ES2230596T3 - Mezcla de vectores de vaccinia recombinantes como vacunas poligueur contra el vih. - Google Patents

Mezcla de vectores de vaccinia recombinantes como vacunas poligueur contra el vih.

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ES2230596T3 ES97903823T ES97903823T ES2230596T3 ES 2230596 T3 ES2230596 T3 ES 2230596T3 ES 97903823 T ES97903823 T ES 97903823T ES 97903823 T ES97903823 T ES 97903823T ES 2230596 T3 ES2230596 T3 ES 2230596T3
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Abstract

SE PROPORCIONAN VACUNAS POLIENV QUE CONTIENEN MEZCLAS DE AL MENOS 4 HASTA 10.000 DIFERENTES VIRUS RECOMBINANTES, EXPRESANDO CADA UNO UNA VARIANTE ENV DE VIH DIFERENTE O UNA PORCION DE LA MISMA QUE CONTIENE REGIONES TANTO VARIABLES COMO CONSTANTES, ASI COMO METODOS PARA FABRICAR Y UTILIZAR DICHAS VACUNAS Y VIRUS POLIENV, INCLUYENDO EL USO DE LA VACUNA POLIENV EN FORMA VIVA, ATENUADA O INACTIVADA, PARA LA PROFILAXIS O TRATAMIENTO DE LA INFECCION POR VIH. LAS VACUNAS VIRALES DE LA INVENCION SE COMBINAN DE FORMA OPTIMA CON UN REFUERZO DE ENV DE VIH RECOMBINANTE, O UNA VACUNA INICIAL O DE REFUERZO CON DNA DEL GEN ENV.

Description

Mezcla de vectores de vaccinia recombinantes como vacunas poligeur contra el VIH.
Este trabajo se financió en parte con fondos del NCI R01-CA57419-03 y la Cancer Center Support Core Grant P30-CA21765, fondos del NIH.NIAID AI-32529 y P01-AI31596-04. En consecuencia, el Gobierno de EE.UU. tiene ciertos derechos sobre esta invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a vacunas polienv para el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), que comprenden una mezcla de al menos 4-40 y de hasta 10.000 virus vaccinia recombinantes, cada uno de los cuales expresa una variante diferente de una proteína de la cubierta del VIH. Las vacunas son adecuadas para la vacunación de mamíferos, incluidos seres humanos, para proporcionar respuestas inmunitarias celulares y/o humorales inesperadamente aumentadas a la infección por VIH. Además, la invención se refiere a procedimientos para preparar y usar tales virus de vaccinia recombinantes y vacunas polienv.
Antecedentes de la invención
Es probable que el virus del SIDA se haya llevado decenas de millones de vidas en el año 2000, lo que lo convierte en un motivo de preocupación sanitaria mundial de la máxima prioridad [véase DeVita y col., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3ª edición, J. B. Lippincott Co., Filadelfia, PA (1992); Wong-Staal, en Virology, páginas 1529-1543; y Hirsch y col., en Virology, páginas 1545-1570]. El diseño de una vacuna eficaz contra el VIH presenta un particular desafío para los inmunólogos, ya que la enzima transcriptasa inversa implicada en la replicación del VIH tiene una elevada tasa de error. Esto tiene como resultado muchas cepas mutantes de VIH que tienen proteínas de la capa o cubierta externa con secuencias proteicas variantes. Estas proteínas variantes de la cubierta a menudo son reconocidas como diversos antígenos por el sistema inmunológico de los mamíferos, que produce más de 10^{9} linfocitos nuevos al día con el único propósito de encontrarse con los antígenos extraños. Las células B y las células T constituyen, respectivamente, los componentes humorales y celulares de la respuesta inmunitaria.
Un buen ejemplo de la resistencia cualitativa de tales respuestas inmunitarias se muestra en pacientes infectados con el VIH y en macacos infectados con el VIS. En cada caso se producen ciclos sucesivos de infección, inmunidad y establecimiento de VIH o VIS variantes [Wrin y col., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7: 211-219 (1994); Burns y Desrosiers, Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188: 185-219 (1994)]. Con cada ciclo, aumenta la diversidad de determinantes antigénicos del VIH (y las correspondientes respuestas inmunitarias), de forma que estas respuestas inmunitarias neutralizan una amplia gama de variantes de VIH y VIS y se inhibe la superinfección.
Sin embargo, los pacientes de SIDA desarrollan respuestas inmunitarias comprometidas que son insuficientes para prevenir que la infección viral por VIH venza al sistema inmunológico del paciente. Esto puede deberse, en parte, al establecimiento de variantes del VIH cuyas proteínas variantes de la cubierta no son reconocidas por el sistema inmunológico del paciente y, por tanto, escapan a la destrucción (Sci. Amer. Aug. 1995, pág.). En tales casos, incluso cuando la respuesta inmunitaria es capaz de impedir la infección de novo (por ejemplo, mutación persistente del virus en puntos secuestrados privilegiados), la infección puede, en último término, vencer a la respuesta inmunitaria del paciente [Pantaleo y col., Nature 362: 355-358 (1993); Embretson y col., Nature 362: 359-362 (1993)].
La identificación por las células T y B de los determinantes antigénicos entre las proteínas del VIH sigue siendo incompleta. Se ha caracterizado la proteína de la cubierta del VIH con una región variable (V1-V5) y una región constante (C1-C5). Se ha identificado un péptido representativo de la región V3 como el principal determinante neutralizante (PND) [Javaherian y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 6768-6772 (1989), aunque otras regiones de la proteína de la cubierta también pueden estar implicadas en la provocación de la respuesta inmunitaria. La proteína de la cubierta de longitud completa contiene aproximadamente de 850 a 900 aminoácidos, en la que la variación de la longitud se debe a hipermutaciones [Starcich y col., Cell 45: 637 (1986)].
Las primeras vacunas contra el VIH evaluadas en estudios clínicos se diseñaron para presentar proteínas de la cubierta únicas, o porciones de las mismas, al sistema inmunológico. Sin embargo, las respuestas neutralizantes contra una única o varias proteínas de la cubierta no reconocían diversos aislamientos de VIH y los individuos no estaban protegidos de la infección [Belshe y col., J. Am. Med. Assoc. 272: 431-431 (1994);patente de EE.UU. nº 5.169.763: publicación PCT WO 87/06262; Zagury y col., Nature 332: 728-731 (1988); Kieny y col., Int. Conf. AIDS 5: 541 (1989); Eichberg, Int. Conf. AIDS 7: 88 (1991); Cooney y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1882-1886 (1993); Graham y col., J. Infect. Dis. 166: 244-252 (1992); J. Infect. Dis. 167: 533-537 (1993); Keefer y col., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2): 141-143 (1994); McElrath y col., J. Infect. Dis. 169: 41-47 (1994); Fauci, Science 264: 1072-1073 (mayo 1994)].
En consecuencia, existe una gran necesidad largo tiempo deseada y urgente de descubrir vacunas y procedimientos que provoquen una respuesta inmunitaria suficiente para tratar o prevenir las infecciones por VIH.
Resumen de la invención
Con la presente invención se pretende superar una o más deficiencias de las técnicas relacionadas. En particular, la vacuna POLIENV de la invención proporciona de forma ventajosa una respuesta inmunitaria más fuerte. La fuerza de la presente invención reside en su potencia para reclutar compartimentos de células B, células T colaboradoras y células T citotóxicas de la respuesta inmunitaria para provocar una inmunidad eficaz tanto humoral como celular. Por ejemplo, la presente invención provoca un gran abanico de actividades de anticuerpos específicos de VIH. En los ensayos neutralizantes de VIH se demuestra que lis anticuerpos provocados son de una calidad superior. Sorprendentemente, la invención puede generar respuestas inmunitarias contra cepas de VIH "nativas", es decir cepas de VIH para los que no se han incluido las proteínas de la cubierta en la mezcla polienv.
Para proporcionar vacunas contra el VIH más eficaces, la presente invención proporciona vacunas polienv que comprenden mezclas de al menos 4 hasta aproximadamente 10.000, preferentemente de 4 a aproximadamente 1.000 y más preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 de virus recombinantes diferentes, en los que cada uno expresa una variante de proteína de la cubierta (EPV) del VIH diferente (o una porción sustancial de la misma) que incluya las regiones constante y variable de la proteína de la cubierta. Preferentemente, cada una de las variantes de proteína de la cubierta expresadas tiene una estructura y/o inmunogeneicidad similares a la de la proteína de la cubierta del VIH nativo que se encuentra en una célula infectada o una bicapa lipídica de VIH, tal como en forma oligomérica. También se proporcionan procedimientos para preparar y usar tales virus recombinantes y vacunas polienv. En su uso como una vacuna, cada una de las variantes de las proteínas de la cubierta induce, preferentemente, una subpoblación diferente de células B y/o T, en la que cada subpoblación responde a diferentes proteínas de la cubierta y, por tanto, a múltiples variantes del VIH. Una mezcla de este número, tipo y/o estructura de las proteínas de la cubierta es un procedimiento recién descubierto para provocar una fuerte respuesta inmunitaria específica de VIH y perdurable con una actividad neutralizante de amplio espectro.
En una forma de realización preferida, los virus recombinantes se seleccionan del grupo constituido por virus vaccinia, poxvirus canario, adenovirus y virus adenoasociados (AAV). En un ejemplo específico, más adelante, se usa el virus vaccinia para preparar una vacuna polienv. En una forma de realización preferida, una vacuna de virus vaccinia recombinante de la invención se administra por vía subcutánea. Otra ventaja de la invención es que la administración subcutánea de virus vacuna no tiene como resultado la formación de una lesión, por lo que se evita la liberación de virus vaccinia infeccioso, que es una amenaza potencial para una población inmunocomprometida.
Preferentemente, una vacuna polienv del virus recombinantes de la invención comprende un lisado de las células en crecimiento infectadas con el virus, por ejemplo células vero, que contienen variantes de la proteína de la cubierta expresada además de virus infecciosos. La inclusión del lisado con las variantes de proteína de la cubierta que contribuye la respuesta inmunitaria, representa una distinción concreta de la presente invención, ya que generalmente el virus de purifica del lisado de las células cultivadas.
En las vacunas de la invención, el nucleótido EV se puede aislar de pacientes infectados con un virus VIH de un área geográficamente restringida, de pacientes infectados con un virus VIH de diferentes cepas o de aislamientos de laboratorio de VIH.
Los presentes inventores han descubierto que las vacunas polienv de la presente invención provocan respuestas inmunitarias inesperadamente aumentadas mediante la expresión y/o la presentación de diversas variantes de la proteína de la cubierta, conteniendo cada una las regiones constante y variable, con, preferentemente, una estructura sustancialmente similar a la de una proteína de la cubierta del VIH nativo. Las respuestas inmunitarias aumentadas reconocen las cepas de VIH además de las cepas que expresan la proteína de la cubierta proporcionada con la vacuna polienv. Por tanto, el objetivo de tal vacuna es proporcionar respuestas inmunitarias aumentadas a un amplio abanico de cepas de VIH, en las que dichas respuestas inmunitarias son adecuadas para tratar o prevenir la infección (o la infección continuada a causa de mutaciones) por diferentes cepas del virus.
La presente invención también proporciona el ácido nucleico de una variante env (EV) que codifica (o es complementario a) al menos un determinante antigénico de una variante de proteína de la cubierta (EPV). Preferentemente, la EPV se encuentra codificada por un virus recombinante, como se proporciona además en una vacuna POLIENV de la presente invención. El ácido nucleico variante comprende al menos una mutación que confiere diferentes propiedades antigénicas, o una estructura tridimensional, a la EPV codificada.
La presente invención también proporciona una composición de vacuna que comprende una vacuna POLIENV de la presente invención y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición de la vacuna además comprende un adyuvante y/o una citosina que intensifica una respuesta inmunitaria de la vacuna POLIENV a al menos una cepa de VIH en un mamífero al que se le ha administrado la composición de la vacuna. Una vacuna POLIENV de la presente invención es capaz de inducir una respuesta inmunitaria incluida al menos una respuesta inmunitaria humoral (por ejemplo, anticuerpos) y una respuesta inmunitaria celular (por ejemplo, activación de células B, células T colaboradoras y células T citotóxicas (CTL)).
La presente invención también proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria a una infección por VIH en un mamífero, que es profiláctica para una infección por VIH, donde el procedimiento comprende la administración a un mamífero una composición de vacuna que comprende una vacuna POLIENV de la presente invención, que protege al mamífero de una patología clínica relacionada con el VIH causada por infección de al menos una cepa de VIH.
La presente invención también proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria a una infección por VIH en un mamífero para el tratamiento de una infección por VIH. El procedimiento comprende administrar a un mamífero una composición que comprende una vacuna POLIENV inactivada o atenuada de la presente invención, donde la composición provoca una respuesta inmunitaria aumentada, con respecto a los controles, el mamífero frente a una patología clínica relacionada con el VIH causada por infección de al menos una cepa de VIH.
En otra forma de realización, el procedimiento profiláctico o terapéutico de producir una respuesta inmunitario a VIH comprende la administración de una cantidad eficaz de otra (por ejemplo, segunda) una vacuna POLIENV que comprende al menos 4 a aproximadamente 10.000 virus recombinantes diferentes, en los que los virus recombinantes son de una especie diferente de la de los virus recombinantes de la vacuna anterior, y cada uno de los virus recombinantes del POLIENV comprende un nucleótido variante env que codifica una variante diferente de la proteína de la cubierta de una proteína de la cubierta del VIH.
La respuesta inmunitaria específica del VIH generada con la vacuna con el virus recombinante POLIENV de la invención puede intensificarse más mediante inoculación inicial o refuerzo una respuesta inmunitaria humoral o celular, o ambas, mediante la administración de una cantidad eficaz de al menos una vacuna de proteína env recombinante de VIH, o de ADN, o ambas. Preferentemente, la vacuna de proteína recombinante o de ADN es también una vacuna POLIENV. Cualquiera de las estrategias de vacunas proporcionadas en la presente memoria descriptiva se puede proporcionar en cualquier orden. Por ejemplo, un sujeto se puede inocular con una vacuna polienv con virus recombinante, seguido por un refuerzo con una vacuna de ADN, con una inyección de refuerzo final con una vacuna de proteína recombinante. Preferentemente, ka proteína env de VIH recombinante está mezclada con un adyuvante. En una forma de realización preferida, ejemplo más adelante, la proteína env de VIH recombinante se administra por vía intramuscular. Preferentemente, una vacuna de ADN se administra con un disparador de genes.
Los anteriores procedimientos de la invención proporcionan el incentivo de utilizar un nuevo vector plasmídico con ingeniería genética. Por tanto, en un aspecto principal, la presente invención proporciona un plásmido bifuncional que puede servir como una vacuna de ADN y un vector de virus recombinantes, que comprende un punto de inserción heteróloga bajo el control de una secuencia de control de la expresión animal y una secuencia de control de la expresión viral. Preferentemente, la secuencia control de la expresión animal es un promotor inmediato temprano de citomegalovirus (CMV) y la secuencia de control de la expresión viral es un promotor temprano del virus vaccinia, un promotor tardío del virus vaccinia, o ambos.
Otros objetos, características, ventajas, utilidades y formas de realización de la presente invención serán evidentes para los expertos practicantes a la luz de la siguiente descripción detallada y de los ejemplos relacionados con la presente invención.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Representación esquemática de la orientación del gen VIH-1 en el genoma del virus vaccinia. El gen de la cubierta VIH-1 está colocado entre los segmentos derecho e izquierdo del locus de la timidita quinasa. En el extremo C del gen de la cubierta VIH-1 existe un sitio de restricción HindIII. La inserción adecuada proporciona un fragmento HindIII de un tamaño de aproximadamente 7 kb. Mediante técnicas Southern con este patrón se confirmó la posición y la orientación correctas del gen de la cubierta VIH-1.
Figura 2. Representación gráfica de datos que muestran que la respuesta con anticuerpos específica de VIH es a largo plazo en modelos con mamíferos. Se muestran los resultados de sueros de ratones representativos probados con análisis ELISA para anticuerpos específicos de VIH. Cada muestra se diluyó a 1:100 (barras macizas), A 1:1.000 (barras tramadas) y a 1:10.000 (barras vacías) antes de realizar los análisis con placas de ELISA recubiertas con VIH-1. Se extrajeron muestras de los ratones de prueba a varios tiempos (1 mes, 4 meses y 6 meses) tras la inyección de 10^{7} pfu de una construcción de virus vaccinia que expresa una proteína de la cubierta VHI-1. El ratón control se inmunizó con un virus vaccinia que no contienen secuencia de la cubierta. Se muestran las barras del error estándar.
Figura 3. Representación gráfica de los datos que muestran cómo afecta la dosis de virus vaccinia a la inducción de al menos una respuesta inmunitaria, incluida la producción de anticuerpos específicos de VIH. Muestras representativas de suero de ratón se analizaron mediante ELISA con placas recubiertas de VIH-1. Se extrajeron muestras de los ratones al los que se había inyectado 10^{5}, 10^{6} y 10^{7} pfu de un virus vaccinia que expresa la proteína de la cubierta VHI-1. Las muestras de suero se probaron aproximadamente tres semanas después de la inyección. Cada muestra se diluyó a 1:100 (barras macizas), a 1:1.000 (barras tramadas) y a 1:10.000 (barras vacías) antes del análisis en placas de ELISA recubiertas con VIH-1, Se muestran las barras con los errores estándar.
Figura 4. Representación gráfica de los datos que muestran que la mezcla de construcciones de virus vaccinia no compromete la inducción de los anticuerpos específicos de VIH en mamíferos a los que se les ha inyectado. Muestras representativas de suero de ratón se analizaron mediante el ELISA aproximadamente 2 meses después de la inyección de 10^{7} pfu de virus vaccinia que expresa la o las proteínas de la cubierta VHI-1. "Sencillo" identifica una muestra de un ratón que recibió una mezcla de virus de vaccinia. "Mezcla" representa una muestra de un ratón que recibió una mezcla de virus de vaccinia que expresan cinco proteínas de la cubierta distintas. Cada muestra se diluyó a 1:100 (barras macizas), a 1:1.000 (barras tramadas) y a 1:10.000 (barras vacías) antes del análisis en placas de ELISA recubiertas con VIH-1. Se muestran las barras con los errores estándar.
Figura 5. Producción de recombinación con nuevos virus de vaccinia mediante la sustitución de productos de PCR para las secuencias pEvenv4 BH10. Se muestra el procedimiento de la sustitución de la secuencia. Se sustituyeron los productos de PCR con las respectivas secuencias BH10 env en los puntos únicos de las enzimas de restricción KpnI y BsmI. Tras el corte y empalme del plásmido con productos de PCR, los nuevos plásmidos se recombinaron con el VV de tipo salvaje para crear vectores de expresión VV.
Figura 6. Respuestas en el ELISA de Abbott tras la inmunización. Los sueros de los cuatro chimpancés se analizaron con el ensayo clínico Abbott (véase Materiales y Procedimientos, más adelante). Los resultados de cada muestra de suero (eje Y) se registran para cada fecha de prueba (eje X). Se observaron respuestas elevadas en los chimpancés inmunizados con la vacuna mezclada VVEnv.
Figura 7. Mapa de plásmido bifuncional que puede actuar como vacuna de ADN y como vector VV de recombinación. La presencia de los promotores temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) y temprano y tardío del virus vaccinia (VV) permite la expresión del gen extraño en células de mamífero o en células infectadas con VV.
Descripción detallada de lo desvelado Descubrimiento de respuestas inmunitarias inesperadamente aumentadas a vacunas mixtas POLIENV frente a VIH
Los intentos precedentes de proporcionar vacunas contra diferentes cepas de VIH se han centrado en una o más regiones variables de gp120 o gp60. Cabía esperar que tales regiones variables proporcionadas en la vacuna proporcionaran una amplia protección frente a la infección por VIH. Sin embargo, tales vacunas no han tenido éxito, ya que la respuesta inmunitaria inducida por la vacuna no reconoce muchas cepas distintas de VIH. Por tanto, existe una necesidad crucial de proporcionar vacunas que provoquen respuestas inmunitarias a diversas cepas del VIH, de forma que las vacunas sean adecuadas para el tratamiento y/o la prevención del VIH.
Los presentes inventores han descubierto que se pueden inducir respuestas inmunitarias primarias y secundarias inesperadamente aumentadas contra varias o muchas cepas diferentes de VIH, mediante el uso de vacunas polienv que contienen una mezcla de al menos 4, hasta 1.000 y posiblemente tantas como 10.000, virus recombinantes, donde cada uno codifica una variante distinta de la proteína de la cubierta (EPV). La vacuna también puede contener EPV expresadas por los virus, por ejemplo, producidos en las células huésped usadas para la producción de virus.
Los términos "inoculación inicial" o "primaria" y "refuerzo" o "reforzar" se usan en la presente memoria descriptiva para referirse a las inmunizaciones inicial y posteriores, respectivamente, es decir, de acuerdo con las definiciones normales de estos términos en inmunología.
El ácido nucleico codificador de la EPV (ácido nucleico de la variante de la cubierta (EV)) se puede aislar de la misma población o de otra diferente (por ejemplo, geográfica) de seres humanos infectados con VIH. Como alternativa, los diferentes ácidos nucleicos EV se pueden obtener de cualquier fuente y seleccionar en función de la selección de secuencias para las diferencias en la secuencia codificadora o mediante la evaluación de las diferencias en las respuestas inmunitarias humoral y/p celular provocadas a diversas cepas de VIH, in vitro o in vivo, según procedimientos conocidos.
El descubrimiento inicial estaba relacionado con las vacunas de virus de vaccinia recombinantes. Sin embargo, como un experto habitual en la técnica apreciará con facilidad, se puede usar cualquier virus recombinante para expresar antígenos POLIENV para una vacuna de la invención. Además, el uso de varias vacunas virales puede obviar respuestas inmunitarias antivirales que pueden proporcionar un refuerzo con la vacuna viral menos eficaz (debido a la posible potenciación de una respuesta enérgica antiviral).
Como un experto en la técnica apreciará con facilidad, los inventores han encontrado además que el refuerzo con una proteína o varias proteínas env de VIH recombinante, preferentemente proteínas, además potencia los procedimientos de inmunización de la invención. La o las proteínas env de VIH pueden corresponder a las proteínas env de VIH expresadas en la vacuna POLIENV o pueden ser diferentes proteínas env de VIH.
De igual forma, como el experto en la técnica puede apreciar, los procedimientos de inmunización de la presente invención se intensifican mediante el uso de una vacuna de ADN. La vacuna de ADN se puede usar como un refuerzo, por ejemplo como se ha descrito antes en relación con las proteínas de VIH recombinante. Como alternativa, la vacuna con ADN se puede usar para iniciar la inmunidad, con la vacuna o vacunas virales recombinantes usadas para reforzar la respuesta inmunitaria antiVIH. Como con la vacuna BOOSTER de proteína env recombinante, la vacuna de ADN puede comprender uno o más vectores para la expresión de uno o más genes env de VIH. Además, los genes env de VIH pueden corresponder a genes expresados mediante la vacuna con virus recombinante, o pueden ser diferentes. En una forma de realización preferida, los vectores se preparan para la expresión en la vacuna con virus recombinante y en células de mamífero sometidas a transfección como parte de una vacuna de ADN.
Se ha encontrado que esta respuesta inmunitaria (humoral y/o celular) es eficaz para un abanico más amplio de cepas de un virus infeccioso, tal como VIH, y no se limita a las cepas de virus que expresan las variantes específicas de la proteína de la cubierta (EPV) proporcionadas por la vacuna POLIENV. De este modo, la presente invención proporciona muchas EPV codificadas por una vacuna viral recombinante que proporciona respuestas inmunitarias inesperadamente aumentadas a muchas cepas de VIH.
Vacunas POLIENV y vacunación
Por tanto, la presente invención proporciona, en un aspecto, vacunas POLIENV usando mezclas de al menos 4, y hasta 10.000, virus de vaccinia recombinantes diferentes, donde cada uno expresa una variante de proteína de la cubierta diferente, o una porción antigénica de la misma. Como un experto en la técnica apreciará con facilidad se pueden emplear de 4 a aproximadamente 1000, o preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 100, virus recombinantes diferentes. Un experto habitual en la técnica puede además apreciar con facilidad que para las vacunas se pueden usar otros virus. Ejemplos de virus adecuados que pueden actuar como huéspedes virales recombinantes para vacunas, además del vaccinia, incluyen el poxvirus canario, adenovirus y virus adenoasociados. También se proporcionan procedimientos para preparar y usar tales vacunas POLIENV.
Una vacuna POLIENV de la presente invención induce al menos una de las respuestas inmunitarias humoral y celular en un mamífero al que se ha administrado la vacuna POLIENV, pero la respuesta a la vacuna es subclínica, o es eficaz para aumentar al menos una respuesta inmunitaria a al menos una cepa de VIH, de forma que la administración de la vacuna es adecuada para los propósitos de la vacunación.
Vacunas virales. Para preparar vacunas virales POILENV para la administración de antígenos POLIENV de VIH se pueden usar varios huéspedes virales producidos por ingeniería genética ("virus recombinantes"). Las vacunas virales son particularmente ventajosas, ya que el componente de infección viral estimula una respuesta inmunitaria enérgica dirigida a la activación de los linfocitos B, los linfocitos T colaboradores y los linfocitos T citotóxicos. Se pueden usar numerosas especies de virus como huéspedes virales recombinantes para las vacunas de la invención. Un virus recombinante preferido para una vacuna viral en el virus vaccinia [Publicación de Patente Internacional WO 87/06262. 22 de octubre, 1987, por Moss y col.; Cooney y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1882-6 (1993); Graham y col., J. Infect. Dis. 166: 244-252 (1992); McElrath y col., J. Infect. Dis. 169: 41-47 (1994)]. En otra forma de realización se puede usar poxvirus canario [Pilaoux y col., AIDS, Res. Hum. Retroviruses 11: 373-81 (1995), erratum in AIDS, Res. Hum. Retroviruses 11: 875 (1995); Andersson y col., J. Infect. Dis. 174: 977-85 (1996); Fries y col., Vaccine 14: 428-34 (1996); Gonczol y col., Vaccine 13: 1080-5 (1995)]. Otra alternativa es el adenovirus defectivo o el adenovirus [Gilardi-Hebenstreit y col., J. Gen. Virol. 71: 2425-31 (1990); Prevec y col., J. Infect. Dis 161: 27-30 (1990); Lubeck y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6763-7 (1989); Xiang y col., Virology 219: 220-7 (1996)]. Entre otros vectores adecuados se incluyen los retrovirus empaquetados en células con un intervalo de huéspedes anfotrófico [véase Millar, Human Gene Ther. 1:5-14 (1990); Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, \NAK 9] y virus de ADN defectivos o atenuados, tales como, pero no limitados a ellos, el virus del herpes simples (HSV) [véase, por ejemplo, Kaplitt y col., Molec. Cell. Neurosci. 2: 230-330 (1991)]], el papilomavirus, el virus de Epstein Barr (EBV), los virus adenoasociados (AAV) [véase, por ejemplo, Samulski y col., J. Virol. 61: 3096-3101 (1987); Samulski y col., J. Virol. 63: 3822-3828 (1989)] y similares.
Vacunas de ADN. Una alternativa de una vacuna tradicional que comprende un antígeno y un adyuvante implica la introducción directa in vivo de ADN que codifica el antígeno en tejidos de un sujeto para la expresión del antígeno por las células del tejido del sujeto. Tales vacunas se denominan en la presente memoria descriptiva "vacunas de ADN" o "vacunas con base de ácido nucleico". Las vacunas de ADN se describen en la Publicación de Patente Internacional WO 95/20660 y la Publicación de Patente Internacional WO 93/19183. La capacidad del ADN inyectado directamente codificador de una proteína viral para provocar una respuesta inmunitaria protectora se ha demostrado en numerosos sistemas experimentales [Conry y col., Cancer Res., 54: 1164-1168 (1994); Cox y col., Virol., 67: 5664-5667 (1993); Davis y col., Hum. Mole. Genet., 2: 1847-1851 (1993); Sedegah y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 9866-9870 (1994); Montgomery y col., DNA Cell Bio., 12: 777-783 (1993); Ulmer y col., Science, 259: 1745-1749 (1993); Wang y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 4156-4160 (1993); Xiang y col., Virology, 1999: 132-140 (1994)]. En los estudios para valorar esta estrategia en la neutralización del virus de la gripe se han usado proteínas virales de la cubierta e internas para inducir la producción de anticuerpos, pero en particular se han centrado en la proteína hemaglutinina viral (HA) [Fynan y col., DNA Cell. Biol., 12: 785-789 (1993A); Fynan y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 11478-11482 (1993B); Robinson y col., Vaccine, 11: 957 (1993); Webster y col., Vaccine, 12: 1495-1498
(1994)].
La vacunación mediante la introducción directa del ADN codificador de una proteína env del VIH para provocar una respuesta inmunitaria protectora produce respuestas humorales y mediadas por células. Esto es análogo a los resultados obtenidos con virus vivos [Raz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 9519-9523 (1994); Ulmer, 1993, ant.; Wang, 1993, ant.; Xiang, 1994, ant.]. En estudios con hurones se ha indicado que las vacunas de ADN dirigidas contra proteína virales internas conservadas del virus de la gripe, junto con glucoproteínas de superficie, son más eficaces contra las variantes antigénicas del virus de la gripe que son vacunas inactivadas o con subviriones [Donnelly y col., Nat. Medicine, 6: 583-587 (1995)]. De hecho, en ratones se han registrado respuestas inmunitarias reproducibles a ADN codificador de nucleoproteínas que duran esencialmente durante la vida del animal [Yankauckas y col., DNA Cell. Biol., 12: 771-776 (1993)].
Como se conoce bien en la técnica, un gran número de factores pueden influir sobre la eficacia de la expresión de genes antigénicos y/o la inmunogeneicidad de las vacunas de ADN. Entre los ejemplos de tales factores se incluyen la reproducibilidad de la inoculación, la construcción del vector plasmídico, la elección del promotor usado para impulsar la expresión génica del antígeno y la estabilidad del gen insertado en el plásmido. Dependiendo de su origen, los promotores difieren en la especificidad tisular y la eficacia en la iniciación de la síntesis del ARNm [Xiang y col., Virology, 209: 564-579 (1994); Chapman y col., Nucle. Acids. Res., 19: 3979-3986 (1991)]. Hasta la fecha, la mayoría de las vacunas de ADN en los sistemas de mamíferos han dependido de los promotores virales derivados de citomegalovirus (CMV). Estos han tenido una buena eficacia en la inoculación muscular y en la piel en una serie de especies de mamíferos. Otro factor del que se conoce que afecta a la respuesta inmunitaria inducida por la inmunización con ADN es el procedimiento de liberación de ADN; las vías parenterales pueden proporcionar índices bajos de transferencia de genes y producir una variabilidad considerable de expresión génica [Montgomery, 1993, ant.]. La inoculación a velocidad elevada de plásmidos usando un disparador de genes, intensificó las respuestas inmunitarias de los ratones [Fynan, 1993B, ant; Eisenbraun y col., DNA Cell Bio., 12: 791-797 (1993)], presumiblemente a causa de una mayor eficacia de la transfección del ADN y de una presentación más eficaz del antígeno por las células dendríticas. Los vectores que contienen la vacuna con base de ácido nucleico de la invención también pueden introducirse en el huésped deseado mediante otros procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, precipitación en dextrano DEAE, fosfato cálcico, lipofección (fusión de lisosomas) o un transportador del vector de ADN [véase, por ejemplo, Wu y col., J. Biol. Chem. 267: 963-967 (1992); Wu y Wu, J. Biol. Chem. 263: 14621-14624 (1988); Hartmut y col., Solicitud de Patente Canadiense nº 2.012.311, presentada el 15 de marzo de 1990].
Plásmidos bifuncionales para virus y vacunas de ADN. Un aspecto preferido de la presente invención se refiere a la ingeniería genética de plásmidos bifuncionales que pueden servir como una vacuna de ADN y como un vector de virus recombinantes. La inyección directa del ADN plasmídico purificado, es decir, como una vacuna de ADN, provocaría una respuesta inmunitaria al antígeno expresado por el plásmido en los sujetos de prueba. Asimismo, el plásmido sería útil en virus recombinantes, vivos, como vehículos de inmunización.
El plásmido bifuncional de la invención proporciona un gen heterólogo, o un sitio de inserción para un gen heterólogo, bajo el control de dos secuencias diferentes de control de la expresión: una secuencia de control de la expresión animal y una secuencia de control de la expresión viral. El término "bajo el control" se usa en su sentido habitual, es decir, operablemente u operativamente asociado con, en el sentido de la secuencia control de la expresión, tal como un promotor, proporciona la expresión para la expresión de un gen heterólogo. En una forma de realización preferida, la secuencia de control de la expresión es un promotor de mamíferos (en la presente invención también se contemplan promotores de aves); en una forma de realización específica, el promotor es el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) (véase la figura 7). En otra forma de realización específica más, el promotor viral es un promotor temprano del virus vaccinia, o un promotor tardío del virus vaccinia, o preferentemente ambos (Figura 7). Los sujetos podían recibir la vacuna con un régimen multiescalonado, donde el plásmido bifuncional se administra como ADN y, en un momento diferente pero en cualquier orden, como una vacuna de virus recombinante. La invención contempla administraciones únicas o múltiples del plásmido bifuncional como una vacuna de ADN o como una vacuna de virus recombinante, o ambos. Este régimen de vacunación puede complementarse con la administración de vacunas de proteínas recombinantes (más adelante) o puede usarse con otros vehículos de
vacunas.
Como un experto en la técnica apreciará con facilidad, los plásmidos bifuncionales de la invención se pueden usar como vectores de vacunas POLIENV. Por tanto, mediante la inserción de al menos 4 a aproximadamente 10.000, preferentemente de 4 a 1000, y más preferentemente de 10 a 100, diferentes genes env de VIH en plásmidos bifuncionales se prepara un correspondiente conjunto de plásmidos bifuncionales útiles como vacunas POLIENV.
Vacunas de proteína recombinantes. La inmunidad activa provocada por la vacunación con una o varias proteínas env de VIH según la presente invención puede iniciar o reforzar una respuesta inmunitaria celular o humoral. La proteína o las proteínas env de VIH, o los fragmentos antigénicos de las mismas, se pueden preparar en una mezcla con un adyuvante para preparar una vacuna.
El término "adyuvante" se refiere a un compuesto o mezcla que intensifica la respuesta inmunitaria a un antígeno. Un adyuvante puede servir cono un depósito tisular que libera lentamente el antígeno y también como un activador del sistema linfoide que intensifica inespecíficamente la respuesta inmunitaria (Hood y col., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamín/Cummings: Menlo Park, California, pág. 384). A menudo, una provocación primaria con un antígeno solo, en ausencia de un adyuvante, no provocará una respuesta inmunitaria humoral ni celular. Los adyuvantes incluyen, aunque no se limita a ellos, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias de superficie activa tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas o hidrocarbonadas, hemocianinas de lapa, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. La selección de un adyuvante depende del sujeto que se va a vacunar. Preferentemente, se usa un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, una vacuna para un ser humano debería evitar los adyuvantes en emulsión oleosa o hidrocarbonada, incluidos los adyuvantes de Freund completo e incompleto. Un ejemplo de un adyuvante para usar con seres humano es la alúmina (gel de aluminio). En una forma de realización específica, más adelante, la proteína env de VIH recombinante se administra por vía intramuscular en alúmina. Como alternativa, la vacuna de proteína env de VIH recombinante se puede administrar por vía subcutánea, intradérmica, intraperitoneal o a través de otras vías aceptables de administración de vacunas.
Administración de vacunas. Según la invención, la inmunización frente a VIH puede llevarse a cabo con una vacuna viral recombinante de la invención sola o combinada con una vacuna de ADN o una vacuna de proteína recombinante, o ambas. En una forma de realización específica, la proteína env de VIH recombinante es alúmina se proporciona por vía i.m. para reforzar la respuesta inmunitaria.
Cada dosis de vacuna viral puede contener los mismos 4 a 10.000, preferentemente 4 a 1000, y más preferentemente 10 a 100, diferentes virus recombinantes, donde cada uno de los cuales expresa un gen env de VIH diferente. Como alternativa, los virus en posteriores vacunas pueden expresar diferentes genes env de VIH. En otra forma más de realización, las posteriores vacunas virales POLIENV pueden tener algunos virus en común, y otros que son diferentes, con la vacuna anterior. Por ejemplo, la vacuna PRIMING puede contener virus de vaccinia que expresan proteínas env de VIH denominadas de forma arbitraria 1-0. Una segunda vacuna (de refuerzo) puede contener virus de vaccinia (o preferentemente un virus diferente, tal como poxvirus canario o adenovirus) que expresan proteínas env de VIH 6-15 ó 11-20, etc.
Una vacuna de ADN o una vacuna de proteína recombinante puede tener un único antígeno de proteína env de VIH o varios antígenos. Preferentemente, una vacuna de ADN o de proteína recombinante para usar en la invención comprende más de un antígeno de proteína env de VIH. Como con las posteriores vacunas virales, la proteína env de VIH o la proteína de una vacuna de ADN o la vacuna de proteína recombinante puede corresponder a una proteína env de VIH expresada en la vacuna viral POLIENV o puede ser diferente de cualquiera de las proteínas env
POLIENV.
En general, una forma de realización preferida de la invención contempla proporcionar la mayor variedad posible en cada protocolo de vacunación, para exponer al receptor al mayor número de proteínas env de VIH y, por tanto, proporcionar la mayor oportunidad para neutralizar la reactividad cruzada con un asilamiento de VIH nativo.
Variantes de la proteína de la cubierta
Como se ha comentado anteriormente, una EPV para usar en las vacunas de la invención se pueden obtener a partir de aislamientos geográficos locales, o cepas, o de aislamientos geográficamente diversos, es decir de diferentes cepas. Como un experto en la técnica apreciará con facilidad, la obtención de nucleótidos env (es decir, genes) de aislamientos naturales tiene numerosas ventajas; los aislamientos están disponibles con facilidad, las EPV corresponden a proteínas naturales contra las que se desea la inmunidad, y las mutaciones del VIH se pueden capturar con rapidez a partir de los nuevos aislamientos.
Una EPV también incluye polipéptidos con actividad inmunogénica inducida por una secuencia de aminoácidos de una secuencia aminoacídica de EPV como al menos un epítopo i determinante antigénico. Esta secuencia de aminoácidos corresponde sustancialmente a al menos un fragmento de 10-900 aminoácidos y/o la secuencia consenso de una EPV de VIH conocida. Tal EPV puede presentar una homología global o identidad de al menos un 50% con la secuencia aminoacídica de una proteína de la cubierta conocida, tal como una homología del 50-99%, o cualquier intervalo o valor comprendido en este, mientras que induce una respuesta inmunogénica contra al menos una cepa de un VIH.
El porcentaje de homología se puede determinar, por ejemplo, mediante la comparación de la información de la secuencia usando el programa informático GAP, versión 6.0, disponible en la University Wisconsin Genetics Computer Groups (UWGCG). El programa GAP utiliza el procedimiento de alineación de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)], como han revisado Smith y Watermnan [Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]. Brevemente, el programa GAP define similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número toral de símbolos en la más corta de las secuencias. Los parámetros por defecto preferidos para el programa GAp incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que contienen un valor de 1 para las identidades y de 0 para las que no son identidades) y la matriz de comparación potenciada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids. Res. 14: 6745 (1986), como han descrito Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, Nacional Biomedical Research Foundation, Washington DC (1979), páginas 353-358; (2) una penalización de 3.0 para cada hueco y una penalización adicional de 0.10 para cada símbolo dentro de cada hueco; y (3) no hay penalización para los huecos de los extremos.
En una forma de realización preferida, una EPV de la presente invención es una forma variante de al menos una proteína de la cubierta de VIH. Preferentemente, la EPV incluye la gp120 y el dominio de oligomerización de gp41, como gp140 [Hallenberger y col., Virology 193: 510-514 (1993)].
Las proteínas de la cubierta de VIH conocidas contienen de aproximadamente 750 a 900 aminoácidos. Ejemplos de tales secuencias están disponibles con facilidad en las bases de datos institucionales y comerciales de la secuencia de VIH, tales como GENBANK, o como recopilaciones publicadas, tales como Myers y col., eds., Human Retroviruses and AIDS, A Compilation and Análisis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Vol. I y II, Theoretical Biology and Biophysics, Los Álamos, NM (1993). Las sustituciones o inserciones de una EPV para obtener otra EPV, codificada por un ácido nucleico para usar en un virus recombinante o vacuna POLIENV de la presente invención, pueden incluir sustituciones o inserciones de la menos un residuo aminoacídico (por ejemplo, 1-25 aminoácidos). Como alternativa, al menos un aminoácido (por ejemplo, 1-25 aminoácidos) se puede delecionar de una secuencia de EPV. Preferentemente, tales sustituciones, inserciones o deleciones se identifican según la determinación de la secuencia de las proteínas de la cubierta obtenidas mediante secuenciación nucleotídica de al menos un ácido nucleico codificador de una EPV de un individuo infectado con VIH.
Preferentemente, los ejemplos no limitantes de tales sustituciones, inserciones o deleciones se realizan mediante la amplificación de las secuencias pueden determinar mediante experimentación rutinaria para proporcionar propiedades funcionales y estructurales modificadas de una proteína de la cubierta o de una EPV. Preferentemente, las EPV obtenidas de este modo poseen propiedades antigénicas distintas a las de la EPV original. Tales diferencias antigénicas se pueden determinar mediante análisis adecuados, por ejemplo mediante las pruebas con un panel de anticuerpos monoclonales específicos de las proteínas de la cubierta de VIH en un análisis ELISA.
Cualquier sustitución, inserción o deleción se puede usar siempre que la proteína EPV resultante provoque anticuerpos que se unen a las proteínas de la cubierta de VIH, pero en las que la EPV presenta un patrón diferente al de los anticuerpos inducidos por una segunda EPV. Cada una de las sustituciones, inserciones o deleciones anteriores también puede incluir aminoácidos modificados o infrecuentes, por ejemplo como se proporcionan en la C.F.R. 37 \NAK 1.822 (p) (2).
La siguiente Tabla 1 presenta ejemplos no limitantes de variantes alternativas de proteínas de la cubierta de VIH, que pueden estar codificadas por un virus recombinante según la presente invención.
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De acuerdo con esto, según los ejemplos anteriores de sustituciones específicas, se pueden producir sustituciones alternativas mediante experimentación rutinaria, para proporcionar EPV alternativas de la presente invención, por ejemplo introduciendo una o más sustituciones, inserciones o deleciones en las proteínas de la cubierta o la EPV que dan lugar a respuestas inmunitarias diferenciales.
S pueden preparar variaciones de la secuencia de aminoácidos en una EPV de la presente invención mediante, por ejemplo, mutaciones en el ADN. Tales EPV incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones de nucleótidos que codifican diferentes residuos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos. Es obvio que las mutaciones que se realizarán en el ácido nucleico que codifica una EPV no deben desplazar a la secuencia fuera del marco de lectura y preferentemente no crearán dominios complementarios que podrían producir estructuras secundarias de ARNm [véase, por ejemplo, Ausubel (1995 rev.), más adelante; Sambrook (1989), más adelante].
El ácido nucleico codificador de EPV de la presente invención también se puede preparar mediante amplificación o mutagénesis dirigida a sitio de nucleótidos del ADN o el ARN que codifica una proteína de la cubierta o una EPV y después mediante la síntesis o la transcripción inversa del ADN codificador para producir ADN o ARN que codifica una EPV [véase, por ejemplo, Ausubel (1995 rev.), más adelante; Sambrook (1989), más adelante] según las enseñanzas y las pautas presentadas en la presente memoria descriptiva.
Los virus recombinantes que expresan EPV de la presente invención, EPV recombinantes o vectores de ácidos nucleicos que las codifican, incluyen un conjunto finito de secuencias codificadoras de EPV como nucleótidos de sustitución que el experto en la técnica puede obtener de forma rutinaria sin necesidad de excesiva experimentación, según las enseñanzas y las pautas que se presentan en la presente memoria descriptiva. Para obtener una descripción más detallada de la química y la estructura de las proteínas véase Schulz, G.E. y col., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, Nueva York, NY (1978) y Creighton, T. E., Proteins:structure and Molecular Properties. W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA (1983). Para una presentación de las sustituciones en la secuencia nucleotídica, tales como preferencias de codón, véase Ausubel y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., Nueva Cork, NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995) (en lo sucesivo "Ausubel (1995, rev.)") a \NAK\NAK A.1.-A.1.24 y Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Sspring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) en los apéndices C y D.
Por tanto, un experto en la técnica, dadas las enseñanzas y las pautas presentadas en la presente memoria descriptiva, conocerá cómo sustituir otros residuos aminoacídicos en otras posiciones de un ADN o ARN env para obtener EPV alternativas, incluidas las variantes producidas por sustituciones, deleciones o inserciones.
Análisis de detección para la actividad de VIH
Para la detección de la actividad antiVIH de suero o células procedentes de un individuo inmunizado con una vacuna de la invención se puede usar cualquier análisis de detección selectiva conocido y/o adecuado, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, los análisis para VIH conocidos incluyen ensayos de infectividad viral [véase, por ejemplo, Chesebro y col., J. Virol. 62: 3779-3788 (1988); Aldovinid y col., eds., Techniques in HIV Research páginas 71-76 (1990)]; análisis neutralizantes [véase, por ejemplo, Holding y col., AIDS Res Huma. Retrovir. 10: 633-643 (1994); Hanson., AIDS Res Huma. Retrovir 10: 645-648 (1994); Laal y col., Res Huma. Retrovir. 9: 781-785 (1993); Hanson J. Acquir. Immune Defic, Syndr. 7: 211-219 (1994)]; análisis de las células mononucleares periféricas (PMN) [véase, por ejemplo, Arduino y col., Antimicrob. Agents. Chemothera. 37: 1095-1101 (1990)]; y análisis de linfocitos T citotóxicos (CTL) [véase, por ejemplo, Hammond y col. J. Exp. Med. 176: 1531-1542 (1992); McElrath y col. J. Virol. 68: 5074-5083 (1994); Walter y col. Cell immunol. 119: 470-475 (1989); Weinhold y col., AIDS Res. Hum. Retrovir. 8: 1371 (1992)]. Entre otras actividades adecuadas, solas o combinadas, se incluyen, aunque no se limita a ellas, la medición cuantitativa y/o cualitativa de la transcripción, la replicación, la traducción, la incorporación de viriones, la virulencia, el rendimiento viral y/o la morfogénesis.
Forma de realización específica: virus vaccinia recombinante que codifica EPV, vacunas POLIENV y procedimientos para su preparación y uso
Visión general. Los virus de vaccinia recombinantes (VV) que expresan proteínas ce la cubierta de VIH (por ejemplo, gp41, gp120 y/o gp160, o una porción de las mismas) proporcionan materiales útiles para la producción y el análisis de vacunas mixtas que inducen al menos una de las siguientes: respuesta inmunitaria humoral o celular contra los virus, así como para el análisis de los determinantes de células B y CTL.
Una vacuna POLIENV de la presente invención consiste en una mezcla de n virus de vaccinia recombinantes distintos, donde n es un número entero de aproximadamente 4 a aproximadamente 10.000 (o cualquier valor dentro de este intervalo), en el que cada construcción del vector de vaccinia expresa una variante de una proteína de la cubierta de VIH-1 (EPV) (por ejemplo, gp 41, gp 120 o gp 160). El virus vaccinia recombinante codifica funcionalmente una EPV y se preparar mediante recombinación de VV de tipo salvaje con un plásmido. Se pueden preparar diversos plásmidos distintos codificadores de EPV mediante la sustitución de una secuencia codificadora de EPV con otra, por ejemplo usando fragmentos de restricción o mutagénesis.
Preparación de virus de vaccinia recombinantes. Los procedimientos para la preparación de plásmidos individuales (donde cada uno expresa una secuencia proteica de VIH única) pueden utilizar amplificación del ADN o del ARN para la sustitución de las secuencias de la variante aislada de la proteína de la cubierta en un vector (por ejemplo, pVenv4 o pVenv1 [Hallenberger y col., Virology 193: 510-514 (1993)], en el que el vector codifica una secuencia conocida de la proteína de la cubierta de VIH (por ejemplo, disponible en NIAID AIDS Research & Referente Reagent Program, Rockville, MD).
Los procedimientos de amplificación de ARN o ADB se conocen bien en la técnica y se pueden usar según la presente invención sin experimentación excesiva, según las enseñanzas y las pautas que se presentan en la presente memoria descriptiva. Entre los procedimientos conocidos de amplificación de ADN o de ARN se incluyen, aunque no se limita a ellos, la reacción en cadena de la polimerasa (PVR) y los procedimientos de amplificación relacionados (véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188 a Mullis y col.; 4.795.699 y 4.921.794 a Tabor y col.; 5.142.033 a Innis; 5.122.464 a Wilson y col.; 5.091.310 a Innis; 5.066.584 a Gyllensten y col.; 4.889.818 a Gelfand y col.; 4.994.370 a Silver y col.; 4.766.067 a Biswas; 4.656.134 a Ringold) y amplificación mediada por ARN que usa ARN antisentido a la secuencia diana como molde para la síntesis de ADN bicatenario (patente de EE.UU. nº 5.130.238 a Malek y col., con la marca NASBA).
Por ejemplo, las construcciones de virus de vaccinia recombinantes preparadas mediante esta vía se pueden usar para inmunizaciones e inducciones de respuestas de células T y/o células B específicas de VIH. Los cebadores utilizan secuencias de VIH conservadas y, por tanto, amplifican con éxito los genes env de muy diversas muestras de pacientes de VIH-1. Las técnicas básicas descritas en la presente pueden usarse de forma similar con los cebadores de la OCR o de otros tipos de amplificación, con el fin de sustituir piezas más pequeñas o más grandes de la secuencia env de los aislamientos con las que se encuentras en los vectores que codifican una proteína de la cubierta del VIH. Véase, por ejemplo, Ausubel, más adelante; Sambrook, más adelante.
Ácidos nucleicos que codifican EPV. La técnica comienza con el aislamiento del ADN de las células infectadas por VIH y la amplificación de las secuencias env mediante PCR. Los productos de la PCR u otros productos de amplificación proporcionan el medio más sencillo para el aislamiento de las secuencias de VIH, pero se puede usar cualquier otro procedimiento conocido y adecuado tal como clonación y aislamiento de los ácidos nucleicos que codifican EPV o de otras proteínas (véase Ausubel, más adelante; Sambrook, más adelante). Preferentemente, los sitios de las enzimas de restricción se incorporan en las secuencias de los cebadores de PCR o de otra amplificación para facilitar la clonación génica.
El ADN aislado para la PCR se puede preparar a partir de varias fuentes virales, incluida la sangre entera fresca o congelada procedente de pacientes VIH + y células que se han infectado in vitro con los aislamientos del virus.
Para producir nuevas construcciones env de VIH, preferentemente se usa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar 100-2700 pares de bases (pb) de un gen env de cada una de las muestras de pacientes diferentes con VIH. Los cebadores de la PCR pueden representar secuencias de VIH bien conservadas que son adecuadas para amplificar genes env de muestras conocidas de genes env, VIH aislados o muestras de diversos pacientes de VIH. El ADN amplificado comprende, preferentemente, una porción que codifica 10-900 (tal como 100-400, 400-600 ó 600-900, o cualquier valor comprendido en estos intervalos) aminoácidos de una gp120 y go41 (ambas forman la gp 160). Una o más de las regiones variables de la cubierta (V1-V5) y de las regiones constantes (C1-C5) se incluyen preferentemente en los productos de PCR, más preferentemente la mayoría de las regiones V1, C1, V2, C2, V3, C3, V4, V4 y V5. Además, las secuencias amplificadas pueden codificar 1-200 aminoácidos más allá del sitio de fragmentación para gp120/gp41. Preferentemente, la mayoría o todo el gen env se amplifica. Opcionalmente, la secuencia codificadora de gp160 amplificada carece de parte o todas las secuencias codificadoras del dominio transmembrana y/o del dominio de cola citoplasmático [véase, por ejemplo, Hallenberger y col., (1993)].
Los cebadores de la PCR se pueden diseñar de forma que los sitios de las enzimas de restricción flanqueen la secuencia génica de la cubierta en el plásmido de vaccinia, de forma que se incorporan en los productos del ADN amplificado. Mediante el uso de técnicas ce clonación con sustitución bien conocidas se pueden generar derivados de plásmidos de vaccinia que expresan las secuencias variantes de la proteína de la cubierta de 1-10.000 pacientes mediante la sustitución de una porción de la secuencia codificadora de la EPV del paciente con una porción correspondiente de la secuencia env en el plásmido de vaccinia, tal como mediante el uso de fragmentos de restricción para la sustitución. Por ejemplo, el plásmido pVenv4 y los productos de la PCR se tratan con KpnI y BsmI para obtener una secuencia codificadora de una gp160 truncada de aminoácidos 1-639, que carece del dominio transmembrana y del dominio de cola citoplasmático de gp41 [véase, por ejemplo Hallenberger y col., (1993)].
Tras la ligación del producto de la PCR y los productos pVenv, las células huésped bacterianas se transforman con la mezcla de ligación a través de una serie de procedimientos bien conocidos en la técnica, incluidos, por ejemplo, electroporación, y las colonias recombinantes se escogen y se analizan mediante secuenciación.
Construcciones de virus de vaccinia recombinantes que codifican proteínas de la cubierta de VIH. A continuación, el virus vaccinia que codifica la EPV se recombina con el virus de tipo salvaje en una célula huésped y las placas de virus que expresan EPV se seleccionan y se crean depósitos de virus. Los depósitos de virus como Venv, donde cada uno contiene una secuencia codificadora de EPV diferente se mezclan usando al menos 4-40, y hasta aproximadamente 10.000 virus recombinantes diferentes, para formar una vacuna POLIENV de la presente invención.
Los plásmidos de vaccinia recombinantes que contienen las secuencias de EPV se secuencian seleccionan opcionalmente con anticuerpos específicos de la proteína de la cubierta de VIH para identificar distintas EPV. Se prefiere la secuenciación mediante el método didesoxi de terminación de la cadena de Sanger [Sambrook y col., (1989), más adelante; United Status Biochemical, Sequenase versión 2.0-DNA Sequencing Kit, novena edición, Amersham Life Science, Inc. (1994)] y deberían leer aproximadamente 50-300 pb de la posición del cebador.
Los procedimientos para la producción de vectores de expresión VV se conocen bien en la técnica [véase, por ejemplo, Mackett, M. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 7415-7419 (1982); Panicali D., y Paoletti E., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 79: 4927-4931 (1982); la patente de EE.UU. nº 4.169.763; Mazzara, G. P. y col., Methods in Enz. 217: 557-581 (1993), Ausubel y col., más adelante, a \NAK\NAK 16.15-16.19]. El vector previamente descrito pSC11 [Chakrabarti, S. y col., Mol. Cell. Biol. 5: 3403-3409 (1985)] se pueden usar, preferentemente, para crear un plásmido codificador de env, tal como pVenv4.
Como vector viral, el virus vaccinia tiene una serie de características útiles, incluida la capacidad que permite la clonación de fragmentos grandes de ADN extraño (mayor de 20 kb), la retención de la infectividad tras la inserción de un ADN extraño, un amplio abanico de huéspedes, un nivel relativamente elevado de síntesis de proteínas y un adecuado transporte, secreción, procesamiento y modificaciones postraduccionales dirigidas por la estructura primaria de la proteína expresada y el uso del tipo de célula huésped. Por ejemplo, la N-O-glucosilación, la fosforilación, la miristilación y la fragmentación, así como el ensamblaje de las proteínas expresadas, se producen de un modo fiel.
Se han desarrollado varias variaciones del vector de vaccinia que son adecuadas para usar en la presente invención (por ejemplo, véase Ausubel y col., más adelante, \NAK\NAK 16.15-16.19). Con más frecuencia, tras la obtención de los depósitos del virus (Ausubel y col., más adelante, \NAK\NAK 16.16), una secuencia de ácido nucleico que codifica una EPV se introduce bajo el control del promotor del virus vaccinia y se integra en el genoma del virus vaccinia de forma que retenga su infectividad (Ausubel y col., más adelante, \NAK\NAK 16.17). Como alternativa, la expresión se puede conseguir mediante la transfección de un plásmido que contiene el gen controlado por el promotor vaccinia codificador de una EPV en una célula que se ha infectado con el virus vaccinia de tipo salvaje.
Preferentemente, la célula huésped y el vector de vaccinia son adecuados y están aprobados para usar el la vacunación de mamíferos y seres humanos. A continuación, estos virus recombinantes se caracterizan usando varios procedimientos conocidos (Ausubel y col., más adelante, \NAK\NAK 16.18). En otra variación más, la cadena de la RAN polimerasa del bacteriófago T7 se puede integrar en el genoma del virus vaccinia de forma que las secuencias codificadoras de EPV se expresarán bajo el control de un promotor de T7, bien en plasma de transfección, un plásmido o un virus vaccinia recombinante.
Se prefiere el uso de promotores de poxvirus ya que los promotores celulares y otros virales no suelen ser reconocidos por el aparato transcripcional de vaccinia. Preferentemente, en los virus de vaccinia recombinantes para las vacunas polienv se usa un promotor temprano/tardío, ya que es deseable expresar la EPV como un antígeno que se presenta en las células huésped infectadas con los virus de vaccinia recombinantes en asociación con el complejo mayor de histocompatibilidad de clase I o II (MHC). A continuación, tal proteína de la cubierta de VIH asociada con el MHC formará dianas para las células T citotóxicas y PRIME mamíferos vacunados para una respuesta de células T citotóxicas y/o una respuesta humoral contra las EPV de VIH expresadas. Esto es porque la capacidad de los vectores del virus vaccinia para inducir la presentación del MHC en las células huésped para este tipo de antígeno parece disminuir tarde en la etapa de infección. Los transcritos que se originan pronto terminará después de la secuencia TTTTTNT y conducirán a una presentación MHC inadecuada.
Como alternativa, cualquiera de los motivos de terminación dentro de la secuencia codificadora del gen se puede alterar mediante mutagénesis si se usa un promotor temprano del poxvirus, para intensificar la presentación MHC de los antígenos de la proteína de la cubierta en las células huésped (Earl y col., más adelante, 1990). Para simular los ARNm del virus vaccinia, las secuencias líder sin traducir y en el extremo 3' normalmente se mantienen cortas, si se usan en los plásmidos de vaccinia que incorporan secuencias codificadoras de EPV de VIH.
Preferentemente, el plásmido usado para preparar las construcciones de vaccinia según la presente invención se ha diseñado con sitios para endonucleasas de restricción para la inserción del gen env en 3' del promotor de vaccinia (Ausubel y col., más adelante, \NAK\NAK 16.17). Más preferentemente, el plásmido ya contiene una secuencia codificadora de la proteína de la cubierta, en la que los sitios de restricción están únicamente cerca de los extremos iniciales y finales de la secuencia codificadora de la proteína de la cubierta. El mismo fragmento de restricción de la secuencia codificadora de la EPV puede reemplazar a la correspondiente secuencia en el plásmido. En tales casos, la porción principal de la secuencia codificadora de EPV se puede insertar tras eliminar del plásmido la mayoría o toda la secuencia codificadora de la proteína de la cubierta.
Preferentemente, la construcción de vaccinia resultante (que contiene la secuencia codificadora de EPV y el promotor de vaccinia) está flanqueada por ADN de vaccinia para permitir la recombinación homóloga cuando el plásmido se transfecciona a células que se han infectado previamente con el virus vaccinia de tipo salvaje. El ADN adyacente del virus vaccinia se escoge de forma que la recombinación no interrumpirá ningún gen viral esencial.
Sin la selección, normalmente la proporción entre virus vaccinia recombinante y parental es de aproximadamente 1:1000. Aunque esta frecuencia es lo bastante elevada como para permitir el uso de hibridación en placas (véase Ausubel y col., más adelante, \NAK\NAK 6.3 y 6.4) o inmunodetección (Ausubel y col., más adelante, a \NAK 6.7) para escoger los virus recombinantes, se ha empleado una variedad de procedimientos para facilitar la identificación de virus recombinantes. En la técnica se conocen ejemplos no limitantes de tales técnicas selección o detección (véase Ausubel y col., más adelante, \NAK\NAK 16.17). Normalmente, el casete de expresión está flanqueado por segmentos de los genes de la timidita quinasa 8TK) del virus vaccinia de forma que la recombinación tiene como resultado la inactivación de la TK. Los virus con un fenotipo TK^{-} pueden distinguirse de aquellos con un fenotipo TK+ mediante la infección de una línea de células TK- en presencia de 5-bromo-desoxiuridina (5-BrdU), que debe ser fosforilado por la TK para incorporarse letalmente en el genoma del virus. Como alternativa o además, los virus recombinantes se pueden seleccionar mediante la expresión simultánea de un gen bacteriano de resistencia a un antibiótico tal como ampicilina (amp) o la guanina fosforribosil transferasa (gpt). Como otro ejemplo, la coexpresión del gen lacZ de Escherichia coli permite la selección simultánea de placas de virus recombinantes con Xgal (Ausubel y col., más adelante, \NAK\NAK 16.17).
Los virus de vaccinia recombinantes que expresan una EPV de la presente invención pueden, opcionalmente, atenuarse o inactivarse según procedimientos conocidos, tales como calor, tratamiento con paraformaldehído, radiación ultravioleta, tratamiento con propriolacteno, formación de híbridos o quimeras o mediante otros procedimientos conocidos [véase, por ejemplo, Zagury y col., Nature 332: 728-731 (1988); Ito y col., Cancer Res. 50: 6915-6918 (1990); Wellis y col., J. Immunol. 99: 1134-9 (1967); D`Honcht, Vaccine 10 (Suppl.): 548-52 (1992); Selenka y col., Arch. Hyg. Bakteriol. 153: 244-253 (1969); Grundwald-Berach y col., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117: 561-567 (1991)]. Por ejemplo, la inactivación con calor a 60ºC reducirá el título de virus de forma considerable. Tales técnicas de atenuación se prueban para determinar su seguridad, ya que la inactivación incompleta podría tener como resultado la muerte del paciente [Dorozynski y Anderson, Science 252: 501-502 (1991)].
Tales virus de vaccinia recombinantes atenuados o inactivados se deben usar cuneado el paciente presente compromiso del sistema inmunológico a causa de complicaciones o cuando se pueda producir el fallecimiento si se administran virus de vaccinia vivos.
Composiciones farmacéuticas
Las preparaciones farmacéuticas de la presente invención, adecuadas para la inoculación o para la administración oral o parenteral, incluyen una vacuna de virus recombinante POLIENV que comprende al menos 4 y hasta aproximadamente 10.000, preferentemente de 4 a aproximadamente 1000 y más preferentemente aproximadamente 10 a aproximadamente 100 virus recombinantes diferentes, en forma de un lisado celular, una fracción unida a la membrana, una forma parcialmente purificada o purificada. Preferentemente, la vacuna polienv comprende lisados celulares que contienen virus recombinantes (o fracciones de los mismos unidas a la membrana) que además comprende proteínas EPV ya expresadas por los virus recombinantes. En la actualidad se ha descubierto que la inclusión de las EPV expresadas aumentan la respuesta principal de anticuerpos.
Las composiciones de vacunas polienv pueden estar en la forma de soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones o emulsiones y también pueden contener agentes auxiliares o excipientes que son conocidos en la técnica. Cada uno de los al menos aproximadamente 4-40 a 10.000 virus diferentes codifican y expresan una EPV diferente, como se presenta en la presente memoria descriptiva. El ADN que codifica EPV puede seleccionarse para representar EPV existentes en una comunidad aislada específica de pacientes con SIDA. Por ejemplo, una vacuna podría representar secuencias de TN de Memphis y usarse como diana para usar en TN de Memphis. Las vacunas diseñadas para representar geográficamente áreas restringidas también pueden ser útiles para usar en comunidades fuera de la comunidad diana.
Como alternativa, los ADN que codifican EPV se pueden seleccionar para representar comunidades, ciudades o países geográficamente distantes, tales como cepas. Por ejemplo, diversos clones se pueden representar en una vacuna POLIENV. Una composición de vacuna polienv puede además comprender inmunomoduladores tales como citoquinas que acentúan una respuesta inmunitaria a una infección viral. Véase, por ejemplo, Berkow y col., eds. The Merck Manual, Fifteenth edition, Merck and Co., Rahway, NJ (1987); Goodman y col., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Octava Edición, Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY (1990); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Tercera Edición, ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987); y Katzung, ed. Basic and Clinical Pharmacology, Quinta edición, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992), donde las referencias citadas en ellas muestran el estado de la técnica.
Como un experto habitual en la técnica deberá entender cuando una vacuna polienv de la presente invención se proporciona a un individuo, puede ser en una composición que puede además comprender al menos uno de los siguientes: sales, tampones, adyuvantes u otras sustancias que son deseables para mejorar la eficacia de la composición. Los adyuvantes son sustancias que pueden usarse para aumentar de forma específica al menos una respuesta inmunitaria. Por lo general, el adyuvante y la composición se mezclan antes de la presentación al sistema inmunológico, o se presentan por separada pero en el mismo sitio de la inmunización. Los adyuvantes se pueden dividir vagamente en varios grupos en función de su composición. Estos grupos incluyen adyuvantes oleosos, sales minerales (por ejemplo AlK(SO_{4})_{2}, AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH_{4}(SO_{4}), sílice, caolín y carbono), polinucleótidos (por ejemplo, ácidos nucleicos poliIC y poliAU) y ciertas sustancias naturales (por ejemplo, cera D de Mycobacterium tuberculosis, sustancias encontradas en Corynebacterium parvum o Bordetella pertussis y miembros del género Brucella). Entre las sustancias particularmente útiles como adyuvantes se encuentran las saponinas (por ejemplo, Quil A., Superfos A/S, Dinamarca). Ejemplos de materiales adecuados para usar en las composiciones de vacunas se describen en, por ejemplo, Osol A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), páginas 1324-1341.
Una composición farmacéutica de vacuna polienv de la presente invención pueden además comprender al menos un compuesto quimioterapéutico antiviral. Se pueden seleccionar ejemplos no limitantes a partir de al menos uno del grupo compuesto por gamma globulina, amantadita, guanidina. Hidroxi bencimidazol, interferón \alpha, interferón \beta, interferón -\gamma, interleuquina 16 (IL-16; Kurth, Nature, 8 de diciembre de 1995); tiosemicarbazonas, metisazona, rifampicina, ribavirina, un análogo de pirimidina (por ejemplo, AZT y/o 3TC), un análogo de purinas, foscarnet, ácido fosfonoacético, aciclovir, didesoxinucleósidos, un inhibidor de la proteasa (por ejemplo, esquinavir (Hoffman-LA Roche); indinavir (Merck); ritonavir (Abbott Labs); AG 1343 (Agouron Pharmaceuticals); VX-2/78 (Glaxo Wellcome)); quimioquinas tales como RANTES, MIP1\alpha o MIP\beta [Science 270: 1560-1561 (1995)] o ganciclovir. Véase, por ejemplo, Richman: AIDS Res. Hum. Retroviruses 8: 1065-1071 (1992); Annu Rev. Pharmacol Toxico 33: 149-164 (1993); Antimicrob Agents Chemother 37: 1207-1213 (1993): AIDS Res. Hum. Retroviruses 10: 901 (1994); Katzung (1992), infra, y las referencias citadas en ellas en las páginas 798-800 y 680-681, respectivamente.
Usos farmacéuticos
La administración de una vacuna polienv (o del antisuero que induce) puede servir como propósito "profiláctico" o "terapéutico", y preferentemente con propósitos profilácticos. Cuando se administra profilácticamente, la composición de vacuna polienv viva se proporciona como avance de la detección de síntomas de infección por VIH o de enfermedad SIDA. La administración profiláctica del o los compuestos sirve para prevenir i atenuar cualquier infección posterior por VIH.
Cuando se proporciona terapéuticamente, la vacuna polienv se proporciona tras la detección de un síntoma de infección real. La administración de vacuna polienv con virus vivos tras la infección por VIH se proporciona sólo cuando se determina que el sistema inmunológico del paciente es capaz de responder a la administración de la vacuna polienv con virus vivos sin un riesgo sustancial por complicaciones inadecuadas o muerte, cuando la administración de un virus vivo se proporciona en la dosis requerida que sirve para atenuar cualquier infección real por VIH.
Como alternativa, cuando la respuesta inmunitaria del paciente está comprometida, la administración terapéutica implica, preferentemente, el uso de una composición de vacuna polienv con virus inactivados o atenuados cuando los virus recombinantes están atenuados o inactivados, como se ha presentado anteriormente. Véase, por ejemplo, Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra y Katzung (1992), infra, Dorozynski y Anderson, Science 252: 501-502 (1991).
Una composición se dice que es "farmacológicamente aceptable" si su administración puede tolerarse por un paciente receptor. Se dice que tal agente se administra en una "cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz" si la cantidad administrada es fisiológicamente significativa. Una vacuna o composición de la presente invención es fisiológicamente significativa si su presencia tiene como resultado un cambio detectable en la fisiología de un paciente receptor, preferentemente mediante la intensificación de la respuesta inmunitaria humoral o celular a un VIH.
La "protección" proporcionada no necesita ser absoluta, es decir, la infección por VIH o enfermedad de SIDA no necesita prevenirse o erradicarse del todo, siempre que se produzca una mejora estadísticamente significativa en relación con una población control. La protección puede estar limitada a mitigar la gravedad o la rapidez de inicio de los síntomas de la enfermedad.
Administración farmacéutica
Una vacuna de la presente invención puede conferir resistencia a una o más cepas de un VIH. Por tanto, la presente invención se refiere y proporciona un medio para prevenir o atenuar la infección con al menos una cepa de VIH. Como se usa en la presente memoria descriptiva, se dice que una vacuna previene o atenúa una enfermedad si su administración a u n individuo tiene como resultado en la atenuación total o parcial (es decir, supresión) de un síntoma o trastorno de la enfermedad, o la inmunidad parcial o total del individuo frente a la enfermedad.
Al menos una vacuna POLIENV de la presente invención se puede administrar por cualquier medico con el que se consiga el propósito pretendido mediante el uso de una composición farmacéutica como se ha descrito en la presente memoria descriptiva.
Por ejemplo, la administración de tal composición se puede realizar a través de varias vías parenterales, tales como por vía subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, transdérmica o bucal. Se prefiere la administración subcutánea. LA administración parenteral se puede realizar mediante inyección en bolos o mediante perfusión gradual en el tiempo. Véase, por ejemplo, Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra y Katzung (1992), infra.
Un régimen típico para prevenir, suprimir o tratar una enfermedad o trastorno que se puede aliviar mediante una respuesta inmunitaria celular por inmunoterapia celular específica activa comprende la administración de una cantidad eficaz de una composición de vacuna como se ha descrito anteriormente, administrada como tratamiento único o en dosis repetidas como intensificadoras o de refuerzo, en un periodo de hasta, e incluido, una semana a aproximadamente 24 meses.
Según la presente invención, una "Cantidad eficaz" de una composición de vacuna es una que baste para alcanzar un efecto biológico deseado, en este caso al menos una respuesta inmunitaria celular o humoral al VIH. Debe entenderse que la dosis eficaz dependerá de la edad, el sexo, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, si alguno, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado. Con los intervalos de las dosis eficaces proporcionadas más adelante no se pretende limitar la invención y representan los intervalos de dosis preferidos. Sin embargo, la dosis más preferida se ajustará para cada paciente de forma individual, y un experto en la técnica los deberá entender y determinar, sin excesiva experimentación. Véase por ejemplo Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), Ebadi, Pharmacology, Little, Brown y Co., Boston, MA (1985) y Katzung (1992), infla.
En general, la dosis para un adulto humano será de aproximadamente 10^{5}-10^{9} unidades formadoras de placas (pfu)/kg o unidades formadoras de colonias (UFC)/kg por dosis, prefiriéndose la dosis de 10^{6}-10^{8}. Cualquiera que sea la dosis que se use, deberá ser una cantidad segura y eficaz según se determine mediante procedimientos conocidos, como también se describen en la presente memoria descriptiva.
Sujetos
Los receptores de las vacunas de la presente invención pueden ser cualquier mamífero que pueda adquirir inmunidad específica a través de una respuesta inmunitaria celular o humoral al VIH, en el que la respuesta celular está mediada por el MHC de clase I p de clase II. Entre los mamíferos, los receptores preferidos son los mamíferos de la orden Primata (incluidos los seres humanos, los chimpancés, los simios y los monos). Los receptores más preferidos son los seres humanos, Preferentemente, los sujetos están infectados con VIH o proporcionan un modelo de infección por VIH [p.ej., Hu y col., Nature 328: 721-723 (1987)].
Habiendo ya descrito la invención, la misma se entenderá con mayor facilidad a través de los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no deben interpretarse como limitantes de la presente invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de vectores con virus vaccinia para la expresión de la proteína Env del VIH
Nomenclatura. Para los propósitos de referencia, una construcción de virus vaccinia recombinante se denomina, como alternativa, en la presente memoria descriptiva construcción VVenv, diseñándose las construcciones específicas de virus vaccinia según un paciente, o según un depositario (p. ej., ATCC o el la fuente GenBank del ADN de env en la construcción). Por ejemplo, VVenv-Doe se referiría a una construcción del vector del virus vaccinia con las secuencias env del paciente Doe, y el VVenv-U28305 se referiría a un vector del virus vaccinia con las secuencias env que se encuentran en GenBank con el número de referencia U28305.
La vacuna polienv está compuesta por 4-100 distintos virus de vaccinia recombinantes, cada uno de los cuales expresa una proteína única de la cubierta VIH-1. Con el propósito de referencia, cada virus individual se denomina VVenv y la mezcla viral final se denominará polienv.
La preparación de cada Venv usa el plásmido designado pVenv4 y un virus vaccinia de tipo salvaje denominad NYCDH, que se describen más adelante. Para obtener detalles adicionales, véase Ryan y col. "Preparation and Use of Vaccinia Virus Vectors for HIV Protein Expression and Immunization" en Immunology Methods Manual, Lefkovits, ed., Academic Press (1996).
Vectores y células huésped. El vector descrito anteriormente pSC11 [Chakrabarti, S. y col., Mol. Cell. Biol. 5: 3403-3409 (1985)] se puede usar para la recombinación de varios genes de VIH en el genoma VV. Los elementos del plásmido pSC11 incluyen el gen lacZ (un gen marcador por el cual las bacterias transformadas y los recombinantes VV se pueden identificar con facilidad como los que poseen actividad \beta-galactosidasa), una porción del gen codificador de la timidita quinasa (TK) y un gen de resistencia a ampicilina (amp). Los genes clonados en el pSC11 se insertan en el genoma VV mediante recombinación homóloga entre el gen de TK del virus de tipo salvaje y las porciones del gen de TK contenido en el pSC11. La inserción del ADN plasmídico en el locus viral de TK inactiva el gen viral de forma que los virus recombinantes se pueden seleccionar con facilidad del medio del virus TK+ mediante cultivo en bromodesoxiuridina (BUdR). Para que los virus Tk- recombinantes sobrevivan a esta selección, deben crecer en células que no suministren una enzima TK activa, tal como la línea celular TK-143, que es un derivado deficiente en TK de la línea celular humana R970-5, una línea celular de osteosarcoma (RMI, J. S. y col., Int. J. Cancer 15: 23-29 (1975)] que apoya el crecimiento de VV [Weir y col. infra (1982)]. La producción de la expresión del segmento génico de VIH se puede realizar mediante inserción de todo el gen en el sitio SmaI del vector pSC11. Los genes de longitud completa se pueden expresar bajo el control del promotor p7-5K.
Como alternativa a la clonación de genes completos de VIH, se puede sustituir secuencias génicas parciales con genes de VIH que ya se han clonado en el pSC11. Por ejemplo, una construcción denominada pVenv1 se preparo a partir del pSC11 y expresa el gen de la proteína de la cubierta (Env) BH10 de VIH [Hallenberger y col., infla,(1993), Kilpatrick y col., J. Biol. Chem. 262: 116-121 (1987)]. La construcción se puede usar como vector parental para sustituir y expresar regiones variables de la proteína de la cuberita de aislamientos de VIH, De igual forma, un vector denominado pVenv4 se construyó a partir del pSC11 para expresar una proteína BH109 env, se fragmentó para excluir los dominios transmembrana y citoplásmico codificadores de las secuencias de gp41, mientras que retienen el dominio de oligomerización [Hallenberger y col., (1993)infra]. Como un experto en la técnica observará, el término "dominio de oligomerización" se usa funcionalmente para hacer referencia a una porción de gp41 que permita la oligomerización de proteínas env, es decir, hay la suficiente estructura como para permitir la oligomerización. El vector pVenv4 codifica una gp160 truncada (también: gp160t, gp140) que se descubrió que formaba una estructura terciaria similar a la del oligómero procesado gp41/gp120 (dímero, trímero o tetrámero) como se encuentra presente en la superficie celular de las células infectadas por VIH. Esta estructura terciaria se mantiene en la forma secretada y en la asociada a la membrana [Hallenberger y col., (1993)]. Preferentemente, este vector se usa como vector parental para la sustitución de las secuencias env alternativas aisladas.
En este ejemplo, la preparación de cada construcción VVenv implica el uso de un pVenv4 y un virus vaccinia de tipo salvaje NYCDH, y las células huésped adecuadas, como se describe con detalle a continuación.
pVenv4: El vector pVenv4 se preparó previamente mediante la inserción de una secuencia codificadora de la cubierta de VIH-1 en el vector recombinante del virus vaccinia, pSC11, [Hallenberger y col., Virology 193: 510-514 (1993); Chakrabarti, S. y col., Mol. Cell. Biol. 5: 3403-3409 (1985)]. La secuencia de VIH-1 derivó de un depósito de laboratorio de virus vivos. La secuencia se denominó "BH10" [Ratner y col., Nature 313: 277-284 (1985)]. Con las técnicas de PCR, pueden amplificarse secuencias únicas de la cubierta de pacientes infectados con VIH-1 y sustituirse en la secuencia env BH10 para crear vectores nuevos. Por ejemplo, se podrían usar los siguientes cebadores para la PCR:
(A) Sentido, posición 5785 (SEC ID Nº 1):
AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA.
(B) Antisentido, posición 7694 (SEC ID Nº 2):
CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTCCAAAT.
(C) Sentido KpnI, posición 5903 (SEC ID Nº 3):
GTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGT.
(D) Antisentido-BsmI, posición 7659 (SEC ID Nº 4):
CCAGAGATTTATTACTCCAACTAGCATTCCAAGG.
(E) (Opcional), sentido-DraIII, posición 6153 (SEC ID Nº 5):
CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG.
(F) (Opcional), antisentido-Bsu361, posición 6917 (SEC ID Nº 6):
TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG.
Estos cebadores están escritos en dirección 5' a 3'.Los sitios de restricción están subrayados (las posiciones numeradas se basan en la secuencia BH10 [Ratner y col., Natre 313: 277-284 (1985)].
Estrategia de PCR: Para producir nuevas construcciones env de VIH-1, se usa la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar 1800 pares de bases (pb) del gen de la cubierta de cuarenta muestras de diferentes pacientes de VIH-1. Los cebadores de la PCR representan secuencias bien conservadas del VOH-1 y, por tanto, genes env amplificados con éxito de diversas muestras de pacientes de VIH-1. El ADN amplificado abarca la totalidad del al gp120 a excepción de aproximadamente 10 aminoácidos altamente conservados en el extremo amino de la proteína. Todas las regiones variables de la cubierta (V1-V5) están incluidas en los productos de la PCR. Además, las secuencias amplificadas codifican aproximadamente 100 aminoácidos más allá del sitio de escisión para la gp120/gp41.
Los cebadores de la PCR que llevan los sitios de las enzimas de restricción para KpnI y BsmI, que flanquean la secuencia génica de la cubierta BH10 en pVenv4, están incorporados en los productos de ADN amplificados.
Primer ciclo de PCR: en un tubo de microcentrífuga de 500 \mul, mezcla:
-
1 \mul del Cebador A (SEC ID Nº 1), 300 ng/\mul;
-
1 \mul del Cebador B (SEC ID Nº 2), 300 ng/\mul;
-
2,5 \mul 10 mM de cada uno de los 4 dNTP;
-
1 \mug de ADN;
-
10 \mul 10X tampón de PCR; y
-
HPLC H20 hasta 99 \mul
-
Del depósito de taq en vórtex dispensar 1 \mul a la reacción de PCR.
Mezclar bien. Revestir con aceite mineral.
Procesamiento en un termociclador del siguiente modo:
-
incubar a 95ºC, 3 minutos hasta la fusión del ADN.
-
40 ciclos: 95ºC, 1 minuto; 45ºC, 2 minutos; 72ºC, 3,5 minutos.
Segundo ciclo PCR: Preparar la reacción de PCR como antes, pero con los cebadores C y D (SEC ID Nº 3 y 4, respectivamente) y sin ADN. Llevar la solución final hasta 95 \mul. Revestir con aceite mineral. Con una punta tapada, retirar 5 \mul de la primera reacción de PCR (por debajo del aceite). Mezclar la muestra en la segunda reacción, por debajo de la capa de aceite y comenzar los ciclos como antes. Por lo general es adecuado el uso de 30 ciclos. Puede ser deseable monitorizar el producto mediante la retirada de 2 \mul para el análisis en gel después de cada 10 ciclos hasta que se identifica una banda clara de aproximadamente 1800 pb.
Mediante el uso de técnicas bien conocidas de clonación por sustitución, se generaron derivados de pVenv4 que expresan una secuencia env de uno de los 40 pacientes en lugar de la secuencia BH10 de la cubierta. Brevemente, el plásmido PVenv4 y los productos de la PCR se cortan con las enzimas KnpI y BsmI y el pVenv4 cortado se procesó en un gel de agarosa y se aisló el fragmento grande. Se descartó el fragmento pequeño (fragmento de 1800 pb) del envBH10. El producto de la PCR cortado también se aisló y se ligó al fragmento de pVEnv4 grande para crear una secuencia quimérica de la cubierta, que ahora contiene 1800 pb de la variante env del ADN del paciente. Tras la ligación del producto de la PCR y los productos pVenv4, las células huésped bacterianas se transforman con la mezcla de la ligación, a través de cualquiera de una serie de procedimientos bien conocidos en la técnica, incluidos, por ejemplo, electroporación, y se escogen colonias recombinantes y se analizan mediante secuenciación.
EL plásmido pVenv4 o los recombinantes preparados con el pVenv4 facilita la inserción de los genes en el genoma del virus vaccinia mediante recombinación homóloga entre el gen de la timidita quinasa (TK) del virus de tipo salvaje y las secuencias Tk dentro del plásmido. LA inserción de ADN de pVenv4 en el locus Tk viral da lugar a un virus vaccinia con el gen de la cubierta de VIH-1 expresado bajo el control del promotor temprano/tardío P7.5K. La actividad del crecimiento del virus está atenuada a causa de la alteración del locus Tk. Otro elemento de pVenv4 es el gen de lacZ que codifica la actividad \beta-galactosidasa. La actividad lacZ se puede usar para seleccionar recombinantes del virus vaccinia (véase a continuación).
El gen de la cubierta expresado por pVenv4 se trunca para excluir la secuencia de gp41 transmembrana/extremo C. El vector se expresa como una estructura oligomérica que se encuentra en el interior de las células y en forma secretada.
Virus vaccinia NYDCH. Cada nuevo plásmido sustituido se recombina individualmente con virus vaccinia de tipo salvaje NYDCH. Este virus se obtuvo de la A.T.C.C. (número de referencia VR-325) y se purificaron sus placas antes de usar. (Buck, C. y Paulino, M. S., eds., American Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae, 6ª ed., American Type Culture Collection, Rockville, Md (1990), pág. 138).
Células huésped bacterianas. El plásmido puede crecer en cualquier huésped adecuado, como se conoce en la técnica [véase p. ej., Ausubel, infra (1995, rev.), \NAK\NAK 16.15-16.19].Un ejemplo no limitante es las células DH5\alpha.
Células deficientes en TK. La transformación y la sustitución de los virus de vaccinia se realiza en la línea celular humana Tk143B, que es un derivado deficiente en TK de la línea celular R970-5, una línea celular de osteosarcoma [RMI y col. (1975), infra] que soporta el crecimiento de VV [Weir y col. infra (1982)]. Cada virus vaccinia recombinante que contienen una secuencia única de gen env de VIH se selecciona según la expresión del gen lacZ (placas víricas superpuestas con Bluo-gal y seleccionadas según la actividad \beta-galactosidasa, según el desarrollo de un color azul). Se pueden realizar dos ciclos de PCR.
Ejemplo 2 Preparación de vacuna polienv
Células Vero. La etapa final de la fabricación es el crecimiento de n construcciones VVenv en células Vero recientemente obtenidas de la A.T.C.C. (número de referencia CCl81 o X38) y clonadas y extendidas para el crecimiento viral. La línea celular Vero está aprobada por la Organización Mundial de la Salud para el desarrollo de vacunas [Hay R., y col., eds. American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7ª ed., American Type Culture Collection, Rockville, Md (1992), pág. 48].
Las células Vero se cultivan con medio Eagles modificado de Dulbecco (Bio Whittaker), un complemento de glutamina (Bio Whittaker) y suero bovino fetal inactivado por calor (Hyclone, Inc.). Como alternativa se puede usar medio sin suero. Cada construcción VVenv se inocula en capas separadas concluyentes de células Vero y se recogen cuando se demuestra la existencia de efectos citopáticos de las células debido a la infección viral. Los extractos celulares se lavan extensamente con PBS (Bio Whittaker) después de recoger y antes de congelar. A continuación las células se rompen mediante congelación-descongelación, sonicación y centrifugación abaja velocidad en una centrífuga (opcional). A continuación, las alícuotas de sobrenadante se almacenan a -70ºC. La proteína de la cubierta está presente en el lisado en concentraciones suficientes como para provocar una respuesta de anticuerpos específicos de la proteína de la cubierta del VIH (detectable mediante ELIDA) en modelos de mamífero, incluso si el VV está atenuado, por ejemplo la prep se calienta a 60ºC durante 1 hora.
El producto de vacuna. Cada depósito de virus (construcción VVenv) de las células Vero se congela de forma individual y después se ajusta y se prueba para determinar su seguridad. Después de completadas las pruebas, alícuotas de cada virus se mezclan para dar un depósito de vacuna de 10^{8} pfu totales/ml ("pfu" por unidades formadoras de placas). Si se usan 40 construcciones de VVenv, cada VVenv se representa preferentemente igual, cuando el VVnev se usa a un título de 2,5 x 10^{6} pfu/ml en el producto de vacuna. Esto debería dar 1 x 10^{8} pfu totales.
Evaluación de la vacuna polienv
Ratones. Los ratones se pueden infectar mediante inyección intraperitoneal de 1 x 107 pfu de VV que expresan env. Los anticuerpos se pueden identificar mediante ELISA del VIH o ensayos de neutralización, como se ha descrito antes, tres semanas después de las inyecciones de VV.
Antes de la fabricación de la vacuna polienv para uso humano, se ha preparado un grupo similar de virus con el propósito de probar la vacuna en ratones, Estos virus se administraron a los ratones por vía intraperitoneal o subcutánea. A continuación, los inventores analizaron el suero con anticuerpos específicos de VIH-1 para determinar la actividad en un ensayo de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA). El ensayo implicaba la siembra en placas de todo el VIH-1 alterado (HLTVm) en placas de ELISA en el bloqueo de las `lacas con seroalbúmina bovina. Después se añadieron muestras de suero a las diluciones de 1:00, 1:1.000 y 1:10.000 en suero salino tamponado con fosfato. El ensayo se desarrolló con un anticuerpo inmunoglobulina de cabra antiratón conjugado con fosfatasa alcalina y con fosfato de p-nitrofenilo. El color de la reacción se interrumpió con una solución de hidróxido sódico y se registró la lectura de la densidad óptica en un lector de placa de ELISA a 405 nm.
Como se muestra en la Figura 2, una única inoculación con la preparación de lisado celular de 106-107 pfu del virus vaccinia /que contienen una única secuencia codificadora de la proteína de la secuencia (VIH-1 y la proteína de la cubierta expresada unida a la membrana) provocó una fuerte respuesta de anticuerpos frente al VIH-1 que se mantuvo durante todo el experimento de seis meses. La respuesta de anticuerpos fue significativamente superior a la comunicada anteriormente con otras inmunizaciones. Este elevada respuesta con antígenos se puede atribuir a la presenta ce proteína de la cubierta unida a la membrana en la preparación de la cubierta. Como se muestra en la figura 3m estas respuestas fueron dependientes de la dosis. En mamífero que recibieron una dosis de 10^{6} pfu se observó una respuesta menor que en aquéllos que recibieron una dosis de 10^{7} pfu.
También se prepararon mezclas de virus de vaccinia que expresan diferentes proteínas de la cubierta de VIH-1. Cuando los ratones recibieron 10^{7} pfu de una mezcla de cinco virus, sus respuestas fueron esencialmente idénticas en cuanto a magnitud a las respuestas generadas contra 107 pfu de un único recombinante de virus vaccinia (Figura 4). El mezclado de numerosos virus de vaccinia que expresan numerosas proteínas env en un número elevado no se ha comunicado y se espera que proporciona un amplio espectro de anticuerpos neutralizantes.
Humanos. Las pruebas con los depósitos de virus mezclados se realizan antes de les estudios clínicos, el primero de los cuales se llevará a cabo con el propósito de escalar la dosis y probar la seguridad.
Los estudios clínicos serán estudios en los que se aumente la dosis de forma gradual implica el ensamblaje de cuatro grupos de voluntarios. Cada grupo recibe una de las siguientes dosis de vacuna:
(1) 2 x 10^{4} pfu
(2) 2 x 10^{5} pfu
(3) 2 x 10^{6} pfu
(4) 2 x 10^{7} pfu
Cada voluntario recibe la vacuna con el virus mixto en 0,5 ml de suero salino, administrado mediante inyección subcutánea.
Ejemplo 3 Inducción de inmunidad neutralizante aislada primaria con una vacuna de virus VIH en función del virus vaccinia contra varias proteínas de la cubierta en chimpancés
La población de aislamientos de VIH-1 está armada con una sofisticada matriz de proteínas de la cubierta. Las proteínas Env son las únicas proteínas externas codificadas viralmente y son las dianas de la actividad de los anticuerpos neutralizantes, aunque los anticuerpos inducidos contra un aislamiento no necesariamente neutralizarán otro. Por esta razón, los inventores han preparado una mezcla de vacunas de VIH-1, polienv, que expresan numerosas proteínas Env. La producción de la vacuna comenzó con la preparación de treinta recombinantes VV distintos, donde cada uno expresa una proteína Env diferente. Después se analizaron los VVenv, individualmente y combinados (polienv) en un modelo con chimpancés. Cuatro chimpancés se inmunizaron por vía subcutánea con tres inyecciones de VVenv solo (chimpancés 1 y 2) o polienv (chimpancés 3 y 4), seguido por una inyección intramuscular de proteína recombinante gp120/gp41 en alúmina. Se demostró seguridad en los cuatro animales, sólo dos de ellos mostraron signos de ulceración en el punto de la inyección. Las muestras de suero se monitorizaron mediante numerosos análisis para determinar la unión y neutralización del VIH. Se demostró que los anticuerpos de los chimpancés 3 y 4 eran los de calidad más elevada de actividad de anticuerpos. La función neutralizante se demostró contra un aislamiento de laboratorio y contra un aislamiento primario de VIH-1, ninguno de los cuales estaba específicamente representado en la vacuna. Por tanto, la estimulación inicial de linfocitos con proteínas env mixtas proporciona de este modo un prometedor procedimiento por el cual se puede provocar la aparición de anticuerpos de alta calidad contra diversos VIH-1.
Materiales y procedimientos
Primero se preparó pVenv4, un vector recombinante de VV, mediante la introducción de un codón de terminación en la secuencia env-BH10 y la inserción del gen de la cubierta BH10 modificado (env) en el pSC11. El pVenv4 expresó un producto proteico Env que se fragmentó en el aminoácido 640 y fue capaz de secreción y oligomerización. La producción de un VV recombinante, Venv4, que expresa esta proteína Env BH10 truncada se ha descrito anteriormente [Hallenberger y col., Virology 193: 510-514 (1993)].
PCR para la amplificación de las secuencias env de individuos infectados por VIH-1. La PCR se usó para amplificar las secuencias env del VIH. En general, las muestras derivaban de la sangre de individuos infectados con VIH-1, tomadas al principio para el diagnóstico de VIH. Otras muestras procedían de individuos con síntomas clínicos de SIDA o de productos proporcionados por el depósito de reactivos de referencia y de investigación de SIDA. Para las muestras de sangre, primero se preparó el ADN mediante la adición gota a gota de sangre o de células infectadas en un tampón de lisis celular con base de SDS e incubación a 65ºC durante 30 minutos. Se añadió pronasa a una concentración de 0,5 mg/ml y el losado se incubó después a 45ºC durante la noche. Se realizaron dos extracciones con fenol, seguidas por precipitación en etanol y la resuspensión de ADN en agua.
Se realizaron dos ciclos de PCR con todas las muestras de ADN mediante los procedimientos estándar. Las secuencias cebadoras se escogieron en función de la secuencia BH10 publicada [Ratner y col., Nature, 313: 277-284 (1985)]. Para obtener fragmentos en los que estuvieran incluidas las secuencias de todas las regiones variables y una porción de gp41, se usaron los cebadores de PCR como se han descrito en el Ejemplo 1. Los productos de la PCR se clonaron posteriormente mediante sustitución en el vector pVenv4 usando procedimientos estándar. La secuenciación se llevó a cabo en los plásmidos nuevos mediante el uso del método de Sanger u el cebador ccatgtggtaaaattaaccccactctgtg (SEC ID Nº 5).
Preparación de VVenv. Se prepararon nuevos recombinantes VV (VVenv) mediante la transfección de células infectadas con VV (NYDCH, ATCC) con los plásmidos de recombinación recién sustituidos (véase anteriormente). Se usaron Transfectam (Promega) y Lipofectamina (Gibco, BRL) pata facilitar la transfección, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Después los VV se purificaron en placas.
Inmunizaciones. Los lisados celulares infectados con VVenv se administraron a chimpancés con inyecciones subcutáneas. Los VVenv se usaron solos o en combinación. Las cantidades totales de VV en pfu fueron similares en cada inyección (aproximadamente 10^{7} pfu) por animal. Las inyecciones intramusculares se realizaron con una mezcla de aproximadamente 40 microgramos de gp120 (Cat. Nº 12101, Intracel, Cambridge, MA), 20 microgramos de gp41 (Cat. Nº 036001, Intracel) y 500 microgramos de alúmina (Rehsorptar gel de adsorción de hidróxido de aluminio, Itergen Co., Purchase, NY) por inóculo.
ELISA. Se realizaron cinco ELISA del siguiente modo: ELISA nº 1 El ELISA de Abbott Clinical, obtenido de los Laboratorios Abbott y realizados según las recomendaciones de los fabricantes (HIVBA HIV-1/HIV-2 (rDNA) EIA, Abbott Laboratorios, Abbott PArk, IL). ELISA nº 2: los ELISA se realizaron mediante el cultivo en placas de Mn-gp160 recombinante (Quality Biological, In. Gaithersburg, MD) a un microgramo/ml. Las placas se bloquearon y se llevaron a cabo los análisis con diluciones seriadas por triplicado de suero. Después se lavaron las placas y se puntuaron con IgG antihumana conjugada-fosfatasa alcalina. ELISA 3: las placas de ELISA se recubrieron con un microgramo/ml de LAI-gp120 (proteína derivada de CHO, Intracel). Las muestras de suero se sembraron en placas después de una dilución 1:100 y se puntuaron con IgG1 antihumana conjugada-fosfatasa alcalina (IGG1 antihumana de ratón-AP cat. Nº 9050-04; Southern Biological Associates Inc., Birmingham, AL= y fosfato de p-nitrofenilo. Las lecturas de la D.O. se tomaron a 405 nm. ELISA nº 5: el ELISA se realizó como en el ensayo nº 3 a excepción de que las placas se recubrieron con un microgramo/ml de IIIB-gp120 (proteína derivada de baculovirus, Intracel, cat nº 12001, Cambridge, MA). ELISA nº 5: el ELISA se llevó a cabo en un ensayo nº3, a excepción de las placas se recubrieron con un microgramo/ml de lisado viral IIIB-(Organon Teknika Co., Dirham, NY).
Ensayos de neutralización. Los ensayos de neutralización de llevaron a cabo con aislamientos de laboratorio o primarios [Montefiori y col., J. Clin. Microbiol. 26: 231-237 (1988); Montefiori y col., Journal of Infectious Diseases 173: 60-67 (1996)]. Aislamientos de laboratorio: el virus se mezcló con una dilución 1:20 de cada muestra de suero y se sembró en placas con células MT-2 o CEM x 174. Se usó tinción con rojo neutro para valorar la viabilidad de las células. Una reducción del 35-40% en la muerte celular en comparación con los cultivos control se definió cono deflección positiva. Aislamientos primarios: el virus se mezcló con una dilución 1:4 de cada muestra de suero y se sembró en placas con PBMC estimuladas con PHA. Los ensayos se puntuaron para p24. Se requirió Una reducción de la infectividad de al menos un 75% en comparación con los cultivos control para una puntuación positiva.
Resultados
Preparación de nuevos virus de vaccinia recombinantes VVenv. Para preparar nuevos virus VV recombinantes (VVenv), donde cada uno expresa una proteína única Env de VIH-1, primero se aisló ADN de las muestras de VIH-1. La mayoría de los ADN se tomaron de sangre de individuos que no habían mostrado signos adversos de enfermedad y que probablemente acababan de recibir el diagnóstico de infección por VIH-1. ADN adicional se obtuvo de pacientes con SIDA o de virus proporcionados por el depósito de reactivos de referencia y de investigación de SIDA. La PCR se realizó con pares de cebadores que incluían sitios de restricción para KpnI y BsmI. Después los fragmentos se sustituyeron en el vector pVenv4 representado en la Figura 5 (el pVene4 inicialmente expresó una proteína BH10 de VIH-1 truncada) en los sitios de restricción para KpnI y BsmI. De este modo, las secuencias de gp120 (V1-V5) y gp41 de BH10 se reemplazaron con las respectivas secuencias en los productos de la PCR. Con cada plásmido sustituido, se preparó un nuevo virus VV recombinante (VVenv).
Este procedimiento proporcionó un medio sencillo por el cual se pudo incorporar en recombinantes VV únicos (VVenv) una gran diversidad de secuencias Env. Es interesante el hecho de que la mayoría de las secuencias eran productivas, lo que sugiere que las secuencias Env en los genomas provirales (de los que la mayoría de los productos de la PCR derivan) rara vez eran defectivas. Entre los VVenv usado en la mezcla de la vacuna existe una gran diversidad.
Inmunización de chimpancés con VVenv sencillo o mixto. Para probar las vacunas VV recombinantes sencillas y mixtas se usaron cuatro chimpancés. El programa de inmunizaciones se muestra en la Tabla 2. Las primeras tres inyecciones contenían VV, mientras que la última inyección contenía una combinación de gp120, gp41 y alúmina, administrada por vía intramuscular. Los chimpancés 1 y 2 recibieron sólo un virus vaccinia y la respectiva proteína de la cubierta, administrados en cada una de las primeras tres inyecciones. Los chimpancés 3 y 4 recibieron una mezcla de 10 VV recombinantes (y la respectiva Env en la primera inyección), diez Env adicionales en la segunda inyección y 10 más de Env única en la última inmunización, proporcionando un total de 30 vectores distintos antes del refuerzo de proteínas. Todos los chimpancés recibieron cantidades similares del virus vaccinia total en unidades formadoras de placas y cantidades similares de proteínas recombinantes totales.
TABLA 2 Programa de inmunización de chimpancés con VV recombinantes mixtos
11
El VVenv recombinante se puede administrar sin que se produzcan erupciones en la lesión. Los cuatro chimpancés se monitorizaron para vigilar la aparición de signos de enfermedad sistémica y formación de lesiones en el punto de la infección. Los animales se analizaron diariamente en busaca de diarrea, rinorrea, tos, estornudos, respiración rápida, letargo, restricción de movimientos y pérdida de apetito. Ninguno de estos signos se hizo evidente en ninguno de los animales en ningún momento. Las fotografías tomadas de los puntos de inyección a intervalos regulares después de la primera inmunización mostraron tumefacción evidente en los cuatro animales. En los chimpancés 1 y 3 aparecieron lesiones leves en los puntos de inyección, del tipo de una vacunación contra la viruela, mientras que no se observaron lesiones en los chimpancés 2 y 4, En la segunda, tercera ni cuarta inyección se observaron síntomas de enfermedad, tumefacción o lesiones en ningún animal, lo que demuestra que se había provocado una respuesta de inmunidad específica de VV a la primera inoculación.
Las inyecciones con VVenv seguidas por inmunizaciones de refuerzo con proteínas dieron anticuerpos positivos mediante ELISA. Los anticuerpos específicos de VIH se monitorizaron durante el esquema de inmunización mediante cinco ELISA diferentes. Los ELISA se usaron para medir la calidad relativa, en lugar de la cantidad absoluta de los anticuerpos en cada animal. En la mayoría de los casos, las pruebas se realizaron con fragmentos de virus que carecías de la estructura tridimensional y oligomérica típica de la env nativa. En estos casos, cabría esperar que en los ELISA se uniera sólo una subpoblación de anticuerpos específicos de VIH. Los resultados obtenidos con el ELISA de Abbott se muestran en la figura 6. El chimpancé 3 superó el corte para positividad después de la primera inmunización con VV, mientras que el chimpancé 4 superó el corte después de la segunda inmunización con VVenv. Las respuestas de los chimpancés 3 y 4 al final del esquema de inmunización superarpón con mucho las de los chimpancés 1 y 2. En el ELISA nº 2 con Mn gp160, el chimpancé 3 fue el único con una respuesta elevada. Esta respuesta se produjo antes del refuerzo proteico y no se vio alterada por la inyección de refuerzo. La respuesta a CGO-LAI unido a una placa de ELISA (ELISA nº 3) usando el mismo antígeno que el usado para el refuerzo con proteína purificada mostró respuesta en sólo el chimpancé 3. En el ELISA nº 4, con IIIB-gp120 unido a la placa, el chimpancé 2 mostró una elevado entorno y, quizá a causa de esto el valor de respuesta más elevada de todos los animales. Las respuestas del quinto ELISA, Organon Technika IIIB lisazo viral fueron positivas con los sueros de los cuatro animales.
Respuestas de neutralización frente a aislamientos primarios y de laboratorio. Los ensayos de neutralización de llevaron a cabo con sueros de cada animal contra aislamientos de laboratorio o primarios. El primer ensayo se realizó en una línea de células T y el último ensayo se llevó a cabo en PBMC seronegativos estimulados con PHA. En todos lo casos, los aislamientos no correspondieron con los representados en las vacunas VIH-1.
Como se demuestra en la tabla 3, las muestras del chimpancé 2, el chimpancé 3 y e chimpancé 4 dieron una deflección positiva (35-40% de inhibición en el crecimiento del virus) contra el aislamiento del laboratorio MN en las células T. Los ensayos con otros dos virus de laboratorio (uno IIIB [Lockey y col., Aids Res. Hum Retroviruses 12: 1297-1299 (1996)] y uno del depósito SF2) no puntuaron positivamente con ninguna muestra. Se muestran los resultados de loes ensayos de neutralización [Montefiori y col., 1988; Montefiori y col., 1996, supra] con cuatro aislamientos primarios probados en PBMC estimuladas con PHA. En estos ensayos se considera que el virus es difícil de neutralizar, ya que los sueros de los pacientes a mentido han proporcionado resultados negativos, incluso cuando se usan diluciones 1:2 [Fenyo y col. AIDS 10: S97-S106 (1996); Moore y Ho, AIDS 9: S117-S136 (1995); Montefiori y col., 1996, supra]. Es interesante el hecho de que una dilución 1:4 del suero del chimpancé 4 fuera capaz de neutralizar uno de los aislamientos primarios de prueba. La situación difería de las experiencias de otros con las vacunas ENV, como en la mayoría de los casos anteriores, lo sueros de individuos inmunizados con Env han proporcionado resultados negativos en los ensayos de neutralización de aislamientos primarios [Steele, Journal of NIH research 6: 40-42 (1994): Moore, Nature 376; 115 (1995)].
TABLA 3 Neutralización por antisuero de chimpancé de virus no específicamente representados en la vacuna
12
El VVenv mixto provoca anticuerpos específicos de VIH-1 de calidad superior al VVenv sencillo. Los resultados de los análisis ELISA y de neutralización se resumen en la Tabla 4, donde se expone una lista de los chimpancés cuyo antisuero proporcionó respuestas superiores en las siete pruebas descritas antes. Como se puede deducir de la tabla, los chimpancés 3 y 4 tuvieron puntuaciones positivas en un compuesto de cinco de siete pruebas, mientras que los 1 y 2 tuvieron una puntuación positiva en sólo tres de siete. Este resultado puede reflejar una calidad superior de los anticuerpos inducidos por el la Polienv en comparación con las vacunas con la Env sencilla.
TABLA 4 Resumen de los ensayos ELISA y de neutralización
13
Discusión
Los experimentos que se describen en este ejemplo se han diseñado para comprobar la seguridad de la vacuna con virus vaccinia contra el VIH-1 y para comparar la eficacia de la inoculación inicial con mezclas de proteínas de la cubierta y con proteínas de la cubierta solas. Los resultados han demostrado, en primer lugar, que los virus de vaccinia podrían usarse como inmunógenos sin inducir una lesión abierta y, en segundo lugar, que se podía provocar un amplio abanico de actividades específicas contra el VIH-1 con la mezcla de proteínas de la cubierta.
El modelo con chimpancés permitió estudiar la seguridad de la Polienv en primates. Los inventores estaban particularmente interesados en determinar la extensión de la formación de lesiones abiertas, ya que los inóculos con VV podían suponer un riesgo de transferencia de virus vivo a individuos sin inmunizar. En el caso del VIH, esto es un motivo de gran preocupación ya que el paciente de SIDA puede no ser capaz de bloquear la infección con VV. Para abordar este problema, los inventores han probado el uso de vacunaciones subcutáneas en chimpancés, cuestionándose si una lesión abierta podría o no evitarse. De hecho, sólo dos de los cuatro chimpancés mostraron lesiones abiertas, Resultados similares se observaron cuando en los estudios clínicos con la vacuna de la viruela se usaron inóculos subcutáneos del depósito de virus vaccinia NYCDH [Connor y col., Journal of Infectious Diseases 135: 167-175 (1977); Benenson y col., Journal of Infectious Diseases 135: 135-144 (1977)].
Es probable que prestando más atención al procedimiento de la inyección y poniendo más cuidado en el seguimiento del punto de inyección se pueda evitar la aparición de lesiones abiertas en todos los casos. Estos resultados demuestran que los aspectos relacionados con la seguridad no impiden el uso de virus de vaccinia como vectores de la vacuna frente al VIH-1.
Las mezclas de proteínas de la cubierta se han probado en ratones (Ejemplo 2) y conejos. En los experimentos con ratones se monitorizaron los anticuerpos antiVIH después de una única inyección de VVenv, mientras que en conejos, el VVenv se usó para reforzar las respuestas provocadas con una vacuna con base de ADN. En los experimentos se indicó que los anticuerpos específicos de VIH-1 podían inducirse o reforzarse con VVenv y que los aislamientos primarios podían neutralizarse con la respuesta de anticuerpos, Para estudiar el potencial de los VVenv mixtos (polienv), los chimpancés se dividieron en dos grupos, Los primeros dos chimpancés recibieron sólo una VVenv mientras que los chimpancés 3 y 4 recibieron una mezcla compuesta por un total de treinta VVenv diferentes.
Después de haber recibido inmunizaciones con virus vaccinia, los cuatro chimpancés recibieron un refuerzo con una única mezcla de proteínas gp120/gp41. Los sueros de cada uno de los cuatro chimpancés se analizaron con cinco ELISA diferentes, donde en cada uno se usó un fragmento diferente y/o configuración diferente de Env. Es interesante el hecho de que los chimpancés 1 y 2 como un grupo respondieron fuertemente en sólo uno de estos ELISA, mientras que los sueros de los chimpancés 3 y 4 como un grupo respondieron enérgicamente el los 4 ensayos, Como cada ensayo medía sólo una fracción del anticuerpo específico del VIH-1 en cada animal, es probable que los resultados reflejen la mayor amplitud de las actividades de unión de los anticuerpos provocados por la vacuna mixta.
Los ensayos de neutralización también se realizaron contra aislamientos de laboratorio y primarios. Es interesante el hecho de que se observó una respuesta positiva contra un aislamiento primario en el chimpancé número 4, incluso aunque el aislamiento primario no se había representado específicamente en la mezcla de la vacuna. De nuevo, estos resultados demostraron la superioridad de los anticuerpos provocados por la mezcla de la vacuna Polienv. Cabría esperar que el incremento en la complejidad de los antígenos de una vacuna condujera a una mayor diversidad de linfocitos y de las correspondientes respuestas de anticuerpos.
La demostración de que se pueden provocar anticuerpos neutralizantes contra un aislamiento primario que no está representado en la vacuna indica que proteínas linealmente distintas comparten estructuras conformacionales. Este concepto también se demuestra mediante las respuestas inmunitarias de los pacientes infectados por VIH.1 en que cualquiera de dos individuos expuestos a una miríada de virus mutuamente excluyentes generalmente están protegidos contra la superinfección cuando se produce una exposición cruzada. El uso de Polienv representa un primer intento en un sistema de chimpancés de imitar la situación en pacientes con VIH-1, Es decir, los anticuerpos neutralizantes se induce con una gran matriz de proteínas EN, en lugar de una única.
En resumen, los inventores han analizado una mezcla de vacuna contra VIH-1 con base de VV denominada Polienv en un modelo de chimpancé. Este ejemplo ha demostrado:
1)
que el VV podía usarse como vacuna sin inducir la formación de lesiones cutáneas abiertas;
2)
que con esta vacuna se podía provocar un amplio espectro de actividades de los anticuerpos específicos de VIH-1; y
3)
que una mezcla de construcciones de Env (polienv) proporcionaba anticuerpos específicos de VIH de calidad superior en comparación con los construcciones de una única Env.
Desde hace tiempo se sabe que el virus vaccinia es una potente vacuna, tanto en su forma salvaje como en su forma recombinante. La fuerza del VV reside en su poder para reclutar compartimentos de linfocitos B y de linfocitos T citotóxicos en la respuesta inmunitaria. El VV ha comprendido una única vacuna capaz de erradicar una enfermedad (viruela) de la población humana. Los datos de este ejemplo indican que los vectores VV recombinantes contribuirán al control futuro del VIH-1.
Ejemplo 4 Preparación de un plásmido bifuncional
Se ha mostrado que las vacunas de ADN provocan fuertes respuestas de anticuerpos y de CTL en varios sistemas distintos (gripe, VIH.1, etc.). Las vacunas basadas en ADN para el virus de la gripe y para el VIH-1 ya están sometidas a estudios clínicos con voluntarios adultos sanos. El virus vaccinia también sirve como base para los programas de vacunación. De hecho, el virus vaccinia ha sido la única vacuna capaz de erradicar una enfermedad (viruela) de la población humana. Numerosos virus de vaccinia recombinantes han provocado respuestas inmunitarias protectoras, como se ha demostrado en estudios animales. Los datos mostrados anteriormente demuestran la eficacia de una vacuna polienv y de la combinación de las estrategias de vacunación, por ejemplo vacunas de ADN y vacunas virales.
Se construye un plásmido bifuncional que pueda actuar como vacuna de ADN y como vector VV recombinante. La Figura 7 muestra un mapa de este plástico, que incluye un promotor de CMV para la expresión en células de mamífero y promotores temprano y tardío del virus vaccinia para la preparación de virus de vaccinia recombinantes. La inyección directa de ADN plasmídico purificado se usaría para provocar respuestas inmunitarias contra una proteína env del VIG en sujetos de prueba. El plásmido también se usaría para preparar y analizar virus de vaccinia recombinantes vivos como vehículos de inmunización con proteína env de VIH.
Los sujetos podrían, potencialmente, ser vacunados con un régimen múltiple, compuesto por una o más vacunaciones con ADN e inmunizaciones con virus de vaccinia recombinantes, administradas en cualquier orden, en inyecciones únicas o múltiples y/o junto con vehículos de vacuna adicionales.
No se debe limitar el alcance de la presente invención a las formas de realización específicas descritas en la presente memoria descriptiva. De hecho, para los expertos en la técnica serán evidentes diversas modificaciones de la invención, además de las descritas en la presente memoria descriptiva, a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas. Tales modificaciones deben interpretarse como que entran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Además debe entenderse que los tamaños de todas las bases y los tamaños de los aminoácidos y todos los pesos moleculares o los valores de las masas moleculares proporcionados para los ácidos nucleicos o los polipéptidos son aproximados y se proporcionan con el objetivo de describir.
En la presente memoria descriptiva se citan varias publicaciones, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad como referencia.
Lista de referencias
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Zagury et al., Nature 332:728-731 (1988).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: St. Jude Children's Research Hospital
\vskip0.800000\baselineskip
332 North Lauderdale
\vskip0.800000\baselineskip
PO Box 318
\vskip0.800000\baselineskip
Memphis, TN 38101-0318
\vskip0.800000\baselineskip
EE.UU.
\vskip0.800000\baselineskip
SOLICITANTES/INVENTORES: Hurwitz, Julia L.
\vskip0.800000\baselineskip
Coleclough, Christopher
\vskip0.800000\baselineskip
Owens, Randall J.
\vskip0.800000\baselineskip
Slobod, Karen
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PREPARACIÓN Y USO DE VECTORES VIRALES PARA VACUNAS MIXTAS DE PROTEÍNAS DE LA CUBIERTA CONTRA EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: KLAUBER & JACKSON
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 411 HACKENSACK AVENUE
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: HACKENSACK
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: NJ
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL:07601
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO; disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM compatible con PC
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Patentin release 1.0, versión 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FECHA DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: pendiente de asignación
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
INFORMACIÓN ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Paul F. Fehlner
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 35.135
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENT: 13401011/PCT
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 210-487-5800
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 201-343-1684
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCAGAAGAC AGTGGCAATG AGAGTGA 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCACTCCATC CAGGTCATGT TATTCCAAAT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGGGTCACA GTCTATTATG GGGTACCTGT GT 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAGAGATTT ATTACTCCAA CTAGCATTCC AAGG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 5
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCATGTGTAA AATTAACCCC ACTCTGTG 
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6
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TACAATTTCT GGGTCCCCTC CTGAGG 
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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID Nº 7
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CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
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(A)
LONGITUD: 880 AMINOÁCIDOS
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(B)
TIPO: AMINOÁCIDO
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(C)
CADENA: AMBAS
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(D)
TOPOLOGÍA: AMBAS
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(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
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(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7
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Claims (18)

1. Una vacuna polienv que comprende al menos de 4 a aproximadamente 10.0000 virus recombinantes diferentes, comprendiendo cada una un ácido nucleico de una variante env (EV) que codifica una variante diferente de la proteína de la cubierta de una proteína de la cubierta del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), en la que
a)
el ácido nucleico EV codifica regiones variables y constantes de la variante de la proteína de la cubierta;
b)
la vacuna polienv es capaz de provocar al menos una de las respuestas inmunitaria celular y humoral en un mamífero contra una cepa de VIH; y
c)
la vacuna polienv es capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra una cepa de VIH para la que no están incluidas las proteínas de la cubierta en la vacuna polienv.
2. La vacuna polienv de la reivindicación 1, que comprende de 10 a 100 virus recombinantes que comprenden diferentes variantes env de VIH.
3. La vacuna polienv de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que los virus recombinantes son los virus vaccinia, poxvirus canario, adenovirus y adenoasociados (AAV).
4. La vacuna polienv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que la variante de la proteína de la cubierta comprende gp120 y una porción de gp41 suficiente para permitir la oligomerización de las proteínas env.
5. La vacuna polienv de la reivindicación 4, en la que el ácido nucleico EV comprende un fragmento de restricción KpnI-BsmI de una secuencia nucleotídica que codifica una proteína de la cubierta de VIH.
6. La vacuna polienv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el ácido nucleico EV se aísla de pacientes infectados con un virus de VIH de un área geográficamente restringida o de pacientes infectados con un virus VIH de diferentes cepas.
7. La vacuna polienv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la vacuna polienv comprende variantes de la proteína de la cubierta expresadas por el virus recombinante.
8. La vacuna polienv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la vacuna polienv comprende al menos un vehículo, un adyuvante o un compuesto quimioterapéutico antiviral farmacéuticamente aceptable.
9. La vacuna polienv de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para usar en la inducción de una respuesta inmunitaria humoral o celular o ambas, frente a un virus de la inmunodeficiencia humana.
10. Una vacuna polienv según la reivindicación 8, en la que el virus recombinante es un virus vaccinia y en la que la vacuna polienv es adecuada para la administración subcutánea.
11. Un procedimiento para preparar una vacuna polienv como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende la combinación de una mezcla de al menos 4 a aproximadamente 10.000 virus recombinantes diferentes para obtener dicha vacuna polienv y la adición opcional de al menos un vehículo, un adyuvante o un compuesto quimioterapéutico antiviral farmacéuticamente aceptable.
12. Una primera vacuna poliev de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y otra vacuna poliev de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que los virus recombinantes de la otra vacuna poliev son de una especie distinta del os virus recombinantes de la primera vacuna poliev, y en la que dicha primera y dicha otra vacuna poliev son adecuadas para administración a un mamífero.
13. La vacuna polienv de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que además comprende
a)
al menos una proteína env recombinante de HIV; o
b)
una cantidad eficaz de al menos un vector de ADN que codifica en la expresión de una proteína env recombinante de HIV; o
c)
ambas, al menos una proteína env recombinante de HIV y una cantidad eficaz de al menos un vector de ADN que codifica en la expresión de una proteína env recombinante de HIV; para producir, iniciar o reforzar una respuesta inmunitaria humoral o celular o ambas, en la que la vacuna polienv de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, la proteína env recombinante de VIH y/o el vector de ADN que codifica en la expresión de una proteína env recombinante de VIH pueden administrarse en cualquier orden.
14. La vacuna polienv de la reivindicación 13, en la que el vector de ADN está adaptado para la administración mediante un disparador de genes.
15. La vacuna polienv de la reivindicación 13, en la que proteína env recombinante de VIH se encuentra mezclada con un adyuvante o está adaptada para su administración intramuscular o ambas.
16. Una vacuna polienv de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que dichos virus recombinantes son plásmidos bifuncionales que pueden servir como vacuna de ADN y un vector de virus recombinante, que comprende una secuencia de control de la expresión animal y una secuencia de control de la expresión viral.
17. Una vacuna polienv según la reivindicación 16, en la que la secuencia de control de la expresión animal es un promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) y la secuencia de control de la expresión viral es un promotor temprano del virus vaccinia, u promotor tardío del virus vaccinia o ambos.
18. Una vacuna polienv según la reivindicación 16, que comprende un gen heterólogo, en el que el gen heterólogo es un ácido nucleico de una variante env (EV) que codifica las regiones variables y constantes de una variante de la proteína de la cubierta de una proteína de la cubierta de l VIH.
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