地用作母载体用于替代其他分离到的env序列。
在此实施例中，如下详述，每一个VVenv构建体的制备涉及了pVVenv4、野生型病毒NYCDH及合适的宿主细胞的应用。
pVenv4：将HIV-1包膜蛋白编码序列插入到pSC11痘苗病毒重组载体中制备到了pVenv4载体〔Hallenberger等，病毒学193:510-514(1993)；Chakrabati等，分子细胞生物学5:3403-3409(1985)〕。HIV-1序列来自活病毒的实验室原种。此序列被命名为“BH10”〔Ratner等，自然313:277-284(1985)〕。用PCR技术，不同的、来自感染了HIV-1病人的包膜蛋白序列被扩增并替代入BH10序列以产生新的载体。如下的引物可用于PCR：
(A)有义，位点5785(SEQ ID NO:1):
AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA
(B)反义，位点7694(SEQ ID NO:2):
CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTCCAAAT
(C)KpnⅠ-有义，位点5903(SEQ ID NO:3):
GTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGT
(D)BsmⅠ-反义，位点7659(SEQ ID NO:4):
CCAGAGATTTATTACTCCAACTAGCATTCCAAGG
(E)(任选)DraⅢ-有义，位点6153(SEQ ID NO:5):
CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG
(F)(任选)Bsu361-反义，位点6917(SEQ ID NO:6):
TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG
引物是以5′→3′方向，下面划线的核苷酸是限制性酶切位点(标有数字的位置根据BH10序列)〔Ratner等，自然313:277-284(1985)〕。
PCR策略：为了制备新的HIV-1 env构建体，多聚酶链式反应(PCR)用于从40个不同HIV-1病人样品中扩增包膜蛋白基因的1800个碱基对(bp),PCR引物代表了HIV-1序列的高保守区因而能成功地从多种不同的HIV-1病人样品中扩增env基因。扩增的DNA覆盖了除此蛋白末端约10个高保守氨基酸之外的全部gp120蛋白。所有的包膜蛋白变异区(V1-V5)包括于PCR产物中。另外，扩增的序列编码gp120/gp41切割位点以外约100个氨基酸。
位于pVenv4中BH10包膜蛋白基因序列的两侧具有带有KpnⅠ和BsmⅠ限制性酶切位点的PCR引物掺入到扩增的DNA产物中。
第一轮PCR：在一个500μl微量离心管中混匀：
-1μl引物A(SEQ ID NO:1) 300ng/μl
-1μl引物B(SEQ ID NO:2) 300ng/μl
-10μl MdNTP每种各2.5μl
-1μg  DNA
-10μl 10×PCR缓冲液及
-HPLC  H2O至终体积99μl
将Taq贮存液振匀，取1μl滴入PCR反应，混匀，覆以矿物油。
在热循环仪上如下述运行：
-95℃孵育3分钟以熔解DNA
-运行40个循环：95℃1分钟；45℃2分钟；72℃3.5分钟
第二轮PCR：用上述方法准备PCR反应体系，但用引物C和D(分别为SEQ ID NO:3和4)，不加DNA。终体积为95μl覆以石蜡油。用一过滤吸头，从第一次PCR反应液中取5μl(石蜡油下的部分)。将其混于石蜡下的第二次反应液中，如前的程序进行循环。30个循环比较合适。每10个循环后取2μl反应液进行凝胶电泳分析以监测产物直至出现一条约1800bp的清晰条带。
用众所周知的替代克隆技术，制备了分别表达来自40个病人的env序列而非BH10包膜蛋白序列的pVenv4的衍生物。简而言之，用KpnⅠ和BsmⅠ分别切割pVenv4质粒和PCR产物，琼脂糖电泳分离大的pVenv4片段，丢弃BH10 env的小片段。同时分离切割后的PCR产物，并与pVenv4的大片段相连以产生嵌合包膜蛋白序列，后者包括由来自病人DNA的变异的1800bp的env基因。PCR产物与pVenv4相连接后，连接产物通过本领域许多熟知的技术中任何一个，包括如电穿孔转入细菌宿主细胞，重组菌落被挑选并用测序的方法鉴定。
质粒pVerv4或由pVenv4制备的重组体可通过野生型病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因和质粒的TK序列之间的同源重组促进基因插入到痘苗病毒基因组。pVenv4 DNA插入到病毒TK座位产生了含有在7.5K早期/晚期启动子控制下表达的HIV包膜蛋白基因的痘苗病毒。由于TK座位的破坏，病毒的生长活性减弱。pVenv4的另一个元件是编码β-半乳糖苷酶活性的lacZ基因，lacZ活性可用于选择痘苗病毒重组子(见下面)。
由pVenv4表达的包膜蛋白基因被截短从而删除了gp41序列的跨膜区/C-末端区。此载体表达产物以寡聚体形式存在于细胞内及有分泌形式中。
痘苗病毒-NYCDH每一个新的，替代质粒单独与野生型痘苗病毒NYCDH重组。此病毒来自A.T.C.C.(许可号VR-325)，并在使用前用噬菌斑纯化。(Buck.C和panlino M.S.编，美国典型培养物保藏中心动物病毒、抗血清、衣原体、立克次氏体目录第6版，美国典型培养物保藏中心，Rockville M.D.(1990)p 138)。
细菌宿主细胞    此质粒可在本领域任何合适的宿主中生长〔如见Ausubel，后述(1995综述)§§16.15-16.19〕。非限制性实例是DH5α。
TK缺陷细胞    转化及痘苗病毒替代都是在人的TK-143B细胞系上完成的。此细胞系为源于人的骨瘤细胞系R970-5的TK缺陷细胞系〔Rhim等，(1975)后述〕，它可支持VV的生长〔Weir等，(1982)后述〕。包含有特异HIV包膜蛋白基因序列的每一痘苗病毒重组子的选择基于lacZ基因的表达(病毒噬斑覆以Bluo-gal并通过蓝色的显现筛选有β-半乳糖苷酶活性的病毒斑)：要进行两轮PCR。
          实施例2：多包膜蛋白疫苗的制备
Vero细胞    最后的生产步骤是在Vero细胞上培养n个VVenv构建体，Vero细胞新近购自A.T.C.C.(许可号CCL81或X38)并经过了克隆和扩增以用于病毒生长。世界卫生组织批准Vero细胞系用于开发疫苗〔Hay.Retal编，美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录，第七版，美国典型培养物保藏中心Rockville MD(1992)p 48〕。
Vero细胞培养于含有谷胺酰胺(Bio-Whittaker)及热灭活的胎牛血清(Hyclone,Inc)的DMEM(Bio-Whittaker)培养基中。另一种方法，无血清培养基也可使用。每一种VVenv构建体接种于单层融合的Vero细胞上，并在细胞由于病毒感染产生病变时收获之。收获后冻存前，细胞提取物以PBS(Bio-Whitter)充分洗涤。然后用冻融、超声或低速离心(任选)的方法破碎细胞。上清部分贮存于-70℃，即使是减毒的VV，如制备物加热至60℃并保持1小时，裂解物中包膜蛋白的浓度足以在动物模型中引发HIV包膜蛋白抗异的抗体(由ELISA检测)。
疫苗产物来自Vero细胞的每一病毒(VVenv构建体)原种都经过分别冻存、滴度测定及安全性检验。检测完成后，将每一病毒的等份相混合以产生108总噬斑形成单位(pfu)/ml的疫苗原种。(pfu代表噬斑形成单位)。如果40个VVenv构建体用于一个疫苗产品中，优选地每个VVenv量相等，每个VVenv的滴度为2.5×106噬斑形成单位/ml，最后此疫苗产品应产生1×108总噬斑形成单位。
              多包膜蛋白疫苗的估价
小鼠以1×107pfu表达env的VV腹膜内注射感染小鼠。感染后三星期，按前述方法，用HIV ELISA和中和测定法鉴定抗体。
在制造人用多包膜蛋白疫苗以前，制备了一组相似的病毒以在小鼠上进行疫苗检测。这些病毒通过腹膜内或皮下方式施用于小鼠。然后，我们检测血清中HIV-1特异性抗体。血清活性以酶联免疫吸附测定(ELISA)检测。此测定涉及将完整的、断裂的HIV-1(HTLVⅢB)铺于ELISA板上，用牛血清白蛋白封闭ELISA板。血清样品以1∶100,1∶1000,1∶10000的稀释度加入PBS。此测定用碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠免疫球蛋白抗体和对硝基苯磷酸显色。显色反应用氢氧化钠溶液中止，且在ELISA板读出器上405nm处读取其光密度。
如图2所示，用含106-107pfu痘苗病毒(含有单一的HIV/包膜蛋白编码序列和表达的膜结合形式的包膜蛋白)的细胞裂解液制剂接种一次会引发在6个月的实验期间中持续存在的针对HIV-1的强抗体反应。这样的抗体反应明显地比以前报道的免疫产生的抗体反应强。这样强的抗体反应也许应归于疫苗制剂中膜结合包膜蛋白的存在。如图3所示，这些反应为剂量依赖性的。施用剂量106pfu的哺乳动物反应比施用剂量107pfu的哺乳动物反应低。
也制备了表达不同HIV包膜蛋白的痘苗病毒混合物。小鼠接受107pfu 5种病毒混合物时，它们的反应在数值上与由107pfu单个痘苗病毒重组子产生的反应相同(图4)。高数量的多种表达包膜蛋白的痘苗病毒的混合还未见报道，期望它能产生广谱的中和抗体。
人类混合的病毒原种实验先于临床试验进行，第一批实验用于剂量梯度和安全性测试。
临床实验是剂量梯度的研究，其涉及了4个志愿组的组合，每一组接受下面其中的一个剂量的疫苗：
(1)2×104pfu
(2)2×105pfu
(3)2×106pfu
(4)2×107pfu
每一志愿者通过皮下注射方式接受了0.5ml盐水形式的混合型病毒疫苗。实施例3：在猩猩中用多包膜蛋白痘苗病毒为基础的HIV-疫苗诱导的
       初级分离物中和免疫原性
用一批混杂的(sophisticated array)包膜蛋白武装(armed)HIV分离物总体(population)包膜蛋白是全部由病毒编码的外部蛋白而且是中和抗体活性的靶蛋白，然而针对一株分离物引发的抗体不一定能中和另一株分离物。基于这个原因，我们制备了一个表达多种Env蛋白的HIV疫苗鸡尾酒：多包膜蛋白(Poly Env)。疫苗制备开始于制备30种不同的VV-重组子，每一重组子表达不同的包膜蛋白。然后VVenv单独或联合(多包膜蛋白)在猩猩模型中进行检测。四只猩猩皮下免疫了三次单个VVenv(猩猩1和2)或多包膜蛋白(猩猩3和4)，然后把于明矾中的重组的gp120/gp41蛋白进行肌内注射。在四只动物中表现出安全性，只有其中的两只在注射位点表现出溃烂。用多次HIV结合试验和中和实验监测血清样品。猩猩3和4的抗体表现出最高质量的抗体活性。对一实验室分离物和一HIV初级分离物中和功能表现出来，这两株分离物都不特异存在于此疫苗中。因此，用混合包膜蛋白引发的淋巴细胞提供了一种引发针对不同HIV-1的高质量抗体的有前途的方法。
                   材料和方法
pVenv4，痘苗病毒重组载体pVenv4是通过将终止密码子引入BH10包膜蛋白序列，并将此修饰过的BH10包膜蛋白基因(env)插入pSC11制备的pVenv4表达一个包膜蛋白产物，此蛋白在640位氨基酸处被截短，并且能分泌和寡聚化。前面已描述过表达此截短的BH10包膜蛋白重组痘苗病毒，VVenv4的制备〔Hallenberger等，病毒学193:510-514(1993)〕。
用PCR方法从感染了HIV-1的个体中扩增env序列PCR用于扩增HIVenv序列。通常地，样品来自感染了HIV-1的个体第一次诊断HIV时采集的血样。其他样品来自具有艾滋病临床症状的个人或艾滋病研究和参比试验库。对于血样，DNA是通过将血或感染细胞逐滴加入以SDS为基础的裂解液中并在65℃孵育30分钟加以制备。将0.5mg/ml的链霉蛋白酶(Pronase)加入其中，裂解物在45℃继续孵育过夜。用酚抽提两遍后，进行乙醇沉淀，然后将DNA重悬于水中。
用标准方法对所有的DNA样品进行两轮PCR。引物序列的选择基于已发表的BH10序列〔Ratner等，自然313:277-284(1985)〕。为了获得包括所有变异区和一部分gp41序列，实例1中描述的PCR引物运用于此。运用标准方法，将PCR产物通过替代克隆到pVenv4载体中。用Sanger法和引物ccatgtgtaaaattaaccccactctgtg(SEQ ID NO:5)对新质粒进行测序。
VVenv的制备通过以新的替代质粒(见上)转染到VV(NYCDH ATCC)感染的细胞中制备新的VV重组体。依据生产商的推荐，转染(Transfectam)(Promega公司)和Lipofectamine(Gibco,BRL)用以促进转染。然后用噬菌斑纯化VV。
免疫感染了VVenv的细胞裂解通过皮下注射接种于猩猩。VVenv或单用或联合使用。每次注射中每只动物的总VV量以pfu表示相似(约107pfu)。肌肉注射中的每一接种物是由约40微克gp120(Cat#12101,Intracel Cambridge,MA)、20微克gp41(Cat#036001Intracel)和500微克明矾(Rehsorptar,Alnminum hydroxideAdsorptive Gel.Intergen.Co.purchase,NY)组成的混合物。
ELISAs 按下述进行5个ELISA:ELISA#1:Abbott临床ELISA购自Abbott实验室并且按照制造商的推荐进行操作(HIV ABHIV-1/HIV-2(rDNA)EIA,Abbott laboratories.Abbott Park,I.L.)。ELISA#2将重组Mn-gp160(Quality BiologicalGalthersburg,MD)以1μg/ml铺于板上而进行。板经包被后用3倍系列稀释的血清进行检测。板经洗涤后通过碱性磷酸酶偶联的抗人IgG记录结果。ELISA#3：以1μg/ml的LAI-gp120(CHO细胞来源的蛋白，Intracel)包被板子，血清以1∶100稀释后铺于板上并通过碱性磷酸酶偶联的抗人IgG(鼠抗人IgG1-AP,Cat#9050-04,SouthernBiological Associates.Inc.Birmingham.A.L.)和对硝基苯磷酸记录结果，在405nm处读取光密度(O.D.)值。ELISA#4：ELISA按3号测定进行，不同之处在于以1μg/ml的ⅢB-gp120(杆状病毒来源的蛋白，Intracel,Cat#12001 Cambridge.MA)包被板子。ELISA#5：此ELISA按测定3进行，不同之处在于以1μg/ml的ⅢB病毒裂解液包被板子(Organon.Teknika.Co.Durham N.Y.)。
中和测定    用实验室分离物或初级分离物进行中和测定〔Montefior等，临床微生物学杂志26:231-237(1988),Montefiori等，传染性杂志173:60-67(1996)〕实验室分离物，病毒以1∶20与血清样品混合并铺于MT-2或CEM-X174细胞上。中性红染色用于估价细胞的生存力。与对照培养物比较，细胞死亡率降低35-40％定义为阳性偏转(positive deflection)。初级分离物：病毒以1∶4与每一血清样品混合，并铺于植物凝集素刺激的PBMC(外周血单核细胞)上。测定得分为p24。与对照培养物比较，感染率至少下降75％对阳性得分是必须的。
                     结果
新的VVenv重组痘苗病毒的制备为了制备新的表达独特HIV-1包膜蛋白的痘苗病毒重组子(VVenv)首先从HIV-1样品中分离DNA。大多数DNA来自于没有外在症状而最初诊断为HIV感染个体的血样。另外的DNA来自艾滋病人或由艾滋病研究和参比试剂库。用含有KpnⅠ和BsmⅠ限制性位点的引物进行PCR。片段在KpnⅠ和BsmⅠ处被替代入如图所示的pVenv4载体中(pVenv4最初表达截短了的HIV-1蛋白BH10)。以这种方式，BH10的gp120(V1-V5)和gp41序列被PCR产物的各个序列取代。随着每一替代质粒，制备新的VV重组病毒(VVenv)。
此方法提供了一种简单的途径，通过它，很多种包膜蛋白序列被掺入到独特的VV重组子中(VVenv)。有趣地是，大部分序列都可表达，这提示原病毒基因组(大部分PCR产物的来源)中的包膜蛋白序列很少有缺陷。用于此疫苗混合物的VVenv有很大的多样性。
用单个或混合的VVenv免疫猩猩四只猩猩用于检测单个或混合的VV重组体疫苗。免疫程序列于表2。前三次注射剂包含VV而最后一次注射是包括gp120,gp41和明矾组合并肌肉内注射。猩猩1和猩猩2在前三次的每一次注射剂中只接受了一种痘苗病毒和各自的包膜蛋白。猩猩3和猩猩4接受了10种重组VV混合物(和第一次注射剂中相应的蛋白)的注射，第二次注射的是10种另外的包膜蛋白，最后一次免疫为10种独特的包膜蛋白，在用蛋白加强以前总共接种了30种不同的载体。所有猩猩接受了相似噬斑形成单位的总痘苗病毒及相似数量的总重组蛋白。
        表2用混合的VV重组子免疫猩猩的程序
           日期            注射猩猩1和2:    1/9/96         VV(Env#1)
         4/16/96        VV(Env#1)
         6/11/96        VV(Env#1)
         7/30/96        重组gp120和重组gp41+明矾猩猩3和4:    1/9/96         VV(Env#1-10)
         4/16/96        VV(Env#11-20)
         6/11/96        VV(Env#21-30)
         7/30/96        重组gp120和重组gp41+明矾
重组VVenv的使用可不导致创伤、监测四只猩猩系统疾病症状和注射位点创伤的形成。每天都观察动物的腹泻、鼻溢、咳嗽、打喷、呼吸短促、倦怠、活动受限及食欲丧失。在任何时候，这些症状在任何动物中都不明显。在第一次VV接种后以规则的时间间隔对注射位点拍照结果表明四只动物中有明显的肿胀。猩猩1和3的注射位点有典型的接种天花时的轻微创伤，而猩猩2和4则没有明显的创伤。在所有动物中，第二次、第三次、第四次注射都没有出现病症、肿胀或损伤，这表明第一次接种引发了VV特异的免疫力。
VVenv注射后用蛋白加强免疫产生了ELISA阳性的抗体。在免疫程序中用5种不同的ELISA监测HIV特异的抗体。ELISA用于检测每只动物中抗体的相对质量而非绝对数量。在大多数情况下，检测是用缺少天然Env典型的三维结构和寡聚体结构的病毒片段进行的。在这些情况下，ELISA只与一部分HIV特异的抗体结合。用Abbott ELISA得到的结果列于图6。猩猩3在第1次VV接种后，超过了阳性截止点(cut-off)。而猩猩4在第二次VVenv接种后超过了阳性截止点。猩猩3和猩猩4在免疫结束时的反应远远超过了猩猩1和猩猩2的反应。在用MNgp160进行检测的ELISA#2中，猩猩3是唯一的高反应者。此反应出现于蛋白加强免疫之前，而不被加强免疫注射扰乱。在用与加强免疫的纯化蛋白相同的抗原作抗原时，对结合于ELISA板上的CHO-LAI的反应(ELISA#3)表明只有猩猩3有很强的反应。用ⅢB-gp120结合的板上进行的ELISA#4中，猩猩2有很强的本底，也许由于高本底的原因，它是所有动物中反应值最高的。第5个ELISA反应中，四只动物血清对Organon Tachnika ⅢB病毒裂解液的反应皆为阳性。
对于初级分离物和实验室分离物的中和反应来自每只动物的血清都分别与实验室分离物和初级分离物进行了中和反应。第一次测定在T细胞系上进行，后一个测定在血清阴性的植物凝集素刺激的外周血单核细胞上(PBMC)进行的。所有情况下，分离物不与HIV-1疫苗中的HIV匹配。如表3所列，猩猩2、3、4的样品在T细胞中对实验室分离物MN有一个阳性偏差(病毒生长有35-40％的抑制)。其他两株实验室病毒的分析(一个是ⅢB〔Lockey等，艾滋病研究与人类逆转录病毒12:1297-1299(1996)〕，一个是SF2贮存种)与任何样品都不反应。用四种分离物在PHA刺激的PBMC上中和分析的结果〔Montefior等，1988前述；Montefior等，1996前述〕列于下。病毒在这些测定中难以被中和，因为即使以1∶2稀释，病人血清经常出现阴性结果。〔Fenyo等，艾滋病10:S97-S106(1996)；Mooreand Ho艾滋病9:S117-S136(1995)；Montefior等，1996前述〕。有趣地是，猩猩4的血清以1∶4稀释时能中和测试初级分离物中的一种。这种情况与其他用Env疫苗实验的经验不同，在以前很多情况下，来自接种Env个体的血清与初级分离物进行中和测定时，结果为阴性。〔Steele,NIH研究杂志6:40-42(1994)；Moore，自然376:115(1995)〕。
表3猩猩抗血清与疫苗中非典型(not specially represented)
   的中和反应
    分离物 猩猩1 猩猩2 猩猩3 猩猩4
实验室株MN  - 阳性偏转 阳性偏转 阳性偏转
初级分离物#1  -  -  -  -
初级分离物#2  -  -  -  -
初级分离物#3  -  -  - 阳性
初级分离物#4  -  -  -  -
混合的VVenv比单个VVenv引发的HIV-1特异的抗体质量高。ELISA和中和测定的结果总结于表4，表4列出了在上述7种检测中有较高反应的猩猩。从中看到，7次实验中，猩猩3和4有5次阳性而猩猩1和2只有3次阳性，或许这个结果可以反映：与单个包膜蛋白疫苗相比，多包膜蛋白疫苗引发的抗体质量更高。
                表4 ELISA和中和测定总结
      测定 接受单个VV产生高反应的猩猩 接受混合VV产生高反应的猩猩
Abbott(ⅢB-gp41)-ELISA#1 猩猩3和猩猩4
 MNgp160BAC ELISA#2 猩猩3
 ⅢB-gp120-BAC ELISA#3 猩猩2
 LAI-gp120-CHO-ELISA#4 猩猩3
 Ⅲb病毒裂解物ELISA#5 猩猩1和猩猩2 猩猩3和猩猩4
实验室分离物中和测定(偏转) 猩猩2 猩猩3和4
初级分离物中和测定 猩猩4
                       讨论
此实施例中设计的实验是为了检测HIV-1痘苗病毒疫苗的安全性并比较包膜蛋白鸡尾酒与单个包膜蛋白疫苗的引发效率。结果表明，首先，痘苗病毒可用作免疫原而不会诱发开放性(open)伤口。其次，用多包膜蛋白“鸡尾酒”可引发较大范围的HIV-1特异的活性。
猩猩模型可使我们在灵长类中检测多包膜蛋白的安全性。我们特别感兴趣于决定开放性伤口形成的程度，因为接种VV时，活病毒疫苗对未免疫个体会造成危害。就HIV而言，因为艾滋病人不能阻挡VV感染，因而它更是一个严肃的问题。为了考察这一问题，我们用皮下注射免疫猩猩以检测是否可以避免开放性伤口。事实上，4只猩猩中只有2只出现开放性伤口。这与在牛痘疫苗临床试验中，用NYCDH痘苗病毒贮存种进行皮下接种时出现的结果相似。〔Connor等，传染病杂志135:167-175(1977)；Benenson等，传染病杂志135:135-144(1977)〕。
如果对注射过程多加注意并进一步照料注射点，开放性伤口在所有病例都可能不会出现。结果表明，安全性问题不会成为痘苗病毒用作HIV-1疫苗载体的障碍。
包膜蛋白鸡尾酒已在小鼠(实施例2)和兔子实验中得以检测。在小鼠实验中，在注射一次VVenv后，抗HIV抗体就可检测到，而在兔子中，VVenv用于加强DNA引发的反应。实验表明，VVenv可以引发或加强HIV特异抗体，而此抗体反应可以中和初级分离物。猩猩被分为两组以检测混合VVenv(多包膜蛋白)的潜力。前两只猩猩只接受1种VVenv，而猩猩3和4则分别接受由30种不同的VVenv组成的“鸡尾酒”。
受到痘苗病毒免疫后，所有四只猩猩都接受了一次混于明矾中的gp120/gp41的加强免疫。四只猩猩中每只猩猩的血清分别以5种不同的ELISA检测，每种ELISA用Env的不同部分或不同构象的Env。有趣地是，猩猩1和2只在其中的一种ELISA中反应强，而猩猩3和4的血清在4种测定中反应都很强。因为每一测定只是检测每一动物中HIV特异抗体的一部分，结果很可能反映了由混合疫苗引发的抗体结合反应范围很广泛。
我们也进行了针对实验室分离物和初级分离物的中和测定。有趣地是，尽管初级分离物没有特异地包括在疫苗混合物中，猩猩4能产生针对此分离物的阳性反应。这些结果再次表明，多包膜蛋白疫苗鸡尾酒可引发的抗体范围更为广泛。疫苗中抗原复杂性的增加或许会导致淋巴细胞及相应抗体反应的多样性。
针对疫苗中不存在的初级分离物的中和抗体的引发表明线性结构不同的蛋白具有共同的构象。这一点也为感染了HIV-1的病人的免疫反应所证实，因为暴露于不同大量病毒的两个体，当病毒交叉暴露时，两个体都可免于超感染。多包膜蛋白的应用代表了在猩猩系统中第一次尝试模仿HIV-1病人的状况，即中和抗体由一大批而不是一个包膜蛋白引发。
概括地说，我们在猩猩模型中测试了一个名为多包膜蛋白的以VV为基础的HIV-1疫苗鸡尾酒。
1)VV可用作疫苗而不诱发开放性损伤；
2)此疫苗可引发广泛的HIV-1特异的抗体活性；及
3)与单个Env构建体相比，Env构建体(多包膜蛋白)鸡尾酒能够产生优质的HIV特异的抗体。
野生型痘苗病毒和重组型痘苗病毒很早就被认为是强有力的疫苗。VV的威力在于它能够征集免疫反应中的B细胞和细胞毒性T细胞。VV包括唯一能够根除人类一种疾病(天花)的疫苗。此实施例提供的数据表明重组痘苗病毒载体将有助于未来对HIV-1的控制。
            实施例4：双功能质粒的制备
几种不同的系统(流感，HIV-1等中)已证明，DNA疫苗能引发强的抗体反应和CTL反应。流感病毒DNA疫苗和HIV-1 DNA疫苗已用于健康成年志愿者的临床实验。痘苗病毒也是免疫计划的重要基础。事实上，痘苗病毒是唯一能够根除人类一种疾病(天花)的疫苗。如在动物研究中所证明的，大量的重组痘苗病毒引发了强的免疫反应。上述证据证明了多包膜蛋白及联合免疫策略的效率，如DNA疫苗和病毒疫苗的效率。
既可作DNA疫苗又可作痘苗病毒重组载体的双功能质粒已得以构建。图7为此质粒的图谱，它包括一个用于在哺乳动物细胞表达的CMV启动子，及用于制备重组痘苗病毒的痘苗病毒早期和晚期启动子。纯化质粒DNA的直接注射可在受试者体内引发针对HIV包膜蛋白的免疫反应。此质粒也将用于制备和验证活的重组痘苗病毒，后者将用于HIV包膜蛋白免疫载体。
也可以多层次的治疗方案接种受试者。此治疗方案包括DNA接种和重组痘苗病毒接种，接种可为任意顺序的一次注射也可多次注射和/或与另外的疫苗载体联合接种。
本发明的范围不局限于在此描述的特定的实施方案。事实上，除此之外，根据前面的描述和附图，本发明的多种修饰对本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修饰将包括于附加权利要求中。需要进一步明白，赋予核酸或多肽所有的碱基大小或氨基酸大小，及所有分子量或分子量值是近似的且为了便于描述。
此处引用了很多出版物，现将之做为一个整体列于参考文献中。
                    参考文献
Ausuber等编，当代分子生物学方法，Green Publishing Assoc.,New York,NY(1987、1988、1989、1990、1991、1992、1993、1994、1995)
Avery’s药物治疗；临床药物学和治疗学的原理和实践第三版，AIDS出版公司，Williams and Wilkins,Baltimore,MD(1987)
Belshe,R.B.等，美国医学协会杂志272:431-431(1994)
Berkow等编，Merck手册，第15版，Merck and Co.,Rahway,NJ(1987)
Birnboim,H.C.和Doly,J.,核酸研究7:1513-1523(1979)
Buck,C和Paulino,M.S.编，动物病毒、抗血清、衣原体立克次氏体目录第6版，美国典型培养物保藏中心Rockville,MD(1990)
Burns,D.P.W.和Desrosiers,R.C.微生物免疫学现代论题188:185-219(1994)
Chakrabarti.S.等，分子细胞生物学5:3403-3409(1985)
Cooney等，美国国家科学院院报90:1882-1886(1993)
Creghton,T.E.，蛋白质：结构和分子特征，W.H.Freeman&Co.,San Francisco,CA(1983)
Devita Jr.,V.T.等，艾滋病，病原学诊断治疗和预防第3版，J.B.Lippincott Co.,Philadelphia,PA(1992)
D’Honcht，疫苗10增刊：548-52(1992)
Dorozynski和Anderson科学252:501-502(1991)
Ebadi，药物学，Little Brown和Co.,Boston,MA(1985)
Eichberg，艾滋病国际会议7:88(1991)
Embreston,J.等，自然362:359-362(1993)
Enami等，病毒学杂志65:2711-2713(1991)
Enami等，美国国家科学院院报87:3802-3805(1990)
Fauci，科学264:1072-1073(1994)
Goodman等编，Goodman和Gilman’s的治疗学药物基础第八版，Pergamon Press,Inc.Elmsford,NY(1990)
Gorse，艾滋病研究与人类逆转录病毒，10(增刊2):141-143(1994)
Gribskov和Burgess核酸研究14:6745(1986)
Graham等，传染病杂志166:244-252(1992)；传染性杂志167:533-537(1993)
Grundwald-Bearch等，临床肿瘤学癌症研究杂志117:561-567(1991)
Hallenberger等，病毒学193:510-514(1993)
Hay,R.等编，美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录第七版，美国典型培养物保藏中心Rockville,MD(1992)
Hirsch,M.S.和Curran,J.“人类免疫缺损病毒，生物学和医学特性”《病毒学》，Fields和Knipe编，Raven Press,Ltd.,New York,NY(1990),PP 1545-1570
Hu等，自然328:721-723(1987)
Ish-Horowicz,D.和Bruke,J.F.，核酸研究9:2989-2998(1981)
Ito等，病毒学杂志65:5491-5498(1991)
Ito等，癌症研究50:6915-6918(1990)
Javaherian,K.等，美国国家科学院院报86:6768-6772(1989)
Katzung编，基础和临床药物学第五版，Appleton and Lange,Norwalk,CT(1992)
Keefer等，艾滋病研究与人类逆转录病毒10(增刊2):S139-143(1994)
Kieny等，艾滋病国际会议5:541(1989)
Kilpatrick等，生物化学杂志262:116-121(1987)
Luytjes等，细胞59:1107-1113(1989)
Mackett,M．等，美国国家科学院院报79:7415-7419(1982)
Mazzara,G.P．等，酶学方法217:557-581(1993)
McElrah等，传染病杂志169:41-47(1994)
Needleman和Wunsch，分子生物学杂志48:443(1970)
Osol,A.，编雷明顿药物科学Mack Publishing Co,Easton,PA(1980),pp1324-1341
Panicali,D.，和Paoletti，E.，美国国家科学院院报79:4927-4931(1982)
Pantaleo,G.等，自然362:355-358(1993)
Rhim,J.S.等，国际癌症杂志15:23-29(1975)
Richman，艾滋病研究与人类逆转录病毒8:1065-1071(1992)
Richman，药物毒理学年评33:149-164(1993)
Richman，抗微生物试剂化学治疗37:1207-1213(1993)
Richman，艾滋病研究与人类逆转录病毒10:901(1994)
Richmond和Mckinney编，微生物学和生物医学实验室生物安全第3版，U.S.Dept of Health & Human Services,Washinton DC(1993)
Sambook,J等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor),NY(1989)
Schulz,G.E．等，蛋白质结构原理，Springer-Verlag,New York,NY(1978)
Schwartz和Dayhoff编，蛋白质序列和结构图集，NationalBiomedical Research Foundation,〔Washington DC？-wp〕(1979),pp.353-358
Selenka等，Arch,Hyg,Bakteriol.153:244-253(1969)
Smith和Waterman，应用数用进展2:482(1981)
Starcich等，细胞45:637(1986)
Towbin,H．等，美国国家科学院院报76:4350(1979)
United States Biochemical，测序酶，2.0版-DNA测序试剂盒第9版(Ninth Edition),Amersham Life Science,Inc.Boise,Idaho(1994)
Weir等，美国国家科学院院报79:1210-1214(1982)
Wellis等，免疫学杂志99:1134-9(1967)
Wong-Staal,F.，“人类免疫缺损病毒及其复制”《病毒学》Fields和Knipe,编，Raven Press,Ltd.,New York,NY(1990),pp.1529-1543
Wrin等，获得性免疫缺损综合征杂志7:211-219(1994)
Wu等，核酸研究分子生物学进展21:101-141(1978)
Zagury等，自然332:728-731(1988)
                     序列表(1)一般信息：
(ⅰ)申请人：圣·朱迪儿童研究医院(Children’s Research
            Hospital )
            332 North  Lauderdale
            PO  Box 318
            Memphis, TN 38101-0318
            美国
    申请人/发明者：Hurwitz,Julia L.
                     Coleclough,Christopher
                     Owens,Randall J.
                     Slobod, Karen
(ⅱ)发明题目：针对人免疫缺损病毒的混合型包膜蛋白疫苗病毒
              载体的制品及应用
(ⅲ)序列数目：7
(ⅳ)通讯地址：
    (A)收信人：KLAUBER & JACKSON
    (B)街道：411 HACKENSACK AVENUE
    (C)城市：HACKENSACK
    (D)州：NJ
    (E)国家：美国
    (F)邮编：07601
(ⅴ)计算机可读形式：
    (A)媒介形式：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)运行系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：Patent In Releaes#1.0,Version#1.30
(ⅵ)当前申请数据：
    (A)申请号：待定
    (B)提交日期：附此
    (C)分类：
(ⅷ)代理人/事务所信息
    (A)姓名：Paul F.Fehlner
    (B)登记号：35,135
    (C)参考/存档：13401011/PCT
(ⅸ)电信信息：
    (A)电话：201-487-5800
    (B)传真：201-343-1684(2)SEQ ID NO:1信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：27个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA
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    AGCAGAAGAC AGTGGCAATG AGAGTGA(2)SEQ ID NO:2信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：30个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
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    CCACTCCATC CAGGTCATGT TATTCCAAAT(2)SEQ ID NO:3信息：
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    (A)长度：32个碱基对
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    (D)拓扑学：线性
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    GTGGGTCACA GTCTATTATG GGGTACCTGT GT(2)SEQ ID NO:4信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度：34个碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
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    CCAGAGATTT ATTACTCCAA CTAGCATTCC AAGG(2)SEQ ID NO:5信息：
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    (A)长度：28个碱基对
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    (C)链型：单链
    (D)拓扑学：线性
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    (A)长度：880个氨基酸
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    (C)链型：两者具备(both)
    (D)拓扑学：两者具备(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7Lys Glu Gln Lys Thr Val Ala Met Arg Val Lys Glu Ser Gln Met Lys1               5                   10                  15Lys Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg Trp Gly Thr Met Leu Leu
        20                  25                  30Gly Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr
    35                  40                  45Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys GluAla Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala
50                  55                 60Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val Trp Ala Thr65                  70                  75                  80His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu Val
            85                  90                  95Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asp Met Val Glu Gln
        100                 105                 110Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu Lys Pro Cys
    115                 120                 125Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser Leu Lys Cys Thr Asp Leu Lys
130                 135                 140Asn Asp Thr Asn Thr Ser Asn Asn Val Thr Ser Ser Ser Trp Gly Arg145                 150                 155                 160Asn Ile Met Glu Glu Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Ser
            165                 170                 175Thr Ser Ile Arg Gly Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe Tyr Lys
        180                 185             190Leu Asp Ile Ile Pro Ile Asp Lys Gly Asn Asp Ser Asn Asp Thr Thr
    195                 200                 205Ser Tyr Lys Phe Thr Leu Thr Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln
210                 215                 220Ala Cys Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala225                 230                 235                 240Pro Ala Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly
            245                 250                 255Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile
        260                 265                 270Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Lau Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu
    275                 280                 285Glu Glu Val Val Ile Arg Ser Ala Ash Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr
290                 295                 300Ile Ile Val Gln Leu Asn Gln Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Pro305                 310                 315                 320Asn Asn Asn Thr Arg Lys Set Ile Arg Ile Gln Arg Gly Phe Gly Arg
            325                 330                 335Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys Ile Leu Gly Asn Met Arg Gln Ala His
        340                 345                 350Cys Asn Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asn Asn Thr Leu Lys Gln Ile Asp
    355                 360                  365Ser Lys Leu Arg Glu Gln Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys
    370             375                 380Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro Glu Ile Val Thr His Ser Phe Asn Cys385                 390                 395                 400Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser Thr
            405                 410                 415Trp Phe Asn Ser Thr Trp Ser Thr Lys Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly
        420                 425                 430Ser Asp Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met
    435                 440                 445Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln
450                 455                 460Ile Arg Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly465                 470                 475                 480Gly Ala Asn Glu Asn Asn Glu Ser Glu Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly
            485                 490                 495Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val
        500                 505                 510Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val
    515                 520                 525Val Gln Arg Glu Lys Arg Ala Val Gly Glu Ile Gly Ala Leu Phe Leu
530                 535                 540Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr545                 550                 555                 560Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln
            565                 570                 575Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu
        580                 585                 590Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu
    595                 600                 605Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly
610                 615                 620Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn625                 630                 635                 640Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp
            645                 650                 655Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu
        660                 665                 670Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp
    675                 680                 685Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp
690                 695                 700Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg705                 710                 715                 720Ile Val Phe Ala Val Leu Ser Val Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr
            725                 730                 735Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr His Leu Pro Ile Pro Arg Gly Pro Asp
        740                 745                 750Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg
    755                 760                 765Ser Ile Arg Leu Val Asn Gly Ser Leu Ala Leu Ile Trp Asp Asp Leu
770                 775                 780Arg Ser Leu Cys Leu Phe Ser Tyr His Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu785                 790                 795                 800Ile Val Thr Arg Ile Val Glu Leu Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Ala
            805                 810                   815Leu Lys Tyr Trp Trp Asn Leu Leu Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu Lys
        820                 825                 830Asn Ser Ala Val Ser Leu Leu Asn Ala Thr Ala Ile Ala Val Ala Glu
    835                 840                 845Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu Val Val Gln Gly Ala Tyr Arg Ala Ile
850                 855                 860Arg His Ile Pro Arg Arg Ile Arg Gln Gly Leu Glu Arg Ile Leu Leu865                 870                 875                 880

Claims (24)

1．一种多包膜蛋白疫苗，包括至少约4-10,000种不同的重组病毒，其中每一种病毒包括编码人免疫缺损病毒(HIV)多包膜蛋白不同变异体的env变异体(EV)的核酸，其中：
a)EV核苷酸编码包膜蛋白变异体的变异区和保守区；并且
b)此多包膜蛋白疫苗能够引发哺乳动物对一个HIV株的细胞免疫反应和体液免疫反应中的至少一种。
2．根据权利要求1的多包膜蛋白疫苗，包括约10-100种包含不同HIV包膜蛋白(env)变异体的重组病毒。
3．根据权利要求1的多包膜蛋白疫苗，其中的重组病毒选自痘苗病毒、金丝雀痘病毒、腺病毒和腺病毒伴随病毒(AAV)。
4．根据权利要求1的多包膜蛋白疫苗，其中的包膜蛋白变异体包括gp120和足以使env蛋白寡聚化的gp41的一部分。
5．根据权利要求4的多包膜蛋白疫苗，其中的包膜蛋白变异体核苷酸包括HIV包膜蛋白编码核苷酸的KpnⅠ-BsmⅠ限制性片段。
6．根据权利要求1的多包膜蛋白疫苗，其中的EV核苷酸是从一个限定的地理区域内感染了HIV病毒的病人或从不同进化枝(clades)内感染了HIV病毒的病人中分离得到的。
7．根据权利要求9的多包膜蛋白疫苗，其中的疫苗包括了由重组病毒表达的包膜蛋白变异体。
8．根据权利要求1的多包膜蛋白疫苗，其中的多包膜蛋白疫苗进一步包括了药物上可接受的载体、佐剂和抗病毒化疗化合物中的至少一种。
9．制备多包膜蛋白疫苗的方法，包括将至少4-约10,000种不同重组病毒混合成混合物以获得多包膜蛋白疫苗，其中，
<ⅰ>每一重组病毒包括编码不同的HIV包膜蛋白变异体的env变异体(EV)核苷酸；
<ⅱ>此EV核苷酸编码包膜蛋白变异体的变异区和保守区；
<ⅲ>此多包膜蛋白疫苗能够引发哺乳动物对一个HIV株的细胞免疫反应和体液免疫反应中的至少一种。
10．根据权利要求9的方法，其中约10-100种包括不同HIV包膜蛋白变异体的重组病毒被混合。
11．根据权利要求9的方法，其中的重组病毒选自痘苗病毒、金丝雀痘病毒、腺病毒和腺病毒伴随病毒(AAV)。
12．根据权利要求9的方法，其中的包膜蛋白变异体包括gp120和足以使env蛋白寡聚化的gp41的一部分。
13．根据权利要求12的方法，其中的EV核苷酸包括HIV包膜蛋白编码核苷酸的KpnⅠ-BsmⅠ限制性片段。
14．根据权利要求9的方法，其中的EV核苷酸是从一个限定的地理区域内感染了HIV病毒的病人或从不同进化枝(clades)内感染了HIV病毒的病人中分离出来的。
15．根据权利要求9的方法，其中的疫苗包括了由重组病毒表达的包膜蛋白变异体。
16．根据权利要求9的方法，其中的组合步骤进一步包括添加药物上可接受的载体、佐剂和抗病毒化疗化合物中的至少一种。
17．根据权利要求9的方法制备的多包膜蛋白疫苗。
18．一种引发哺乳动物对人免疫缺损病毒(HIV)的体液或细胞免疫反应或两种反应都产生的方法，包括给动物施用有效量的根据权利要求1-8任一项的多包膜蛋白疫苗。
19．根据权利要求18的方法，其中的重组病毒为痘苗病毒，包括皮下途径施用此多包膜蛋白疫苗。
20．根据权利要求18的方法，进一步包括给哺乳动物施用有效量的根据权利要求1-8中任一项另一种多包膜蛋白疫苗，其中另一种多包膜蛋白疫苗的重组病毒与权利要求18的疫苗的重组病毒不同。
21．根据权利要求18的方法，进一步包括通过施用<ⅰ>有效量的至少一种重组HIV包膜蛋白或<ⅱ>有效量的至少一种可表达重组HIV包膜蛋白的DNA载体，<ⅲ>或前两者都有引发或加强体液或细胞免疫反应或两种反应均引发，其中DNA载体可在重组HIV包膜蛋白施用之前，之后或同时施用。
22．根据权利要求21的方法，其中的重组HIV包膜蛋白与佐剂形成复合物或通过肌内注射或两者都进行；或其中的DNA载体用基因枪施用。
23．权利要求24的双功能质粒，其中的动物表达控制序列是一个巨细胞病毒立即早期(CMV)启动子，且病毒表达控制序列是痘苗病毒早期启动子，痘苗病毒晚期启动子或两者俱备。
24．包括异源基因的权利要求24的双功能质粒，其中的异源基因为编码HIV包膜蛋白变异体的变异区和保守区的env变异体(EV)核苷酸。
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TR (1) TR199801418T2 (zh)
UA (1) UA73712C2 (zh)
WO (1) WO1997027311A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1913919B (zh) * 2003-09-15 2011-10-19 美国政府健康及人类服务部 基于hiv多进化枝的env的hiv疫苗
CN114686495A (zh) * 2015-12-15 2022-07-01 扬森疫苗与预防公司 人类免疫缺陷病毒抗原、载体、组合物、及其使用方法

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7488485B2 (en) * 2003-09-16 2009-02-10 University Of Kansas Medical Center DNA vaccine compositions and methods of use
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
US6919318B1 (en) * 1998-04-22 2005-07-19 Chiron Corporation Enhancing immune responses to genetic immunization by using a chemokine
WO1999061049A2 (en) * 1998-05-22 1999-12-02 University Of Massachusetts Medical Center Model for infection by a pathogen using administration of nucleic acids
US6562800B1 (en) * 1998-10-30 2003-05-13 University Of Southern California Use of immunopotentiating sequences for inducing immune response
US6759237B1 (en) 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
JP2002538770A (ja) * 1998-11-10 2002-11-19 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル ウイルスベクターとその製造及び投与の方法
WO2000039303A2 (en) * 1998-12-31 2000-07-06 Chiron Corporation Modified hiv env polypeptides
AU2487300A (en) 1998-12-31 2000-07-31 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US7935805B1 (en) * 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1141313A2 (en) * 1998-12-31 2001-10-10 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
WO2000044410A2 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Stichting Biomedical Primate Research Centre Composition and method for obtaining specific immunisation against one or more antigens using different recombinant vectors
DE19907485B4 (de) * 1999-02-12 2008-01-17 Strathmann Ag & Co. Virus-Vakzine
US6420545B1 (en) * 1999-05-24 2002-07-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania CD4-independent HIV envelope proteins as vaccines and therapeutics
AU3793701A (en) * 1999-11-29 2001-06-04 Orchid Biosciences, Inc. Methods of identifying optimal drug combinations and compositions thereof
US20040105871A1 (en) * 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
WO2001092470A2 (en) 2000-03-02 2001-12-06 Emory University Dna expression vectors and methods of use
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
EP1311278A4 (en) * 2000-08-07 2005-01-05 Sloan Kettering Institutefor C METHOD AND IMMUNIZATION COMPOSITION USING MIXED POOLS OF NUCLEIC ACIDS OR MUTED PEPTIDES
DE60239317D1 (de) * 2001-01-12 2011-04-14 Novartis Vaccines & Diagnostic Nukleinsäure mukosale immunisierung
AU2002252199B2 (en) * 2001-03-08 2008-01-03 Emory University MVA expressing modified HIV envelope, GAG, and POL genes
AU2002320314A1 (en) * 2001-07-05 2003-01-21 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP2292772A1 (en) * 2001-07-05 2011-03-09 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. HIV vaccination with a DNA encoding a HIV polypeptide and a HIV polypeptide
GB0118532D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Isis Innovation Materials and methods relating to improved vaccination strategies
US20030170614A1 (en) * 2001-08-31 2003-09-11 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2003020876A2 (en) * 2001-08-31 2003-03-13 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20030228327A1 (en) * 2001-11-05 2003-12-11 Lasher Alfred W. DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
US20070269456A1 (en) * 2001-11-05 2007-11-22 Lasher Alfred W DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
EP1450854A2 (en) 2001-11-30 2004-09-01 Isis Innovation Limited Vaccine
US7094410B2 (en) * 2002-03-02 2006-08-22 The Scripps Research Institute DNA vaccine against proliferating endothelial cells and methods of use thereof
US6923958B2 (en) * 2002-03-02 2005-08-02 The Scripps Research Institute DNA vaccines encoding CEA and a CD40 ligand and methods of use thereof
US20040106566A1 (en) * 2002-05-17 2004-06-03 Shi-Lung Lin RNA-splicing and processing-directed gene silencing and the relative applications thereof
EP2316479B8 (en) * 2002-07-18 2015-03-18 University of Washington Pharmaceutical compositions comprising immunologically active herpes simplex virus (HSV) protein fragments
CA2505583C (en) * 2002-12-03 2014-07-15 University Of Massachusetts Polyvalent, primary hiv-1 glycoprotein dna vaccines and vaccination methods
JP2006528244A (ja) 2003-05-12 2006-12-14 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイティド Ｆｉｖ感染予防接種のための材料と方法
US7658927B2 (en) * 2003-05-12 2010-02-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for immunizing against FIV infection
US8076060B2 (en) * 2003-08-04 2011-12-13 Emil William Chynn Vaccination and immunotherapy as new therapeutic modalities in the treatment of glaucoma
EP2055316A1 (en) * 2003-09-09 2009-05-06 VIRxSYS Corporation Lentivirus vector-based approaches for generating an immune response to HIV in humans
US20070166784A1 (en) * 2003-09-15 2007-07-19 Barnett Susan W Combination approaches for generating immune responses
US20050175627A1 (en) * 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
US7622125B2 (en) 2004-05-05 2009-11-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Polycistronic HIV vector constructs
US7342107B2 (en) * 2004-05-27 2008-03-11 Centocor, Inc. Cynomolgus prostate specific antigen
CA2570563A1 (en) * 2004-06-15 2006-09-28 Centocor, Inc. Method for screening agents against human prostate disease
AU2005274948B2 (en) * 2004-07-16 2011-09-22 Genvec, Inc. Vaccines against aids comprising CMV/R-nucleic acid constructs
US20080085261A1 (en) * 2004-10-19 2008-04-10 Haynes Barton F Vaccine Adjuvant
EP2266602A3 (en) 2004-11-01 2011-08-10 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination approaches for generating immune responses
AU2005316476A1 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric vectors
US20100098721A1 (en) * 2006-10-18 2010-04-22 St. Jude Children's Reseach Hospital Methods and compositions for preparing a universal influenza vaccine
WO2010093784A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
WO2012070974A1 (ru) * 2010-11-22 2012-05-31 Farber Boris Slavinovich Вакцины с повышенной иммуногенностью и способы их получения
CA2826286C (en) * 2011-01-31 2021-09-21 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
AP2013007166A0 (en) 2011-04-06 2013-10-31 Univ Paris Descartes Inst De Rech Pour Le Dev Ird Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an HIV disease in humans
JP2014533290A (ja) 2011-11-14 2014-12-11 ノバルティス アーゲー ポリアニオン性カルボマーとＥｎｖポリペプチドとの免疫原性複合体ならびにその製造法および使用法
WO2013126622A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 President And Fellows Of Harvard College Methods for displaying polypeptides and uses thereof
CN113874078A (zh) 2019-04-05 2021-12-31 Tauc3生物制品有限公司 抗tauc3抗体及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198214A (en) * 1983-08-31 1993-03-30 Stolle Research & Development Corporation Anti-mastitis polyvalent vaccine, method of administration and method for production thereof
GR862412B (en) * 1985-09-25 1987-01-23 Oncogen Vaccines and immuinoassays for acquired immune deficiency syndrome
EP0243029A1 (en) * 1986-04-08 1987-10-28 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus gene
US5169763A (en) * 1986-04-08 1992-12-08 Transgene S.A., Institut Pasteur Viral vector coding glycoprotein of HIV-1
US5081226A (en) * 1986-12-30 1992-01-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Synthetic peptides sharing sequence homology with the HIV envelope protein
EP0469089B1 (en) * 1989-04-18 1997-11-19 Applied Biotechnology, Inc. Generation of hybrid genes and proteins by virus-mediated recombination
EP1156102A1 (en) * 1991-06-14 2001-11-21 Virogenetics Corporation Immunodeficiency virus recombinant poxvirus vaccine
US5643578A (en) * 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
DE69536091D1 (de) * 1994-01-27 2010-09-09 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch Impfung von DNS Transkriptionseinheit
FR2728794B1 (fr) * 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1913919B (zh) * 2003-09-15 2011-10-19 美国政府健康及人类服务部 基于hiv多进化枝的env的hiv疫苗
CN114686495A (zh) * 2015-12-15 2022-07-01 扬森疫苗与预防公司 人类免疫缺陷病毒抗原、载体、组合物、及其使用方法

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Publication number Publication date
KR100571479B1 (ko) 2007-06-07
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TR199801418T2 (xx) 1998-10-21
NZ331024A (en) 2000-02-28
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BG64711B1 (bg) 2005-12-30
EP0876498B1 (en) 2004-10-06
IL125497A0 (en) 1999-03-12
HUP9900389A3 (en) 2001-06-28

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