NO322261B1 - Polyenv-vaksiner mot HIV samt fremgangsmate for fremstilling av disse - Google Patents
Polyenv-vaksiner mot HIV samt fremgangsmate for fremstilling av disse Download PDFInfo
- Publication number
- NO322261B1 NO322261B1 NO19983377A NO983377A NO322261B1 NO 322261 B1 NO322261 B1 NO 322261B1 NO 19983377 A NO19983377 A NO 19983377A NO 983377 A NO983377 A NO 983377A NO 322261 B1 NO322261 B1 NO 322261B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hiv
- virus
- recombinant
- polyenv
- vaccine
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 176
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 51
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 142
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 124
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 86
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 75
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims description 61
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims description 61
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 51
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 51
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 32
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 claims description 30
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 claims description 30
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 claims description 29
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 claims description 28
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 26
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 19
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 19
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 19
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 19
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 18
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims description 13
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 10
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 claims description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 4
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 claims description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 2
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 53
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 49
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 49
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 46
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 45
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 42
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 37
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 30
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 28
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 27
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 22
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 22
- 230000004044 response Effects 0.000 description 22
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 21
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 21
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 19
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 15
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 14
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 14
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 208000018591 proliferative vasculopathy and hydranencephaly-hydrocephaly syndrome Diseases 0.000 description 13
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 13
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 12
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 12
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 12
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 11
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 11
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 11
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 229940126583 recombinant protein vaccine Drugs 0.000 description 8
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 8
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 8
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 8
- 229940033332 HIV-1 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 229940064914 retrovir Drugs 0.000 description 7
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 5
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 5
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 5
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 5
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 5
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 3
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- -1 lysolecithin Chemical compound 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940033330 HIV vaccine Drugs 0.000 description 2
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102400000531 Interleukin-16 Human genes 0.000 description 2
- 101800003050 Interleukin-16 Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 2
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 2
- 241000219871 Ulex Species 0.000 description 2
- 235000010730 Ulex europaeus Nutrition 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- XUYJLQHKOGNDPB-UHFFFAOYSA-N phosphonoacetic acid Chemical compound OC(=O)CP(O)(O)=O XUYJLQHKOGNDPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 2
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 2
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 230000005924 vaccine-induced immune response Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 1
- LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(5-bromo-1h-indol-3-yl)oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C=C12 LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SILNNFMWIMZVEQ-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydrobenzimidazol-2-one Chemical compound C1=CC=C2NC(O)=NC2=C1 SILNNFMWIMZVEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 241001185363 Chlamydiae Species 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000941423 Grom virus Species 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 1
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 1
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282339 Mustela Species 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000036071 Rhinorrhea Diseases 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N Ritonavir Natural products C=1C=CC=CC=1CC(NC(=O)OCC=1SC=NC=1)C(O)CC(CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- DLGSOJOOYHWROO-WQLSENKSSA-N [(z)-(1-methyl-2-oxoindol-3-ylidene)amino]thiourea Chemical compound C1=CC=C2N(C)C(=O)\C(=N/NC(N)=S)C2=C1 DLGSOJOOYHWROO-WQLSENKSSA-N 0.000 description 1
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 1
- DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N amantadine Chemical compound C1C(C2)CC3CC2CC1(N)C3 DKNWSYNQZKUICI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003805 amantadine Drugs 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 230000007416 antiviral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000005860 defense response to virus Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042396 direct acting antivirals thiosemicarbazones Drugs 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229960001936 indinavir Drugs 0.000 description 1
- CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N indinavir Chemical compound C([C@H](N(CC1)C[C@@H](O)C[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H]2C3=CC=CC=C3C[C@H]2O)C(=O)NC(C)(C)C)N1CC1=CC=CN=C1 CBVCZFGXHXORBI-PXQQMZJSSA-N 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 108700010900 influenza virus proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229960003152 metisazone Drugs 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007498 myristoylation Effects 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012457 nonaqueous media Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011092 protein amplification Methods 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 208000010540 rapid respiration Diseases 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 229960000311 ritonavir Drugs 0.000 description 1
- NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N ritonavir Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N 0.000 description 1
- 238000009781 safety test method Methods 0.000 description 1
- 229960001852 saquinavir Drugs 0.000 description 1
- QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N saquinavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN1C[C@H]2CCCC[C@H]2C[C@H]1C(=O)NC(C)(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)C=1N=C2C=CC=CC2=CC=1)C1=CC=CC=C1 QWAXKHKRTORLEM-UGJKXSETSA-N 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 229940083538 smallpox vaccine Drugs 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- ZZIZZTHXZRDOFM-XFULWGLBSA-N tamsulosin hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].CCOC1=CC=CC=C1OCCN[C@H](C)CC1=CC=C(OC)C(S(N)(=O)=O)=C1 ZZIZZTHXZRDOFM-XFULWGLBSA-N 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 150000003584 thiosemicarbazones Chemical class 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 229940124954 vaccinia virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
- C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
- C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
- C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse angår polyenv-vaksiner samt fremgangsmåte for fremstilling av disse.
Oppfinnelsens bakgrunn
AIDS-viruset vil sannsynligvis kreve titalls millioner liv innen årtusen og utgjør et verdensomspennende helseproblem med topp prioritet [se DeVita, et al., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3. utg., J. B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992); Wong-Staal, i Virology, s. 1529-1543; og Hirsch, et al., i Virology, s. 1545-1570]. Utformingen av en effektiv HIV-vaksine gir immuno-logikere en spesiell utfordring fordi revers transkriptase-enzymet involvert i replikasjon av HIV har en høy feilprosent. Dette resulterer i mange mutante HIV-stammer som har ytre kappe- eller envelope-proteiner (env-proteiner) med varierende proteinsekvenser. Disse varierende env-proteiner gjenkjennes ofte som forskjellige antigener av pattedyrimmunsystemet som produserer mer enn IO<9> nye lymfocytter pr. dag for det eneste formål å bekjempe fremmede antigener. B- og T-celler utgjør hhv. de humorale og cellulære komponenter av immunresponsen.
Et godt eksempel på den kvalitative styrke av slike immunresponser er vist i HIV-infiserte pasienter og SIV-infiserte makak-aper. I hvert tilfelle foregår suksessive runder med infeksjon, immunitet og etablering av HIV-varianter eller SIV-varianter [Wrin, et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994); Burns og Desrosiers, Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188:185-219 (1994)]. Med hver syklus øker mangfoldigheten av HIV-antigene determinanter (og de tilsvarende immunresponser), slik at disse immunresponser nøytrali-serer et bredt område av SIV- eller HIV-varianter, og superinfeksjon inhiberes i stor utstrekning.
AIDS-pasienter utvikler imidlertid kompromitterte immunresponser som blir utilstrekkelige til å forhindre at HIV-virusinfeksjon overvinner pasientens immunsystem. Dette kan delvis skyldes etablering av HIV-varianter hvis envelope-variantproteiner ikke gjenkjennes av pasientens immunsystem og således unnslipper destruksjon (Sei. Amer. Aug. 1995, s.). I slike tilfeller, selv om immunresponsen er i stand til å forhindre de novo-infeksjon (f.eks. stadig mutasjon av viruset i priviligerte isolerte seter), kan HIV-infeksjonen til slutt overvinne pasientens immunrespons [Pantaleo et al., Nature 362:344-358 (1993); Embretson et al., Nature 362:359-362
(1993)].
Identifikasjonen av B- og T-celle-antigene determinanter blant HIV-proteiner forblir ufullstendig. HIV-env-proteinet er blitt karakterisert som å inneholde variable (VI-VS) og konstante (C1-C5) områder. Et peptid som er representa-tivt for V3-området har fått betegnelsen den prinsipale nøytraliserende determinant (PND) [Javaherian et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 86:6768-6772 (1989)], selv om andre områder av env-proteinet også kan være involvert i utløsning av en immunrespons. Det uforkortede env-protein fra HIV inneholder ca. 850 til 900 aminosyrer der variasjonen i lengde skyldes hypermutasjon [Starcich et al., Cell 45:637 (1986)].
Gfitz et al. (1990) Journal of Viology 64: 5948-5957 og WO 90/12880 tilveiebringer en fremgangsmåte for generering av hybride gener og proteiner som utnytter fenomenet med intramolekylær rekombinasjon mellom homologe DNA-sekvenser som er tandemarrangert innen et virusgenom. Rencher et al. (1995) AJJDS Research and Human Retroviruses 11:1131-1133 beskriver isolering av kappesekvenser fra blodprøver fra to asymptomatiske HIV-1-infiserte individer. Sekvensdiversiteten til kappepolypeptidet fra hver donor ble analysert, ettersom dette var bredden av antistoffnøytraliseringskapasitet. I studien ble det foreslått at ettersom spekteret av kappesekvenser økte, ville bredden av nøytraliserende antistoffer også øke.
De første vaksiner mot HIV som ble evaluert i kliniske forsøk ble utformet for å fremvise enkle env-proteiner, eller deler derav, for immunsystemet. Nøytraliser-ende responser mot et enkelt, eller noen få, env-proteiner, gjenkjente imidlertid ikke forskjellige isolater av HIV og individene ble ikke beskyttet mot infeksjon [Belshe et al., J. Am. Med. Assoc. 272:431-431 (1994); US patent nr. 5 169 763; PCT-publikasjon WO 87/06262; Zagury et al., Nature 332:728-731
(1988); Kiney et al., Inf. Conf. AIDS 5:541 (1989); Eichberg, Inf. Conf. AIDS 7:88 (1991); Cooney et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:1882-1886 (1993); Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-252 (1992); J. Infect. Dis. 167:533-537 (1993); Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2):S139-143
(1994); Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2):141-143
(1994); McElrath et al., J. Infect. Dis. 169:41-47 (1994); Fauci, Science 264:1072-1073 (mai 1994)].
Det eksisterer således et lenge følt og presserende behov for å oppdage vaksiner og fremgangsmåter som utløser en immunrespons som er tilstrekkelig til å behandle eller forebygge HIV-infeksjoner.
Oppsummering av oppfinnelsen
Foreliggende oppfinnelse omfatter de ifølge kravene anførte trekk og gir en løsning på problemene anngitt heri.
Foreliggende oppfinnelse er ment å overvinne én eller flere av manglene i den beslektede teknikk. Nærmere bestemt tilveiebringer polyenv-vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse fordelaktig en mer robust immunrespons. Styrken til foreliggende oppfinnelse ligger i dens kraft til å rekruttere B-celle-, hjelper-T-celle- og cytotoksiske T-celleområder av immunresponsen for effektiv humoral og cellulær immunitet. Foreliggende oppfinnelse utløser f.eks. en stor bredde av HIV-spesifikke antistoffaktiviteter. HIV-nøytraliseringsanalyser demonstrerer at de utløste antistoffer har utmerket kvalitet. Foreliggende oppfinnelse kan overraskende skape immunresponser mot "native" HIV-stammer, dvs. HIV-stammer for hvilke envelopeproteiner ikke er inkludert i polyenv.-cocktailen.
For å tilveiebringe mer effektive HIV-vaksiner tilveiebringer foreliggende oppfinnelse polyenv-vaksiner som omfatter blandinger av minst 4 og opp til ca. 10 000, fortrinnsvis fra 4 til ca. 1 000 og mer foretrukket fra ca. 10 til 100, forskjellige rekombinante virus som alle uttrykker forskjellige HIV-envelope-proteinvarianter (EPV) (eller en vesentlig del derav) som inkluderer både konstante og variable områder av env-proteinet. Hver av de uttrykte env-proteinvarianter har fortrinnsvis en struktur og/eller immunogenitet som er lignende et nativt HIV-envelope protein som eksisterer i en infisert celle eller et HIV-lipiddobbeltlag, slik som en oligomerform. Det tilveiebringes også fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av slike rekombinante virus og polyenv-vaksiner. Ved deres anvendelse som en vaksine induserer alle de forskjellige envelope proteiner fortrinnsvis et forskjellig undersett av B- og/eller T-celler der hver undersett tilsvarer forskjellige env-proteiner og således mange HIV-varianter. En blanding av dette antall, type og/eller struktur av envelope proteiner er en nyoppdaget metode for utløsning av en sterk, varig HIV-spesifikk immunrespons med bredspektret nøytraliserende aktivitet.
I en foretrukket utførelsesform er de rekombinante virus utvalgt fra gruppen som består av vaccinia, kanarikoppevirus, adenovirus og adeno-assosiert virus (AAV). I et spesifikt eksempel nedenfor anvendes vacciniavirus for å fremstille en polyenv-vaksine. I en foretrukket utførelsesform blir en rekombinant vacciniavirusvaksine ifølge foreliggende oppfinnelse administrert subkutant. En ytterligere fordel ved oppfinnelsen er at subkutan administrering av vacciniavirus ikke resulterer i dannelse av en lesjon og således unngås fri-givelse av infeksiøse vaccinia som er en potensiell trussel for en immunkompromittert populasjon.
En rekombinant virus-polyenv-vaksine omfatter fortrinnsvis et lysat av de virusinfiserte vekstceller, f.eks. vero-celler, som inneholder uttrykte env-proteinvarianter i tillegg til infeksiøs virus. Inklusjon av lysat-env-proteinvariantene som oppmuntrer immunresponsen representerer et spesielt særpreg ved foreliggende oppfinnelse fordi virus generelt renses bort fra vekstcellelysatet.
I vaksinene ifølge oppfinnelsen kan EV-nukleotidet isoleres fra pasienter infisert med et HIV-virus fra et geografisk begrenset område, fra pasienter infisert med et HIV-virus fra forskjellige virusgener, eller fra laboratorieisolater av HIV.
De foreliggende oppfinnere har oppdaget at polyenv-vaksiner ifølge oppfinnelsen utløser uventet forhøyde immunresponser ved ekspresjon og/eller fremvisning av multiple env-proteinvarianter som alle inneholder både konstante og variable områder, fortrinnsvis med en struktur som er vesentlig lik strukturen av et nativt HIV-env-protein. De forhøyede immunresponser gjenkjenner HIV-stammer i tillegg til de stammer som uttrykker env-proteinene som tilveiebringes i polyenv-vaksinen. Målet for en slik vaksine er således å tilveiebringe forhøyede immunresponser mot et bredt område av HIV-stammer, og hvor immunresponsene er egnede for behandling eller forebyggelse av infeksjon (eller fortsatt infeksjon på grunn av mutasjon) av forskjellige stammer av viruset.
Det er også beskrevet env variant (EV)-nukleinsyre som koder for (eller er komplementær til) minst én antigen determinant av en envelope proteinvariant (EPV). EPV blir fortrinnsvis kodet for av et rekombinant virus, som ytterligere tilveiebrakt i en polyenv-vaksine ifølge oppfinnelsen. Nukleinsyrevarianten omfatter minst én mutasjon som overfører forskjellige antigene egenskaper, eller tredimensjonal struktur til den kodete EPV.
Det er også beskrevet et vaksinepreparat som omfatter en polyenv-vaksine ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer eller fortynningsmiddel. Vaksinepreparatet kan ytterligere omfatte et adjuvans og/eller et cytokin som forhøyer en polyenv-vaksine-immunrespons mot minst én HIV-stamme hos et pattedyr som er blitt administrert vaksinepreparatet. En polyenv-vaksine ifølge oppfinnelsen er i stand til å indusere en immunrespons, inklusiv minst én av en humoral immunrespons (f.eks. antistoffer) og en cellulær immunrespons (f.eks. aktivering av B-celler, hjelper-T-celler og cytotoksiske T-celler (CTL)).
Det er også beskrevet en fremgangsmåte for utløsning av en immunrespons mot en HIV-infeksjon hos et pattedyr som er profylaktisk for en HIV-infeksjon, hvilken fremgangsmåte omfatter at det til et pattedyr administreres et vaksinepreparat som omfatter en polyenv-vaksine ifølge oppfinnelsen som gir pattedyret beskyttelse mot en klinisk HIV-relatert patologi forårsaket av infeksjon av minst én HIV-stamme.
Oppfinnelsen beskriver også en fremgangsmåte for utløsning av en immunrespons mot en HIV-infeksjon hos et pattedyr for 'terapi av en HIV-infeksjon. Fremgangsmåten omfatter at det til et pattedyr administreres et preparat som omfatter en inaktivert eller svekket polyenv-vaksine ifølge oppfinnelsen, der preparatet utløser en forhøyet immunrespons, i forhold til kontroller, hos pattedyret mot en klinisk virus-patologi forårsaket av infeksjon med minst én HIV-stamme.
I en ytterligere utførelsesform omfatter den profylaktiske eller terapeutiske fremgangsmåte for utløsning av en immunrespons mot HIV administrering av en effektiv mengde av en annen (f.eks. en andre) polyenv-vaksine som omfatter minst 4 til ca. 10 000 forskjellige rekombinante virus, hvori de rekombinante virus er av en forskjellig art enn de rekombinante virus i den foregående vaksine, og hver av de rekombinante virus i polyenv omfatter et env-variantnukleotid som koder for en forskjellig env-proteinvariant av et HIV-env-protein.
Den HIV-spesifikke immunrespons dannet med den polyenv-rekombinante virusvaksine ifølge oppfinnelsen kan ytterligere forsterkes ved priming eller boosting av en humoral eller cellulær immunrespons, eller begge, ved administrering av en effektiv mengde av minst ett rekombinant HIV env-protein, eller en DNA-vaksine, eller begge. Fortrinnsvis er det rekombinante protein, eller DNA-vaksine, også en polyenv-vaksine. Enhver av vaksinestrategiene tilveiebrakt heri kan være i enhver rekkefølge. Et individ kan f.eks. primes med en rekombinant virus-polyenv-vaksine, etterfulgt av boosting med en DNA-vaksine, med en endelig boost med en rekombinant proteinvaksine. Det rekombinante HIV env-protein foreligger fortrinnsvis i blanding med et adjuvans. I en spesifikk utførelsesform, eksemplifisert nedenfor, administreres det rekombinante HIV env-protein intramuskulært. En DNA-vaksine administreres fortrinnsvis med en genpistol.
De foregående fremgangsmåter tilveiebringer incitamentet til genetisk konstruksjon av en ny plasmidvektor. I et naturlig følgende aspekt beskrives således et bifunksjonelt plasmid som kan tjene som en DNA-vaksine, og en rekombinant virusvektor omfattende et heterologt innføyelsessete under kontroll av både en animalsk ekspresjonskontrollsekvens og en virusekspresjonssekvens. Den animalske ekspresjonskontrollsekvens er fortrinnsvis en cytomegalovirus-umiddelbart tidlig (CMV) promoter, og virusekspresjonskontrollsekvensen er en vacciniavirus-tidlig promoter, en vacciniavirus-sen promoter, eller begge.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1. Skjematisk fremstilling av orienteringen av HIV-l-genet i et vacciniavirus-genom. HIV-l-envelopegenet er beliggende mellom høyre og venstre segmenter av stedet for tymidinkinase. Et Hindlll-sete eksisterer ved C-terminalen av HIV-l-envelopegenet. Den passende innføyelse gir et Hindlll-fragment med en størrelse på ca. 7 kb. Southern-blots med dette mønster bekreftet posisjonen og den korrekte orientering av HIV-l-envelopegenet. Figur 2. Grafisk fremstilling av data som viser at den HIV-spesifikke antistoffrespons er langvarig i pattedyr-modelier. Resultatene for representative musesera testet i ELISA for HIV-spesifikke antistoffer er vist. Hver prøve ble fortynnet 1:100 (faste søyler), 1:1000 (skraverte søyler) og 1:10 000 (åpne søyler) før analyse på HIV-l-belagte ELI SA - plater. Prøver fra testmus ble tatt på forskjellige tids-punkter (1 måned, 4 måneder og 6 måneder) etter injeksjon av IO<7> pfu av en vacciniaviruskonstruksjon som uttrykker et env-protein av HIV-1. Kontrollmusen ble immunisert med en vacciniavirus som ikke inneholdt noen env-sekvens. Streker for standardfeil er vist. Figur 3. Grafisk fremstilling av data som viser hvordan vacciniavirusdosen påvirker induksjon av minst én immunrespons, inkludert HIV-spesifikk antistoffproduksjon. Representative museserumprøver ble testet ved hjelp av ELISA på HIV-l-belagte plater. Serumprøver ble tatt fra mus injisert med IO<5>, IO<6> og IO<7> pfu av et vacciniavirus som uttrykker HIV-1-env-proteinet. Serumprøver ble testet ca. 3 uker etter injeksjon. Hver prøve ble fortynnet 1:100 (fylte søyler),
1:1 000 (skraverte søyler) og 1:10 000 (åpne søyler) før
analyse på HIV-l-belagte ELISA-plater. Streker for standardfeil er vist.
Figur 4. Grafisk fremstilling av data som viser at blandingen av vacciniaviruekonstruksjoner ikke kompromitterer utløsningen av HIV-spesifikt antistoff hos injiserte pattedyr. Representative museserumprøver ble testet ved hjelp av ELISA ca. 2 måneder etter injeksjon av IO<7> pfu vacciniavirus som uttrykker HIV-1-env-protein (proteiner). "Enkel" identifiserer en prøve fra en mus som mottok et enkelt vacciniavirus. "Blanding" representerer en prøve fra en mus som mottok en blanding av vacciniavirus som uttrykker fem forskjellige env-proteiner. Hver prøve ble fortynnet 1:100 (fylte søyler),
1:1 000 (skraverte søyler) og 1:10 000 (åpne søyler) før analyse på HIV-l-belagte ELISA-plater. Streker for standardfeil er vist.
Figur 5. Produksjon av ny vacciniavirusrekombinasjon ved erstatning av pEvenv4 BH10-sekvenser med PCR-produkter. Metoden for sekvenssubstitusjon er vist. Respektive BH10 env-sekvenser ble erstattet med PCR-produkter ved de unike enzymrestriksjonsseter for Kpnl og Bsml. Etter kuttingen av plasmid og ligering med PCR-produkter ble nye plasmider rekombinert med villtype-W for å danne W-ekspresjonsvektorer. Figur 6. Responser i Abbott ELISA etter immunisering. Sera fra alle fire sjimpanser ble testet med Abbott klinisk analyse (se materialer og metoder nedenfor). Resultater for hver serumprøve (Y-aske) er registrert for hver testdato {X-akse). Høye responser ble observert hos sjimpanser immunisert med den blandede Wenv-vaksine. Figur 7. Kart over bifunksjonelt plasmid som kan virke både som en DNA-vaksine og som en W-rekombinasjonsvektor. Tilstedeværelse av cytomegalovirus-umiddelbart tidlig (CMV) promoter og vacciniavirus (W) sene og tidlige promoterer tillater ekspresjon av det fremmede gen i både pattedyrceller eller W-infiserte celler.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Oppdagelse av uventet forhøyede immunresponser mot blandede HIV-polyenv-vaksiner.
Tidligere forsøk på å tilveiebringe vaksiner mot forskjellige stammer av HIV har fokusert på ett eller flere variable områder av gpl20 eller gpl60. Det ble forventet at slike variable områder, tilveiebrakt i en vaksine, ville tilveiebringe bred beskyttelse mot HIV-infeksjon. Slike vaksiner har imidlertid ikke vært vellykkede når den vaksineinduserte immunrespons ikke gjenkjenner mange forskjellige stammer av HIV. Det foreligger derfor et kritisk behov for å tilveiebringe vaksiner som utløser immunresponser mot multiple stammer av HIV, slik at vaksinene er egnede for behandling og/eller forebyggelse av HIV.
De foreliggende oppfinnere har oppdaget at uventet forhøyede primære og sekundære (boosting) immunresponser kan induseres mot noen, eller mange, forskjellige HIV-stammer, ved anvendelse av polyenv.-vaksiner som inneholder en blanding av minst 4 og opptil så mange som 1 000 og muligens så mange som 10 000 rekombinante virus som hver koder for en forskjellig envelopeproteinvariant (EPV). Vaksinen kan også inneholde EPV uttrykt av virusene, f.eks. som produsert i vertscellene anvendt for virusproduksjon.
Betegnelsene "priming" eller "primær" og "boost" eller "boosting" anvendes heri for å referere til hhv. den første og etterfølgende immuniseringer, dvs. i overensstemmelse med definisjonene som disse betegnelser vanligvis har i immunologi.
Den EPV-kodende nukleinsyre (envelopevariant (EV) nukleinsyre) kan isoleres fra den samme eller forskjellige populasjoner (f.eks. geografiske) av mennesker infisert med HIV. Alternativt kan de forskjellige EV-nukleinsyrer oppnås fra enhver kilde og utvelges basert på screening av sekvensene med hensyn til forskjeller i kodingssekvens, eller ved evaluering av forskjeller i utløste humorale og/eller cellulære immunresponser mot multiple HIV-stammer, in vitro eller in vivo, i overensstemmelse med kjente metoder.
Den opprinnelige oppdagelse angikk rekombinante vacciniavirusvaksiner. Som det lett kan erkjennes av en fagperson kan imidlertid ethvert rekombinant virus anvendes for å uttrykkes polyenv.-antigener for en vaksine ifølge oppfinnelsen. Anvendelsen av multiple virusvaksiner kan videre forebygge antivirus-immunresponser som kan gjøre en booster med virusvaksinen mindre effektiv (på grunn av mulig potensering av en kraftig antivirusrespons).
Som det lett erkjennes fra en fagperson har de foreliggende oppfinnere videre funnet at boosting med rekombinant HIV env-protein eller proteiner, fortrinnsvis proteiner, ytterligere potenserer injiseringsmetodene ifølge oppfinnelsen. HIV env-proteinet eller proteinene kan tilsvarer HIV env-proteinene uttrykt i polyenv.-vaksinen, eller de kan være forskjellige HIV env-proteiner.
Som det likeledes kan erkjennes av fagpersonen blir immuniseringsmetodene ifølge oppfinnelsen forbedret ved anvendelse av en DNA-vaksine. DNA-vaksinen kan anvendes som en boost, f.eks. som beskrevet ovenfor med hensyn til de rekombinante HIV-proteiner. Alternativt kan DNA-vaksinen anvendes for å prime immunitet der den rekombinante virusvaksine, eller vaksiner, anvendes for å forsterke anti-HIV-immunresponsen. Som for den rekombinante env-protein-booster-vaksine, kan DNA-vaksinen omfatte én eller flere vektorer for ekspresjon av ett eller flere HIV env-gener. HIV env-genene kan dessuten tilsvarer gener uttrykt av den rekombinante virusvaksine, eller de kan være forskjellige. I en foretrukket utførelsesform fremstilles vektorer for ekspresjon i den rekombinante virusvaksine og i transfekterte pattedyrceller som en del av en DNA-vaksine.
Denne immunrespons (humoral og/eller cellulær) er funnet å være effektiv for et bredere område av stammer av et infeksiøst virus, slik som HIV, og er ikke begrenset til virusstammene som uttrykker de spesifikke envelopeproteinvarianter (EPV) tilveiebrakt av polyenv-vaksinen. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således multiple EPV som kodes for av en rekombinant virusvaksine som gir uventet forhøyede immunresponser mot multiple stammer av HIV.
Polyenv- vaksiner og vaksinasjon
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således, i et aspekt, polyenv-vaksiner som anvender blandinger av minst 4 og opp til 10 000 forskjellige rekombinante vacciniavirus som alle uttrykker forskjellige envelope proteinvarianter, eller en antigendel derav. Som det lett erkjennes av en fagperson kan 4 til ca. 1 000, eller fortrinnsvis ca. 10 til ca. 100, forskjellige rekombinante virus anvendes. En gjennomsnittlig fagperson kan videre lett erkjenne at andre viruser kan anvendes for vaksiner. Eksempler på egnede virus som kan virke som rekombinante virusverter for vaksiner, i tillegg til vaccinia, inkluderer kanarikopper, adenovirus og adeno-assosiert virus. Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av slike polyenv-vaksiner.
En polyenv-vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse induserer minst én av en humoral og en cellulær immunrespons hos et pattedyr som er blitt administrert polyenv-vaksinen, men responsen på vaksinen er subklinisk, eller den er effektiv ved å forhøye minst én immunrespons mot minst én stamme av HIV, slik at vaksineadministreringen er egnet for vaksina-sjonsformål.
Virusvaksiner. Forskjellig genetisk konstruerte virusverter ("rekombinante virus") kan anvendes for å fremstille polyenv.-virusvaksiner for administrering av HIV-polyenv.-antigener. Virusvaksiner er spesielt fordelaktige ved at virusinfeksjonskomponentene fremmer en kraftig immunrespons som målretter aktivering av B-lymfocytter, hjelper-T-lymfocytter og cytotoksiske T-lymfocytter. Et stort antall virus-arter kan anvendes som de rekombinante virusverter for vaksinene ifølge oppfinnelsen. Et foretrukket rekombinant virus for en virusvaksine er vacciniavirus [internasjonal patentpublikasjon WO 87/06262, 22. oktober 1987, av Moss et al.; Cooney et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 50:1882-6
(1993); Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-52 (1992); McElrath et al., J. Infect. Dis. 169:41-7 (1994)]. I en annen utførelsesform kan rekombinant kanarikopper anvendes [Pialoux et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 11:373-81 (1995), erratum in AIDS Res. Hum. Retroviruses 11:875 (1995); Andersson et al., J. Infect. Dis 174:977-85 (1996); Fries et al., Vaccine 14:428-34 (1996); Gonczol et al., Vaccine 13:1080-5 (1995)]. Et annet alternativ er defekt adenovirus eller adenovirus [Gilardi-Hebenstreit et al., J. Gen. Virol. 71:2425-31 (1990); Prevec et al., J. Infect. Dis. 161:27-30 (1990); Lubeck et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:6763-7 (1989); Xiang et al., Virology 219:220-7 (1996)]. Andre egnede virusvektorer inkluderer retrovirus som er pakket i celler med amfotropisk vertsområde [se Miller, Human Gene Ther. 1:5-14 (1990); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, § 9], og svekket eller defekt DNA-virus, slik som, men ikke begrenset til, herpes simplex-virus (HSV) [se f.eks. Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)], papillom-virus, Epstein Barr-virus (EBV), adenoassosiert virus (AAV)
[se f.eks. Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989)] og lignende.
DNA-vaksiner. Et alternativ til en tradisjonell vaksine som omfatter et antigen og et adjuvans involverer den direkte in vivo-innføring av DNA som koder for antigen i vev hos et individ for ekspresjon av antigenet av cellene hos individets vev. Slike vaksiner betegnes heri som "DNA-vaksiner" eller "nukleinsyrebaserte vaksiner". DNA-vaksiner er beskrevet i internasjonal patentpublikasjon WO 95/20660 og internasjonal patentpublikasjon WO 93/19183. Evnen hos direkte injisert DNA som koder for et virusprotein til å utløse en beskyttende immunrespons er blitt demonstrert i et stort antall eksperimentelle systemer [Conry et al., Cancer Res., 54:1164-1168 (1994); Cox et al., Virol, 67:5664-5667 (1993); Davis et al., Hum. Mole. Genet., 2:1847-1851 (1993); Sedegah et al., Proce. Nati. Acad. Sei., 51:9866-9870 (1994); Montgomery et al., DNA Cell Bio., 12:777-783 (1993); Ulmer et al., Science, 259:1745-1749 (1993); Wang et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 90:4156-4160 (1993); Xiang et al., Virology, 199:132-140 (1994)]. Undersøkelser for å vurdere denne strategi ved nøytralisering av influensavirus har benyttet både envelope- og interne virusproteiner for å indusere reduksjon av antistoffer, men har spesielt fokusert på virushema-glutininproteinet (HA) [Fynan et al., DNA Cell. Biol., 12:785-789 (1993A); Fynan et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 90:11478-11482 (1993B); Robinson et al., Vaccine, 11:957, (1993); Webster et al., Vaccine, 12:1495-1498 (1994)].
Vaksinasjon gjennom direkte innføring av DNA som koder for et HIV-env-protein for å utløse en beskyttende immunrespons, produserer både cellemedierte og humorale responser. Dette er analogt med resultater oppnådd med levende virus [Raz et al.. Proe. Nati. Acad. Sei., 91:9519-9523
(1994); Ulmer, 1993, supra; Wang, 1993, supra; Xiang, 1994, supra]. Studier med ildere indikerer at DNA-vaksiner mot konserverte interne influensavirusproteiner, sammen med over-flateglykoproteiner, er mer effektive mot antigene varianter av influensavirus enn både inaktiverte og subvirion-vaksiner [Donnelly et al., Nat. Medicine, 6:583-587 (1995)]. Reproduserbare immunresponser mot DNA som koder for nukleo-protein som varer vesentlig hele dyrets levetid, er da også rapportert for mus [Yankauckas et al., DNA Cell Biol., 12:771-776 (1993)].
Som velkjent i teknikken kan et stort antall faktorer påvirke effektiviteten av ekspresjon av antigene gener og/eller immunogeniteten av DNA-vaksiner. Eksempler på slike faktorer inkluderer reproduserbarheten av inokulering, konstruksjon av plasmidvektoren, valget av promoteren anvendt for å drive antigen-genekspresjon og stabilitet av det inn-føyde gen i plasmidet. Avhengig av deres opprinnelse har promotorer forskjellige vevsspesifisitet og effektivitet ved initiering av mRNA-syntese [Xiang et al., Virology, 209:564-579 (1994); Champman et al., Nucle. Acids. Res., 19:3979-3986
(1991)]. Hittil har de fleste DNA-vaksiner i pattedyrsystemer vært avhengig av viruspromoterer avledet fra cytomegalovirus (CMV). Disse har hatt god effektivitet ved både muskel- og hudinokulering hos et stort antall pattedyrarter. En annen faktor som er kjent for å påvirke immunresponsen utløst ved DNA-immunisering er metoden for DNA-utlevering; parenterale metoder kan gi lave grader av genoverføring og gi betydelig variabilitet av genekspresjon [Montgomery, 1993, supra]. Høy-hastighetsinokulering av plasmider ved anvendelse av en genpistol forhøyet immunresponsene hos mus [Fynan, 1993B, supra; Eisenbraun et al., DNA Cell Biol., 12:791-797 (1993)], antakeligvis på grunn av en høyere DNA-transfeksjonseffektivi-tet og en mer effektiv antigenfremvisning av dendrittiske celler. Den nukleinsyrebaserte vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse kan også innføres i den ønskede vert ved hjelp av andre metoder kjent i teknikken, f.eks. transfeksjon, elektroporering, mikroinjeksjon, transduksjon, cellefusjon, DEAE-dekstran, kalsiumfosfatutfelling, lipofeksjon (lysosomfusjon) , eller en DNA-vektortransportør [se f.eks. Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu og Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., Canadisk patentsøknad nr.
2 012 311, innlevert 15. mars 1990].
Bifunksjonelle plasmider for viurs- og DNA-vaksiner. Et foretrukket aspekt angår konstruksjon av bifunksjonelle plasmider som kan tjene som en DNA-vaksine og en rekombinant virusvektor. Direkte injeksjon av det rensede plasmid-DNA, dvs. som en DNA-vaksine, ville utløse en immunrespons mot antigenet uttrykt av plasmidet hos testindividene. Plasmidet ville også være anvendelig i levende, rekombinante virus som immuniseringsvehikler.
Det bifunksjonelle plasmid tilveiebringer et heterologt gen, eller et innføyelsessete for et heterologt gen, under kontroll av to forskjellige ekspresjons-kontrollsekvenser: En animalsk ekspresjonskontrollsekvens og en virus-ekspresjonskontrollsekvens. Betegnelsen "under kontroll" anvendes i dens vanlige betydning, dvs. operabelt eller operativt assosiert med, i den betydning at ekspresjonskontrollsekvensen, slik som en promoter, tilveiebringer ekspresjon av et heterologt gen. I en foretrukket utførelses-form er den animalske ekspresjonskontrollsekvens en pattedyr-promoter (fuglepromoterer er også omfattet av foreliggende oppfinnelse); i en spesifikk utførelsesform er promoteren cytomegalovirus umiddelbart tidlig (CMV) promoter (se figur 7). I en ytterligere spesifikk utførelsesform er virus-promoteren en vacciniavirus-tidlig promoter, eller en vacciniavirus-sen promoter, eller fortrinnsvis begge (figur 7). Individer kan vaksineres med et flertrinns regime der det bifunksjonelle plasmid administreres som DNA og, på et forskjellig tidspunkt, men i enhver rekkefølge, som en rekombinant virusvaksine. Foreliggende oppfinnelse angår enkle eller flere administreringer av det bifunksjonelle plasmid som en DNA-vaksine eller som en rekombinant virusvaksine, eller begge. Dette vaksinasjonsregime kan komplementeres med administrering av rekombinante proteinvaksiner (nedenfor) , eller kan anvendes med ytterligere vaksinevehikler.
Som lett kan erkjennes av en vanlig fagperson, kan de bifunksjonelle plasmider anvendes som polyenv.-vaksine-vektorer. Ved innføyelse av minst 4 til ca. 10 000, fortrinnsvis 4 til 1 000 og mer foretrukket 10 til 100, forskjellige HIV-env-gener i bifunksjonelle plasmider, kan det således fremstille et tilsvarende sett av bifunksjonelle plasmider som er anvendelig som en polyenv.-vaksine.
Rekombinante proteinvaksiner. Aktiv immunitet utløst ved vaksinasjon med et HIV-env-protein, eller proteiner, kan prime eller forsterke en cellulær eller humoral immunrespons. HIV-env-proteinet, eller proteiner, eller antigene fragmenter derav, kan prepareres i en blanding med et adjuvans for å fremstille en vaksine.
Betegnelsen "adjuvans" refererer til en forbindelse eller en blanding som forhøyer immunresponsen mot et antigen. Et adjuvans kan tjene som et vevsdepot som langsomt frigir antigenet, og også som en lymfoidsystemaktivator som uspesifikt forhøyer immunresponsen (Hood et al., Immunology, 2. utg., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, s. 384). Ofte vil en primær utfordring med et antigen alene, i fravær av et adjuvans, ikke kunne utløse en humoral eller cellulær immunrespons. Adjuvanser inkluderer, men er ikke begrenset til, komplett Freunds adjuvans, ukomplett Freunds adjuvans, saponin, mineralgeler som aluminiumhydroksid, over-flateaktive stoffer som lysolecitin, "pluronic" polyoler, polyanioner, peptider, olje- eller hydrokarbonemulsjoner, keyhole limpet-hemocyaniner, dinitrofenol og potensielt anvendelige adjuvanser, slik som BCG ( bacille Calmette- Guerin) og Corynebacterium parvum. Utvelgelse av et adjuvans avhenger av individet som skal vaksineres. Fortrinnsvis anvendes et farmasøytisk akseptabelt adjuvans. En vaksine for et menneske bør f.eks. unngå olje- eller hydrokarbonemulsjonsadjuvanser, inkludert komplett og ukomplett Freunds adjuvans. Et eksempel på et adjuvans som er egnet for anvendelse på mennesker er alun (aluminagel). I en spesifikk utførelsesform, nedenfor, blir rekombinant HIV-env-protein administrert intramuskulært i alun. Alternativt kan den rekombinante HIV-env-proteinvaksine administreres subkutant, intradermalt, intraperitonealt eller via andre akseptable vaksineadministreringsveier.
Vaksineadministrering. Immunisering mot HIV kan oppnås med en rekombinant virusvaksine ifølge oppfinnelsen alene, eller i kombinasjon med en DNA-vaksine eller en rekombinant proteinvaksine, eller begge. I en spesifikk utførelsesform tilveiebringes rekombinant HIV-env-protein i alun intramuskulært for å forsterke immunresponsen.
Hver dose av virusvaksinen kan inneholde de samme 4 til 10 000, fortrinnsvis 4 til 1 000 og mer foretrukket 10 til 100, forskjellige rekombinante virus som hver uttrykker et forskjellig HIV-env-gen. Alternativt kan virusene i etterfølg-ende vaksiner uttrykke forskjellige HIV-env-gener. I en ytterligere utførelsesform kan de etterfølgende polyenv.-virusvaksiner ha noen virus til felles, og andre som er forskjellige fra den tidligere vaksine. Priming-vaksinen kan f.eks. inneholde vacciniavirus som uttrykker HIV-env-proteiner, vilkårlig betegnet 1-10. En andre (booster) vaksine kan inneholde vacciniavirus (eller fortrinnsvis en forskjellig virus, slik som kanarikopper eller adenovirus) som uttrykker HIV-env-proteiner 6-15 eller 11-20, etc.
En DNA-vaksine eller en rekombinant proteinvaksine kan inneholde et enkelt HIV-env-proteinantigen eller flere antigener. Fortrinnsvis omfatter en DNA- eller rekombinant proteinvaksine for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse flere enn ett HIV-env-proteinantigen. Som for etterfølgende virusvaksiner kan HIV-env-proteinet eller proteinet i en DNA-vaksine eller en rekombinant proteinvaksine, tilsvare et HIV-env-protein uttrykt i polyenv.-virusvaksinen, eller det kan være forskjellig fra ethvert av polyenv.-env-proteinene.
En foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen angår generelt tilveiebringelse av den størst mulige variasjon i hver vaksinasjonsprotokoll for å utsette mottakeren for det største antall HIV-env-proteiner og således tilveiebringe den største mulighet for nøytralisering av kryssreaktivitet med et naturlig HIV-isolat.
Envelopeproteinvarianter
Som anført ovenfor kan en EPV for anvendelse i vaksinene ifølge oppfinnelsen oppnås fra geografisk lokale isolater, eller "clades", eller fra geografisk forskjellige isolater, dvs. forskjellige "clades". Som det lett erkjennes av en fagperson har env-nukleotider (dvs. gener) oppnådd fra naturlige isolater mange fordeler: Isolatene er lett til-gjengelige, EVP tilsvarer naturlig forekommende proteiner som det ønskes immunitet mot, og mutasjoner av HIV kan isoleres hurtig fra nye isolater.
En EPV inkluderer også polypeptider med immunogen aktivitet som er utløst av en aminosyresekvens av en EPV-aminosyresekvens i form av minst én epitop eller antigen determinant. Denne aminosyresekvens tilsvarer vesentlig minst et 10-900 aminosyrefragment og/eller en konsensus-sekvens av en kjent HIV-EPV. En slik EPV kan ha en samlet homologi' eller identitet på minst 50 % med en kjent envelopeprotein-aminosyresekvens, slik som 50-99 % homologi, eller ethvert område eller verdi deri, under utløsning av en immunogen respons mot minst én stamme av en HIV.
Prosent homologi kan f.eks. bestemmes ved sammen-ligning av sekvensinformasjon ved anvendelse av GAP-data-programmet, versjon 6,0, tilgjengelig fra the University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). GAP-programmet benytter grupperingsmetoden ifølge Needleman og Wunsch [J. Mol. Biol. 48:443 (1970)], som er revidert av Smith og Waterman [Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]. Kort beskrevet definerer GAP-programmet likhet som antall grupperte symboler (dvs. nukleotider eller aminosyrer) som er like, delt ved det totale antall symboler i den kortere av de to sekvenser. De foretrukne standardparametre for GAP-programmet inkluderer: (1) En enhetlig sammenligningsmatriks (inneholdende en verdi på 1 for identiteter og 0 for ikke-identiteter) og den vekt-lagte sammenligningsmatriks ifølge Gribskov og Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745 (1986), som beskrevet av Schwartz og Dayhoff, red. Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC
(1979), s. 353-358; (2) en "straff" på 3,0 for hvert gap og ytterligere 0,10 straff for hvert symbol i hvert gap; og (3) ingen straff for endegap.
I en foretrukket utførelsesform er EPV en variantform av minst ett HIV-envelopeprotein. Fortrinnsvis inkluderer EPV gpl20 og oligomeriseringsdomenet til gp41, som gpl40 [Hallenberger, et al., Virology 193:510-514 (1993)].
Kjente HIV-envelopeproteiner inneholder ca. 750 til 900 aminosyrer. Eksempler på slike sekvenser er lett til-gjengelige fra kommersielle og institusjonelle HIV-sekvens-databaser, slik som GENBANK, eller som publiserte kompila-sjoner, slik som Myers et al., red., Human Retroviruses and AIDS, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, vol. I and II, Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, NM (1993). Substitusjoner eller inn-føyelser i en EPV for å oppnå en ytterligere EPV som kodes for av en nukleinsyre for anvendelse i en rekombinant virus- eller polyenv.-vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse, kan inkluderer substitusjoner eller innføyelser av minst én'amino-syrerest (f.eks. 1-25 aminosyrer). Alternativt kan minst én aminosyre (f.eks. 1-25 aminosyrer) deleres fra en EPV-sekvens. Fortrinnsvis identifiseres slike substitusjoner, innføyelser eller delesjoner basert på sekvensbestemmelse av envelope-proteiner oppnådd ved nukleotidsekvensering av minst én EPV-kodende nukleinsyre fra et individ infisert med HIV.
Ikke-begrensende eksempler på slike substitusjoner, innføyelser eller delesjoner utføres fortrinnsvis ved hjelp av amplifikasjon av ENV-DNA- eller RNA-sekvenser fra HIV-1-infiserte pasienter, som kan bestemmes ved hjelp av rutineeksperimentering for å gi et envelopeprotein eller en EPV modifiserte strukturelle og funksjonelle egenskaper. De således oppnådde EPV har fortrinnsvis forskjellige antigene egenskaper i forhold til den opprinnelige EPV. Slike antigene forskjeller kan bestemmes ved hjelp av egnede analyser, f.eks. ved testing med et panel av monoklonale antistoffer som er spesifikke for HIV-envelopeproteiner i en ELISA-analyse.
Enhver substitusjon, innføyelse eller delesjon kan anvendes så lenge som det resulterende EPV-protein utløser antistoffer som bindes til HIV-envelopeproteiner, men der denne EPV har et forskjellig mønster enn antistoffer utløst av en andre EPV. Enhver av de ovennevnte substitusjoner, inn-føyelser eller delesjoner kan også inkludere modifiserte eller uvanlige aminosyrer, f.eks. som beskrevet i 37 CF.R.
§ 1.822 (p) (2).
Den følgende tabell 1 viser eksempler på alternative varianter av HIV-envelopeproteiner som kan kodes for av et rekombinant virus.
Basert på de ovenfor angitte eksempler på spesifikke substitusjoner, kan således alternative substitusjoner utføres ved hjelp av rutineeksperimentering for å tilveiebringe alternative EPV, f.eks. ved å gjøre én eller flere substitusjoner, innføyelser eller delesjoner i envelopeproteiner eller EPV som forårsaker forskjellige immunresponser.
Aminosyresekvensvariasjoner i en EPV ifølge oppfinnelsen kan f.eks. fremstilles ved mutasjoner i DNA. Slike EPV inkluderer f.eks. delesjoner, innføyelser eller substitusjoner av nukleotider som koder for forskjellige aminosyre-rester innen aminosyresekvensen. Mutasjoner som vil bli utført i en nukleinsyre som koder for en EPV må åpenbart ikke plassere sekvensen ut av leserammen og vil fortrinnsvis ikke danne komplementære domener som kan produsere sekundære mRNA-strukturer [se f.eks. Ausubel (1995 rev.), infra; Sambrook
(1989), infra].
Nukleinsyre som koder for EPV kan også fremstilles ved amplifikasjon eller setedirigert mutagenese av nukleotider i DNA eller RNA som koder for et envelopeprotein eller en EPV, og deretter syntetisering eller revers transkribering av det kodende DNA for å produsere DNA eller RNA som koder for en EPV [se f.eks. Ausubel (1995 rev.), infra; Sambrook (1989), infra], basert på læren og veiledningen presentert heri.
Rekombinante virus som uttrykker EPV, rekombinante EPV eller nukleinsyrevektorer som koder for disse, inkluderer et begrenset sett av EPV-kodende sekvenser i form av substitusjonsnukleotider som kan oppnås rutinemessig av en fagperson, uten unødig eksperimentering, basert på læren og veiledningen presentert heri. For en detaljert beskrivelse av proteinkjemi og struktur, se Schulz, G. E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978), og Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA (1983). For en beskrivelse av nukleotidsekvenssubstitusjoner slik som kodonpreferanser, se Ausubel et al., Red. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., New York, NY
(1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995)
(heretter "Ausubel (1995 rev.)") i §§ A. 1.1-A. 1.24, og Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) ved appendiks C og D.
En gjennomsnittlig fagperson, gitt læren og veiledningen presentert heri, vil vite hvordan andre aminosyre-rester kan substitueres i andre posisjoner av et ENV-DNA eller -RNA for å oppnå alternative EPV, inkludert substitusjons-, delesjons- eller innføyelsesvarianter.
Screeningsanalyser for HIV- aktivitet
For screening av anti-HIV-aktivitet av sera eller celler fra et individ som er immunisert med en vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse, kan det anvendes enhver kjent og/eller egnet screeningsanalyse, hvilket er kjent i teknikken. Kjente HIV-analyser inkluderer f.eks. virus-infektivitetsanalyser [se f.eks. Chesebro et al., J. Virol. 62:3779-3788 (1988); Aldovini et al., red. Techniques in HIV Research s. 71-76 (1990)]; nøytraliseringsanalyser [se f.eks. Golding et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:633-643 (1994); Hanson, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:645-648 (1994); Laal et al., Res. Hum. Retrovir. 9:781-785 (1993); Hanson, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994)]; perifere mononukleære (PMN) celleanalyser [se f.eks. Arduino et al., Antimicrob. Agents Chemoter. 37:1095-1101 (1990)]; og cytotoksiske T-lymfocytt (CTL) analyser [se f.eks. Hammond et al., J. Exp. Med. 176:1531-1542 (1992); McElrath et al., J. Virol. 68:5074-5083 (1994); Walker et al., Cell. Immunol. 119:470-475 (1989); Weinhold et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 8:1373 (1992)]. Andre egnede aktiviteter, alene eller i enhver kombinasjon, inkluderer, men er ikke begrenset til, kvantitativ og/eller kvalitativ måling av transkripsjon, replikasjon, translasjon, virioninkorporering, virulens, virusutbytte og/eller morfo-genese.
Spesifikk utførelsesform: Rekombinant vacciniavirus som koder for EPV, polyenv.- vaksiner og fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse av disse
Oversikt. Rekombinante vacciniavirus (W) som uttrykker HIV-envelopeproteiner (f.eks. gp 41, gp 120 og/eller gp 160, eller en del derav) tilveiebringer materialer som er anvendelige for produksjon og testing av blandede vaksiner som induserer minst én av en humoral eller cellulær immunrespons mot viruset, så vel som for analyser av B-celle- og CTL-determinanter.
En polyenv.-vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse består av en blanding av n forskjellige rekombinante vaccinia-virus hvor n er et helt tall fra ca. 4 til 10 000 (eller ethvert område eller verdi deri), hvori hver vacciniavektor-konstruksjon uttrykker en variant av et HIV-l-envelopeprotein (EPV) (f.eks. gp 41, gp 120 eller gp 160). Det rekombinante vacciniavirus koder funksjonelt for en EPV og fremstilles ved rekombinasjon av villtype-W med et plasmid. Multiple, distinkte plasmider som koder for EPV kan fremstilles ved å erstatte én EPV-kodingssekvens med en annen, f.eks. ved anvendelse av et restriksjonsfragment eller ved mutagenese.
Fremstilling av rekombinante vacciniavirus. Fremgangsmåte for fremstilling av individuelle plasmider (som hver uttrykker en unik HIV-proteinsekvens) kan anvende DNA- eller RNA-amplifikasjon for substitusjon av isolerte envelope-proteinvariantsekvenser i en vektor (f.eks. pVenv4 eller pVenvl [Hallenberger et al., Virology 193:510-514 (1993)], hvor denne vektor koder for en kjent HIV-envelopeprotein-sekvens (f.eks. tilgjengelig fra NIAID AIDS Research & Reference Reagent Program, Rockville, MD) .'
Fremgangsmåter for amplifikasjon av RNA eller DNA er velkjente i teknikken og kan anvendes i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse uten unødig eksperimentering, basert på læren og veiledningen presentert heri. Kjente metoder for DNA- eller RNA-amplifikasjon inkluderer, men er ikke begrenset til, polymerasekjedereaksjon (PCR) og beslektede amplifika-sjonsprosesser (se f.eks. US patent nr. 4 683 195, 4 683 202, 4 800 159, 4 965 188, Mullis et al.; 4 795 699 og 4 921 794, Tabor et al; 5 142 033, Innis; 5 122 464, Wilson et al.; 5 091 310, Innis; 5 066 584, Gyllensten et al.; 4 889 818, Gelfand et al.; 4 994 370, Silver et al.; 4 766 067, Biswas; 4 656 134, Ringold) og RNA-mediert amplifikasjon som anvender anti-sens-RNA til målsekvensen som et templat for dobbelt-trådet DNA-syntese (US patent nr. 5 130 238, Malek et al., med handelsnavnet NASBA).
Rekombinante vacciniaviruskonstruksjoner fremstilt på denne måte kan f.eks. anvendes for immuniseringer og utløsning av HIV-spesifikke T- og/eller B-celleresponser. Primere benytter konserverte HIV-sekvenser og amplifiserer således vellykket env-gener fra mange forskjellige HIV-1-pasient-prøver. De grunnleggende teknikker beskrevet heri kan likeledes anvendes med PCR eller andre typer av amplifikasjons-primere for å erstatte env-sekvensen funnet i vektorer som koder for et HIV-envelopeprotein med mindre eller større deler av env-sekvensen fra feltisolater. Se f.eks. Ausubel; infra, Sambrook, infra.
Nukleinsyrer som koder for EPV. Teknikken starter med isolering av DNA fra HIV-infiserte celler og amplifikasjon av env-sekvenser ved hjelp av PCR. PCR- eller andre amplifika-sjonsprodukter tilveiebringer den enkleste måte for isolering av HIV-sekvenser, men alle andre egnede og kjente metoder kan anvendes, slik som kloning og isolering av nukleiner som koder for EPV eller proteiner (se Ausubel. infra; Sambrook, infra). Enzymrestriksjonsseter inkorporeres fortrinnsvis i PCR- eller andre amplifikasjonsprimerseveknser for å lette genkloning.
Isolert DNA for PCR kan fremstilles fra mange virus-kilder, inkludert friskt eller frosset helt blod fra HIV+-pasienter og celler som er blitt infisert in vi tro med virus-isolater.
For å produsere nye HIV-env-konstruksjoner anvendes polymerasekjedereaksjonen (PCR) fortrinnsvis til å identifi-sere 100-2 700 basepar (bp) av et env-gen fra alle forskjellige HIV-pasientprøver. PCR-primerne kan representere vel-konserverte HIV-sekvenser som er egnede for amplifikasjon av env-gener fra kjente prøver av env-gener, isolerte HIV-prøver eller forskjellige HIV-pasientprøver. Det amplifiserte DNA omfatter fortrinnsvis en del som koder for 10-900 (slik som 100-400, 400-600 eller 600-900, eller ethvert område eller enhver verdi deri) aminosyrer av et gpl2 0 og gp41 (begge ut-gjør gpl60). Ett eller flere av de envelope-variable områder (V1-V5) og konstante områder (C1-C5) er fortrinnsvis inkludert i PCR-produktene, mer foretrukket de fleste av VI, Cl, V2, C2, V3, C3, V4, C5 og V5-områdene. Amplifiserte sekvenser kan dessuten kode for 1-200 aminosyrer utenfor spaltingssetet for gpl20/gp41. Fortrinnsvis blir det meste eller alt av hele env-genet amplifisert. Den amplifiserte gpl60-kodingssekvens mangler eventuelt en del av, eller alle, sekvenser som koder for transmembrandomenet og/eller det cytoplasmatiske haledomene [se f.eks. Hallenberger et al. (1993)].
PCR-primerne kan utformes slik at restriksjonsenzym-seter flankerer envelope-gensekvensen i vaccinia-plasmid, slik at de inkorporeres i de amplifiserte DNA-produkter. Ved anvendelse av velkjente substitusjonskloningsteknikker kan vaccinia-plasmidderivater som uttrykker envelope-protein-variantsekvenser fra 1-10 000 pasienter dannes ved å erstatte en del av env-sekvensen i vaccinia-plasmidet med en tilsvarende del av pasientens EPV-kodingssekvens, slik som ved anvendelse av restriksjonsfragmenter for substitusjonen. pVenv4-plasmidet og PCR-produkter behandles f.eks. med Kpnl og Bsml for å oppnå en sekvens som koder for et trunkert gpl60 med aminosyrer 1-639 som mangler både transmembrandomenet og det cytoplasmatiske haledomene i gp41 [se f.eks. Hallenberger et al. (1993)] .
Etter ligering av PCR-produktet og pVenv-produktene transformeres bakterievertscellene med ligeringsblandingen via enhver av et antall fremgangsmåter som er velkjente i teknikken, inkludert f.eks. elektroporering, og rekombinante kolonier utplukkes og undersøkes ved sekvensering.
Rekombinante vacciniavirus-konstruksjoner som koder for HIV-envelopeproteiner. Vaccinia som koder for EPV rekombineres deretter med villtypevirus i en vertscelle, og det lages virusforråd. Virusforrådene i form av Wenv som alle inneholder forskjellige EPV-kodingssekvenser, blandes deretter ved anvendelse av minst 4-40 og opp til ca. 10 000 forskjellige rekombinante virus for å danne en polyenv.-vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse.
De rekombinante vaccinia-plasmider inneholdende EPV-sekvensene blir deretter eventuelt sekvensert eller screenet med HIV-envelopeprotein-spesifikke antistoffer for å identifi-sere forskjellige EPV. Sekvensering ved hjelp av Sanger-metoden med dideoksykjedeterminering er foretrukket. Prose-dyren tilpasses fortrinnsvis fra tidligere beskrevne metoder [Sambrook et al. (1989), infra; United States Biochemical, Sequenase Version 2.0 - DNA Sequencing Kit, 9. utg., Amersham Life Science, Inc., (1994)] og bør lese ca. 50-300 bp fra primerposisjon.
Metoder for produksjon av W-ekspresjonsvektorer er velkjente i teknikken [se f.eks. Mackett, M. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 79:7415-7419 (1982); Panicali, D., og Paoletti, E., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 79:4927-4931
(1982); US patent nr. 4 169 763; Mazzara, G. P. et al., Methods in Enz. 217:557-581 (1993), Ausubel et al., infra ved §§ 16.15-16.19]. Den tidligere beskrevne pSCll-vektor
[Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985)]
kan fortrinnsvis anvendes for å danne et env-kodet plasmid, slik som pVenv4.
Som en virusvektor har vaccinia-virus et antall nyttige egenskaper, inkludert kapasitet som tillater kloning av store fragmenter av fremmed DNA (større enn 20 Kb), reten-sjon av infektivitet etter innføyelse av fremmed DNA, et bredt vertsområde, et forholdsvis høyt proteinsyntesenivå og egnede transport-, sekresjons-, bearbeidelses- og pdst-transla-sjonelle modifikasjoner, som diktert av den primære struktur av det uttrykte protein og den anvendte vertscelletype. N-O-glykosylering, fosforylering, myristoylering og spaltning, så vel som sammensetning av uttrykte proteiner, foregår f.eks. på en pålitelig måte.
Atskillige variasjoner av vaccinia-vektoren er blitt utviklet og er egnede for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse (f.eks. se Ausubel et al., infra, §§ ved 16.15-16.19). Mest alminnelig, etter dannelse av virusforrådet (Ausubel, infra ved § 16.16), blir en nukleinsyresekvens som koder for en EPV plassert under kontroll av en vacciniavirus-promoter og integrert i genomet av vaccinia for å bibeholde infektivitet (Ausubel et al., infra ved § 16.17). Alternativt kan ekspresjon oppnås ved transfeksjon av et plasmid inneholdende det vaccinia-promoterkontrollerte gen som koder for en EPV i en celle som er blitt infisert med villtype-vaccinia.
Fortrinnsvis er vertscellen og vaccinia-vektoren egnet og godkjent for anvendelse ved vaksinasjon av pattedyr
og mennesker. Disse rekombinante virus karakteriseres deretter ved anvendelse av forskjellige kjente metoder (Ausubel et al., infra ved § 16.18). I en ytterligere variasjon kan bakteriofag T7 RNA-polymerasekjeden integreres i genomet av vaccinia, slik at EPV-kodingssekvensene vil uttrykkes under kontroll av en
T7-promoter, enten i transfektert plasma, plasmid eller et rekombinant vaccinia-virus.
Anvendelse av koppeviruspromoterer er foretrukket fordi cellulære og andre viruspromoterer ikke vanligvis gjenkjennes av vaccinia-transkripsjonsapparatet. En sammensatt tidlig/sen promoter anvendes fortrinnsvis i rekombinant vaccinia for polyenv.-vaksiner, fordi det er ønskelig å uttrykke EPV som et antigen som presenteres i rekombinant vacciniavirus-infiserte vertsceller i forbindelse med hoved-histokompatibilitetsklassen (MHC) I eller II. Et slikt MHC-assosiert HIV-envelopeprotein vil deretter danne cytotoksiske T-cellemål og prime vaksinerte pattedyr for en cytotoksisk T-cellerespons og/eller en humoral respons mot de uttrykte HIV-EPV. Dette er fordi vacciniavirusvektorenes evne til å indusere MHC-presentasjon i vertsceller for denne type antigen synes å minske sent i infeksjonsstadiet. Transkripsjoner som begynner tidlig vil terminere etter sekvensen TTTTTNT og føre til utilstrekkelig MHC-fremvisning.
Alternativt kan alle slike termineringsmotiver innen kodingssekvensen av genet endres ved mutagenese dersom en tidlig koppeviruspromoter anvendes, for å forhøye MHC-fremvisning av envelopeproteinantigener i vertsceller (Earl et al. , infra. 1990) . For å etterligne vacciniavirus-mRNA blir utrans-laterte leder- og 3'-terminale sekvenser vanligvis holdt korte hvis de anvendes i vaccinia-plasmidene som inkorporerer HIV EPV-kodende sekvenser.
Fortrinnsvis er plasmidet anvendt for dannelse av vacciniakonstruksjoner ifølge foreliggende oppfinnelse utformet med restriksjonsendonukleaseseter.for innføyelse av env-genet nedstrøms for vacciniapromoteren (Ausubel et al. , infra, § 16.17). Mer foretrukket inneholder plasmidet allerede en envelopeprotein-kodingssekvens, hvori restriksjonssetene entydig forekommer nær både begynnelsen og enden av envelope-protein-kodingssekvensen. Det samme restriksjonsfragment av EPV-kodingssekvensen kan deretter erstatte den tilsvarende sekvens i plasmidet. I slike tilfeller kan hoveddelen av den EPV-kodende sekvens innføyes etter at det meste, eller alt, av envelopeprotein-kodingssekvensen fra plasmidet er fjernet.
Fortrinnsvis er den resulterende vaccinia-konstruksjon (inneholdende EPV-kodingssekvensen og vacciniapromoteren) flankert av vaccinia-DNA for å tillate homolog rekombinasjon når plasmidet transfekteres i celler som tidligere er blitt infisert med villtype-vacciniavirus. Det flankerende vacciniavirus-DNA utvelges slik at rekombinasjon ikke vil forstyrre et essensielt virusgen.
Uten seleksjon er forholdet mellom rekombinant og parental vacciniavirus vanligvis ca. 1:1 000. Selv om denne frekvens er høy nok til å tillate anvendelse av plakk-hybridisering (se Ausubel et al., infra ved §§ 6.3 og 6.4) eller immunscreening (Ausubel et al., infra ved § 6,7) for å utvelge rekombinante virus, er det blitt utviklet mange forskjellige metoder for å lette identifikasjon av rekombinant virus. Ikke-begrensende eksempler på slike seleksjons- eller screeningsteknikker er kjent i teknikken (se Ausubel et al., infra ved § 16.17). Vanligvis flankeres ekspresjonskassetten av segmenter av vaccinia-tymidinkinase (TK) genene, slik at rekombinasjon resulterer i inaktivering av TK. Virus med en TK"-fenotype kan deretter skjelnes fra de med en TK<+->fenotype ved å infisere en TK"-cellelinje i nærvær av 5-brom-deoksy-uridin (5-BrdU), som må være fosforylert av TK for å bli letalt inkorporert i virusgenomet. Alternativt, eller i tillegg, kan rekombinante virus utvelges ved samtidig ekspresjon av et bakterielt antibiotikaresistent gen, slik som ampicillin (amp) eller guanin-fosforibosyltransferase (gpt). Som et ytterligere eksempel tillater samtidig ekspresjon av Bscherichia coli lac Z-genet samtidig screening av rekombinante virusplakker med Xgal (Ausubel, infra, § 16.17).
De rekombinante vacciniavirus som uttrykker en EPV ifølge foreliggende oppfinnelse kan eventuelt svekkes eller inaktiveres i overensstemmelse med kjente metoder, slik som med varme, paraformaldehydbehandling, ultrafiolett stråling, propriolaktenbehandling, hybrid- eller kitnærdannelse eller ved hjelp av andre kjente metoder [se f.eks. Zagury et al., Nature 332:728-731 (1988); ItO et al., Cancer Res. 50:6915-6918
(1990); Wellis et al., J. Immunol. 99:1134-9 (1967); D'Honcht, Vaccine 10 (Suppl.):548-52 (1992); Selenka et al., Arch. Hyg. Bacteriol. 153:244-253 (1969); Grundewald-Bearch et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117:561-567 (1991)]. Varmeinaktiver-ing ved 60 °C vil f.eks. redusere virustiter betydelig. Slike svekkingsteknikker blir sikkerhetstestet fordi ufullstendig inaktivering kan føre til pasientdød [Dorozynski og Anderson, Science 252:501-502 (1991)].
Slike svekkede eller inaktiverte rekombinante vaccinia skal anvendes når pasienten kan ha et kompromitert immunsystem, fordi komplikasjoner eller død kan forekomme når levende vaccinia administreres.
Farmasøytiske preparater
Farmasøytiske preparater som er egnede for inokulering eller for parenteral eller oral administrering inkluderer en polyenv.-rekombinant virusvaksine som omfatter minst 4 og opp til ca. 10 000, fortrinnsvis 4 til ca. 1 000 og mer foretrukket 10 til ca. 100, forskjellige rekombinante virus i form av et cellelysat, en membranbundet fraksjon, delvis renset eller renset. Fortrinnsvis omfatter polyenv.-vaksinen cellelysat inneholdende rekombinant virus (eller membranbundne fraksjoner derav) som ytterligere omfatter EPV-proteiner som allerede er uttrykt av de rekombinante virus. Inkludering av uttrykte EPV er nå oppdaget å forhøye den primære antistoffrespons.
Polyenv.-vaksinepreparater kan foreligge i form av sterile vandige eller ikke-vandige løsninger, suspensjoner eller emulsjoner, og kan også inneholde hjelpemidler eller eksipienser som er velkjente i teknikken. Hver av de minst ca. 4-40 til 10 000 forskjellige virus koder for og uttrykker forskjellige EPV, som vist heri. DNA som koder for EPV kan utvelges til å representere EPV som eksisterer i en spesifikk isolert gruppe av AIDS-pasienter. En vaksine kunne f.eks. representere sekvenser fra Memphis, TN, og være målrettet for anvendelse i Memphis, TN. Vaksiner utformet til å representere geografisk begrensede områder kan også være anvendelige for anvendelse i grupper utenfor målgruppen.
Alternativt kan DNA som koder for EPV utvelges til å representere geografisk spredte grupper, byer eller land, slik som "clades". Multiple kloner kan f.eks. være representert i én polyenv.-vaksine. Et polyenv.-vaksinepreparat kan videre omfatte immunmodulatorer, slik som cytokiner, som aksentuerer en immunrespons mot en virusinfeksjon. Se f.eks. Berkow et al., red., The Merck Manual, 5. utg., Merck & Co., Rahway, NJ
(1987); Goodman et al., red., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutis, 8. utg., Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY (1990); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics,
3. utg., ADIS Press, Ltd., Williams and Wilkins, Baltimore, MD
(1987); og Katzung, red. Basic and Clinical Pharmacology, 5. utg., Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992), hvilke referanser og referanser anført deri viser teknikkens stand. Det vil erkjennes av en fagperson at, når en polyenv.-vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse gis til et individ, kan den foreligge i et preparat som ytterligere kan omfatte minst én av salter, buffere, adjuvanser eller andre stoffer som er ønskelige for å forbedre effektiviteten av preparatet. Adjuvanser er stoffer som kan anvendes for spesifikt å forsterke minst én immunrespons. Vanligvis blir adjuvanset og preparatet blandet før tilførsel til immunsystemet, eller de tilføres separat, men på samme sted hos individet som immuniseres. Adjuvanser kan løst deles i flere grupper basert på deres sammensetning. Disse grupper inkluderer oljeadjuvanser, mineralsalter (f .eks. AlK(S04)2, AlNa{S04)2, AlNH4(S04), silisiumoksid, kaolin og karbon), poly-nukleotider {f.eks. poly-IC- og poly-AU-nukleinsyrer), og visse naturlige stoffer (f .eks. voks D fra Mycc-jbac teri un? tuberculosis, stoffer funnet i Corynebacterium parvum eller Bordetella pertussis, og medlemmer av slekten Brucella). Blant stoffene som er spesielt anvendelige som adjuvanser er saponinene (f.eks. Quil A., Superfos A/S, Danmark). Eksempler på egnede materialer for anvendelse i vaksinepreparater er f.eks. beskrevet i Osol, A., red., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), s. 1324-1341. Et farmasøytisk polyenv.-vaksinepreparat ifølge foreliggende oppfinnelse kan videre, eller ytterligere, omfatte minst én kjemoterapeutisk antivirusforbindeIse. Ikke-begrensende eksempler kan utvelges fra minst én av gruppene som består av gammaglobulin, amantadin, guanidin, hydroksybenz-imidazol, interferon-a, interferon-p, interferon-y, inter-leukin-16 (IL-16; Kurth, Nature, 8. desember 1995); tiosemi-karbazoner, metisazon, rifampin, ribvirin, en pyrimidinanalog (f.eks. AZT og/eller 3TC), en purinanalog, foskarnet, fosfono-eddiksyre, acyclovir, dideoksynukleosider, en protease-inhibitor (f.eks. saquinavir (Hoffmann-La Roche); indinavir (Merck); ritonavir (Abbott Labs); AG 1343 (Agouron Pharmaceuticals); VX-2/78 (Glaxo Wellcome)); kjemokiner som RANTES, MlPla eller MIPlp [Science 270:1560-1561 (1995)] eller ganciclovir. Se f.eks. Richman, AIDs Res. Hum. Retroviruses fl: 1065-1071 (1992) ; Annu Rev Pharmacol Toxico 33: 14 9-164
(1993); Antimicrob Agents Chemother 37: 1207-1213 (1993); AIDs Res. Hum. Retroviruses 10:901 (1994; Katzung (1992), infra, og referansene anført deri på hhv. side 798-800 og 680-681.
Farmasøytiske anvendelser
Administreringen av en polyenv.-vaksine (eller antisera som den utløser) kan enten være for et "profylaktisk" eller et "terapeutisk" formål, og fortrinnsvis for profylaktiske formål. Når det gis profylaktisk gis det levende polyenv.-vaksinepreparat forut for enhver påvisning eller symptom på HIV-infeksjon eller AIDS-sykdom. Den profylaktiske administrering av forbindelsen (forbindelsene) tjener til å forebygge eller svekke enhver etterfølgende HIV-infeksjon.
Når den gis terapeutisk gis polyenv.-vaksinen ved påvisning av et symptom på reell infeksjon. Administreringen av en levende polyenv.-vaksine etter HIV-infeksjon utføres kun når pasientens immunsystem bestemmes å være i stand til å reagere på administrering av den levende polyenv.-vaksine uten vesentlig risiko for komplikasjoner eller død, idet administreringen av en levende virus gis i den nødvendige dose som tjener til å svekke enhver reell HIV-infeksjon.
Alternativt, når pasientens immunrespons er kompromitert, involverer terapeutisk administrering fortrinnsvis anvendelse av et svekket eller inaktivert polyenv.-vaksinepreparat hvor de rekombinante virus er svekket eller inaktivert, som vist ovenfor. Se f.eks. Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra og Katzung (1992), infra, Doronzynski og Anderson, Science 252:501-501 (1991).
Et preparat sies å være "farmakologisk akseptabelt" dersom administrering av preparatet kan tolereres av en mottakende pasient. Et slikt middel sies å bli administrert i en "terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde" dersom den administrerte mengde er fysiologisk signifikant. En vaksine eller et preparat ifølge foreliggende oppfinnelse er fysiologisk signifikant dersom dets tilstedeværelse fører til en påvisbar endring i fysiologien hos en mottakende pasient, fortrinnsvis ved å forhøye en humoral eller cellulær immunrespons mot et HIV.
"Beskyttelsen" som tilveiebringes behøver ikke å være absolutt, dvs. at HIV-infeksjonen eller AIDS-sykdommen behøver ikke å bli totalt forebygget eller utryddet, forutsatt at det foreligger en statistisk signifikant forbedring i forhold til en kontrollpopulasjon. Beskyttelsen kan være begrenset til å redusere alvorligheten eller hurtigheten av inntreden av symptomer på sykdommen.
Farmasøytisk administrering
En vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse kan gi resistens mot én eller flere stammer av et HIV. Oppfinnelsen angår således, og tilveiebringer, et middel for å forebygge eller svekke infeksjon av minst én HIV-stamme. Som anvendt heri angis en vaksine å forebygge eller svekke en sykdom dersom administrering av vaksinen til et individ enten fører til total eller delvis svekkelse (dvs. undertrykkelse) av et syk-domssymptom eller en sykdomstilstand, eller gir individet
total eller delvis immunitet overfor sykdommen.
Minst én polyenv.-vaksine ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres på enhver måte som oppnår det til-siktede formål ved anvendelse av et farmasøytisk preparat som beskrevet heri.
Administrering av et slikt preparat kan f.eks. ut-føres på forskjellige parenterale måter, slik som subkutan, intravenøs, intradermal, intramuskulær, intraperitoneal, intranasal, transdermal eller bukal. Subkutan administrering er foretrukket. Parenteral administrering kan utføres ved hjelp av bolusinjeksjon eller ved gradvis perfusjon over tid. Se f.eks. Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery
(1987), og Katzung (1992), infra.
Et typisk regime for forebyggelse, undertrykkelse eller behandling av en sykdom eller tilstand som kan lindres ved en cellulær immunrespons ved hjelp av en aktiv spesifikk cellulær immunterapi, omfatter administrering av en effektiv mengde av et vaksinepreparat som beskrevet ovenfor, administrert som en enkel behandling eller gjentatt som forhøyede eller forsterkede doser, i en tidsperiode opp til, og inkludert, én uke til ca. 24 måneder.
Med begrepet en "effektiv mengde" av et vaksinepreparat menes en mengde som er tilstrekkelig til å oppnå en ønsket biologisk effekt, i dette tilfelle minst én av effektene cellulær eller humoral immunrespons mot HIV. Det er underforstått at den effektive dose vil være avhengig av mottakerens alder, kjønn, helse og vekt, type av samtidig behandling, hvis noen, behandlingshyppighet og beskaffenheten av den ønskede effekt. Områdene for effektive doser vist nedenfor er ikke ment å begrense foreliggende oppfinnelse og representerer foretrukne doseområder. Den mest foretrukne dose vil imidlertid skreddersys til hvert individ, hvilket forstås å bestemmes av en fagperson uten unødvendig eksperimentering. Se f.eks. Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery
(1987), infra, Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, MA (1985) og Katsung (1992), infra.
Generelt angitt vil dosen for et voksent menneske være fra ca. IO<5> til IO<9> plakkdannende enheter (pfu)/kg, eller kolonidannende enheter (CFU)/kg pr. dose med 10<6->10<8> som foretrukket. Uansett hvilken dose som anvendes bør den være en sikker og effektiv mengde, som bestemt ved kjente metoder som også er beskrevet heri.
Mottakere
Mottakerne av vaksinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være ethvert pattedyr som kan erverve spesifikk immunitet via en cellulær eller humoral immunrespons mot HIV, hvor den cellulære respons formidles av et MHC klasse I eller klasse II-protein. Blant pattedyr er de foretrukne mottakere pattedyr av primatordenen (inkludert mennesker, sjimpanser og andre aper). De mest foretrukne mottakere er mennesker. Individene infiseres fortrinnsvis med HIV eller tilveiebringer en modell for HIV-infeksjon [f.eks. Hu, et al., Nature 328:721-723 (1987)].
Den foregående generelle beskrivelse av oppfinnelsen er i det etterfølgende nærmere beskrevet ved hjelp av eksempler som er illustrerende og ikke er ment å være begrensende for oppfinnelsen.
Eksempler
Eksempel 1
Fremstilling av vacciniavirusvektorer for HIV- env- protein-ekspresjon
Nomenklatur. For referanseformål blir en rekombinant vacciniaviruskonstruksjon alternativt referert til heri som en Wenv-konstruksjon, idet spesifikke vacciniaviruskonstruksjoner er utformet i overensstemmelse med en pasient, eller en deponering (f.eks. ATCC eller GenBank-kilden for env-DNA i konstruksjonen) . Wen-Doe refererer f .eks. til en vaccinia-virusvektorkonstruksjon som inneholder env-sekvenser fra pasient Doe, og Wenv-U28305 refererer til en vacciniavirus-vektor inneholdende env-sekvensene funnet i GenBank aksesjons nr. U28305.
Polyenv.-vaksinen består av 4-100 forskjellige rekombinante vacciniavirus som hver uttrykker et unikt HIV-1-envelopeprotein. For referanseformål er hvert individuelt virus betegnet som Wenv og den endelige virusblanding refereres til som polyenv.
Prepareringen av hver Wenv anvender plasmidet betegnet pVenv4 og et villtype-vacciniavirus betegnet NYCDH, beskrevet nedenfor. For ytterligere detaljer se Ryan et al., "Preparation and Use of Vaccinia Virus Vectors of HIV Protein Expression and Immunization", i Immunology Methods Manual, Lefkovits, red., Academic Press (1996).
Vektorer og vertsceller. Den tidligere beskrevne pSCll-vektor [Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985)] kan anvendes for rekombinasjon av multiple HIV-gener i W-genomet. Elementer av pSCll-plasmidet inkluderer lacZ-genet (et rapportørgen, ved hjelp av hvilket transfor-merte bakterier og W-rekombinant er lett kan identifiseres som de som har p*-galaktosidaseaktivitet) , en porsjon av genet som koder for tymidinkinase (TK) , og et ampicillinresistensgen (amp) . Gener klonet i pSCll innføyes i W-genomet ved homolog rekombinasjon mellom TK-genet i villtype-viruset og delene av TK-genet inneholdt i pSCll. Innføyelse av plasmid-DNA i det virale TK-locus inaktiveres virusgenet slik at rekombinante viruser lett kan utvelges fra bakgrunnen av TK<+->virus ved hjelp av dyrking i bromdeoksyuridin (BUdR) . For at rekombinante TK"-virus skal overleve denne seleksjon må de dyrkes i celler som ikke danner et aktivt TK-enzym, slik som TK" 143-cellelinjen som er TK-manglende derivat av den humane cellelinje R970-5, en osteosarkomcellelinje (Rhim, J. S. et al., Int. J. Cancer 15:23-29 (1975)] som understøtter veksten av W [Weir et al., infra (1982)]. Produksjonen av HIV-gensegmentekspresjon kan være ved hjelp av full geninnføyelse i Smal-setet av pSCll-vektoren. Uforkortede gener kan uttrykkes under kontroll av P7.5K-promoteren. ;Som et alternativ til kloningen av komplette HIV-gener kan HIV-gener som allerede er blitt klonet i pSCll erstattes med partielle gensekvenser. En konstruksjon betegnet pVenvl ble f.eks. fremstilt fra pSCll og uttrykker BH10 HIV envelopeprotein (env) genet [Hallenberger et al., infra, ;(1993); Kilpatrick et al., J. Biol. Chem. 262:116-121 (1987)]. Konstruksjonen kan anvendes som en stamvektor for å substitu-ere og uttrykke forskjellige envelopeproteinområder fra felt-HIV-isolater. Likeledes ble en vektor betegnet pVenv4 konstruert fra pSCll til å uttrykke et BH10 env-protein, trunkert til å utelukke det transmembrane og cytoplasmatiske haledomene som koder for gp41-sekvenser under bibeholdelse av oligomeriseringsdomenet [Hallenberger et al., (1993), infra]. Som det vil erkjennes av den dyktige fagperson anvendes betegnelsen "oligomeriseringsdomene" funksjonelt for å referere til en del av gp41 som tillater oligomerisering av env-proteiner, dvs. at det er tilstrekkelig struktur for oligomerisering. pVenv4-vektoren koder for et trunkert gpl60 (også: gpl60t, gpl40) som ble oppdaget å danne en tertiær struktur som er lignende strukturen av den bearbeidede gp41/gpl20-oligomer (dimer, trimer eller tetramer) som er til stede på celleoverflaten av HIV-infiserte celler. Denne tertiære struktur opprettholdes i både utskilt og membranassosiert form [Hallenberger et al., ;(1993)]. Denne vektor anvendes fortrinnsvis som en stamvektor for substitusjon av alternative isolerte env-sekvenser. ;I dette eksempel involverer fremstillingen av hver Wenv-konstruksjon anvendelse av en pVenv4 og en villtype-vacciniavirus NYCDH, og egnede vertsceller, som beskrevet i detalj nedenfor. ;pVenv4. pVenv4-vektoren ble tidligere fremstilt ved innføyelse av en HIV-l-envelope-kodingssekvens i pSCll-vacciniavirus-rekombinasjonsvektor [Hallenberger et al., Virology 193:510-514 (1993); Chakrabarti et al., Mol. Cell Biology 5:3403-3409 (1985)]. HIV-1-sekvensen stammet fra en laboratoriebeholdning av levende virus. Sekvensen ble betegnet "BH10" [Råtner et al., Nature 313:277-284 (1985)]. Ved hjelp ;av PCR-teknikker kan unike envelopesekvenser fra HIV-1-infiserte pasienter amplifiseres og substitueres i BH10-env-sekvensen for å danne nye vektorer. De følgende primere kan f.eks. anvendes for PCR. (A) Sens, posisjon 5785 (SEKV.ID NR: 1): ;AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA ;(B) Antisens, posisjon 7694 (SEKV.ID NR: 2): ;CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTCCAAAT ;(C) Kpnl-sens, posisjon 5903 (SEKV.ID NR: 3) ;GTGGGTCACAGTCTATTATG GGGTACCTGTGT ;(D) Bsml-antisens, posisjon 7659 (SEKV.ID NR: 4) ;CCAGAGATTTATTACTCCAACT AGCATTCCAAGG ;(E) (valgfri) Dralll-sens, posisjon 6153 (SEKV.ID NR: 5) ;CCATGTGTAAAATTAACCC CACTCTGTG ;(F) (valgfri) Bsu36I-antisens, posisjon 6917 (SEKV.ID NR: 6) ;TACAATTTCTGGGTCCCCT CCTGAGG. ;Disse primere er skrevet 5 til 3. Restriksjonsseter er understreket (nummererte posisjoner er basert på BH10-sekvensen [Råtner et al., Nature 313:277-284 (1985)]. ;PCR-strategi: For å produsere nye HIV-1 env-konstruksjoner anvendes polymerasekjedereaksjonen (PCR) for å amplifi-sere 1 800 basepar (bp) av envelopegen fra 40 forskjellige HIV-1 pasientprøver. PCR-primerne representerer godt konserverte HIV-1-sekvenser og amplifiserer således vellykket env-gener fra mange forskjellige HIV-1 pasientprøver. Det amplifiserte DNA omfatter hele gpl20-proteinet, med unntak av ca. 10 høykonserverte aminosyrer ved proteinets aminoterminal. Alle envelope-variable områder (VI-V5) er inkludert i PCR-produktene. Amplifiserte sekvenser koder dessuten for ca. ;100 aminosyrer utenfor spaltingssetet for gpl20/gp41. ;PCR-primerne som inneholder restriksjonssetene for Kpnl og Bsml som flankerer BH10-envelopegensekvensen i pVenv4, inkorporeres i de amplifiserte DNA-produkter. ;Første runde PRC: I et 500 ul mikrosentrifugerør blandes: ;- 1 ul primer A (SEKV.ID NR: 1), 300 ng/ul; - 1 ul primer B (SEKV.ID NR: 2), 300 ng/ul; - 2,5 ul 10 mM av hver av 4 dNTP; - 1 ug DNA; ;- 10 ul 10X PCR-buffer; og ;- HPLC H20 til 99 ul. ;Taq-forråd virvles og 1 ul tilsettes til PCR-reaksjonen. Blandes godt. Overlegges med mineralolje. ;Kjøres på et termisk sykliseringsapparat som følger: ;- Inkuberes ved 95 °C, 3 minutter, for å smelte DNA. ;- 40 sykluser kjøres: 95 °C, 1 minutt; 45 °C, ;2 minutter; 72 °C, 3,5 minutter. ;Andre runde PCR: PCR-reaksjonsblandingen prepareres som beskrevet ovenfor, men med primere C og D (hhv. SEKV.ID NR: 3 og 4) og uten DNA. Den ferdige løsning bringes til 95 ul. Overlegges med mineralolje, 5 ul fjernes fra den første PCR-reaksjon (fra under oljen) med en pipette. Prøven blandes med den andre reaksjonsblanding, under oljelaget, og syklusene startes som ovenfor. 30 sykluser er vanligvis passende. Det kan være ønskelig å kontrollere produktet ved å fjerne 2 ul for genanalyse etter hver 10. syklus, inntil det identifiseres et tydelig bånd på ca. 1 800 bp. ;Ved anvendelse av velkjente substitusjonskloningsteknikker ble det dannet pVenv4-derivater som uttrykker en env-sekvens fra én av de 40 pasienter, i stedet for BH10-envelopesekvensen. Kort beskrevet ble pVenv4-plasmidet og PCR-produktene deretter spaltet med Kpnl og Bsml, og det spaltede pVenv4 ble kromatografert på en agarosegel og det store fragment ble isolert. Det lille fragment (1 800 bp-fragment) av BH10 env ble kastet. Det spaltede PCR-produkt ble også isolert og ligert til det store pVenv4-fragment for å danne en kimær envelopesekvens som nå inneholder 1 800 bp av variant-env fra pasient-DNA. Etter ligering av PCR-produktet og pVenv-produktene transformeres bakterievertsceller med ligeringsblandingen via enhver av et antall velkjente metoder i teknikken, inkludert f.eks. elektroporering, og rekombinante kolonier utelukkes og undersøkes ved sekvensering. ;Plasmid pVenv4, eller rekombinanter dannet med pVenv4, letter innføyelsen av gener i vacciniavirusgenomet ved homolog rekombinasjon mellom tymidinkinase (Tk) genet i vill-typeviruset og Tk-sekvensene i plasmidet. Innføyelse av pVenv4 DNA i virus-Tk-locus gir et vacciniavirus hvor HIV-l-envelopegenet er uttrykt under kontroll av den P7.5K-tidlige/sene promoter. Viruset svekkes med hensyn til vekstaktivitet på grunn av ødeleggelse av Tk-locus. Et ytterligere element av pVenv4 er lacZ-genet som koder for p-galaktosidaseaktivitet. LacZ-aktivitet kan anvendes for å selektere vacciniavirus-rekombinanter (se nedenfor). ;Envelopegenet uttrykt av pVenv4 trunkeres for å utelukke den transmembrane/C-terminale gp41-sekvens. Vektoren uttrykkes som en oligomerstruktur som finnes i celler og i utskilt form. ;Vacciniavirus-NYCDH. Hvert nytt substituert plasmid blir individuelt rekombinert med villtype-vacciniavirus NYCDH. Dette virus ble erholdt fra A.T.C.C. (aksesjons nr. VR-325) og ble plakk-renset før bruk (Buck, C, og Paulino, M. S. red., American Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae, 6. utg. American Type Culture Collection, Rockville, MD (1990), s. 138). ;Bakterievertsceller. Plasmidet kan dyrkes i enhver egnet vert, som kjent i teknikken [se f.eks. Ausubel, infra (1985 rev), §§ 16.15-16.19]. Et ikke-begrensende eksempel er DH5a-celler. ;TK-manglende celler. Transformasjonen og vaccinia-virus-substitusjonen iføres på den humane Tk" 143B-cellelinje som er et TK-manglende derivat av den humane cellelinje R970-5, en osteosarkomcellelinje [Rhim et al. (1975), infra] som understøtter veksten av W [Weir et al. (1982), infra]. Hver vacciniavirusrekombinant inneholdende en unik HIV-env-gen-sekvens utvelges basert på ekspresjon av lacZ-genet (virusplakker overlegges med Bluo-gal og utvelges for p-galaktosidaseaktivitet som bedømt ved utvikling av en blå farge). To runder med PCR kan utføres. ;Eksempel 2 ;Fremstilling av polyenv.- vaksine ;Vero-celler. Det siste fremstillingstrinn er å dyrke n Wenv-konstruksjoner på vero-celler nyinnkjøpt fra A.T.C.C. ;(aksesjons nr. CCL81 eller X38) og klonet og ekspandert for virusdyrking. Vero-cellelinjen er godkjent av verdens helse-organisasjon for vaksineutvikling [Hay, R. et al., red. American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7. utg., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1992), s. 48]. ;Vero-celler dyrkes med Dulbecco's modifiserte Eagles medium (Bio-Whittaker), et glutaminsupplement (Bio-Whittaker) og varmeinaktivert kalvefosterserum (Hyclone, Inc.). Alternativt kan serumfritt medium anvendes. Hver Wenv-konstruksjon inokuleres på et separat konfluent lag av vero-celler og inn-høstes når cellene viser cytopatiske effekter på grunn av virusinfeksjon. Celleekstrakter vaskes grundig med PBS (Bio-Whittaker) etter innhøsting og før frysing. Cellene sprenges deretter åpne ved frysing-tining, sonikering eller sentrifu-gering ved lav hastighet i en sentrifuge (valgfritt). Aliquoter av supernatanter lagres deretter ved -70 °C. Envelopeprotein er til stede i lysatet i tilstrekkelige konsentrasjoner til å utløse HIV-envelopeprotein-spesifikt antistoff (påvisbar ved hjelp av ELISA) i pattedyrmodeller, selv om W er svekket, f.eks. oppvarmes preparatet til 60 °C i én time. ;Vaksineprodukt. Hvert virusforråd (Wenv-konstruksjon) fra Vero-celler blir individuelt nedfrosset og deretter titrert og sikkerhetstestet. Etter at testene er utført blandes aliquoter av hvert virus for å gi en stamvaksine på IO<8> totale pfu/ml ("pfu" betyr plakkdannende enheter). Dersom 40 Wenv-konstruksjoner anvendes er hver Wenv fortrinnsvis representert i like store mengder, hver Wenv anvendes ved et titer på 2,5 x IO<6> pfu/ml i vaksineproduktet. Dette skulle gi 1 x IO<8> totale pfu. ;Evaluering av polyenv- vaksine ;Mus. Mus kan infiseres med en intraperitoneal injeksjon på 0,1 x IO<7> pfu env-uttrykkende VV. Antistoff kan identifiseres ved hjelp av HIV-ELISA, eller ved nøytraliser-ingsanalyse, som beskrevet ovenfor, 3 uker etter VV-injeksjoner. ;Før fremstilling av polyenv.-vaksinen for human bruk er det blitt fremstilt en lignende gruppe virus for formålet vaksinetesting i mus. Disse virus ble administrert til mus enten intraperitonealt eller subkutant. Serum-HIV-l-spesifikt antistoffserum ble deretter testet for aktivitet i en enzym-bundet immunosorbentanalyse (ELISA). Analyseninvolverte utspredning av hele, nedbrutte HIV-1 (HTLVnIB) på ELISA-plater og deretter blokkering av platene med bovint serumalbumin. Serumprøver ble deretter tilsatt ved fortynninger på 1:100, 1:1 000 og 1:10 000 i fosfatbufret saltløsning. Analysen ble fremkalt med et alkalisk fosfatasekonjugert geit-anti-mus-immunglobulinantistoff og p-nitrofenylfosfat. Fargereaksjonen ble sanset med en natriumhydroksidløsning, og avlesningen av den optiske tetthet ble utført på en ELISA-plateavleser ved 4 05 nm. ;Som vist i figur 2 utløste en enkel inokulering med et cellelysatpreparat med 10<6->10<7> pfu vacciniavirus (inneholdende en enkel HIV-l/envelopeprotein-kodingssekvens og membranbundet uttrykt envelopeprotein) en sterk antistoffrespons overfor HIV-1 som ble bibeholdt gjennom hele tidsforløpet av eksperimentet på 6 måneder. En slik antistoffrespons var betydelig høyere enn tidligere rapportert med andre immuniseringer. Denne høye antistoffrespons kan tilskrives tilstedeværelse av membranbundet envelopeprotein i et vaksinepreparat. Som vist i figur 3 var disse responser doseavhengige. Det ble observert lavere responser hos pattedyr som ble gitt en dose på 10<6> pfu enn hos pattedyr som ble gitt en dose på IO<7> pfu. ;Blandinger av vacciniavirus som uttrykker forskjellige HIV-l-envelopeproteiner ble også fremstilt. Når mus mottok IO<7> pfu av en blanding av 5 virus, hadde deres responser vesentlig identisk størrelse med responser dannet mot 10<7> pfu av en enkel vacciniavirusrekombinant (figur 4). Blandingen av tallrike env-uttrykkende vacciniavirus i store mengder er ikke rapportert og forventes å tilveiebringe et bredt spektrum av nøytraliserende antistoff. ;Mennesker. Tester på det blandede virusforråd utføres før kliniske forsøk, hvor formålet med det første forsøk vil være doseregulering og sikkerhetstesting. ;De kliniske forsøk vil være en dosereguleringsunder-søkelse som involverer sammensetning av fire grupper av frivillige. Hver gruppe mottar én av de følgende vaksinedoser: ;(1) 2 x 10<*> pfu
(2) 2 x IO<5> pfu
(3) 2 x IO<6> pfu
(4) 2 x IO<7> pfu
Hver frivillig mottar den blandede virusvaksine i 0,5 ml saltløsning, administrert ved subkutan injeksjon.
Eksempel 3
Induksjon av primær isolatnøytraliseringsimmunitet med en multi- envelope- vacciniavirusbasert HIV- l- vaksine hos sj impanser
Populasjonen av HIV-l-isolater utrustes med en raffinert rekke av envelope-proteiner. ENV-proteiner er de eneste viruskodede eksterne proteiner og mål for nøytraliser-ende antistoffaktivitet, men antistoffer utløst mot et isolat vil allikevel ikke nødvendigvis nøytralisere ét annet. Av denne årsak er det ved foreliggende oppfinnelse fremstilt en HIV-l-vaksinecoctail, polyenv, som uttrykker tallrike env-proteiner. Vaksineproduksjon startet med fremstilling av 30 atskilte W-rekombinanter som hver uttrykker et distinkt Env-protein. Wenv ble deretter testet, individuelt og i kombinasjon (PolyEnv) i en sjimpansemodell. Fire sjimpanser ble immunisert subkutant med tre injeksjoner av enkel Wenv (sjimpanse 1 og 2) eller PolyEnv (sjimpanse 3 og 4), etterfulgt av én intramuskulær injeksjon med rekombinant gpl20/gp41-protein i alun. Sikkerhet ble vist hos alle fire dyr, kun to av dyrene viste tegn på sårdannelse på injeksjonsstedet. Serumprøver ble kontrollert ved hjelp av tallrike tester for HIV-binding og nøytralisering. Antistoffene fra sjimpanse 3 og 4 viste den høyeste kvalitet for antistoffaktivitet. Nøytraliseringsfunksjon ble demonstrert både mot et laboratorieisolat og et primært isolat av HIV-1, idet ingen av disse var spesifikt representert i vaksinen. Primingen av lymfocytter med blandede env-proteiner tilveiebringer således en lovende metode som muliggjør at høykvalitetsantistoffer kan utløses mot forskjellige HIV-1.
Materialer og metoder
pVenv4, en VV-rekombinasjonsvektor. pVenv4 var tidligere fremstilt ved innføring av et stoffkodon i BH10-env-sekvensen og innføyelse av det modifiserte BHlO-envelopegen (env) i pSCll. pVenv4 uttrykte et env-proteinprodukt som var trunkert ved aminosyre 64 0, og var i stand til både sekresjon og oligomerisering. Produksjon av en rekombinant VV, Vvenv4, som uttrykker dette trunkerte BHlO-env-protein, er beskrevet tidligere [Hallenberger et al., Virology 193:510-514 (1993)].
PCR for amplifikasjon av env-sekvenser fra HIV-1-infiserte individer. PCR ble anvendt for å amplifiserer HIV-env-sekvenser. Generelt ble uttatte prøver som stammet fra blodet fra HIV-l-infiserte individer først diagnostisert for HIV. Andre prøver var fra individer med kliniske symptomer på AIDS eller fra produkter tilveiebrakt av AIDS-forsknings- og referansereagensmagasinet. For blodprøver ble DNA først preparert ved dråpevis tilsetning av blod eller infiserte celler til en SDS-basert cellelysisbuffer, og inkubert ved 65 °C i 30 minutter. Pronase ble tilsatt i en konsentrasjon på 0,5 mg/ml og lysatet ble ytterligere inkubert ved 45 °C over natten. To fenolekstraksjoner ble etterfulgt av etanol-utfelling og resuspensjon av DNA i vann.
To runder av PCR ble utført med alle DNA-prøver ved hjelp av standard metoder. Primersekvenser ble valgt basert på den publiserte BHlO-sekvens [Råtner et al., Nature 313:277-284
(1985)]. For å oppnå fragmenter som inkluderte sekvenser fra alle variable områder og en del av gp41, ble PCR-primere, som beskrevet i eksempel 1, anvendt. PCR-produkter ble deretter klonet ved substitusjon i pVenv4-vektoren ved anvendelse av standard metoder. Sekvenséring ble utført på de nye plasmider ved anvendelse av Sanger-metoden og primeren
CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG (SEKV.ID NR: 5).
Fremstilling av Wenv. Nye VV-rekombinanter (Wenv) ble fremstilt ved transfeksjon av W (NYCDH, ATCC)-infiserte celler med de nylig substituerte rekombinante plasmider (se ovenfor). Transfektam (Promega) og lipofektamin (Gibco, BRL) ble anvendt for å lette transfeksjon, etter fabrikantens anbefalinger. W ble deretter plakk-renset.
Immuniseringer. Wenv-infiserte cellelysater ble administrert til sjimpanser ved subkutane injeksjoner. Wenv ble enten anvendt alene, eller i kombinasjon. De totale mengder W, angitt ved pfu, var lignende i hver injeksjon (ca. IO<7> pfu) pr. dyr. Intramuskulære injeksjoner ble utført med en blanding av ca. 40 mikrogram gpl20 (katalog nr. 12101, Intracel, Cambridge, MA), 20 mikrogram gp41 (katalog nr. 036001, Intracel) og 500 mikrogram alun (Rehsorptar Aluminium hydroksid Adsorpive Gel, Intergen Co., Purchase, NY) pr. inokulering.
ELISA. Fem ELISA ble utført som følger: ELISA nr. 1: Abbott klinisk ELISA ble innkjøpt fra Abbott Laboratories og utført som anbefalt av fabrikanten (HIV AB HIV-l/HIV-2 (rDNA) EIA, Abbott Laboratories, Abbott Park, I.L.). ELISA nr. 2: ELISA ble utført ved utspredning av rekombinant Mn-gpl60 (Quality Biological, Inc. Gaithersburg, MD) i en mengde på 1 ug/ml. Platene ble blokkert og tester ble utført med tre-doble seriefortynninger av sera. Platene ble deretter vasket og bedømt med alkalisk fosfatasekonjugert anti-humant IgG. ELISA 3: ELISA-plater ble belagt med 1 ug/ml LAI-gpl20 (CHO-avledet protein, Intracel). Serumprøver ble deretter utspredt etter en 1:100-fortynning og bedømt med alkalisk fosfatasekonjugert anti-humant IgGl-(mus-anti-humant IgGl-AP, kat. nr. 9050-04, Southern Biological Associates, Inc., Birmingham, A.L.) og p-nitrofenylfosfat. Avlesninger av optisk tetthet ble utført ved 405 nm. ELISA nr. 4: ELISA ble utført som i analyse nr. 3, med unntak av at platene ble belagt med 1 ug/ml UIB-gpl20 (baculovirus-avledet protein, Intracel, katalog nr. 12001, Cambridge, MA). ELISA nr. 5: ELISA ble utført som i analyse nr. 3, med unntak av at platene ble belagt med 1 ug/ml UIB viruslysat (Organon Teknika Co., Durham, N.Y.).
Nøytraliseringsanalyser. Nøytraliseringsanalyser ble utført med laboratorieisolater eller primære isolater [Montefiori et al., J. Clin. Microbiol. 26:231-237 (1988); Montefiori et al., Journal of Infectious diseases 173:60-67
(1996)]. Laboratorieisolater: Virus ble blandet med en 1:20-fortynning av hver serumprøve og utspredt på MT-2- eller CEM-xl74-celler. Nøytral rød farge ble anvendt for å vurdere leve-dyktigheten av celler. En 35-40 % reduksjon av celledød sammenlignet med kontrollkulturer ble definert som et positivt utslag. Primære isolater: Virus ble blandet med en l:4-fortynning av hver serumprøve og utspredt på PHA-stimulert PBMC. Analyser ble dømt med hensyn til p24. En reduksjon av infektivitet på minst 75 % sammenlignet med kontrollkulturer var nødvendig for en positiv bedømmelse.
Resultater
Fremstilling av nye VVenv-rekombinante vacciniavirus. For å fremstille nye VV-rekombinanter (Wenv) , som hver uttrykker et unikt HIV-l-env-protein, ble DNA ført isolert fra HIV-l-prøver. De fleste DNA var fra blodet til individer som ikke hadde vist noen ytre tegn på sykdom, og sannsynligvis ble underkastet den første diagnose for HIV-l-infeksjon. Ytterligere DNA var fra AIDS-pasienter eller fra virus tilveiebrakt fra AIDS-forsknings- og referansereagensmagasinet. PCR ble utført med primerpar som omfattet Kpnl- og Bsml-restriksjonsseter. Fragmenter ble deretter substituert inn i pVenv4-vektoren avbildet i figur 5 (pVenv4 uttrykte opprinnelig et trunkert HIV-l-protein, BH10) ved Kpnl- og Bsml-restriksjonsseter. På denne måte ble gpl20 (V1-V5) og gp41-sekvenser fra BH10 erstattet med respektive sekvenser i PCR-produkter. Med hvert substituert plasmid ble det fremstilt et nytt VV-rekombinant virus (Wenv) .
Denne metode ga en enkel måte ved hvilken en stor mangfoldighet av Env-sekvenser kunne inkorporeres i unike W-rekombinante (Wenv) . Det er interessant at majoriteten av sekvensene var produktive, hvilket antyder at Env-sekvenser i provirusgenomer (fra hvilke de fleste PCR-produkter var avledet) sjeldent var defekte. Det eksisterer en enorm mangfoldighet blant de anvendte Wenv i vaksineblandingen.
Immunisering av sjimpanser med enkle eller blandede Wenv. Fire sjimpanser ble anvendt for testingen av enkle og blandede W-rekombinante vaksiner. Planen for immuniseringene er vist i tabell 2. De første tre injeksjoner inneholdt W, mens den siste injeksjon inneholdt en kombinasjon av gpl20, gp41 og alun, gitt intramuskulært. Sjimpanser 1 og 2 mottok kun én vacciniavirus og det respektive envelopeprotein, gitt i hver av de første tre injeksjoner. Sjimpanser 3 og 4 mottok en blanding av 10 rekombinante W (og de respektive Env i den første injeksjon), 10 ytterligere Env i den andre injeksjon og 10 ytterligere unike Env i den siste immunisering, hvilket totalt ga 30 forskjellige vektorer før proteinforsterkningen. Alle sjimpanser mottok lignende totale mengder med vaccinia-virus i plakkdannende enheter og lignende totale mengder med rekombinante proteiner.
Rekombinant Wenv kan administreres uten lesjons-utbrudd. Alle fire sjimpanser ble kontrollert for tegn på systemisk sykdom og lesjonsdannelse på infeksjonsstedet. Dyr ble analysert på en daglig basis med hensyn til diaré, rhinoré, hosting, nysing, hurtig respirasjon, letargi, begrenset bevegelse og tap av appetitt. Ingen av disse tegn var synlige hos noen dyr på noe tidspunkt. Fotografier tatt av injeksjonsstedene med jevne mellomrom etter en første W-immunisering viste synlig svelling hos alle fire dyr. Milde lesjoner viste seg på injeksjonsstedene hos sjimpanse 1 og 3 og er typiske eksempler på koppevaksinasjon, mens ingen lesjoner var synlige hos sjimpanse 2 og 4. Ingen sykdoms-symptomer, svelling eller lesjoner, var synlige i de andre, tredje og fjerde injeksjoner hos noen dyr, hvilket viser at W-spesifikk immunitet var blitt utløst av den første inokulering.
Injeksjoner av Wenv etterfulgt av proteinforsterk-ningsimmuniseringer ga ELISA-positivt antistoff. HIV-spesifikke antistoffer ble kontrollert under immuniseringene ved hjelp av fem forskjellige ELISA. ELISA ble anvendt for å måle den relative kvalitet fremfor den absolutte kvantitet av antistoffer hos hvert dyr. I de fleste tilfeller' ble testene ut-ført med virusfragmenter som manglet den tredimensjonal og oligomere struktur som er typisk for nativt Env. I disse tilfeller ville ELISA forventes kun å binde en undergruppe av HIV-spesifikke antistoffer. Resultater oppnådd med Abbott-ELISA er vist i figur 6. Sjimpanse 3 overskred grensen for positivitet etter den første VV-immunisering,' mens sjimpanse 4 overskred grensen etter den andre Wenv-immunisering. Responsene fra sjimpanse 3 og 4 ved slutten av immuniseringsregimet gikk langt utover responsene fra sjimpanse 1 og 2. I ELISA nr. 2 med MN gpl60 ble det kun respons fra sjimpanse 3. Denne respons forekom før proteinforsterkningen og ble ikke for-styrret av forsterkningsinjeksjonen. Responsen på CHO-LAI bundet til en ELISA (ELISA nr. 3)-plate ved anvendelse av det samme antigen som anvendt for den rensede proteinforsterkning, viste kun sterk respons fra sjimpanse 3. I ELISA nr. 4 med IIIB-gpl20, platebundet, viste sjimpanse 2 en høy bakgrunn og, kanskje på grunn av den høye bakgrunn, den høyeste respons-verdi av alle dyr. Responsverdier på den femte ELISA, Organon Technika IIIB-viruslysat, var positive med sera fra alle fire dyr.
Nøytraliseringsresponser overfor primære og laboratorieisolater. Nøytraliseringsanalyser ble utført med sera fra hvert dyr mot laboratorie- og primære isolater. Den første analyse ble utført på en T-cellelinje, mens den siste analyse ble utført på serumnegative PHA-stimulerte PBMC. I alle tilfeller kunne isolatene ikke måle seg med isolatene representert i HIV-l-vaksinene.
Som vist i tabell 3 ga prøver fra sjimpanse 2, sjimpanse 3 og sjimpanse 4 et positivt utslag (35-40 % inhibering av virusvekst) i forhold til MN-laboratorieisolatet i T-celler. Analyser med to andre laboratorievirus (ett UIB
[Lockey et al., Aids Res Hum Retroviruses 12:1297-1299 (1996)]
og ett SF2-stamvirus) ga ingen positive resultater med noen prøve. Resultatene fra nøytraliseringsanalyser [Montefiori et al., 1988, supra; Montefiori et al., 1996, supra] med fire primære isolater testet på PHA-stimulert PBMC er vist. Virus betraktes som vanskelig å nøytralisere i disse analyser fordi pasientsera ofte gir negative resultater, selv når det anvendes 1:2 fortynninger [Fenyo et al., AIDS 10.-S97-S106
(1996); Moore og Ho, AIDS 9:S117-S136 (1995); Montefiori et al., 1996, supra]. Det er interessant at en 1:4-fortynning av sjimpanse 4-serum var i stand til å nøytralisere ett av de primære testisolater. Situasjonen atskilte seg fra erfaringer hos andre med Env-vaksiner, fordi, som i de fleste tidligere tilfeller, har sera fra Env-immuniserte individer vist negative resultater i nøytraliseringsanalyser av primære isolater [Steele, Journal of NIH research 6:40-42 (1994); Moore, Nature 376:115 (1995)].
Blandet Wenv utløser en høyere kvalitet av HIV-1-spesifikke antistoffer enn enkel Wenv. Resultatene fra ELISA-og nøytraliseringsanalysene er oppsummert i tabell 4 som viser de sjimpanser hvis sera ga de høyere responser i de 7 tester beskrevet ovenfor. Som det fremgår fra tabellen ga sjimpanse 3 og 4 positivt resultat i en sammensetning av 5 av 7 tester, mens sjimpanse 1 og 2 ga positivt resultat kun i 3 av 7 tester. Dette resultat kan avspeile at Poly-Env utløser en høyere kvalitet av antistoffer sammenlignet med enkle Env-vaksiner.
Diskusjon
Eksperimenter beskrevet i dette eksempel ble utformet for å teste sikkerheten av en vacciniavirus-basert HIV-1-vaksine og sammenlignet effektiviteten av priming med envelope-coctails og enkle envelopevaksiner. Resultatene viste først at vacciniavirus kunne anvendes som et immunogen uten å indusere en åpen lesjon, og for det andre at det kunne utløses et bredt spektrum av HIV-l-spesifikk aktivitet med envelope-coctailen.
Sjimpansemodellen tillot undersøkelse av sikkerheten av PolyEnv i primater. Det var spesielt interessant å bestemme graden av dannelse av åpne lesjoner, fordi VV-inokulasjoner kunne opptre som en trussel for overføring av levende virus til uimmuniserte individer. I tilfellet med HIV er det en alvorlig bekymring at en AIDS-pasient ikke kan være i stand til å blokkere VV-infeksjonen. For å bringe klarhet i denne' bekymring ble det ved foreliggende oppfinnelse testet anvendelse av subkutane vaksinasjoner hos sjimpanser, idet det ble undersøkt hvorvidt en åpen lesjon kunne unngås. Kun to av de fire sjimpanser oppviste i realiteten åpne lesjoner. Lignende resultater ble observert når subkutane inokulasjoner av NYCDH-vacciniavirusforrådet ble anvendt i kliniske forsøk rettet på koppevaksinen [Connor et al., Journal of Infectious diseases
155:167-175 (1977); Benenson et al., Journal of Infectious Diseases 135:135-144 (1977)].
Det er sannsynlig at åpne lesjoner kan unngås i alle tilfeller når det legges ytterligere oppmerksomhet på injek-sjonsprosedyren og pleie av injeksjonsstedet oppfølges. Disse resultater viser at sikkerhetsspørsmål ikke behøver å utelukke anvendelse av vacciniavirus som en HIV-l-vaksinevektor.
Envelope-coctails er blitt testet i eksperimenter på mus (eksempel 2) og kaniner. I museeksperimentene ble anti-HIV-antistoffer kontrollert etter en enkel injeksjon av Wenv, mens i kaniner ble Wenv anvendt for å forsterke responser utløst med DNA-baserte injeksjoner. Eksperimenter indikerte at HIV-l-spesifikke antistoffer kunne utløses eller forsterkes med Wenv, og at primære isolater kunne nøytraliseres ved hjelp av antistoffresponsene. For å undersøke potensialet til blandet Wenv (PolyEnv), ble sjimpanser delt i to grupper. De to første sjimpanser mottok kun én Wenv, mens sjimpanser 3 og 4 mottok coctails sammensatt av totalt 30 forskjellige Wenv.,
Etter å ha mottatt vacciniavirusimmuniseringer ble
alle fire sjimpanser gitt en forsterkningsinjeksjon med én enkel gpl20/gp41-proteinblanding i alun. Sera fra hver av de fire sjimpanser ble testet i 5 forskjellige ELISA som hver benyttet et forskjellig fragment og/eller konfigurasjon av . env. Det er interessant at sjimpanse 1 og 2 sett sammen kun reagerte sterkt i én av disse ELISA, mens sera fra sjimpanser 3 og 4 sett sammen reagerte sterkt i fire slike analyser.
Fordi hver analyse kun målte en fraksjon av det HIV-1-spesifikke antistoff i hvert dyr avspeiler resultatene sannsynligvis den overlegne bredde av antistoffbindende aktiviteter som utløses av den blandede vaksine.
Nøytraliseringsanalyser ble også utført mot både laboratorie- og primære isolater. Det er interessant at det ble observert en positiv respons mot et primært isolat hos sjimpanse 4, selv om det primære isolat ikke var blitt spesifikt representert i vaksineblandingen. Disse resultater viste igjen en større bredde av antistoffer utløst ved hjelp av polyenv.-vaksinecoctailen. Økning av antigenkompleksiteten av en vaksine kan forventes å føre til en økt mangfoldighet av lymfocytt- og tilsvarende antistoffresponser.
Demonstrasjonen av at nøytraliserende antistoffer kan utløses mot et primært isolat som ikke er representert i vaksinen viser at lineært forskjellige proteiner deler konformasjonelle strukturer. Denne oppfatning demonstreres også av immunresponsene fra HIV-l-infiserte pasienter ved at to individer som utsettes for et uttall av innbyrdes forskjellige virus generelt beskyttes mot superinfeksjon når det forekommer mange forskjellige virusangrep samtidig. Anvendelsen av polyenv. representerer et første forsøk i et sjimpansesystem til å etterligne situasjonen hos HIV-l-pasienter. Dette vil si at nøytraliserende antistoffer utløses med en lang rekke, i stedet for et enkelt, env-protein.
Som oppsummering er det testet en VV-basert HIV-1-vaksinecoctail betegnet polyenv i en sjimpansemodell. Dette eksempel har vist: 1) VV kan anvendes som en vaksine uten å indusere en åpen hudlesjon; 2) en stor bredde av HIV-l-spesifikke antistoffaktiviteter kan utløses med denne vaksine; og 3) en cocktail av Env-konstruksjoner (PolyEnv) ga en overlegen kvalitet av HIV-spesifikke antistoffer sammenlignet med en enkel Env-konstruksjon.
Vacciniavirus har lenge vært kjent for å være en potent vaksine, både i villtypeform og i rekombinant form. Styrken av VV ligger i dens kraft til å rekruttere både de B-og cytotoksiske T-lymfocyttområder av immunresponsen..VV har omfattet den eneste vaksine som er i stand til å utrydde en sykdom (kopper) fra den human populasjon. Dataene i dette eksempel indikerer at rekombinante VV-vektorer vil bidra til den fremtidige kontroll av HIV-1.
Eksempel 4
Fremstilling av et bifunksjonelt plasmid
DNA-vaksiner er blitt vist å utløse sterke antistoff-og CTL-responser i flere forskjellige systemer (influensa, HIV-1, etc.). DNA-baserte influensa- og HIV-l-vaksiner benyttes allerede i kliniske forsøk med frivillige voksne friske mennesker. Vacciniavirus tjener også som en sterk basis for vaksinasjonsprogrammer. Vacciniavirus har faktisk vært den eneste vaksine som er i stand til å utrydde en sykdom (kopper) fra den humane populasjon. Et stort antall rekombinante vacciniavirus har utløst beskyttende immunresponser, som vist i dyreforsøk. Dataene vist ovenfor demonstrerer effektiviteten av en polyenv.-vaksine, og å kombinere vaksinasjonsstrategier, f.eks. DNA-vaksiner og virusvaksiner.
Et bifunksjonelt plasmid som både kan virke som en DNA-vaksine og en W-rekombinant vektor er konstruert. Figur 7 viser et kart over dette plasmid som inkluderer en CMV-promoter for ekspresjon i pattedyrceller, og vaccinia-tidlige og -sene promoterer for fremstilling av rekombinant vaccinia. Den direkte injeksjon av renset plasmid DNA vil anvendes for å utløse immunresponser mot et HIV-env-protein hos test-individer. Plasmidet vil også anvendes for å fremstille og teste levende, rekombinante vacciniavirus som HIV-env-protein-immuniseringsvehikler.
Individer kan potensielt vaksineres med et flertrinns regime som består av både DNA-vaksinasjon (vaksinasjoner) og rekombinant vacciniavirus-immunisering (immuniseringer), gitt i enhver rekkefølge, i enkle eller flere injeksjoner og/eller i forbindelse med ytterligere vaksinevehikler.
Referanseliste
Ausubel et al., red, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc, New York, NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995).
Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeubcs, 3. utg. ADIS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987).
Belshe, R.B. et al., J. Am. Med. Assoc. 272:431-431 (1994).
Berkow et al., red., The Merck Manual, 15. utg. Merck and Co., Rahway, NJ (1987).
Birnboim, H.C. og Doly, 1., Nucleic Aads Res. 7:1513-1523
(1979) .
Buck, C, og Paulino, M.S., red., American Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae, 6. utg. American Type Culture Collection, Rockville, MD (1990).
Burns, D.P.W. og Desrosiers, R.C., Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188:185-219 (1994).
Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985). Cooney et al.. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:1882-1886 (1993). Creighton, TE.. Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA (1983).
DeVita Ir., V.T. et al., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3. utg. J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA
(1992).
D'Honcht, Vaccine 10 Suppl.:518-52 (1992).
Dorozynski og Anderson, Science 252:501-502 (1991). Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, MA (1985). Eichberg, Int. Conf. AIDS 7:88 (1991).
Embretson, J et al., Nature 362:339-362 (1993).
Enarni et al., J. Virol. 65:2711-2713 (1991).
Enarni et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87:3802-3805 (1990). Fauci, Science 264:1072-1073 (1994).
Goodman et al., red., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8. utg. Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY (1990) Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2):141-143 (1994).
Gribskov og Burgess, Nucl. Aads Res. 14:6745 (1986).
Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-252 (1992); J. Infect. Dis. 167:533-537 (1993).
Grundwald-Bearch et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117:561-567 (1991).
Hallenberger et al., Virology 193:510-514 (1993).
Hay, R. et al., red., American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7. utg. American Type Culture Collection, Rockville. MD (1992).
Hirsch, M.S., og Curran, 1. "Human immunodeficiency viruses, biology and medical aspects," in Virology, Fields og Knipe, red., Raven Press, Ltd., New York, NY (1990), s. 1545-1570
Hu et al., Nature 328:721-723 (1987).
Ish-Horowicz, D. og Burke, J.F., Nucleic Aads Res. 9:2989-2998
(1981) .
Ito et al., J Virol. 65:5491-5498 (1991).
Ito et al., Cancer Res. 50:6915-6918 (1990).
Javaheriasn K. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 86:6768-6772 (1989).
Katrung, ed., Basic and Clinical Pharmacology, 5. utg. Appleton og Lange, Norwalk, CT (1992).
Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrour. 10 (Suppl. 2):S139-143
(1994) .
Kieny et al., Int. Conf. AIDS 5:541 (1989).
Kilpatrick et al. J. Biol. Chem. 262:116-121 (1987).
Luytjes et al., Cell 59:1107-1113 (1989).
Mackett, NI. er al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 79:7415-7419
(1982) .
Mazzara, G.P. et al., Methods in Enz. 217:557-581 (1993). McElrath et al., J. Infect. Dis. 169:4147 (1994).
Needleman og Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970).
Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Saences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), s. 1324-1341.
Panicali, D., og Paoletti, E., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 79:4927-4931 (1982).
Pantaleo, G. et al., Nature 362:355-358 (1993).
Rhim, J.S. et al., Int. J. Cancer 15:23-29 (1975).
Riclurian, AIDs Res. Hum. Retroviruses 8:1065-1071 (1992); Richman, Annu Rev Pharmacol Toxico 33:149-164 (1993); Richman, Antimicrob Agents Chemother 37:1207-1213 (1993); Richman, AIDs Res. Hum. Retroviruses 10:901 (1994).
Riclunond og McKinney, red. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, 3. utg. U.S. Dept. of Health & Human Services, Washington DC (1993).
Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Schulz, G.E. et al., Prinaples of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978).
Schwartz and Dayhoff, red, Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, [Washington, DC ?-wp] (1979), s. 353-358.
Selenka et al., Arch. Hyg. Bakteriol. 153:244-2S3 (1969). Smith og Waterrnan, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981).
Starcich et al., Cell 45:637 (1986).
Towbin, H. er al., Proe. Nati., Acad. Sei. (USA) 76:4350
(1979).
United States Biochernical, Sequenase Version 2.0 - DNA Sequencing Kit, 9. utg., Arnersham Life Science, Inc., Boise, Idaho (1994).
Weir et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 79:1210-1214
(1982).
Wellis et al., J. Immunol. 99:1134-9 (1967).
Wong-Staal, F., "Human immunodeficiency viruses and their replication," in Virology, Fields og Knipe, red., Raven Press. Ltd., New York, NY (1990), s. 1529-1543.
Wrin et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994). Wu et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101-141
(1978).
Zagury et al., Nature 332:728-731 (1988).
Claims (17)
1. Polyenv-vaksine,
karakterisert ved at den omfatter fra minst 4 til ca. 10 000 forskjellige rekombinante virus som hver omfatter en envelope-variant (EV) nukleinsyre som koder for en forskjellig envelope-proteinvariant av et humant immunsviktvirus (HIV)-envelope-protein, hvori a) EV-nukleotidet koder for både variable og konstante områder av envelope-proteinvarianten; b) polyenv-vaksinen er i stand til å utløse minst én av en cellulær og en humoral immunrespons hos et pattedyr mot en HIV-stamme; og c) polyenv-vaksinen er i stand til å utløse en immunrespons mot en HIV-stamme, hvorved envelope-proteinene ikke er inkludert i polyenv-vaksinen.
2. Polyenv-vaksine ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter fra ca. 10 til 100 rekombinante virus som omfatter forskjellige envelope-varianter av HIV.
3. Polyenv-vaksine ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at de rekombinante virus er vaccinia, kanarikoppevirus, adenovirus eller adenoassosiert virus (AAV).
4. Polyenv-vaksine ifølge ethvert av kravene 1-3, karakterisert ved at envelope proteinvarianten omfatter gpl20 og en del av gp41 som er tilstrekkelig til å tillate oligomerisering av envelope-proteiner.
5. Polyenv-vaksine ifølge krav 4, karakterisert ved at EV-nukleinsyren omfatter et Kpnl-Bsml-restriksjonsfragment av en nukleotid-sekvens som koder for et HIV-envelope protein.
6. Polyenv-vaksine ifølge ethvert av kravene 1-5, karakterisert ved at EV-nukleinsyren er isolert fra pasienter infisert med et HIV-virus fra et geografisk begrenset området eller fra pasienter infisert med et HIV-virus fra forskjellige "clades".
7. Polyenv-vaksine ifølge ethvert av kravene 1-6, karakterisert ved at den omfatter envelope proteinvarianter som uttrykkes av det rekombinante virus.
8. Polyenv-vaksine ifølge ethvert av kravene 1-7, karakterisert ved at den ytterligere omfatter minst én av en farmasøytisk akseptabel bærer, et adjuvans og en kjemoterapeutisk antivirusforbindelse.
9. Polyenv-vaksine ifølge ethvert av kravene 1 til 8 for anvendelse ved utløsning av en humoral eller cellulær immunrespons, eller begge, mot et humant immunsviktvirus.
10. Polyenv-vaksine ifølge ethvert av kravene 1 til 8, karakterisert ved at den videre omfatter; (a) minst ett rekombinant HIV-envelope-protein; eller (b) en effektiv mengde av minst én DNA-vektor som ved ekspresjon koder for et rekombinant HIV-envelope-protein; eller (c) både minst ett rekombinant HIV-envelope-protein og en effektiv mengde av minst én DNA-vektor som ved ekspresjon koder for et rekombinant HIV-envelope-protein;
for å frembringe, starte eller forsterke en humoral eller cellulær immunrespons eller begge deler, hvori polyenv-vaksinen ifølge ethvert av kravene 1-8, det rekombinante HIV-envelope-protein, og/eller DNA-vektoren som ved ekspresjon koder for et rekombinant HIV-envelope-protein, kan administreres i enhver rekkefølge.
11. Polyenv-vaksine ifølge krav 10, karakterisert ved at DNA-vektoren er tilpasset for administrering med en genkanon.
12. Polyenv-vaksine ifølge krav 10, karakterisert ved at det rekombinante HIV-envelope-protein foreligger i en blanding med et adjuvans eller er tilpasset for intramuskulær administrering, eller begge.
13. Polyenv-vaksine ifølge ethvert av kravene 1 til 9, hvori minst ett av nevnte rekombinante virus er et bifunksjonelt plasmid som kan tjene som en DNA-vaksine og en rekombinant virusvektor,
karakterisert ved at det omfatter et heterologt innføyelsessete under kontroll av både en animalsk ekspresjonskontrollsekvens og en virus-ekspresjonskontrollsekvens.
14. Polyenv-vaksine ifølge krav 13, karakterisert ved at den animalske ekspresjonskontrollsekvens er en cytomegalovirus-umiddelbart tidlig (CMV) promoter, og virus-ekspresjonskontrollsekvensen er en vacciniavirus-tidlig promoter, en vacciniavirus-sen promoter, eller begge.
15. Polyenv-vaksine ifølge krav 13 omfattende et heterologt gen,
karakterisert ved at det heterologe gen er en envelope-variant (EV) nukleinsyre som koder for både variable og konstante områder av en envelope-proteinvariant av et HIV-envelope-protein.
16. Fremgangsmåte for fremstilling av en polyenv-vaksine som angitt ethvert av kravene 1 til 8, karakterisert ved at den omfatter kombine-ring i blanding av minst 4 til ca 10 000 ulike rekombinante virus for å erholde den nevnte polyenv-vaksine, og eventuelt tilsetting av minst én farmasøytisk akseptabel bærer, adjuvans eller en antiviral kjemoterapeutisk forbindelse.
17. En første polyenv-vaksine ifølge ethvert av kravene 1 til 8 og en annen polyenv-vaksine ifølge ethvert av kravene 1 til 8,
karakterisert ved at de rekombinante virus av typen polyenv-vaksiner er en forskjellig type enn rekombinante virus i den første polyenv-vaksinen, og hvori nevnte første og nevnte andre polyenv-vaksinen er egnet for administrering til et pattedyr.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/590,288 US5741492A (en) | 1996-01-23 | 1996-01-23 | Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses |
PCT/US1997/000669 WO1997027311A1 (en) | 1996-01-23 | 1997-01-23 | Mixture of recombinant vaccinia vectors as polyenv vaccines for hiv |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO983377D0 NO983377D0 (no) | 1998-07-22 |
NO983377L NO983377L (no) | 1998-09-23 |
NO322261B1 true NO322261B1 (no) | 2006-09-04 |
Family
ID=24361647
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19983377A NO322261B1 (no) | 1996-01-23 | 1998-07-22 | Polyenv-vaksiner mot HIV samt fremgangsmate for fremstilling av disse |
Country Status (29)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US5741492A (no) |
EP (2) | EP0876498B1 (no) |
JP (2) | JP2000504326A (no) |
KR (1) | KR100571479B1 (no) |
CN (1) | CN1229501C (no) |
AP (1) | AP1200A (no) |
AT (1) | ATE278790T1 (no) |
AU (1) | AU709174B2 (no) |
BG (1) | BG64711B1 (no) |
BR (1) | BR9707611A (no) |
CA (1) | CA2243570C (no) |
CZ (1) | CZ296575B6 (no) |
DE (1) | DE69731075T2 (no) |
DK (1) | DK0876498T3 (no) |
EA (1) | EA002390B1 (no) |
ES (1) | ES2230596T3 (no) |
GE (1) | GEP20032902B (no) |
HK (1) | HK1016218A1 (no) |
HU (2) | HU0402182D0 (no) |
IL (2) | IL156919A0 (no) |
NO (1) | NO322261B1 (no) |
NZ (1) | NZ331024A (no) |
OA (1) | OA10814A (no) |
PL (1) | PL188641B1 (no) |
PT (1) | PT876498E (no) |
RO (1) | RO120268B1 (no) |
TR (1) | TR199801418T2 (no) |
UA (1) | UA73712C2 (no) |
WO (1) | WO1997027311A1 (no) |
Families Citing this family (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7488485B2 (en) * | 2003-09-16 | 2009-02-10 | University Of Kansas Medical Center | DNA vaccine compositions and methods of use |
GB9711957D0 (en) * | 1997-06-09 | 1997-08-06 | Isis Innovation | Methods and reagents for vaccination |
US20030138454A1 (en) * | 1997-06-09 | 2003-07-24 | Oxxon Pharmaccines, Ltd. | Vaccination method |
US6919318B1 (en) * | 1998-04-22 | 2005-07-19 | Chiron Corporation | Enhancing immune responses to genetic immunization by using a chemokine |
WO1999061049A2 (en) * | 1998-05-22 | 1999-12-02 | University Of Massachusetts Medical Center | Model for infection by a pathogen using administration of nucleic acids |
US6562800B1 (en) * | 1998-10-30 | 2003-05-13 | University Of Southern California | Use of immunopotentiating sequences for inducing immune response |
US6759237B1 (en) | 1998-11-05 | 2004-07-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same |
JP2002538770A (ja) * | 1998-11-10 | 2002-11-19 | ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル | ウイルスベクターとその製造及び投与の方法 |
WO2000039303A2 (en) * | 1998-12-31 | 2000-07-06 | Chiron Corporation | Modified hiv env polypeptides |
AU2487300A (en) | 1998-12-31 | 2000-07-31 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
US7935805B1 (en) * | 1998-12-31 | 2011-05-03 | Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc | Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof |
EP1141313A2 (en) * | 1998-12-31 | 2001-10-10 | Chiron Corporation | Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles |
WO2000044410A2 (en) * | 1999-01-28 | 2000-08-03 | Stichting Biomedical Primate Research Centre | Composition and method for obtaining specific immunisation against one or more antigens using different recombinant vectors |
DE19907485B4 (de) * | 1999-02-12 | 2008-01-17 | Strathmann Ag & Co. | Virus-Vakzine |
US6420545B1 (en) * | 1999-05-24 | 2002-07-16 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | CD4-independent HIV envelope proteins as vaccines and therapeutics |
AU3793701A (en) * | 1999-11-29 | 2001-06-04 | Orchid Biosciences, Inc. | Methods of identifying optimal drug combinations and compositions thereof |
US20040105871A1 (en) * | 2000-03-02 | 2004-06-03 | Robinson Harriet L. | Compositions and methods for generating an immune response |
WO2001092470A2 (en) | 2000-03-02 | 2001-12-06 | Emory University | Dna expression vectors and methods of use |
US8623379B2 (en) * | 2000-03-02 | 2014-01-07 | Emory University | Compositions and methods for generating an immune response |
EP1311278A4 (en) * | 2000-08-07 | 2005-01-05 | Sloan Kettering Institutefor C | METHOD AND IMMUNIZATION COMPOSITION USING MIXED POOLS OF NUCLEIC ACIDS OR MUTED PEPTIDES |
DE60239317D1 (de) * | 2001-01-12 | 2011-04-14 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Nukleinsäure mukosale immunisierung |
AU2002252199B2 (en) * | 2001-03-08 | 2008-01-03 | Emory University | MVA expressing modified HIV envelope, GAG, and POL genes |
AU2002320314A1 (en) * | 2001-07-05 | 2003-01-21 | Chiron, Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
EP2292772A1 (en) * | 2001-07-05 | 2011-03-09 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | HIV vaccination with a DNA encoding a HIV polypeptide and a HIV polypeptide |
GB0118532D0 (en) * | 2001-07-30 | 2001-09-19 | Isis Innovation | Materials and methods relating to improved vaccination strategies |
US20030170614A1 (en) * | 2001-08-31 | 2003-09-11 | Megede Jan Zur | Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof |
WO2003020876A2 (en) * | 2001-08-31 | 2003-03-13 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof |
US20030228327A1 (en) * | 2001-11-05 | 2003-12-11 | Lasher Alfred W. | DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same |
US20070269456A1 (en) * | 2001-11-05 | 2007-11-22 | Lasher Alfred W | DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same |
EP1450854A2 (en) | 2001-11-30 | 2004-09-01 | Isis Innovation Limited | Vaccine |
US7094410B2 (en) * | 2002-03-02 | 2006-08-22 | The Scripps Research Institute | DNA vaccine against proliferating endothelial cells and methods of use thereof |
US6923958B2 (en) * | 2002-03-02 | 2005-08-02 | The Scripps Research Institute | DNA vaccines encoding CEA and a CD40 ligand and methods of use thereof |
US20040106566A1 (en) * | 2002-05-17 | 2004-06-03 | Shi-Lung Lin | RNA-splicing and processing-directed gene silencing and the relative applications thereof |
EP2316479B8 (en) * | 2002-07-18 | 2015-03-18 | University of Washington | Pharmaceutical compositions comprising immunologically active herpes simplex virus (HSV) protein fragments |
CA2505583C (en) * | 2002-12-03 | 2014-07-15 | University Of Massachusetts | Polyvalent, primary hiv-1 glycoprotein dna vaccines and vaccination methods |
JP2006528244A (ja) | 2003-05-12 | 2006-12-14 | ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション,インコーポレイティド | Fiv感染予防接種のための材料と方法 |
US7658927B2 (en) * | 2003-05-12 | 2010-02-09 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Materials and methods for immunizing against FIV infection |
US8076060B2 (en) * | 2003-08-04 | 2011-12-13 | Emil William Chynn | Vaccination and immunotherapy as new therapeutic modalities in the treatment of glaucoma |
EP2055316A1 (en) * | 2003-09-09 | 2009-05-06 | VIRxSYS Corporation | Lentivirus vector-based approaches for generating an immune response to HIV in humans |
EP1675613B1 (en) | 2003-09-15 | 2012-05-23 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Hiv vaccines based on env of multiple clades of hiv |
US20070166784A1 (en) * | 2003-09-15 | 2007-07-19 | Barnett Susan W | Combination approaches for generating immune responses |
US20050175627A1 (en) * | 2003-09-24 | 2005-08-11 | Oxxon Therapeutics Ltd. | HIV pharmaccines |
US7622125B2 (en) | 2004-05-05 | 2009-11-24 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Polycistronic HIV vector constructs |
US7342107B2 (en) * | 2004-05-27 | 2008-03-11 | Centocor, Inc. | Cynomolgus prostate specific antigen |
CA2570563A1 (en) * | 2004-06-15 | 2006-09-28 | Centocor, Inc. | Method for screening agents against human prostate disease |
AU2005274948B2 (en) * | 2004-07-16 | 2011-09-22 | Genvec, Inc. | Vaccines against aids comprising CMV/R-nucleic acid constructs |
US20080085261A1 (en) * | 2004-10-19 | 2008-04-10 | Haynes Barton F | Vaccine Adjuvant |
EP2266602A3 (en) | 2004-11-01 | 2011-08-10 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Combination approaches for generating immune responses |
AU2005316476A1 (en) * | 2004-12-15 | 2006-06-22 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Chimeric vectors |
US20100098721A1 (en) * | 2006-10-18 | 2010-04-22 | St. Jude Children's Reseach Hospital | Methods and compositions for preparing a universal influenza vaccine |
WO2010093784A2 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Modified virus vectors and methods of making and using the same |
WO2012070974A1 (ru) * | 2010-11-22 | 2012-05-31 | Farber Boris Slavinovich | Вакцины с повышенной иммуногенностью и способы их получения |
CA2826286C (en) * | 2011-01-31 | 2021-09-21 | Intellect Neurosciences Inc. | Treatment of tauopathies |
AP2013007166A0 (en) | 2011-04-06 | 2013-10-31 | Univ Paris Descartes Inst De Rech Pour Le Dev Ird | Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an HIV disease in humans |
JP2014533290A (ja) | 2011-11-14 | 2014-12-11 | ノバルティス アーゲー | ポリアニオン性カルボマーとEnvポリペプチドとの免疫原性複合体ならびにその製造法および使用法 |
WO2013126622A1 (en) | 2012-02-24 | 2013-08-29 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for displaying polypeptides and uses thereof |
LT3390430T (lt) * | 2015-12-15 | 2019-11-25 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Žmogaus imunodeficito antigenai, vektoriai, kompozicijos ir jų panaudojimo būdai |
CN113874078A (zh) | 2019-04-05 | 2021-12-31 | Tauc3生物制品有限公司 | 抗tauc3抗体及其应用 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5198214A (en) * | 1983-08-31 | 1993-03-30 | Stolle Research & Development Corporation | Anti-mastitis polyvalent vaccine, method of administration and method for production thereof |
GR862412B (en) * | 1985-09-25 | 1987-01-23 | Oncogen | Vaccines and immuinoassays for acquired immune deficiency syndrome |
EP0243029A1 (en) * | 1986-04-08 | 1987-10-28 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce | Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus gene |
US5169763A (en) * | 1986-04-08 | 1992-12-08 | Transgene S.A., Institut Pasteur | Viral vector coding glycoprotein of HIV-1 |
US5081226A (en) * | 1986-12-30 | 1992-01-14 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Synthetic peptides sharing sequence homology with the HIV envelope protein |
EP0469089B1 (en) * | 1989-04-18 | 1997-11-19 | Applied Biotechnology, Inc. | Generation of hybrid genes and proteins by virus-mediated recombination |
EP1156102A1 (en) * | 1991-06-14 | 2001-11-21 | Virogenetics Corporation | Immunodeficiency virus recombinant poxvirus vaccine |
US5643578A (en) * | 1992-03-23 | 1997-07-01 | University Of Massachusetts Medical Center | Immunization by inoculation of DNA transcription unit |
DE69536091D1 (de) * | 1994-01-27 | 2010-09-09 | Univ Massachusetts Medical | Immunisierung durch Impfung von DNS Transkriptionseinheit |
FR2728794B1 (fr) * | 1994-12-30 | 1997-03-21 | Rhone Merieux | Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro |
-
1996
- 1996-01-23 US US08/590,288 patent/US5741492A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-01-23 CZ CZ0229398A patent/CZ296575B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-01-23 DK DK97903823T patent/DK0876498T3/da active
- 1997-01-23 IL IL15691997A patent/IL156919A0/xx unknown
- 1997-01-23 CN CNB971932344A patent/CN1229501C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-01-23 US US08/788,815 patent/US5846546A/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-23 NZ NZ331024A patent/NZ331024A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-01-23 GE GEAP19974458A patent/GEP20032902B/en unknown
- 1997-01-23 AP APAP/P/1998/001325A patent/AP1200A/en active
- 1997-01-23 JP JP9526911A patent/JP2000504326A/ja active Pending
- 1997-01-23 CA CA002243570A patent/CA2243570C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-01-23 HU HU0402182A patent/HU0402182D0/hu unknown
- 1997-01-23 ES ES97903823T patent/ES2230596T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-23 TR TR1998/01418T patent/TR199801418T2/xx unknown
- 1997-01-23 PL PL97328193A patent/PL188641B1/pl unknown
- 1997-01-23 DE DE69731075T patent/DE69731075T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-23 AT AT97903823T patent/ATE278790T1/de active
- 1997-01-23 IL IL125497A patent/IL125497A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-01-23 WO PCT/US1997/000669 patent/WO1997027311A1/en active IP Right Grant
- 1997-01-23 AU AU18299/97A patent/AU709174B2/en not_active Ceased
- 1997-01-23 EP EP97903823A patent/EP0876498B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-01-23 EA EA199800638A patent/EA002390B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-01-23 HU HU9900389A patent/HU224344B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1997-01-23 BR BR9707611A patent/BR9707611A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-01-23 KR KR1019980705646A patent/KR100571479B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1997-01-23 RO RO98-01218A patent/RO120268B1/ro unknown
- 1997-01-23 UA UA98084523A patent/UA73712C2/uk unknown
- 1997-01-23 PT PT97903823T patent/PT876498E/pt unknown
- 1997-01-23 EP EP03077363A patent/EP1378516A1/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-07-22 OA OA9800118A patent/OA10814A/en unknown
- 1998-07-22 NO NO19983377A patent/NO322261B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-08-21 BG BG102712A patent/BG64711B1/bg unknown
- 1998-09-21 US US09/157,963 patent/US6086891A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-03-24 HK HK99101230A patent/HK1016218A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-07-17 JP JP2007186200A patent/JP2007259870A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5846546A (en) | Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein immunogenic composition against human immunodeficiency viruses | |
WO1997027311A9 (en) | Mixture of recombinant vaccinia vectors as polyenv vaccines for hiv | |
US7981430B2 (en) | Multi-clade chimeric immunogens derived from highly conserved regions of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) consensus proteome | |
JP2006514549A (ja) | Il−15を発現する組換えワクチンウイルスおよびその使用方法 | |
AU2001259291B2 (en) | Improved immunogenicity using a combination of DNA and vaccinia virus vector vaccines | |
US20090227658A1 (en) | Methods and compositions for immunization against hiv | |
AU2001259291A1 (en) | Improved immunogenicity using a combination of DNA and vaccinia virus vector vaccines | |
US20080306244A1 (en) | Renta: an HIV immunogen and uses thereof | |
US6723558B1 (en) | Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |