BG64711B1 - Смес от рекомбинантни вектори на ваксина като роlyеnv ваксини за нiv - Google Patents

Смес от рекомбинантни вектори на ваксина като роlyеnv ваксини за нiv Download PDF

Info

Publication number
BG64711B1
BG64711B1 BG102712A BG10271298A BG64711B1 BG 64711 B1 BG64711 B1 BG 64711B1 BG 102712 A BG102712 A BG 102712A BG 10271298 A BG10271298 A BG 10271298A BG 64711 B1 BG64711 B1 BG 64711B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
hiv
vaccine
virus
recombinant
polyenv
Prior art date
Application number
BG102712A
Other languages
English (en)
Other versions
BG102712A (bg
Inventor
Julia Hurwitz
Christopher Coleclough
Randall Owens
Karen Slobod
Original Assignee
St.Jude Children's Research Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by St.Jude Children's Research Hospital filed Critical St.Jude Children's Research Hospital
Publication of BG102712A publication Critical patent/BG102712A/bg
Publication of BG64711B1 publication Critical patent/BG64711B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до polyenv-ваксини, които представляват смеси най-малко от 4 до около 10000 различни рекомбинантни вируса, всеки от които експресира различен вариант на HIV env или на част отнего, съдържаща и двете области, константна и променлива, както и до методи за изготвяне и приложението на такива polyenv-ваксинита и вируси, включително приложение на polyenv-ваксина като жива, атенюирана или инактивирана форма за профилактика и лечение на HIV инфекция. Вирусните ваксини са оптимално комбинирани с рекомбинатен HIV env усилвател или с една рекомбинантна ДНК, съдържаща HIV env гена, за иницииране и усилване на ваксината.

Description

Област а техниката
Настоящото изобретение се отнася до polyenv-ваксините срещу вируса на човешки имунодефицит (HIV), които обхващат смес от най-малко 4-40 и до 10,000 рекомбинантни vaccinia вируси, всеки един от които експресира различен вариант на белтъка на обвивката на HIV. Ваксините са подходящи за ваксиниране на бозайници, включително хора, с цел да се получи неочаквано повишен клетъчен и/ или хуморален имунен отговор срещу HIV инфекция. Освен това, изобретението е свързано с методи за конструиране и приложение на такива рекомбинантни vaccinia вируси и polyenv-ваксини.
Предшестващото състояние на техниката
Вирусът на СПИН е вероятно да порази десетки милиони живи същества до 2000 година, съставлявайки световен здравен проблем от първостепенно значение [вж. De Vita, et al., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3rd edition, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992); Wong-Staal, in Virology, pp 1529-1543; and Hirsch, et al., in Virology, pp. 1545-1570]. Дизайнът на една ефективна HIV ваксина представлява особено предизвикателство за имунолозите, тъй като ензимът обратна транскриптаза, участваща при репликацията на HIV, притежава висок порядък на грешка. В резултат на това се получават много мутантни HIV щамове, при които белтъците на обвивката са с вариантни белтъчни последователности. Тези варианти на белтъците на обвивката често се разпознават от имунната система на бозайниците като различни антигени, която произвежда повече от 10’нови лимфоцити на ден с единствената цел да неутрализира чуждите антигени. В- и Т-клетките съставляват, съответно, хуморалните и клетъчните компоненти на имунния отговор.
Добър пример за качествената сила на такива имунни отговори се изявява при HIVинфектирани пациенти и при SIV-инфектирани маймуни. При всеки случай се откриват последователни цикли на инфекция, имунитет и установяване на варианти на HIV или на SIV [Wrin, et al., J. Aquir. Immune Defic. Syndr. 7: 211-219 (1994); Burns and Desrosiers. Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188: 185-219 (1994)]. C всеки цикъл разнообразието от HIV антигенни детерминанти (и съответните имунни отговори) нараства, така че тези имунни отговори неутрализират широк спектър от SIV или HIV варианти и суперинфекцията е потисната в значителна степен.
Пациентите със СПИН обаче развиват нарушение в имунните отговори, които се оказват недостатъчни да предотвратят HIV вирусната инфекция от завладяване на имунната система на пациента. Това може да се дължи отчасти на установяването на HIV варианти, чийто вариантни белтъци на обвивката не се разпознават от имунната система на пациента и така избягват разрушаване (Sci. Amer. Aug. 1995, pp ). В такива случаи, дори ако имунният отговор е способен да предотврати de novo инфекция (например налични мутации на вируса в предпочитани отделени места), HIV инфекцията може в крайна сметка да победи имунния отговор на пациента [Pantaleo et al., Nature 362: 355-358 (1993); Embertson. Et al., Nature, 362:359-362(1993)].
Идентифицирането на В- и Т- клетъчните антигенни детерминанти измежду HIV белтъците остава непълно. Белтъкът на HIV обвивката е охарактеризиран като притежаващ променлива (V1-V5) и константна (С1-С5) области. Един пептид, представителен за областта V3, е наречен основен неутрализиращ детерминант (Principal Neutralizig Determinant PND) [Javaherian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 6768-6772 (1989), въпреки че други области на белтъка на обвивката могат да бъдат включени в предизвикването на имунния отговор. Пълната дължина на белтъка на обвивката от HIV включва около 850 до 900 аминокиселини, с вариации на дължината, дължащи се на хипермутации [Starcich et al., Cell 45:537 (1986)].
Първите ваксини срещу HIV, оценени в клинични изпитания, са били проектирани да представляват единични белтъци на обвивката, или части от тях. Обаче, неутрализиращите отговори срещу един единствен белтък или срещу няколко белтъци на обвивката не разпознават различните изолати от HIV и индивидите на са били защитени от инфекция [Belshe et al., J. Am. Med. Assoc. 272: 431-431 (1994); US 5, 169, 763. WO 1987/006262; Zagury et al., Nature 332: 728-731 (1988); Kieny et al., Int. Conf. AIDS 5:541 (1989); Eichberg, Int. Conf. AIDS 7:88 (1991); Cooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1882-1886 (1993); Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-252 (1992); J. Infect. Dis. 167:533-537 (1993); Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2): S139-143 (1994); Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2): 141-143 (1994): McElrath etal., J. Infect. Dis. 169:41-47 (1994); Fauci, Science 264: 1072-1073 (May 1994)].
В съответствие c това, отдавна съществува належаща нужда да се открият ваксини и методи, които да предизвикват имунен отговор, достатъчно силен, за да лекува или предпазва otHIV инфекции.
Техническа същност на изобретението
Настоящото изобретение е предвидено да превъзмогне едно или повече празни места на свързани техники. По-специално, polyenvваксината на изобретението има предимството, че предизвиква един по-груб имунен отговор. Силата на настоящото изобретение се заключава в неговата мощ да мобилизира В клетките, помощните Т клетки и цитотоксичните компартименти на Т клетките при имунния отговор, с цел да се получи ефективен хуморален и клетъчен имунитет. Например, настоящото изобретение предизвиква голяма широта от активности на HIV-специфичните антитела. Тестове за неутрализация на HIV показват, че получените антитела са с най-високо качество. Изненадващо, изобретението може да генерира имунни отговори срещу “naive” HIV щамове, т.е. HIV щамове, за които съответни белтъци на обвивката не са включени в polyenv коктейла.
За получаване на по-ефективни HIV ваксини, настоящото изобретение предоставя polyenv-ваксини, включващи смеси от наймалко 4 и до около 10,000, за предпочитане от 4 до около 1,000 и най-добре от около 10 до около 100, различни рекомбинантни вируси, всеки от които експресира различен вариант на HIV белтък на обвивката (envelope protein variant - EPV) (или съществена част от него). Всеки вариант включва както константна, така и вариабилна област от белтъка на обвивката. За предпочитане, всеки от експре сираните варианти на белтъка на обвивката притежава структура и/или имуногенност подобна на тази на природния HIV белтък на обвивката, който е налице в една инфектирана клетка или в двойния липиден слой на HIV, така както е в олигомерна форма. Също предоставени са методи за изготвяне и приложение на такива рекомбинантни вируси и polyenv ваксини. При използването им като ваксини, всеки вариант от белтъците на обвивката индуцира преимуществено различен набор от В и/или Т клетки, като всеки набор съответства на различни белтъци на обвивката и следователно, на множествени HI V варианти. Смес от този брой, тип и/или структура на белтъците на обвивката е откритият понастоящем метод за предизвикване на силен и траен HIV-специфичен отговор с широк спектър неутрализираща активност.
В едно предпочитано изпълнение, рекомбинантните вируси са подбрани от едно група, включваща vaccinia, canary pox virus, аденовирус и адено-асоцииран вирус (AAV). В един специфичен пример, вж. по-долу, vaccinia вирусът се използва за изготвяне на polyenv ваксина. В едно предпочитано изпълнение, рекомбинатна ваксина на базата на vaccinia вирус, предмет на изобретението, се въвежда подкожно. Едно по-нататъшно предимство на изобретението е, че подкожното въвеждане на vaccinia вирусът не води до образуване на лезия, като по-този начин се избягва отделянето на инфекциозен vaccinia вирус, което е потенциална заплаха при една имунокомпрометирана популация.
Предпочитателно, една рекомбинантна вирусна polyenv-ваксина, предмет на изобретението, включва лизат от инфектираните с вирус клетъчни култури, например vero клетки. В допълнение към инфекциозния вирус, лизатьт съдържа експресирани варианти на белтъка на обвивката. Включването на лизат от варианти на белтъка на обвивката, който предизвиква имунния отговор, представлява специфична особеност на настоящото изобретение, тъй като обикновено вирусът се пречиства от лизата на клетките, в която се култивира.
При ваксините на изобретението, EV нуклеотид може да бъде изолиран от пациенти, инфектирани с HI V вирус от ограничена географска област, от пациенти, инфектирани с HIV вирус от различни щамове или от лабораторни изолати от HIV.
Авторите на настоящото изобретение са открили , че polyenv-ваксините, предмет на изобретението, предизвикват неочаквано силни имунни отговори чрез експресията и/или наличието на множествени варианти на белтъка на обвивката, всеки един съдържащ константна и променлива области, преимуществено притежаващи структура, съществено подобна на тази на един природен HIV белтък на обвивката. Повишените имунни отговори разпознават и други HIV щамове освен щамовете, които експресират белтъците на обвивката, включени в polyenv ваксината. Така, целта на такава ваксина е да се получат повишени имунни отговори спрямо широк спектър от HI V щамове, които имунни отговори са подходящи за лечение или предпазване от инфекция (или продължаваща инфекция дължаща се на мутации) с различни вирусни щамове.
Настоящото изобретение предоставя също env вариант (EV), т.е. нуклеинова киселина, кодираща (или комплементарна на) наймалко един антигенен детерминант на един вариант белтък на обвивката (Е VP). EVP предпочитателно се кодира от рекомбинантен вирус, както по-нататък е представено в една polyenvваксина, предмет на настоящото изобретение. Вариантът на нуклеинова киселина включва най-малко една мутация, която придава различни антигенни свойства или различна тримерна структура на кодирания EVP.
Настоящото изобретение също предоставя състав на ваксината, който включва polyenvваксината на изобретението и фармацевтично подходящ носител или разредител. В състава на ваксината може освен това да бъде включен един адювант и/или цитокин, който повишава имунния отговор на polyenv-ваксината на най-малко една HIV линия у бозайник, на който е въведен този състав на ваксината. Polyenv-ваксината на настоящото изобретение може да индуцира имунен отговор, включващ най-малко един от хуморалните имунни отговори (напр. антитела) и един клетъчен имунен отговор (напр. активиране на В клетки, помощни Т клетки и цитотоксични Т клетки (CTLs).
Настоящото изобретение предоставя също метод за предизвикване на имунен отговор срещу HIV инфекция у бозайник, който предпазва от HIV инфекция. Методът включва въвеждане у бозайник на една ваксинна комбинация, съдържаща polyenv-ваксина, предмет на изобретението, която предпазва бозайника срещу една клинична HIV-сходна патология предизвикана от заразяване с най-малко един щам
HIV.
Настоящото изобретение предоставя също метод за предизвикване на имунен отговор у бозайник срещу HIV заразяване, с цел терапия на HIV инфекция. Методът включва въвеждане у бозайника на една комбинация, съдържаща инактивирана или атенюирана polyenv-ваксина, предмет на изобретението, която комбинация предизвиква повишен имунен отговор в сравнение с контролите, у бозайник срещу една клинична HIV-сходна вирусна патология предизвикана от заразяване с най-малко един HIV щам.
В едно следващо изпълнение профилактичният или терапевтичният метод за предизвикване на имунен отговор срещу HIV включва въвеждане на ефективно количество от друга (например втора) polyenv-ваксина, съдържаща най-малко от 4 до около 10,000 различни рекомбинантни вируси, при което рекомбинантните вируси са от вид различен от рекомбинантните вируси на предшестващата ваксина и всеки от рекомбинантните вируси в polyenv-ваксината включва вариант на env нуклеотидната последователност, кодиращ различен вариант белтък на обвивката на HIV.
HIV-специфичният имунен отговор генериран с polyenv рекомбинантна вирусна ваксина, предмет на изобретението, може да бъде още повече усилен чрез иницииране или поддържане на хуморалния или клетъчния имунен отговор, или и на двата, чрез въвеждане на ефективно количество на най-малко един рекомбинантен HIV белтък на обвивката или на една ДНК ваксина, или и на двете. Предпочитателно ваксината на база рекомбинантен белтък или кодиращата го ДНК да е също polyenv-ваксина. Всяка една от предложените тук стратегии за ваксина, може да бъде реализирана по който и да е ред. Например, един индивид може да бъде иницииран с една polyenv рекомбинантна вирусна ваксина, последван от реимунизация с ДНК ваксина и с финална реимунизация с рекомбинантна белтъчна ваксина. Предпочитателно, рекомбинантният HIV белтък на обвивката е смесен с адювант. В едно специфично изпълнение, представено по-долу, рекомбинантният HIV env белтък е въвеждан интрамускулно. Предпочита4 телно, една ДНК ваксина е въвеждана с един ген - пушка.
Гореспоменатите методи на изобретението насочват за създаване чрез генно инженерство на нов плазмиден вектор. Така в заключение, настоящото изобретение предоставя един бифункционален плазмид, който може да служи като ДНК ваксина и като рекомбинантен вирусен вектор, който има едно място за хетероложна инсерция, което е под контрола едновременно на последователност контролираща животинска експресия и последователност контролираща вирусната експресия. За предпочитане последователността за контрол на животинската експресия е промотор на цитомегаловирус ранен ген (CMV), а последователността контролираща вирусната експресия е ранен промотор на vaccinia вирус или vaccinia вирус късен промотор или и двете.
Други обекти, аспекти, преимущества, приложения и изпълнения на Настоящото изобретение ще бъдат видни за опитните експериментатори от следващото подробно описание и примери, отнасящи се до настоящото изобретение.
Кратко описание на фигурите
Фигура 1. Схематично представяне на ориентацията на HI V-1 гена в генома на vaccinia вирус. Генът на HIV-1 обвивката е поставен между десния и левия сегменти на локуса на тимидин киназата. Едно Hind III място се намира в С-края на гена за HI V-1 обвивката. Правилната инсерция образува един Hind III фрагмент с големина около 7 kb. ДНК-блот хибридизация с такъв профил потвърди позицията и правилната ориентация на гена на HIV-1 обвивката.
Фигура 2. Графично представяне на данни, показващи, че отговорът на HIV-специфичното антитяло е продължителен в модели от бозайници. Представени са резултати от репрезентативни миши серуми тестирани с ELISA за HIV-специфични антитела. Всяка проба е разреждана 1:100 (плътни стьлбчета), 1:1000 ( защриховани стьлбчета) и 1:10,000 (незапълнени стьлбчета) преди тестиране на HIV-1 покрити ELISA платки. Проби от изследваните мишки са взимани през различни периоди от време (1 месец, 4 месеца и 6 месеца) след инжектирането на 107 pfu от един vaccinia вирус конструкт, експресиращ един белтък на HIV-1 обвивката. Контролната мишка е имунизирана с vaccinia вирус, който не съдържа последователност на обвивката. Линиите върху стьлбчета показват стандартната грешка.
Фигура 3. Графично представяне на данни, показващи как дозата на vaccinia вирус повлиява индукцията на най-малко един имунен отговор, включително продукцията на HIVспецифично антитяло. Представителни проби от миши серум са тестирани с ELISA на HIV покрити платки. Серумни проби са взимани от мишки, инжектирани с 105, 106 и 107 pfu от един vaccinia вирус експресиращ белтък на HIV-1-обвивката. Серумните проби са тестирани приблизително 3 седмици след инжекцията. Всяка проба е разреждана 1:100 (плътни стьлбчета), 1:1000 (защриховани стьлбчета) и 1:10,000 (незапълнени стьлбчета) преди да бъдат тестирани върху HIV-1-покрити ELISA платки. Линиите върху стълбчетата показват стандартната грешка.
Фигура 4. Графично представяне на данни показващи, че смесването на vaccinia вирус конструкти не компрометира образуването на HIV-специфично антитяло у инжектираните бозайници. Репрезентативни проби от миши серум са тестирани с помощта на ELISA около 2 месеца след инжектирането с 107 pfu vaccinia вирус експресиращ белтьк(ци) на HIV-1 обвивката. “Единичен” означава една проба от мишка, която е получила един единствен vaccinia вирус. “Смес” означава проба от мишка, която е получила смес от vaccinia вируси, експресиращи пет различни белтъци на обвивката. Всяка проба е разреждана 1:100 (плътни стьлбчета), 1:1000 (защриховани стьлбчета) и 1:10,000 (незапълнени стьлбчета) преди изпитването върху HIV-1-покрити ELISA платки. Линиите върху стълбчетата представляват стандартната грешка.
Фигура 5. Получаване на оригинална vaccinia вирус рекомбинация чрез заместване на PCR продукти за pEvenv4 ВН 10 последователности. Представен е методът за заместване на последователност. PCR продукти са субституирани за съответни ВН10 env последователности при уникалните рестрикционни места за ΚρηΙ и Bsml. След срязване на плазмида и лигиране с PCR продукти, новите плазмиди са рекомбинирани с див тип VV за създаване VV-експресионни вектори.
Фигура 6. Отговори след имунизация в
Abbott ELISA. Серуми от всичките четири шимпанзета са тестирани с клиничния тест на Abbott (вж. Материали и методи по-долу). Резултатите за всяка серумна проба (Y-oc) са отчетени за всяка тестирана дата (Х-ос). Силни отговори са наблюдавани у шимпанзета, имунизирани със смесена VVenv ваксина.
Фигура 7. Карта на бифункционален плазмид, който може да действува едновременно като ДНК ваксина и като VV вектор за рекомбинация. Наличието на цитомегаловирус ранен (CMV) промотор и vaccinia вирус (VV) ранен и късен промотори, позволява експресия на чуждия ген в клетки на бозайници или във VV инфектирани клетки.
Подробно описание на изобретението
Откриване на неочаквано повишени имунни отговори срещу смесени HIV polyenv ваксини.
Предварителни опити за получаване на ваксини срещу различия щамове от HIV бяха съсредоточени върху една или повече променливи области от gpl20 или gpl60. Очакваше се, че такива променливи области в една ваксина, биха предоставили широка защита срещу HIV инфекция. Обаче такива ваксини не бяха успешни, тъй като индуцираният с ваксината имунен отговор не разпознава много различни линии HIV. Следователно, съществува критична нужда от получаване на ваксини, които предизвикват имунни отговори срещу множество щамове HIV, така че ваксините да са подходящи за лечение и/или предпазване от HIV.
Авторите на настоящото изобретение са открили, че могат да бъдат индуцирани неочаквано повишени първични и усилващи (boosting) имунни отговори срещу няколко или много различни HI V щамове при използуване на polyenvваксини, които включват смес от най-малко 4 и до 1,000 а възможно и до 10,000 рекомбинантни вируси, всеки един от които кодира различен вариант белтък на обвивката (EVP). Ваксината може също да съдържа EVPs експресирани от вирусите, например както се синтезират в клетъчните култури, използвани за получаване на вирус.
Термините “priming” или “primary” и “boost” или “boosting”, използвани тук, се отнасят за началната имунизация, респективно за последващите имунизации, т.е. в съответствие с дефинициите, които тези термини обикновено имат в имунологията.
Нуклеиновата киселина, която кодира EVP (т.е. нуклеиновата киселина за вариант на обвивката (EV)) може да бъде изолирана от човешки индивиди, заразени с HIV от същата или от различна популация (напр. географски различия). Алтернативно, различните EV-нуклеинови киселини могат да бъдат получени от който и да е източник и да бъдат подбрани въз основа на скрининг на последователностите за разлики в кодиращата последователност или чрез определяне in vitro или in vivo с известни методи на различията на предизвиканите хуморални и/или клетъчни имунни отговори спрямо множество HIV щамове.
Началното откритие бе свързано с рекомбинантни vaccinia вирус ваксини. Обаче, както веднага може да бъде преценено от всеки, който е специалист в тази област, който и да е вирус може да бъде използван да експресира polyenv-антигени за ваксина на изобретението. Освен това използването на множество от вирусни ваксини може да избегне анти-вирусни имунни отговори, които могат да намалят ефективността на реимунизацията с вирусната ваксина (поради възможно потенциране на един мощен анти-вирусен отговор).
Както веднага може да бъде оценено от специалиста в тази област, изобретателите освен това са установили, че реимунизацията с рекомбинантни HIV белтък или белтъци на обвивката, за предпочитане с белтъци, потенцират допълнително методите за имунизация на изобретението. HIV белтъкът или белтъците на изобретението могат да съответствуват на HI V белтъците експресирани в polyenv-ваксината, или те могат да бъдат различни HIV белтъци на обвивката.
Подобно на това, както може да бъде оценено от специалиста, методите за имунизация на представеното изобретение са подсилени с използване на ДНК ваксина. ДНК ваксината може да се използува за реимунизация, напр. както бе описано по-горе за рекомбинантните HIV белтъци. Алтернативно, ДНК ваксината може да бъде използувана за първична имунизация, а рекомбинантната вирусна ваксина или ваксини да бъдат използвани за засилване на анти-HIV имунния отговор. Така както е с рекомбинантната envбелтък-ваксина за реимунизация, ДНК вакси6 ната може да съдържа един или повече вектори за експресия на един или повече HIV-envгени. В допълнение, HIV env гените биха могли да съответстват на гените, експресирани от рекомбинантната вирус ваксина, или могат да бъдат различни. В едно предпочитано изпълнение, векторите са конструирани като част от една ДНК ваксина за експресия в рекомбинантната вирус ваксина у трансфектирани клетки от бозайници.
Установено е, че този имунен отговор (хуморален и/или клетъчен) е ефективен за един по-широк спектър от щамове на един инфекциозен вирус, като HIV, и не се ограничава до вирусните щамове, експресиращи специфичните варианти белтък на обвивката (EVPs), предоставени от polyenv-ваксината. По такъв начин настоящото изобретение предоставя множествени EVPs, кодирани от една рекомбинантна вирусна ваксина, която дава неочаквано повишени имунни отговори срещу множество щамове HIV.
Polyenv-ваксини и ваксинация
Настоящото изобретение предоставя, в един аспект, polyenv-ваксини, като използва смеси от най-малко 4 и до 10,000 различни рекомбинантни vaccinia вируси, като всеки експресира различен вариант белтък на обвивката или една антигенна част от него. Както веднага ще бъде оценено от специалиста в тази област, могат да бъдат използвани от 4 до около 1000, или за предпочитане от около 10 до около 100 различни рекомбинантни вируси. Специалистът с обща подготовка в тази област може да прецени, че други вируси могат да бъдат използвани за ваксини. Примери за подходящи вируси, които могат да действуват като рекомбинантни вирусни гостоприемници за ваксини, освен vaccinia, включват canarypox, аденовирус, и аденосвързан вирус. Предоставени са също методи за изготвяне и приложение на такива polyenv-ваксини.
Една polyenv-ваксина на настоящото изобретение индуцира най-малко един хуморален и един клетъчен имунен отговор у бозайник, на когото е въведена polyenv-ваксина, но отговорът срещу ваксината е субклиничен или е ефективен за повишаване на поне един имунен отговор срещу най-малко един щам HIV, така че въвеждането на ваксината е подходящо за целите на ваксинацията.
Вирусни ваксини.
Различни, получени с генно инженерство вирусни гостоприемници (“рекомбинантни вируси”), могат да бъдат използвани за получаване на polyenv вирусни ваксини за въвеждане на HIV polyenv антигени. Вирусните ваксини са с особено предимство, тъй като компонентът на вирусната инфекция стимулира мощен имунен отговор, който прицелно активира В лимфоцити, помощни Т лимфоцити и цитотоксични Т лимфоцити. Многобройни вирусни видове могат да бъдат използвани като рекомбинантен вирусен гостоприемник за конструиране на ваксините на изобретението. Предпочитан рекомбинантен вирус за вирусна ваксина е vaccinia вирус [International Patent Publication WO 1987/006262, October 22, 1987, by Moss et al.; Cooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1882-6 (1993); Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-52 (1992; McElrath et al., J. Infect. Dis. 169:41-7 (1994)]. В друго изпълнение, може да бъде използван рекомбинантен canarypox [Pialoux et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 11:373-81 (1995), erratum in AIDS Res. Hum. Retroviruses 11:875 (1995); Andersson et al., J. Infect. Dis. 174:977-85 (1996); Fries et al., Vaccine 14: 428-34 (1996); Gonczol etal., Vaccine 13: 1080-5 (1995)]. Друга алтернатива е дефектен аденовирус или аденовирус [Gilardi-Hebenstreit et al., J. Gen Virol. 71:2425-31 (1990); Prevec et al., J. Infect. Dis. 161: 27-30 (1990); Lubeck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6763-7 (1989); Xiang et al., Virology 219:220-7 (1996)]. Други подходящ вирусни вектори включват ретровируси, които са пакетирани в клетки с амфотропен спектър на приемник [вж. Miller, Human Gene Ther. 1:5-14 (1990); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, § 9] и атенюиран или дефектен ДНК вирус, като, но не ограничаващ се до herpes simplex вирус (HSV) [вж. напр. Kalitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2:320-330 (1991)], papillomavirus, Epstein Barr вирус (EBV), аденосвързан вирус (AAV) [вж. напр. Samulski et al., J. Virol. 61:3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989)] и подобни на тях.
ДНК ваксини.
Една алтернатива на традиционната ваксина, съдържаща антиген и адювант, е директното въвеждане in vivo на ДНК кодираща антигена в тъканите на индивида, в резултат на което антигенът се експресира от клетките на тъканта на приемника. Такива ваксини тук са наречени “ДНК ваксини” или “ваксини на базата на нуклеинова киселина”. ДНК ваксините са описани във WO 1995/020660 и WO 1993/ 019183. Способността на директно инжектира- 5 ната ДНК, кодираща вирусен белтък да предизвика протективен имунен отговор, е демонстрирана в много експериментални системи [Conry et al., Cancer Res., 54:1164-1168 (1994); Cox et al., Virol., 67:5664-5667 (993); Davis et 10 al., Hum. Mole. Genet., 2:1847-1851 (1993); Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:98669870 (1994); Montgomery et al., 12: 777-783 (1993); Ulmer et al., Science, 259: 1745-1749 (1993); Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15 90:4156-4160 (1993); Xiang et al., Virology, 199:132-140 (1994)]. Проучвания за оценка на тази стратегия при неутрализация на инфлуенца вирус са използвали и двата вида вирусни белтъци - на обвивката и вътрешни вирусни 20 белтъци за индуциране продукция на антитела. По-специално проучванията са били фокусирани върху вирусен хемаглутинин (НА) [Fynan et al., DNA Cell. Biol., 12:785-789 (1993A);
Fynan et al., Proc. Natl Acad. Sci., 90 : 11478- 25 11482 (1993B); Robinson et al., Vaccine, 11:957 (1993); Webster et al., Vaccine, 12:1495-1498 (1994)].
Ваксинацията чрез директно въвеждане на ДНК, кодираща HIV-env-белтък , за да пре- 30 дизвика протективен имунен отговор, продуцира и двата - клетъчно-медииран и хуморален отговори. Това е аналогично на резултатите, получени с живи вируси [Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91:9519-9523 (1994); Ulmer, 1993, 35 no-rope; Wang, 1993, no-rope; Xiang, 1994, supra]. Изследвания c порове показват, че ДНК ваксини срещу консервативни вътрешни вирусни белтъци на инфлуенцата, заедно с повърхностни гликопротеини, са по-ефективни 40 срещу антигенни варианти на вируса на инфлуенцата, отколкото инактивираната или субвирусната ваксини [Donnelly et al., Nat. Medicine, 6 : 583-587 (1995)]. И наистина, представени са данни за мишки, които показват възпроиз- 45 водими имунни отговори срещу кодиран от ДНК нуклеопротеин, които се запазват обикновено през целия живот [Yankauckas et al., DNA Cell Biol., 12:771-776 (1993)].
Както е известно, голям брой фактори 50 могат да повлияват ефективността на експресията на антигенни гени и/или имуногенността на ДНК ваксините. Примери за такива фактори включват репродуцируемостта на инокулацията, конструкцията на плазмидния вектор, подбора на промотора, използуван за насочване на антигенната генна експресия и стабилността на вмъкнатия в плазмида ген. В зависимост от техният произход, промоторите се различават по тъканна специфичност и ефективност за иницииране синтез на мРНК [Xiang et al., Virology, 209 : 564-579 (1994); Chapman et al., Nucleic Acids Res., 19: 3979-3986 (1991)]. Понастоящем, повечето ДНК ваксини в системи на бозайници, се основават на вирусни промотори, произхождащи от цитомегаловирус (CMV). Тези ваксини са имали добра ефективност при мускулно и подкожно инокулиране редица животински видове. Друг фактор, който е известно, че повлиява имунния отговор предизвикан с ДНК имунизация, е методът за внасяне на ДНК. Парентералните пътища могат да дадат ниски нива на генен пренос и значителна вариабилност на генната експресия [Montgomery, 1993, по-горе]. Високоскоростно инокулиране на плазмиди чрез микропрожектили с използването на “геннапушка”, повишава имунните отговори у мишки [Fynan, 1993В, по-горе; Eisenbraun et al., DNA Cell Biol., 12:791-797 (1993)], вероятно поради по-голямата ефективност на ДНК трансфекцията и по-ефективното антигенно представяне в дендритните клетки. Вектори, съдържащи нуклеиновата киселина - ваксина на изобретението, би могло да бъдат въведени в желан гостоприемник и чрез други известни методи, напр. трансфекция, електропорация, микроинжектиране, трансдукция, клетъчно сливане, ендоцитоза чрез DEAE декстран, или копреципитация с калциев фосфат, липофекция (чрез сливане с липозоми) или с друг ДНК вектор преносител [вж. напр. Wu et al., J. Biol. Chem., 267: 963-967 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988); Hartmut et al., Canadian Patent Application No. 2,012,311, filed March, 1990].
Бифункционални плазмиди за вирусни и ДНК ваксини.
Един предпочитан аспект на настоящото изобретение се отнася до инженерно създаване на бифункционални плазмиди, които могат да служат като ДНК-ваксина и рекомбинантен вирусен вектор. Директното инжектиране на пречистена плазмидна ДНК, т.е. ка то ДНК-ваксина, ще предизвика имунен отговор в тестираните индивиди срещу антигена експресиран от плазмида. Плазмидът би бил полезен също в живи, рекомбинантни вируси като имунизационен вехикулум.
Бифункционалният плазмид на изобретението предоставя хетероложен ген или едно място за инсерция на хетероложен ген, под контрола на две различни контролиращи експресията последователности: една животинска контролираща експресията последователност и една вирусна контролираща експресията последователност. Терминът “под контрол” се използва в обикновения смисъл, т.е. оперативен или оперативно свързан, в смисъл че последователността контролираща експресията, например един промотор, се предоставя за експресия на един хетероложен ген. В едно предпочитано изпълнение, контролиращата експресията последователност на животното е един животински промотор (промотори от птици също са предвидени от настоящото изобретение); в едно специфично изпълнение, промоторът е ранен цитомегаловирус (CMV) промотор (вж. фигура 7). В едно следващо специфично изпълнение, вирусният промотор е един vaccinia вирус ранен промотор, или един vaccinia вирус късен промотор, или предпочитателно и двата (фигура 7). Индивиди могат да бъдат ваксинираш по една мултиподредена схема, с бифункционалният плазмид въведен като ДНК и по различно време, но в някакъв определен ред, като рекомбинантна вирусна ваксина. Изобретението предвижда еднократно или многократни въвеждания на бифункционалния плазмид като ДНК ваксина или като рекомбинантна вирусна ваксина, или и двете. Тази схема за ваксиниране трябва да бъде планирана с въвеждане на рекомбинантни белтъчни ваксини (по-долу) или би могла да се прилага с допълнителни вехикулуми за ваксина.
Всеки специалист с обща подготовка в тази област може да прецени, че бифункционалните плазмиди на изобретението, могат да бъдат използувани като вектори за polyenvваксина. Това може да стане чрез инсерция на най-малко 4 до около 10,000, за предпочитане 4 до 1000 и най-предпочитателно 10 до 100, различни HIV env гени в бифункционални плазмиди , като по този начин се изготвя съответен набор от бифункционални плазмиди, които се използуват като polyenv-ваксина.
Рекомбинантни белтъчни ваксини.
Активен имунитет чрез ваксиниране с един или с повече HIV-env белтъци, съгласно настоящото изобретение, може да инициира или да усили (чрез реимунизация) клетъчен или хуморален имунен отговор. HIV-env белтъкът или белтъците, или антигенните фрагменти от тях, могат да бъдат смесени с адювант за изготвяне на ваксина.
Терминът “адювант” означава вещество или смес, която повишава имунния отговор срещу антигена. Адювантьт може да функционира като тьканно депо, което бавно освобождава антигена и също като активатор на лимфоидната система, който неспецифично повишава имунния отговор (Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/ Cummings: Menlo Park, California, p.384). Често, един първичен сигнал само с един антиген, в отсъствие на адювант, може да не предизвика хуморален или клетъчен имунен отговор. Адювантите включват, но не се ограничават до пълен адювант на Freund, непълен адювант на Freund, сапонин, минерални телове като алуминиев хидроокис, повърхностно активни вещества като лизолецитин, плуронови полиоли, полианиони, пептиди, масло или въглеводородни емулсии, хемоцианини, динитрофенол и прилагани при човешки индивиди адюванти като BCG (Bacille Calmette-Guerin) и Corynebacterium parvum. Изборът на адювант зависи от индивида, който ще бъде ваксиниран. Предпочитателно се използува фармацевтично приемлив адювант. Например, ваксина за човешки индивид, трябва да избягва масло или въглеводородни емулсии като адюванти, включително пълен и непълен адювант на Freund. Един пример на подходящ за човешки индивиди адювант е стипцата (алуминиев гел). В едно специфично изпълнение, по-долу, рекомбинантен HIV-env-белтьк е въвеждан интрамускулно в стипца. Алтернативно, рекомбинантната HIV env белтък ваксина, може да бъде въвеждана подкожно, интрадермално, интраперитонеално или по други пътища, подходящи за въвеждане на ваксина.
Въвеждане на ваксина.
Съгласно изобретението, имунизацията срещу HIV може да бъде изпълнена само с рекомбинантна вирусна ваксина на изобретението или в комбинация с ДНК ваксина, или една рекомбинатна белтъчна ваксина, или и с двете. В едно специфично изпълнение, рекомбинантният HI V-env-белтък в стипца се предоставя интрамускулно за засилване на имунния отговор.
Всяка доза вирусна ваксина може да съдържа 4 до 10,000, за предпочитане 4 до 1000 и най-предпочитателно 10 до 100, различни рекомбинантни вируси, всеки един експресиращ различен HIV env ген. Алтернативно, вирусите в следващи ваксини могат да експресират различни HIV env гени. В друго изпълнение, последващите polyenv вирусни ваксини могат да имат някои общи вируси с предхождащата ваксина и други, които са различни. Например началната ваксина може да съдържа vaccinia вируси, експресиращи HIV env белтъци, условно означени 1-10. Втора усилваща ваксина може да съдържа vaccinia (или предпочитателно един различен вирус, като например canarypox или аденовирус) вируси, които експресират HIV env белтъци 6-15 или 11-20 и т.н.
Една ДНК ваксина или рекомбинантен белтък-ваксина може да има един HI V-env белтъчен антиген или множество антигени. За предпочитане, една ДНК ваксина или рекомбинантен белтък ваксина за приложение на изобретението, включва повече от един HIV env белтъчен антиген. При следващите вирусни ваксини, HIV-env белтък или белтък на една ДНК ваксина, или рекомбинантен белтък ваксина, може да отговаря на един HIV env белтък, експресиран в polyenv вирусната ваксина, или той може да бъде различен от който и да е от polyenv env белтъците.
Едно предпочитано изпълнение на изобретението предвижда създаване на възможно най-голямо разнообразие при всеки ваксинационен протокол. По този начин реципиентът се излага на най-голям брой HIV env белтъци и така се предоставя най-голяма възможност за неутрализиране на кръстосаната реактивност с един наивен HIV изолат.
Варианти на белтъка на обвивката
Както беше отбелязано по-горе, един EVP, използван за ваксини на изобретението, може да бъде получен от географски ограничени изолати, или популации, или от географски различни изолати, т.е. различни популации. Както може да бъде преценено от специалиста в тази област, получаването на env нуклеотидни последователности (т.е. гени) от естествени изолати има множество предимства: изолатите са лесно достъпни. EVPs съответстват на естествено срещащите се белтъци, спрямо които е желания имунитет, и мутации на HI V могат бързо да бъдат доловени от новите изолати.
Един EPV включва също полипетиди, които имат имуногенна активност, обусловена аминокиселинната последователност на една EVP представена с най-малко един епитоп или антигенен детерминант. Тази аминокиселинна последователност по същество съответствува на най-малко един 10-900 аминокиселинен фрагмент и/или консензус последователност на един известен HIV EVP. Такъв EVP може да притежава като цяло най-малко 50% хомология или идентичност спрямо една известна аминокиселинна последователност на белтъка на обвивката, като на места достига 50-99% хомология или какъвто и да е друг порядък или стойност, като предизвиква имуногенен отговор срещу поне един щам на HIV.
Процентът хомология може да бъде определен, например, чрез сравнение информацията на последователността с помощта на GAP компютърна програма, версия 6.0, която е на разположение от University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Програмата (GAP използува метода на разпределение на Needleman and Wunsch [J. Mol. Biol. 48 :443 (1970)], ревизиран от Smith and Waterman [Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]. Накратко, GAP програмата определя сходството като брой на разпределени символи (напр. нуклеотиди или аминокиселини), които са подобни, разделени на общия брой символи в покъсата от двете последователности. Предпочитаните неизпълнени параметри на (GAP програмата включват: (1) единна матрица за сравнение (със стойност 1 за тъждественост и 0 за нетьждественост) и матрица за сравнение на Gribskov and Burgess, Nucleic Acids Res., 14:6745 (1986), както е описано от Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Founfation, Washington, DC (1979), pp.353358; (2) наказателна стойност от 3.0 за всеки нехомоложен участък и допълнително 0.10 наказания за всеки символ в такъв участък ; и (3) без наказание за всички крайни несъответствия.
В едно предпочитано изпълнение, EVP на Настоящото изобретение е една вариантна форма на най-малко един HIV белтък на обвивката. За предпочитане, EVP включва gpl20 и олигомеризиращия домен на gp41, както gp 140 [Hallenberger, et al., Virology 193:510514(1993)].
Известните HIV белтъци на обвивката съдържат около 750 до 900 аминокиселини. Примери за такива последователности са търговско и индустриално достъпни от HIV-последователности база-данни, като GENEBANK, или от публикувани сводки, като Myers et al., eds., Human Retroviruses and AIDS, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Vol. I and II, Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, NM (1993). Заместване или инсерция в един EVP с цел да се получи допълнителен EVP, кодиран от една нуклеинова киселина, с цел да се използува в един рекомбинантен вирус или polyenv-ваксина, предмет на настоящото изобретение, може да включва замествания или инсерция на наймалко един аминокиселинен остатък (напр. 125 аминокиселини). Алтернативно, най-малко една аминокиселина (напр. 1-25 аминокиселини) може да бъде делетирана от EVP последователност. За предпочитане, такива замествания, инсерции или делеции се разпознават въз основа определяне последователността на белтъците на обвивката, чрез секвениране на наймалко една EVP кодираща нуклеинова киселина от даден индивид, инфектиран с HIV.
Неограничаващи примери за такива замествания, инсерции или делеции предпочитателно са реализирани чрез амплифициране на последователностите на env-ДНК или РНК от HIV-1 инфектирани пациенти. Това може да бъде установено с рутинни експерименти при се получават модифицирани структурни и функционални свойства на белтък на обвивката или EVP. Така получените EVP предпочитателно имат различни антигенни свойства от тези на оригиналния EVP. Такива антигенни разлики могат да бъдат установени чрез подходящи тестове, напр. с ELISA-теста, проведен с набор от моноклонални антитела специфични за белтъците на HIV обвивката.
Може да бъде използвано всякакво заместване, инсерция или делеция, докато полученият EVP белтък предизвика образуване на антитела, които се свързват с белтъци на HIV обвивката; характерът на антителата от този EVP е различен в сравнение с антителата предизвикани от един втори EVP. Всяко от горните замествания, инсерции или делеции може също да включва модифицирана или необикновена аминокиселина, напр. както е предоставено в 37 C.F.R. § 1.822(р)(2).
Следващата таблица 1 представя неограничаващи примери на алтернативни варианти на белтъците на обвивката на HIV, които могат да бъдат кодирани от рекомбинантни вируси на настоящото изобретение.
o r> E- Μ Σ >*
04 0 >< - См
co 3 ο r· M
r* a Ьй Σ
\o x Е“
Ul o
V X ι-ч
rn X id ο w СЛ
CN x u bd
i r4 J X X cn
η X m 20i X ζ υ cd a
O σι o Λ ζ Cd X
X S co υ > X a
r* ζ ω
«0 u> s cd o E-
ce X in o X χ o ω
« <3* w Ε- ИЧ Σ X
X 8- m ω Ο Σ
co a · T CN Σ 5- X
§ > 4
3E s o r4 a X См k4
s o\ Σ
CD 4
r* > Σ
ID b
Ш bd
o
m ω SZ
CN
r4 ω
гЧ
o Ю E-· Cd > Ζ 4
σι <
CD Cd Q
r* X Cd X
ID X
in > Ι-Ч
x* a
**l > Η
<N 0
гЧ > ω 4
os >·
04 >
CO
r· > 4
ID X ><
in Д
N· X ο Ω Ζ
m Cd ω Ο Q >
CN Ь > 4 Μ X
*H 4 > Ο 1-4 Ζ
o χτ
04 w
CD и ω U
r· Μ Ε- α» Q
ID Σ Μ Η Ο.
in ►J Μ Σ Ь
x* Ο X Μ U 4
m J Ь. 4 Σ Μ
CN 1-4 Σ 4 Ε-
Ή Σ J 4 ►4
гЧ Γ*4
Ο 04 o.
04 Q z 0
CD Ь
Γ* a
Ю >
ιη u
ХГ 4
m X >< o
CN w X
гЧ 4
Ο 00 X u
04 > Ж
CD z X
r· X
ID > 4 a a X
in ω
XT ь « 4 X β.
m Q Cd M 4 Cd
CN >« X ь
r4 4 E-< w ►J
ο Γ* id X Z
04 4 «
CD Q Cd
r> Cd
ID A
Ш U
x? b.
m ►J
CN E-· >
*4 E-i a
r4 Ό
ο гч г-4 M
04 ИЧ >
03 Q
С* Cd b
Ό X o
Ш Σ
Ν* O
?*ι Cd Q z
η >
•Η Σ H
οττ Q z co X
04 Z
00 2 X b
Γ* X
40 Σ Ь4
1П Z Q
Ν* Cx
m z bl a Q =
CN Cd 0 Q
гЧ E-
Ο ο >
04 z co
CO > 0 Cd
Г- u X
u> > kJ X a w
in > J Σ bd
*· Cd
m O X Ot X
CN Qi
гЧ 2 Q co E->
r4 04
o in rH z Cd E- k4 <0
04 b CO Σ
CO Q < 0
Γ* Z E->
io 2 E-> 0 a kJ
in kJ > X X b.
o X z o 2
m b 2 h4 •T· 0
CM u
H 2 z a co M
o N* r4 u Σ ·.
04 w z o
co > \
r- u >
40 ►J U
in & ►J
N* ь
t*4 J Σ
CN a > o>
r4 > Cd
1 οετ 1 u
04 x
CO a
Г* j
40 Ul
in o Cd
N· Q bl
Г4 X
CN kJ
r4 co z
121
o 0 гЧ co 0 Z кЧ ω
04 b 2 Od
CO co ь
Г* k4 > o Σ E-
40 z 2 X O
in tu X
4· co a b ω
m u
CM z 2
•H 2 H X o
o r* r4 k4 Σ > X
04 Cd 2 0 X ►J
CO 0 Cd < w 2
P* Cd Ci a 0 Z
40 Cd Q o
in Σ M E-· )-4 >
N* H Cd 2
f*4 z OC ω > b
CN at 2 2 X ©
r4 O X CO o
o 40 X Z H co a
04 Ul 2 E-
CO Ul E-> > 0
Г* co H Z
<o E-
IT 2
- iX CO
1*4 z co
CN co 2 Cd
r4 E- Z Ь4
151
Ο 04 Q < сл
оч Ζ Q Е- СЛ
ο X
0· Оа
40 СЛ 2
1Л а ич
<Γ Ζ Q
m о сл
04 X Q Z □
гЧ Q X о X 2
ο ο сч к > а
СЛ X О X ω 2
00 н > < Σ и
Γ* ич > U
4Ο О
in X в CU сл
Ч* X 2 а в >
m >· Cd X Ζ
сч X J
*ч X J >« Е- =
с σ> с И в
ш 2 си W х
ω η а > О
г* X о х В
40 о X X ω
1Л > ИЧ Σ X о
•ч* X X О и
Г*) U Q 2
СЧ х О X СЛ г·
•Ч ич J > а
гЧ со гЧ
о Ч· сч ω СХ а
<л Ьц
00 V) в
0* > ИЧ в
40 X
1Л X сл
Ч* и
<*» <
СЧ О
гЧ В X
230 ИЧ > j »
<л > в ft ИЧ
00 <л в S
г- в Dd сл
40 2 СЛ Q
1Л υ
ч· W X 2 в
ω в ИЧ
сч •Л ИЧ
гЧ в ас ИЧ X Σ
| 220 | Ьц X >
ch 3 2
co X в X о
г* >«
40 И 2
сл в <
ч· 2 ИЧ
m в 2
сч в сл
гЧ в сл сл
гЧ сЧ СЧ
о Р* сч 2
σ\ в X X И а:
00 и
г* X а ОТ в ИЧ
W сз х
1Л в X сл
Ч о
m 2 сл и'
сч X
гЧ в X X υ о
| 260 ; X < X X в
сл Ζ Q со
00 2 X X
г* и
40 X
1Л J X
ч· ич Σ J
<*) < >
сч X ><
гЧ и
1 250 1 В
сл Di е
00 в
0· и
40 >« X X
1Л X
ч· ►ч Σ
η CU X
сч нч
Ой
•Ч ч· сч
Ο ο m > X at M Σ o n m z M X в Ο ο 10 m rt
σ\ > 1-4 Q o 01 z co rt ω X 01 o X J oi >
«0 Μ <5 at X a co 0« M CD at 0
Γ* Η 0 x X r> ot r* X w u co B
10 Η X ct 10 B H ω X 10 Z Q z B k4
Ш rt co in U >< in 0 co rt fc z
чГ >4 4f Z > B Σ ЧГ u M at > rt
ΓΠ ω Π M > co 1-4 X co’ © >
CN 0 CN ω rt O > в CN X at a Q rt
гЧ ζ r4 > ьч 4 гЧ © at X Q u
ο σι <Ν ►4 H CO 1 320 i u> a, B ο in <*ι Ж B Ct ►4 X
m 01 O M rt α у 01 B rt > at z
co Φ Z x h Ф > X в h H
г* ο X Γ* J Г* fc« H z > B
U> Η 10 o X в 10 rt > B CO z
ω СЛ B Ш > rt tn at o X X
чГ > ЧГ M j > 0 X at X
η > H B m ИЧ X m fc fc co »4
(Ν 0« CN B M z > CN © rt
^4 ct X co H bt X Q r4 a CO
ο 00 CN Μ 1 3101 < > B ο им ο 4^ m o X cu B
σι ο 01 z co 0 01 M a Σ ►4 co
φ χ Ф Q z M CO X X
Γ* в r- B (0 Σ < J Г* Ct в B X ft
10 υ 10 b. H U cu X io 1-4
ιη ο B X in Z Q tn co Qi z B ©
ЧГ > « rt Q ω co X -< X at 0 CX
ΓΗ в co > r*l co 0 rt > m at Z co a< >
CN co в (N a Σ CN > X tn k4
cH > h-t r4 B-i J > Σ нЧ Z B B co
rH r~ r4 o *4 m
|c m n
1 3901 > Ε- Σ 420 1 ο o z x Si 450 1 at X
σι E- сл σι Е- сл at σι O
co x o X co сл H < CD a. Of ω Ω
r* z r* ζ Ω r* Ω X кЧ
id z a ID и ID Еч Η > X
1П o X ο tn > in кЧ Ω >
5У tt > Ω СЛ чу tt чу Еч Ζ tt Ω сл
m o tt X X *4 tt k4 m Ω ζ ο И X
ГЧ ω Si < > Q ГЧ ω Ω ГЧ W ζ ω a X
•Ч tt X Of C5 k-Ч »ч ο гЧ O ω at W
ο ® m J >4 1 J101 ο tt > ω o чУ M X ο ο
σι hi сл a X M σι υ > 91 Еч Σ ο Ζ ο
co US X Е- bl tt co ζ M * CO Z σ Ω W Η
r* Ω > «< Γ* ь. ω Г* z W Ο Еч Ω
<£> M > Ω E- ю ω z E- Σ X \0 сл ζ Ω Ο Ω
Ш o o X tt Ω in X >4 Ω in <3 ζ X U Σ
X ω οι ω z чу Ε- Σ ω X чУ X Μ Η Еч
m J k4 > m > E- w m b 14 α. Ζ Ο
ГЧ Еч > < кЧ сч »4 > СЧ сл ο Ω X
r-4 z < X tt Q »ч ω гЧ z Ω X Σ
1 370 z X w ω tt o o чУ tt Ω k4 > a o m чУ b X 0 W
01 z σι Ω σι сл ζ > Ω
CD X ο Q z < co Ο U co ζ Ω
Г* ω f- at co c*· Ο O r* b. at Ζ сл 0
IO tt ο X W < 10 сл Ю ζ >ч υ X
in сл z in сл X a. o Η in Еч кЧ
Ω > чУ Of X сл tt z M* сл ζ Еч ο
ΓΊ z X m X z b < сл m Ζ сл Ω Ε-
ГЧ o ГЧ tt CD J ГЧ fa. Ω
^4 X >4 гЧ k-4 > z < tt *4 Ω Σ »4
r4 Ю r4 σι m 421
Ο co XJ· b<
04 z
ω cn
Γ* w M M > H
40 U fa
Ш OS CO iZ E-
’Г bi u
η o > ω i- u
см □ a
•-4 w o o fa ω
ο Γ* xf M fa ь
σι De
co fa u
r* < a
co ><
in σ ь ►j H
N* rt <n
m X o at
CM o a
> E- rt
ο 4> ω a a fa >
σι o rt
co 3
r* Σ bl fa co u
10 Z a fa
in bl >
№ M fa
f*l o ω
CN
*4 M
4S1
o ^4 in z b<
σι Q z
co fa fa
Σ bl
10 Q z ω
in 0
XT 0
i*l 0 rt > bi
CM fa ►J
r4 & cn
500 Cu bi j
σι bi > H
00 ω > 4 J
r* cn e- M z H
10 ω Q 0 a: b
in z cn rt X
xj· z b cn rt fa
n и o fa E-< Q
CM z Q w 0 ω
r4 rt H M O 0
| 490 o >
σι σ cn
co a
t** PC cn
co H > ω
in J
Ν» u bi
m j E- bi
CN o
^4 ь
r4 CO Ν»
o XJ* in a
σι o u rt 3 X
co > Σ M
r* > bi
10 tf fa X
in ai
XT fa fa cn rt
m rt cn Oi Σ bi
CM fa fa
r4 b «
1 530 04
σι rt
co > M
r- 0 0
10 J bl fa
in щ J ь
bl fa
m b< >
CM fa fa H a M
r4 > bi
1 5201 > Q
σι fa
φ ><
r* fa Z
10 >9 fa
in u
N· ω fa
<*> cn Z
CN fa bi
r4 3 fa
511
Ο kA u > o o 10 o ω DA o m 10 0 3
σι B <=s σι 4 σι X 4
co Σ 4 M > B co >4 Σ co M Cu Σ Z 4
r* co < o< r· X O r· 0 M X co Z
10 << > at 0 B 10 o 10 u Σ
IA LA o LA >4 Pi M
0 <c V < 0 V Of a X
m Σ ω x Q o m O' •
CM B CM CM o ω Z
rd CO H rM X Pi Of .O
ο 10 LA 0 co 1 5901 DA Σ X . O CM 10 a F4
σι σι >4 σι в X >4
co co \ t co at B CO
r* 0 co Γ* Z C* u
10 4 10 z co Q 10 > 4 Ж
LA u. > LA σ LA
0 o Tf 4 Of
m 4 >-4 cu m o X r*i Ж > 4
CM U. CO >4 M CM > CM o:
r*4 4 Σ > ω M r-L M rM < 4 B
oss ’ 1 < > Σ o co LA 0 Q o rM 10 o a
σι 0 σι co X σι 4
CD M > 4 Σ co 4 Σ co Of
r* ω w B >4 r* >4 > r* X DA
10 o b. > 10 O X 4 X co 10 Ж >
LA > M < LA X X in 0
V < Ό· < B 04 >4 m· X
m ai <*1 o CA a m > K
CM x ω CM > 0 CM B co
ω X. o r-4 B < r-4 4
H Л· LA 571 rM o 10
Ο ΚΟ ΚΟ ь Σ
σκ Σ Е- a ζ
аз Ζ X ζ Η
г* Ζ Q 0 ο ζ
KO ζ
Ш 1-4 Ь
ч· ο Q Σ СЛ
m ω Q Ζ СЛ
гч A Σ α >
r-1 co Η ζ 0
0S9 1 χ at ><
σι ζ
ш co и и
Γ* ζ
KO сл Е- <
in < CO ω ζ
ЧГ ζ
ζ
<*Ч CU X
сЧ >
Ο V KO- < Е- ζ ь W
σι Η
co Ε-> CU ><
г* υ
κο Μ >
in A Е-· ζ Η <
X at
0
<ч СЛ X
^4 Q Ой
r4 ш
ο σκ κο ω ΟΙ >
σ\ ζ
α> X Μ Ct oi
Γ* Μ 0 Q
κο ο
ιη ο
ХГ ζ Ж Е- Q >
m ο
СЧ <0
r4 ω α 0« Z
ο CD ΚΟ Μ Ε- σ 1
m Μ A
co A Μ 4з ι
Γ* С0 Ε- ζ
κο ζ >< ь.
tn Μ
A Ь Μ > M
ΓΊ ω Ζ 0 Q x
ГЧ Ε- ω
γ4 > Μ
Ο Γ* κο Ζ и X
σι Ζ Q ω <0
co 1-4 >
Γ* ω A ζ O
κο Oi X Ct
ιη ο ω
*· ζ
m ω ο» χ
ГЧ Σ A ►ч Ct
γ4 Ζ
ι-4 κο ΚΟ
o CM Σ ►4
Ol »4 >
CD b>
r* A M
κο X ot
in H
ЧГ >< <0
m z •
CM A
r4 Z
o гЧ r* z o X
σι E-· co
co H
r- z co 0 Q
KO t*4 co >« A
tn z
z co
m z
CM A
r4 ω z 0
o o r* μ X
σκ z
CD X M ω O
r* Q z
KO A
tn ω © X а
M· A
m A
CM ω □ < X
r*4 o A at X
r4 04 Ш
Ο 1Л r* u, u
σ\ cn
CD u
r* a
ID ω o
in
N* 0
m O <
CN as co z
r4 > ft. M
1 7,0 at CO z
σι z Ьй at
co > M
r· > M J
<0 cn o z
in J ft.
n· > Ж
< co E- H
CN X
r4 > H4
ο m r* Hf >
σι at
co ►3 >
r* 0
ID > M
tn u M
Ν' o <
m 0 «:
CN >
•4 M > <
721
o CD r* at и ο Ο* <
σι Ж > ο Ζ cn
co CO 3
r* a ti ο ЙЙ
ID Q 0 α< CO
in a
Ν' a 0
n at £> ο ω
CN ω Ω
r-4 e>
1.. ...”» 0 ,
σι ω σ •
co ω Ό
Γ* Η Q
4> Μ Ε-
m ο Di »
Ν' ω Q ο
«*> a Ω a
CN at Ο Ε-
r4 Q 0 И
o ID r* Ch J
σι ο Μ
co ο: Μ Ο σ
c* CU ο Η at w
U> ж > Η < ο
in Dt X Ζ Η
Ν’ J Η < Си ь
m X Ω Ch
CN Ε- ИЧ
r4 Ο
гЧ in Γ*
ο гЧ CD Ж b > o X
σι Ω cn U
co u < M
г* a ft. u
10 □ z co
in a cn
Ν* ω
<*» cc Ω co
CN X at o
гЧ >
1 008 1 cn u a ь
σι ft. cn 3
CD Ω co H
Γ* u ft. ИЧ o
ID Ω u M
in cn H z
N* at 3 Ό
m Ω u
CN Q
r4 Q ft] > 0 i-
1 790 3 ><
σι bi ft. Ω
CO Ω o
r· < E- A o
ID Ω cn
in cn ft. Ω u
Ν’ 0
m z O X H cn
CN > Ω &
Ж Ω < cn
<D Г-
Ο л· J
0 ω
co α X 01
r* cn Μ 0 в ►4
ш Ζ
Ш ><
л* Ο J >-4
m ►4 > Σ S-.
сч ►4 >
<н Ζ 0 и
Ο m 0 Ζ 0 ft
0 X J 0 0
co Β J Η
r* αί
Μ) ►4 Μ υ
1П < ο Μ > ОС
л· Μ Q ζ
m 2 J
сч 0 ►4 H
гЧ X 0 ►4
1 _____820' α Η4 ►4
0 0 X X
0 u
Г* *4 Μ в в
ш ω Q 0 bi
1П > Μ Л
л· Μ Β < J >
ΓΌ 01 d
сч Β < > X Σ
f—t > < h-t
811
Ο Γ* 0 > o u 0 >
σ\ < ВЧ B > Сь
ω 0 d ft B
Г* o ai
to >
1Л > M 0 ft
Л* ω J ft
m M ‘
СЧ > M ft
гЧ a 0 bi
ο νο ω a •
0 в t
0 o M Ct z
r* ω 0 z
to < B
tn >
л· > cn
cn h4 >
cn <
r4 B ьч > ►4
0S8 1 B
0 z Q ft
0 J Cu >
r* ►4 Z b
to 0 z
in > h4 ω B
Л· ft > Ск
m w
CN z Ж 0
r4 X 01 o
841
0 0 ►4 a >
0 ►4
Γ* M *4 a cn
0 a 0
in ω X
V ►4 b
m 0
CN o
r4 01
I 880 M >
0 d
0 a B
r* Qt X
to h4 >
in X z
Л* x ►4 ►4
cn J-4 >
ГЧ ft 0 h-4
01 o B
871
Съответно, въз основа на горните примери за специфични замествания, алтернативни замествания могат да бъдат правени чрез рутинни експерименти, за получаване на алтернативни EPV на настоящото изобретение, например като се правят едно или повече замествания, инсерции или делеции в белтъците на обвивката или EPV, което поражда различни имунни отговори.
Вариации в аминокиселинната последователност на един EPV на настоящото изобретение могат да бъдат направени например чрез мутации в ДНК. Такива EPV включват, например, делеции, инсерции или замествания на нуклеотидите, кодиращи различни аминокиселинни остатъци в аминокиселинната последователност. Очевидно, мутации, които ще бъдат направени в нуклеинова киселина, кодираща EPV, не трябва да поставят последователността извън рамката за четене и предпочитателно не трябва да създават комплементарни домени, които могат да продуцират вторични мРНК структури [вж. например Ausubel (1995 rev.), по-долу; Sambrook (1989), по-долу].
Нуклеинова киселина, кодираща EPV на изобретението, може също да бъде получена чрез амплификация или мястонасочена мутагенеза на нуклеотиди в ДНК или РНК кодиращи белтък на обвивката или EPV, и след това синтезиращи или обратно транскрибиращи кодиращата ДНК, така че да се получат ДНК или РНК кодиращи EPV [вж. например Ausubel (1995 rev.), по-долу; Sambrook (1989), по-долу]. Тези изпълнения се основават на инструкциите и упътванията на представени в цитираната литература.
Рекомбинантни вируси, експресиращи EPV на настоящото изобретение, рекомбинантни EPV или вектори от нуклеинова киселина, кодиращи варианти на белтъка на обвивката, включват един завършен набор от EPV-кодиращи последователности, които рутинно могат да бъдат получени от специалиста в тази област на базата на тук представените инструкции и ръководство без прекомерно експериментиране. За подробно описание на белтъчната химия и структура, вж. Schulz, G. Е. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978), and Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA (1983). За представяне на замествания на нуклеотидни последователности от типа на предпочитани кодони, вж. Ausubel et al., eds Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., New York, NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994,1995)(за които става дума по-долу, “Ausubel (1995 rev)”) при §§ A. 1.1.-A. 1.24, and Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY (1989) at Appendices C and D.
Специалистът c основна подготовка в тази област, с дадените тук указания и инструкции, ще знае как да замени и други аминокиселинни остатъци на други места в една env ДНК или РНК, за да получи алтернативни EPV, включително варианти със заместване, с делеция или с инсерция.
Скрининг тестове за HIV активност
За скриниране на анти-HIV активност в серуми или клетки от индивиди, имунизирани с ваксината на изобретението, може да бъде използуван всеки известен и/или подходящ тест за скриниране, който се прилага в тази област. Например, HIV тестове включват тестове за вирусна инфекциозност [вж. например Chesebro et al., J. Virol. 62 :3779-3788 (1988); Aldovini et al., eds., Techniques in HIV Research pp. 71-76 (1990)]; тестове за неутрализация [вж. напр. Golding et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10: 633-643 (1994); Hanson, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:645-648 (1994); Laal et al., Res. Hum. Retrovir. 9: 781-785 (1993); Hanson, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994)]; тестове за периферни мононуклеарни (peripheral mononuclear, PMN) клетки [вж. например Arduino et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37:1095-1101 (1990)]; и тестове за цитотоксични Т-лимфоцити (CTL) [вж. например Hammond et al., J. Exp. Med. 176: 1531-1542 (1992); McElrath et al., J. Virol. 68: 5074-5083 (1994); Walker et al., Cell Immunol. 119:470475 (1989); Weinhold et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 8:1373 (1992)]. Други подходящи активности, сами или в комбинация, включват, но не се ограничават до количествено и/или качествено измерване на транскрипцията, репликацията, транслацията, включването на вириони, вирулентност, вирусен добив и/или морфогенеза.
Специфично изпълнение: Рекомбинантен vaccinia вирус кодиращ EPV. Polyenv вакси ни и методи за конструиране и приложението им
Общ преглед.
Рекомбинантни vaccinia вируси (VV), експресиращи HIV белтъци на обвивката (напр. gp41, gp 120 и /или gp 160, или част от тях) предоставят материали, полезни за получаване и тестиране на смесени ваксини, които включват най-малко един хуморален или клетъчен имунен отговор срещу вируса, а също така и за анализи на В-клетки и детерминанти на цитотоксични лимфоцити (CTL).
Polyenv-ваксината на настоящото изобретение представлява смес от η различни рекомбинантни vaccinia вируси, където η е цяло число от около 4 до около 10,000 (или какъвто и да е порядък и стойност между тях), където всеки конструкт от vaccinia вектор експресира един вариант на белтъка на обвивката (EPV) HaHIV-Ι (напр. gp41, gpl20 или gpl60). Рекомбинантният vaccinia вирус функционално кодира един EPV и е конструиран чрез рекомбинация на дивия тип VV с един плазмид. Могат да бъдат конструирани множество различни плазмиди кодиращи EPV чрез заместване на една кодираща EPV последователност с друга, например като се използува един рестрикционен фрагмент или мутагенеза.
Получаване на рекомбинантни vaccinia вируси.
Методите за получаване на индивидуални плазмиди (всеки експресиращ една уникална HIV белтъчна последователност) могат да използуват ДНК или РНК амплификация за заместването на изолирани варианти от последователности на белтъка на обвивката в един вектор (напр. pVenv4 или pVenvl [Hallenberger et al., Virology 193: 510-514 (1993)], който вектор кодира известна последователност на белтъка на обвивката на HIV (напр. на разположение от NIAID AIDS Research & Reference Reagent Program, Rockville, MD).
Методите за амплификация на РНК или ДНК са добре познати на специалистите и могат да бъдат използвани в съответствие с представеното изобретение без ненужно експериментиране, като се ползуват представените тук инструкции и ръководство. Известните методи за амплификация на ДНК и РНК включват, но не се ограничават до, полимеразна верижна реакция (PCR) и сходни процеси на амплификация (вж. например US No 4,683,195,
4,683,202,4,800,169,4,965,188 на Mullis et al.; 4,795,699 и 4,921,794 на Tabor et al.; 5,142,033 на Innis; 5,122,464 на Wilson et al.; 5,091,310 на Innis; 5,066,584 на Gyllensten et al.; 4,889,818 на Gelfand et al.; 4,994,370 на Silver et al.; 4,766,067 на Biswas; 4,656,134 на Ringold), както и РНК медиирана амплификация, която използува антисенз РНК на прицелната последователност като матрица за синтеза на двойноверижна ДНК (US 5,130,238 на Malek et al., с търговско наименование NASBA).
Например, рекомбинантните vaccinia вирус конструкти, получени по този начин, могат да бъдат използвани за имунизации и предизвикване на HIV-специфични Т и/или В-клетъчни отговори. Праймери използват консервативни HIV последователности и по този начин успешно амплифицират env гени от много различни проби HaHIV-Ι пациенти. Основните техники, описани тук, могат по подобен начин да бъдат използвани с PCR или други типове праймери за амплификация, с цел по-малки или по-големи парчета от env последователности от полеви изолати да заместят последователности във вектори, кодиращи белтък на обвивката на HIV. Вж. например Ausubel] по-долу, Sambrook, по-долу.
EPV кодиращи нуклеинови киселини.
Техниката започва с изолиране на ДНК от HIV-инфектирани клетки и амплификация на env последователности с помощта на PCR. PCR и други продукти на амплификация са найпростите средства за изолиране на HIV последователности, но могат да бъдат прилагани и всякакви други подходящи и известни методи, като клониране и изолиране на HIV-кодираща нуклеинова киселина или белтъци (вж. Ausubel, по-долу; Sambrook, по-долу). За улеснение клонирането на гена в PCR или други последователности на амплификационен праймер предпочитателно се включват ензимни рестрикционни места.
Изолирана ДНК за PCR може да бъде получена от множество вирусни източници, включително от свежа или замразена кръв на HI V+ пациенти и от клетки, инфектирани in vitro с вирусни изолати.
За получаване на нови HI V env конструкти, полимеразната верижна реакция (PCR) се използва предимно за амплифициране на 1002700 базови двойки (Ьр) на един env ген от проба на всеки отделен HIV пациент. PCR23 праймерите могат да представляват консервативни HIV последователности, които са подходящи за амплифициране на env гени от известни проби на env гени , HIV изолати или различни проби от HIV пациенти. Амплифицираната ДНК преимуществено включва фрагмент, кодиращ 10-900 (като 100-400, 400-600 или 600-900, или какъвто и да е порядък и стойност измежду тях) аминокиселини на един gpl20 и gp41 (двата правят gpl60). За предпочитане, в PCR продуктите се включват една или повече от променливите области на обвивката (V1-V5) и константните области (С1-С5) найпредпочитателно повечето от VI, Cl, V2, С2, V3, СЗ, V4, С4 и V5 области. Освен това, амплифицираните последователности могат да кодират 1-200 аминокиселини под мястото на скъсване за gp 120/gp41. За предпочитане е повечето или целият env ген да бъде амплифициран. По избор в амплифицираната последователност, кодираща gp 160, може да отпаднат част или изцяло последователностите кодиращи за трансмембранния домен и/или цитоплазмения домен [вж. например Hallenberger et al., (1993)].
PCR праймерите могат да бъдат проектирани така че във vaccinia плазмида последователността на гена на обвивката да бъде фланкирана от рестрикционни ензимни места. По този начин те се включват в амплифицираните ДНК-продукти. С помощта на добре известните техники за субституционно клониране могат да се получат производни деривати на vaccinia плазмида, които експресират последователности- варианти на белтъка на обвивката от 110,000 пациенти. За целта се използват съответни рестрикционни фрагменти, с помощта на които част от env-последователността на vaccinia плазмида се замества от съответната EPV-кодираща област на пациента. Например, плазмидът pVenv4 и PCR продуктите се третират с рестриктазите ΚρηΙ и Bsml, при което се получава последователност, кодираща един скъсен gpl60, съставен от 1-639 аминокиселини, в който липсват както трансмембранния домен, така и крайния цитоплазмен домен на gp41 [вж. например Hallenberger et al., (1993)].
След лигиране на PCR продукта с pVenv продуктите, бактериалните клетки гостоприемници се трансформират с лигираната смес, чрез който и да е от известните методи за трансформация, включително, например електропорация и рекомбинантните колонии се отделят и изследват чрез секвениране.
Рекомбинантни vaccinia вирус конструкти кодиращи белтъци на обвивката на HIV.
След това vaccinia плазмидът, кодиращ EPV, се рекомбинира в клетка-приемник с див тип вирус и плаките EPV експресиращ вирус се подбират и се изготвят вирусни култури. Всяка една от тези култури, означавани като VVenv, съдържа различна EPV кодираща последователност. За да се образува polyenv-ваксината на настоящото изобретение, се смесват от 4-40 и до около 10,000 различни рекомбинантни вируси.
Рекомбинантните vaccinia плазмиди, съдържащи EPV последователностите след това по избор се секвенират или скринират със специфични антитела срещу белтъка на обвивката на HIV за идентифициране на различни EPV. Предпочитано е секвенирането по Sanderметода. Процедурата е адаптирана преимуществено от предварително описани методи [Sambrook et al., (1989), по-долу; United States Biochemical, Sequenase Version 2.0 - DNA Sequencing Kit, Ninth Edition, Amersham Life Science, Inc., (1994)] и трябва да се четат приблизително 50-300 базови двойки от мястото на праймера.
Методи за получаване на VV експресионни вектори са добре известни на специалиста в тази област, [вж. например Mackett, М. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:74157419 (1982); Panicali, D., and Paoletti, E., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79 :4927-4931 (1982); US 4,169,763; Mazzara, G. P. et al., Methods in Enz. 217:557-581 (1993), Ausubel etal., по-долу, при §§ 16.15-16.19]. Описаният по-рано pSCl 1 вектор [Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985)] може c предпочитание да бъде използуван за създаване на envкодиращ плазмид, като pVenv4.
В качеството му на вирусен вектор, vaccinia вирусът има известен брой полезни характеристики, включително капацитет, който позволява клониране на големи фрагменти чужда ДНК (по-големи от 20 КЬ), запазване на инфекциозността след инсерция на чужда ДНК, широк спектър от гостоприемници, относително високо ниво на белтъчен синтез и добри възможности за транспорт, секреция, процесинг и пост-транслационни модификации, обусловени от първичната структура на експресирания белтък и от типа на използваната клетка-гостоприемник. Например, N-Oгликозилиране, фосфорилиране, миристилиране и накъсване, както и сглобяване на експресираните белтъци, се проявяват по един достоверен начин.
Създадени са няколко варианта на vaccinia вектора, които са подходящи за приложение в настоящото изобретение (например, вж. Ausubel et al., по-долу, §§ 16.15-16.19). Най-общо, след получаване на вирусните култури (Ausubel, по-долу при §§ 16.16), последователността на нуклеиновата киселина, кодираща EPV, се поставя под контрол на vaccinia вирусен промотор и се включва в генома на vaccinia така, че да се запази инфекциозността (Ausubel et al., по-долу при § 16.17). Алтернативно, експресия може да бъде постигната чрез трансфектиране на плазмид, съдържащ vaccinia промотор-контролираният ген, кодиращ EPV в клетка, която е била инфектирана с див тип vaccinia.
За предпочитане, клетката гостоприемник и vaccinia векторът са подходящи и утвърдени за приложение при ваксинация на бозайници и човек. Тези рекомбинантни вируси след това са характеризирани с помощта на различни известни методи (Ausubel et al., по-долу при § 16.18). В една друга вариация, последователността на бактериофага Т7, кодираща фаговата РНК полимераза може да бъде интегрирана в генома на vaccinia, така че EPV кодиращите последователности да бъдат експресирани под контрола на един Т7 промотор, в трансфектирана плазма, в плазмид или рекомбинантен vaccinia вирус.
Предпочита се използването на промотори от вирус на шарка, тъй като клетъчни и други вирусни промотори обикновено не се разпознават от транскрипционния апарат на vaccinia. За предпочитане е при рекомбинантна vaccinia за polyenv-ваксини да се използва комбинация ранен/късен промотор, тъй като е желателно в прицелните клетки, инфектирани с рекомбинантния vaccinia вирус, EPV да се експресира като антиген заедно с белтъците от клас I или II на главния комплекс на тьканната съвместимост (Major Histocompatibility Class-MNC). Такъв белтък на обвивката на HIV, свързан с МНС, ще формира след това прицел за цитотоксичните клетки и първично ваксинирани бозайници за цито токсичен Т клетъчен отговор и/или хуморален отговор срещу експресираните EPV на HIV. Това е защото способността на vaccinia вирусните вектори да индуцират присъствие на МНС в клетките-гостоприемник за този тип антиген, изглежда намалява по-късно в инфекциозния стадий. Ранни транскрипти ще завършват след последователността TTTTTNT и водят до неадекватно представяне на МНС.
Алтернативно, който и да е завършващ мотив в кодиращата последователност на гена може да бъде променен чрез мутагенеза, ако се използва ранен промотор на вируса на шарката, за да повиши МНС-представянето на антигените на белтъка на обвивката в клеткитеприемник (Earl et al., по-долу, 1990). Ако в HIV-EPV кодиращите последователности, включени във vaccinia-плазмидите участват и нетранслиращи се лидерни и 3’-крайни последователности, тези последователности обикновено се оставят къси. Така съответните мРНК наподобяват матричните РНК на самия vaccinia вирус.
За предпочитане, плазмидът, използван за получаване на vaccinia конструкти съгласно настоящото изобретение, е планиран с места за рестрикционни ендонуклеази за инсерция на env ген след vaccinia промотора (Ausubel et al., по-долу, § 16.17). Още по-предпочитано е плазмидът вече да съдържа последователност, кодираща белтък на обвивката , като единични рестрикционни места се разполагат в близост до началото и края на последователността, кодираща белтъка на обвивката. Същият рестрикционен фрагмент на EPV кодиращата последователност може след това да замести съответната последователност в плазмида. В такива случаи, основната част от EPVкодиращата последователност може да бъде вмъкната след отстраняване от плазмида на повечето от или цялата кодираща последователност на белтъка на обвивката .
За предпочитане, полученият vaccinia конструкт (съдържащ EPV кодиращата последователност и vaccinia-промотора) е фланкиран от vaccinia ДНК, за да позволи хомоложна рекомбинация, когато плазмидът е трансфектиран в клетки, които предварително са били инфектирани с див тип vaccinia вирус. Фланкиращата vaccinia вирусна ДНК е подбрана така, че рекомбинацията да не прекъсва съществени за вируса гени.
Без селекциониране, отношението на рекомбинантния спрямо изходния vaccinia вирус обикновено е около 1:1000. Въпреки че тази честота е достатъчно висока за да позволи използването на плак-хибридизация (вж. Ausubel et al., по-долу при §§ 6.3 и 6.4) или имуноскрининг (Ausubel et al., по-долу при § 6.7) за подбор на рекомбинантни вируси, приложени са различни методи за улесняване идентифицирането на рекомбинантните вируси. Неограничен брой примери на такива техники за селекция или скрининг са известни в тази област (вж. Ausubel et al., по-долу при § 16.17). Обикновено експресионната касета е фланкирана от сегменти на vaccinia тимидин-киназни (ТК) гени, така че рекомбинацията води до инактивиране на ТК. Вирус с ТК фенотип може след това да бъде разграничен от вируси с TIC фенотип чрез инфектиране на една ТК’ клетъчна линия в присъствието на 5-бромодезоксиуридин (5-BrdU), който трябва да бъде фосфорилиран с ТК, за да бъде летално включен във вирусния геном. Алтернативно или допълнително, рекомбинантните вируси могат да бъдат селекционирани чрез коекспресия на един резистентен на антибиотици бактериален ген, като ампицилин (ашр) или гуанинфосфорибозил трансфераза (guanine phosphoribosyl transferase gpt). Като следващ пример, коекспресия на гена на Escherichia coli lac Z дава възможност за коскрининг на рекомбинантни вирусни плаки с Xgal (Ausubel, § 16.17).
Рекомбинантни vaccinia вируси, експресиращи EPV, предмет на настоящото изобретение, могат по избор да бъдат атенюирани или инактивирани с помощта на известни методи, като например с топлина, третиране с формалдехид, ултравиолетово облъчване, третиране с проприолактон, образуване на хибрид или на химера или с други известни методи [вж. например, Zagury et al., Nature, 332: 728-731 (1988); Ito et al., Cancer Res. 50 :6915-6918 (1990); Wellis et al., J. Immunol. 99: 1134-9 (1967); D’Honcht, Vaccine 10 (Suppl.):548-52 (992); Selenka et al., Arch. Hyd. Bakteriol. 153:244-253 (1969); Grundwald-Bearch et al., J. Cancer Rec. Clin. Oncol. 117:561-567 (1992)]. Например топлинно инактивиране при 60°С ще редуцира значително вирусния титър. Такива техники за атенюиране са тестирани за сигурност, тъй като непълно инактивиране може да доведе до смърт на пациента [Dorozynski and
Anderson, Science 252:501-502 (1991)].
Такава атенюирана или инактивирана рекомбинантна vaccinia е подходяща за ползуване когато пациентът има нарушена имунна система, тъй като при въвеждане на жива vaccinia могат да настъпят усложнения или смърт.
Фармацевтичен състав
Фармацевтични препарати на Настоящото изобретение, подходящи за инокулиране или за парентерално или перорално въвеждане, включват една polyenv рекомбинантна вирусна ваксина, съдържаща най-малко 4 и до около 10,000, предпочитателно 4 до около 1000, и най-добре 10 до около 100 различни рекомбинантни вируси във формата на клетъчен лизат, мембранно-свързана фракция, частично пречистена или пречистена форма. Предпочитателно, polyenv-ваксината включва клетъчен лизат, съдържащ рекомбинантен вирус (или мембранно-свързани фракции от него), която по-нататък съдържа EPV белтъци вече експресирани от рекомбинантни вируси. Включването на експресирани EPV е открито понастоящем, за да повиши първичния отговор на антитялото.
Polyenv-ваксината може да бъде във форма на стерилни водни или неводни разтвори, суспензии или емулсии и може също да съдържа спомагателни агенти или ексципиенти, известни в тази област. Всеки от наймалко около 4-40 до 10,000 различни вируси кодира и експресира различен EPV, както е представено тук. ДНК кодираща EPV може да бъде подбрана да представя EPV съществуващи в една специфична изолирана общност от болни от спин пациенти. Например, една ваксина може да представлява последователности от Мемфис, щата Тенеси и да бъде прицелна за приложение в Мемфис, Тенеси. Ваксини, планирани като представителни за ограничени географски области, могат също да бъдат полезни за приложение в общности извън прицелната общност.
Алтернативно, ДНКи кодиращи EPV могат да бъдат избрани да представят географски отдалечени общности, градове или страни, като clades. Например, множество клонове могат да бъдат представени в една polyenv ваксина. Съставът на polyenv ваксината може освен това да включва имуномодулатори като цитокини, което засилва имунния отговор срещу вирусната инфекция. Вж. напр. Berkow et al., eds. The Merck Manual, Filteen Edition, Merck and Co., Rahway, NJ (1987); Goodman et al., eds., Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY (1990); Avery’s Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Third Edition, ADIS Press, Ltd., Williams and Wikins, Baltimore, MD (1987); and Katzung, ed. Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk. CT (1992), литературата и цитатите тук показват състоянието на проблема.
Както може да бъде разбрано от специалиста с обща подготовка в тази област, когато polyenv ваксината на настоящото изобретение се приложи на един пациент, тя може да има състав, който освен това включва соли, буфери, адюванти или други вещества, които са желателни за подобрение ефикасността на състава. Адювантите са вещества, които могат да се използват за специфично увеличение най-малко на един имунен отговор. Нормално, адювангьт и съставките се смесват преди контакта с имунната система или се прилагат поотделно, но на същото място, където ще бъде имунизацията. Адювантите могат грубо да бъдат разпределени в няколко групи според техния състав. Тези групи включват маслени адюванти, минерални соли (например A1K(SO4)2, AlNa(SO4)2, A1NH4(SO4)2, силикат, каолин и въглерод), полинуклеотиди (например poly IC и polyAU) и някои природни вещества (например восък D от Mycobacterium tuberculosis, вещества, открити в Corynebacterium parvum, или Bordetella pertussis и членове на рода Brucella). От тези вещества особено полезни като адювант са сапонините (например Quit A., Superfos A/S, Denmark). Примери за материали, подходящи за използване в състава на ваксини са представени, например в Osol, A. ed., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), pp. 1324-1341.
Фармацевтичният състав на polyenv-ваксината на настоящото изобретение може понататък или допълнително да включва поне едно антивирусно химиотерапевтично съединение. Неограничен брой примери могат да бъдат подбрани от най-малко една от групите, състоящи се от гама-глобулин, амантадин, гу анидин, хидрокси бензимидазол, интерферона, интерферон-β, интерферон-χ, интерлевкин16 (IL-16; Kurth, Nature, December 8, 1995); тиосемикарбазони, метисазон, рифампин, рибвирин, един пиридинов аналог (например, AZT и/или ЗТС), един пуринов аналог, фоскарнет, фосфонооцетна киселина, ацикловир, дидезоксинуклеозиди, един протеазен инхибитор (например, саквинавир (Hoffmann-La Roche); индинавир (Merck); ритонавир (Abbott Labs); AG 1343 (Agouron Pharmaceuticals); VX-2/78 (Glaxo Wellcome); хемокини, като RANTES, MIPla или ΜΙΡΙβ [Science 270: 1560-1561 (1995)] или ганцикловир. Вж. например, Richman: AIDs Res. Humm. Retroviruses 8: 1065-1071 (1992); Annu Rev. Pharmacol. Toxicol. 33: 149-164 (1993); Antimicrob Agents Chemother. 37: 1207-1213 (1993); AIDs Res. Hum. Retroviruses 10: 901 (1994); Katzung (1992), по-долу, и литературата цитирана тук на стр. 798-800 и 680-681 съответно.
Фармацевтично приложение
Въвеждането на polyenv ваксина (или антисерумите, които тя предизвиква) може да бъде с “профилактична” или “терапевтична цел” и преимуществено с профилактични цели. Когато се прилага профилактично, живата polyenv-ваксина се прилага предварително, преди откриване или симптоми на HI V инфекция или заболяване от СПИН. Профилактичното въвеждане на съединението(нията) служи да предотврати или да отслаби последваща HI V инфекция.
Когато се прилага за терапия, polyenvваксината се прилага при откриването на симптом на активна инфекция. Въвеждането на жива polyenv-ваксина след HI V инфекция се прилага само при случаите, при които е определено, че имунната система на пациента е способна да отговори на въвеждането на жива polyenv-ваксина, без съществен риск от неблагоприятни усложнения или смърт, като въвеждането на жива polyenv-ваксина се прилага в необходимите дози, които могат да отслабят активната HIV инфекция.
Алтернативно, когато имунният отговор на пациента е нарушен, терапевтичното въвеждане включва преимуществено прилагането на една атенюирана или инактивирана polyenvваксина, в която рекомбинантните вируси са атенюирани или инактивирани, както е представено по-горе. Вж. например Berkow (1987), по-долу. Goodman (1990), по-долу, Avery (1987), по-долу и Katzung (1992), по-долу, Dorozynski and Anderson, Science 252:501-502 (1991).
Съставът се определя като “фармакологично приемлив”, ако неговото въвеждане се толерира от пациента-приемник. Такъв агент се въвежда в “терапевтично или профилактично ефективно количество” ако въведеното количество е физиологично значимо. Една ваксина или комбинация на настоящото изобретение е физиологично значима ако нейното наличие води до забележими промени във физиологията на пациента-приемник, преимуществено чрез повишаване хуморалния или клетъчния имунен отговори срещу HIV.
“Предпазването”, което се предлага, не е необходимо да бъде абсолютно, т.е. заразяването с HIV или заболяването от СПИН не следва да бъде напълно предотвратено или премахнато; предоставя се статистически значимо подобрение спрямо контролна популация. Предпазването може да бъде ограничено до намаляване на тежестта или скоростта на поява на симптомите на заболяването.
Фармацевтично въвеждане
Ваксината на настоящото изобретение може да предизвика резистентност срещу един или повече щамове на HIV. Настоящото изобретение се отнася до и предоставя средство за предпазване или отслабване на инфекцията срещу най-малко един HIV щам. В използвания тук смисъл, за една ваксина се приема, че предпазва или отслабва едно заболяване, ако нейното въвеждане у един индивид води до пълно или частично отслабване (т.е. супресия) на симптом или състояние на заболяването, или до пълни или частично развитие на имунитет у индивида срещу заболяването.
Поне една polyenv-ваксина, предмет на настоящото изобретение, може да бъде въведена по който и да е начин, като за постигане предвидените цели, се използва някой от фармацевтичните състави описани тук.
Например, такъв състав може да бъде въведен по различни парентерални начини, като подкожно, интравенозно, интрадермално, интрамускулно, интраперитонеално, интраназално, трансдермално или през устата. Предпочита се подкожното въвеждане. Парентералното въвеждане може да бъде като bolus инжекция или постепенно чрез перфузия за определено време. Вж. например, Berkow (1987) по-долу, Goodman (1990), по-долу, Avery (1987), по-долу и Katzung (1992) по-долу.
Типичен пример на схема за предпазване, потискане или лечение на заболяване или състояние, което може да бъде облекчено с клетъчен имунен отговор чрез активна специфична клетъчна имунотерапия, включва въвеждане на ефективно количество ваксина, както е описано по-горе, приложена като еднократно третиране или многократно, като повишаващо или усилващо дозиране, за един период от една седмица до около 24 месеца.
В съответствие с настоящото изобретение, “ефективно количество” за една ваксина е това, което е достатъчно за постигане на желан биологичен ефект, в случая поне на един клетъчен или хуморален имунен отговор срещу HIV. Разбираемо е, че ефективната дозировка зависи от възрастта, пола, здравословното състояние и телесното тегло на приемника, вида на съпровождащо лечение, ако има такова, честотата на приложение и вида на желания ефект. Диапазонът на ефективните дози, предложени по-долу, не е предвиден да ограничава изобретението и представлява предпочитани дози. Най-предпочитаните дозировки се определят за конкретния пациент, от специалиста в тази област, без излишно експериментиране. Вж. например, Berkov (1987), подолу, Goodman (1990), по-долу, Avery (1987), по-долу, Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, MA (1985) и Katsung (1992), noдолу.
Общо може да се каже, че дозировката за възрастен индивид ще бъде от около 10*109 образуващи плаки единици (pfu)/kg или образуващи колонии единици (CFU)/kg за доза, за предпочитане 106 109. Каквато и доза да се използва, тя трябва да бъде безопасна и в ефективно количество, определено с известните методи и също описано тук.
Обекти
Приемници на ваксините на настоящото изобретение могат да бъдат бозайници, които могат да придобият специфичен имунитет чрез клетъчен или хуморален имунен отговор срещу HIV, като клетъчният отговор се медиира от един МНС клас I или клас II белтък. Измежду бозайниците, предпочитани приемници са бозайници от рода Primata (включително хора, шимпанзета, човекоподобни май муни и други маймуни). Най-предпочитани приемници са човешки индивиди. Обектите предпочитателно представляват заразени с HIV индивиди или са модели на HI V инфекция [например Hu et al., Nature: 721-723 (1987)].
След като вече е дадено общо описание на изобретението, същото ще бъде по-добре разбрано чрез следващите примери, които са представени като илюстрация и не са предвидени да ограничават настоящото изобретение.
Примери
Пример 1. Конструиране на vaccinia вирусни вектори за експресия на HIV-env-белтък
Терминология и означения.
За означаване и отпратки, един рекомбинантен vaccinia вирус конструкт тук алтернативно се означава като VVenv конструкт, като специфичните vaccinia вирусни конструкти се означават и според пациента или според депозиториума (например, АТСС или GenBank като източник на env ДНК, използвана в конструкта). Например, VVenv-Doe се отнася за един конструкт vaccinia вирусен вектор, на който притежава env последователности от пациент Doe, a VVenv-U28305 се отнася за vaccinia вирусен вектор, притежаващ env последователности, намиращи се в GenBank, accession No. U28305.
Polyenv-ваксината се състои от 4-100 отделни рекомбинантни vaccinia вируси, всеки от които експресира един уникален HIV-1 белтък на обвивката. Всеки отделен вирус е означен като VVenv, а крайната вирусна смес се означава като polyenv.
При конструирането на всеки VVenv се използва плазмидът, означен като pVenv4 и един див тип vaccinia вирус, означен като NYCDK, описан по-долу. За допълнителни подробности, вж. Ryan et al., “Preparation and Use of Vaccinia Virus Vectors for HIV Protein Expression and Immunization”, in Immunology Methods Manual, Lefkovits, ed. Academic Press (1996).
Вектори и клетки-приемници
Описаният по-рано pSCll вектор {Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:34033409 (1985) може да бъде използван за рекомбинация на множество от HIV гени във VV генома. Плазмидът pSCl 1 включват елементите: генът lacZ (един ген репортер, чрез който трансформираните бактерии и VV рекомбинантите могат лесно да бъдат идентифицирани като такива притежаващи β-галактозидазна активност); една част от гена, кодиращ тимидинкиназа (ТК) и ген за резистентност към ампицилин (amp). Гените, клонирани в pSCll са вкарани чрез инсерция във VV генома, посредством хомоложна рекомбинация между ТК гена на дивия тип вирус и частите от ТК гена, включени в pSCll. Инсерциятанаплазмидна ДНК във вирусния ТК локус инактивира вирусния ген така, че рекомбинантните вируси могат да бъдат подбрани чрез култивиране в присъствие на бромдезоксиуридин (BUdR). За да преживее тази селекция, рекомбинантният ТК+ вирус трябва да се развива в клетки, които не доставят активен ТК ензим, като например клетъчната линия ТК· 143, която е ТК дефицитен дериват на човешката линия R970-5. R970-5 е остеосаркомна клетъчни линия (Rhim, J.S. et al., Int. J. Cancer 15:23-29 (1975))], c която се култивира VV [Weir et al., по-долу (1982)]. Експресията на сегмент от HIV гена, може да се осъществи чрез инсерция на целия ген в Smal място на вектора pSC 11. Пълната дължина на гените може да се експресира под контрола на Р7.5К промотор.
Като алтернатива на клонирането на цели HIV гени, възможно е те да бъдат заместени с частични HIV-генни последователности, които са били вече клонирани в pSCll. Например, един конструкт, наречен pVenv 1, е конструиран от pSCll и експресира ВН10 HIV гена на белтъка на обвивката (env) [Hallenberger et al., по-долу, (1993); Kilpatrick et al., J. Biol. Chem. 262:116-121 (1987)]. Конструктът може да бъде използван като изходен вектор, който да замести и да експресира променливи области на белтъка на обвивката от полеви HIV изолати. По подобен начин от pSCl 1 е конструиран вектора, наречен pVenv4, pSCll, който да експресира белтъка ВН10 env белтък, скъсен, за да се отстранят последователностите Hagp41, кодиращи трансмембранния и цитоплазмения домен и на белтъка, като се запазва олигомеризиращия домен [Hallemberger et al. 1993), по-долу]. Както може да бъде оценено от специалиста в тази област, терминът “олигомеризиращ домен” е използван функционално, за да се означи онази част от gp41, която позволява олигомеризация на env белтъци, т.е. налице е достатъчно структура за олигомеризация. Векторът pVenv4 кодира един скъсен gpl60 (също: gpl60t, gpl40), който е установено, че образува третична структура, която е подобна на тази на процесирания gp41 /gp 120 олигомер (димер, тример или тетрамер), какъвто е налице по клетъчната повърхност на инфектираните с HIV клетки. Тази третична структура се запазва и в двете форми - секретираща и мембранносвързана [Hallenberger et al., (1993)]. Този вектор преимуществено се прилага като изходен вектор за заместване на алтернативни последователности на env изолати.
В този пример изготвянето на всеки VVenv конструкт се извършва с pVenv4 и див тип vaccinia вирус NYCDH и подходящи клетки-приемници, както е описано подробно подолу.
PVenv4:
Векторът PVenv4 е конструиран по-рано чрез инсерция на една кодираща последователност на HI V-1 -обвивката в pSC 11 рекомбинантен vaccinia вирусен вектор [Hallenberger, et al., Virology 193:510-514 (1993); Chakrabarti et al., Mol. Cell Biology 5:3403-3409 (1985)]. HIV-1 последователността е от един лабораторен щок на жив вирус. Последователността е наречена “ВН10” [Ratner et al., Nature 313:277-284 (1985)]. C PCR техника могат да бъдат амплифицирани уникални последователности на обвивката от HIV-1 инфектирани пациенти и могат да бъдат заместени в ВН10 env последователността, за създаване на нови вектори. Например, следните праймери могат да бъдат използвани за PCR.
(A) Сенз, позиция 5785 (SEQ ID NO: 1): AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA (B) Антисенз, позиция 7694 (SEQ ID N0:2):
CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTCCAAAT (C) Kpnl-сенз, позиция 5903 (SEQ ID N0:3):
GIOGGICACAGIUlATTATCCGGTACCIUlUr (D) Bsml-антисенз, позиция 7659 (SEQ ID NO: 4):
(XAGAGAITIATTACICCAACIAGCAITCCAAGG (E) (по избор) DraIII-сенз, позиция 6153 (SEQ ID NO: 5):
CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGT (F) (по избор) ВзиЗбЬантисенз, позиция 6917 (SEQ ID N0:6):
TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG
Праймерите са изписани в посока 5 към
3. Рестрикционните места са подчертани (номерираните позиции са въз основа на последователността ВН10 [Ratner et al., Nature
313:277-284 (1985)].
PCR стратегия:
За получаване на нови HIV-1 конструкти се използва полимеразна верижна реакция (PCR) за амплификация на 1800 базови двойки (Ьр) от гена на обвивката измежду 40 различни проби на HIV-1 пациенти. PCR-праймерите представляват високо консервативни HIV-1 последователности, които успешно амплифициратепу гените от много различни проби HaHIV-Ι пациенти. Амплифицираната ДНК обхваща целия белтък gp 120, с изключение на около 10 висококонсервативни аминокиселини от амино-края (ИР^-края) на белтъка. Всички променливи области на обвивката (V1-V5) са включени в PCR продуктите. Освен това, амплифицирани последователности кодират около 100 аминокиселини под мястото на срязване за gpl 20/gp41.
Носещи места за рестрикционните ензими ΚρηΙ и BsmI в PCR-праймерите, които фланкират последователността на ВН10 гена на обвивката в pVenv4, са включени в амплифицираните ДНК продукти.
Първи тур PCR:
Смеси в една микроцентрофужна епруветка от 500 1:
μΐ праймер A (SEQ ID NO: 1), 300 ng4tl; 1 μΐ праймер Β (SEQ ID NO: 2), 300 ng4tl;
2.5 μΐ 10 mM от всеки от 4-те dNTPs;
gg ДНК;
μΐ 10 x PCR буфер; и
HPLC Н20 до 99 μΐ
Разбъркай на вортекс tag-реактива и пипетирай 1 μΐ за PCR реакция. Смеси добре. Нанеси отгоре минерално масло.
Остави реакцията да протича в циклотермостат както следва:
Инкубирай на 95°С, 3 min за разтопяване на ДНК.
Реакцията протича при 40 цикъла: 95°С, 1 min, 45°С, 2 min; 72°С, 3.5 min.
Втори тур PCR:
Подготви PCR реакция както по-горе, но с праймери С и D (SEQ ID NO: 3 и 4, съответно) и без ДНК. Крайният разтвор да се доведе до 95 μΐ. Надслой с минерално масло. Вземете 5 μΐ от реакционната смес под минералното масло след първата PCR реакция. За втората реакция, смеси пробата под слоя на минералното масло и започни циклите както преди. Обикновено са подходящи 30 цикъла. Желателно е продуктът да се проверява, като се отделят 2 μΐ за гел анализ след всеки 10 цикъла, докато се идентифицира една ясна ивица при около 1800 Ьр.
Използвани са добре известни техники за субституционно клониране за генериране на pVenv4 деривати, които експресират env последователност от един от 40 пациенти, вместо последователността ВН10 на обвивката. Накратко, плазмидът pVenv4 и PCR продуктите се срязват с ΚρηΙ и BsmI, след което срязаният pVenv4 се разделя в агарозен гел и се изолирва големия фрагмент. Малкият фрагмент (1800 Ьр фрагмент) на ВН10 env се отстранява. Срязаният PCR продукт също се изолира и се лигира с големия pVenv4 фрагмент. Така се създава една химерна последователност на обвивката, която съдържа 1800 Ьр на env вариант от ДНК на пациента. След лигиране на PCR продукта и pVenv4 продуктите, бактериалните клетки-приемници се трансформират със сместа за лигиране с използване на всеки един от добре известните методи в тази област, включително например, електропорация и рекомбинантните колонии се отбират и изследват чрез секвениране.
Плазмидите pVenv4 или рекомбинанти, получени с рVenv4 улесняват инсерцията на гени в генома на vaccinia вируса, чрез хомоложна рекомбинация между гена за тимидинкиназа (Тк) на дивия тип вирус и Тк последователностите вътре в плазмида. Инсерция на pVenv4 ДНК във вирусния Тк локус води до получаване на vaccinia вирус с ген за обвивката на HIV-1 , експресиран под контрола на Т7.5К ранен/късен промотор. Вирусът е атенюиран по отношение активността за растеж, поради разкъсването на Тк локуса. Един допълнителен елемент на pVenv4 е lacZ гена, който кодира β-галактозидазна активност. Активността на lacZ може да бъде използвана за подбор на рекомбинанти на vaccinia вирус (вж. по-долу).
Генът за обвивката, експресиран от pVenv4 е скъсен, с цел да се изключат последователностите на трансмембранния/С-край на gp41. Векторът се експресира като олигомерна структура, която се намира вътре в клетките и в секреторна форма.
Vaccinia вирус-NYCDH.
Всеки нов, субституиран плазмид е индивидуално рекомбиниран с дивия тип vaccinia вирус NYCDH. Този вирус е доставен от А.Т.С.С. (Accession No. VR-325) и преди употреба е плака-пречистен (Buck, С., and Paulino, M.S. eds., American Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae, 6111 Ed., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1990), p. 138).
Бактериални клетки-приемници.
Плазмидът може да се развива във всеки подходящ приемник, както е известно на специалистите в тази област [вж. например, Ausubel, по-долу (1995 rev.), §§ 16.15-16.19]. Един неограничаващ пример са DH5a клетките.
ТК-дефицитни клетки.
Трансформация и заместване във vaccinia вируса са правени на човешка клетъчна линия Тк-143В, която е Tk-дефицитен дериват на човешката клетъчна линия R970-5. Последната представлява една остеосаркомна клетъчна линия [Rhim et al. (1975), по-долу], която поддържа развитието на VV [Weir et al., (1982), по-долу]. Всеки рекомбинант на vaccinia вируса, който съдържа една уникална последователност на HIV env гена е подбран въз основа на експресията на lacZ гена (върху вирусните плаки се нанася HaBluo-gal и по развитието на синьо оцветяване се селекционират за β-галактозидазна активност. Могат да бъдат изпълнени два цикъла за PCR.
Пример 2. Получаване на polyenv-ваксина
Vero клетки.
Крайният етап от производството е да се получат n VVenv конструкти на Vero клетки новозакупени от А.Т.С.С. (Accession No. CCL81 or Х38), да се клонират и да се намножат за вирусно развитие. Линията Vero клетки е утвърдена от Световната Здравна Организация (World Health Organization) за получаване на ваксини [Hay, R., et al., eds., American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7th Ed., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1992), стр. 48].
Vero клетките се култивират в Dulbecco’s Modified Eagles Medium (Bio-Whittaker), c добавка глутамин (Bio-Whittaker) и топлинноинактивиран телешки фетален серум (Hyclone, Inc.). Алтернативно може да бъде използвана безсерумна среда. Всеки VVenv конструкт се инокулира върху отделен конфлуентен слой от Vero клетки и се събират, когато клетките проявяват цитопатни ефекти, дължащи се на вирусната инфекция. Клетъчните екстракти са измиват добре с PBS (Bio-Whittaker) след събирането им и преди да се замразят. След това клетките се разрушават чрез замразяване-размразяване, с ултразвуково третиране или нискооборотно центрофугиране в центрофуга (по избор). Определени количества (аликвоти) от супернатантата се отделят и съхраняват на -70°С. Белтъкът на обвивката е в достатъчно голяма концентрация в лизата, за да предизвика образуване на антитяло, специфично за HI V белтъка на обвивката антитяло (което се открива с ELISA) в модели от бозайници, дори когато VV е атенюиран, например препаратът е загряван при 60°С за 1 h.
Ваксинен продукт.
Всеки щок-вирусен (VVenV конструкти) от Vero клетки се замразява отделно, титрира се впоследствие и се тестира за безопасност. След завършване на тестовете, порции от всеки вирус се смесват, за да се получи една щокваксина от 10’ общо pfu/ml (“pfu” е поставено като плакообразуващи единици). Ако се използват 40 VVenv конструкти, всеки VVenv е преимуществено еднакво представен, всеки VVenv е използван при титър 2.5 х 106 pfu/ml във ваксинния продукт. Това трябва да даде 1x10 общо pfu/ml.
Оценка на polyenv-ваксината Мишки.
Мишки могат да бъдат инфектирани с една интраперитонеална инжекция 0.1 х 10’ pfu env-експресиращи V V. Антителата могат да бъдат идентифицирани чрез HIV ELISA или неутрализационни тестове, както е описано по-горе, три седмици след инжекциите с VV.
Преди да се произведе polyenv-ваксина за приложение при човека, подобна група вируси беше получена с цел тестиране на ваксината у мишки. Тези вируси бяха въвеждани у мишките интраперитонеално или подкожно. След това беше тестирано серумното HIV-1специфично антитяло, серумът беше тестиран за активност с една ензимно-свързана имуносорбентна проба (ELISA). Пробата включва нанасяне на цял, неразкъсан HIV-1 (HTLVIIIb) върху ELISA платки и блокиране на платките с говежди серумен албумин. След това серум ните проби бяха разредени до 1:100,1:1000 и 1:10,000 във фосфатно буфериран физиологичен разтвор. Тестът се осъществява със свързано с алкална фосфатаза козе-анти-мишо имуноглобулин антитяло и р-нитрофенилфосфат. Цветната реакция се спира с разтвор на натриева основа и оптичната плътност се отчита на фотометър за ELISA платки при 405 nm.
Както е представено на фигура 2, еднократно инокулиране на препарат от клетъчен лизат от 10М07 pfu vaccinia вирус (съдържащ една кодираща последователност за HIV-1/белтък на обвивката и експресиран мембранно свързан белтък на обвивката) предизвиква силен антитяло-отговор срещу HIV-1, който беше подържан през цялото време от шест месеца на експеримента. Този имунен отговор беше значително по-силен, отколкото съобщените по-рано с други имунизации. Този силен антитяло-отговор може да се отдаде на наличието на мембранно свързан белтък на обвивката във ваксинния препарат. Както е показано на фигура 3, тези отговори са дозозависими. По-слаби отговори са наблюдавани при бозайници, на които е прилагана доза от 106 pfu в сравнение с бозайниците, на които е прилагана доза 107 pfu.
Изготвени бяха също смеси от vaccinia вируси, експресиращи различни HIV-1 белтъци на обвивката. Когато на мишки бяха въвеждани 107 pfu от смес на пет вируса, отговорите бяха общо взето идентични по сила с отговорите генерирани срещу 107 pfu от единичен рекомбинант на vaccinia вирус (фигура 4). Смесването на голям брой множество env-експресиращи vaccinia вируси не е съобщено и се очаква то да предизвика широк спектър от неутрализиращи антитела.
Човешки индивиди
Тестове с щок от смесен вирус се провеждат преди клиничните изпитания, първият от които е за увеличаване на дозата и определяне на безопасността.
Клиничните изпитания следва да бъдат проучване върху зависимостта доза/ефект, включващи 4 групи от доброволци. Всяка група получава една от следните дози ваксина:
(1) 2 х 104 pfu (2) 2 х 105pfu (3) 2 х 106 pfu (4) 2x10’ pfu
Всеки доброволец получава смесената вирусна ваксина в 0.5 ml физиологичен разтвор, въведена с еднократна подкожна инжекция.
Пример 3. Индукция на имунитет неутрализиращ първичен изолат с една мулти-env ваксина на базата на vaccinia вирус HIV-1 у шимпанзета
Популацията от HIV-1 изолати е защитена с внушително количество белтъци на обвивката. Env-белтъците са единствените кодирани от вирус белтъци по външната повърхност и са прицелни места за неутрализиращата активност на антителата, като антителата получени срещу един изолат не е задължително да неутрализират друг. По тази причина ние направихме един HIV-1 ваксинен коктейл, PolyEnv, експресиращ множество Env белтъци. Продуцирането на ваксина започна с получаване на тридесет отделни VVрекомбинанти, всеки експресиращ отделен Env белтък. След това Wenv бяха тестирани, индивидуално и в комбинация (PolyEnv) на модел шимпанзета. Четири шимпанзета бяха имунизирани подкожно с три инжекции от единичен Wenv (шимпанзета 1 и 2) или PolyEnv (шимпанзета 3 и 4), последвани от една интрамускулна инжекция с рекомбинантен gpl 20/gp41 белтък в стипца. Безвредност на ваксината бе демонстрирана при всичките четири животни; само две от тях показаха белези на улцерация на мястото на инжектиране. Серумните проби бяха контролирани с множество тестове за HIV-свързване и неутрализация. Антителата на шимпанзета 3 и 4 показаха най-високо качество на активност. Неутрализиращата функция беше проявена срещу един лабораторен изолат и един първичен изолат от HI V-1, нито един от които не беше специфично представен във ваксината. Така инициирането на лимфоцити със смесени env белтъци, предлага един обещаващ метод, с който могат да бъдат получени висококачествени антитела срещу различни HIV-1.
Материали и методи pVenv4, един рекомбинационен VV вектор.
PVenv4 беше предварително получен чрез вкарване на един стоп кодон в последователността ΒΗΙΟ-env и инсерцията на модифицирания ВН10 ген на обвивката (env) в pSC 11. р Venv4 експресира един продукт на Env белтъка, който беше скъсен при аминокисе лина 640, и имаше способността да секретира и да олигомеризира. Продуцирането на рекомбинантния VV, VVenv4, който експресира този скъсен ВН10 Env белтък, е описано по-рано [Hallenberger et al., Virology 193:510-514 (1993)].
PCR за амплификация на env последователности от заразени с HIV-1 индивиди.
Използван беше PCR за амплифициране на HIV env последователности. Общо, проби от кръв на заразени с HIV-1 индивиди бяха взимани при първата диагноза за HIV. Други проби бяха от индивиди с клинични симптоми на спин или от продукти предоставени от изследвания върху спин и от депозиториум за реагенти. При кръвните проби, ДНК беше найнапред получена чрез добавяне на капки кръв или инфектирани клетки в лизиращ буфер, съдържащ SDS и инкубиране при 65°С за 30 min. Прибавяна беше проназа до концентрация 0.5 mg/ml и след това лизатът беше инкубиран на 45°С за една нощ. Правени бяха две фенолови екстракции, утаяване с етанол и ресуспендиране на ДНК във вода.
Проведени бяха два тура PCR за всички ДНК проби със стандартни методи. Праймерните последователности бяха избирани въз основа на публикувана ВН10 последователност [Ratner et al., Nature 313:277-284 (1985)]. За получаване на фрагменти, включващи последователности от всички променливи области и част от gp41, бяха използвани PCR праймери както са описани в пример 1. PCR продуктите бяха впоследствие клонирани чрез заместване в pVenv4 вектор с помощта на стандартни методи. Секвенирането на новите плазмиди беше извършено по метода на Sanger и с праймер ccatgtgtaaaattaaccccactctgtg (SEQ ID NO: 5).
Получаване на Wenv.
Нови VV-рекомбинанти (Wenv) бяха получени чрез трансфекция на VV(NYCDH, АТСС)-инфектирани клетки с ново-субституирани рекомбинантни плазмиди (вж. по-горе). Transfectam (Promega) и Lipofectamine (Gibco, BRL) бяха използвани за улесняване на трансфекцията, следвайки указанията на производителя. След това VV бяха пречистени чрез плак-техниката.
Имунизации.
Wenv-инфектирани клетъчни лизати бяха въвеждани у шимпанзета с подкожни ин жекции. VVenv бяха използвани самостоятелно или в комбинация. Общите количества VV в pfu бяха подобни във всяка инжекция (приблизително 107 pfu) на животно. Интрамускулните инжекции бяха със една смес от около 40 pg gpl20 (Cat # 12101, Intracel, Cambridge, MA), 20 pg gp41 (Cat # 036001, Intracel) и 500 pg стипца (Rehsorptar Aluminium hydroxide Adsorptive Gel, Intergen Co., Purchase, N.Y.) per inoculum.
ELISA.
Проведени бяха пет ELISA тестове както следва. ELISA #1 Abbott клинична ELISA беше закупена от Abbott Laboratories и изпълнена съответно на препоръките на производителите (HIVAB HIV-l/HIV-2 (rDNA) EIA, Abbott Laboratories, Abbott Park, I.L.. ELISA #2: ELISA тестовете бяха изпълнени чрез нанасяне на рекомбинантен Mn-gpl60 (Quality Biological, Inc. Gaithersburg, MD) no lpg/ml. Платките бяха блокирани и тестовете проведени с трикратни последователни серийни разреждания на серумите. След това платките бяха измивани и белязани със свързан с алкална фосфатаза античовешки IgG. ELISA 3: ELISA платките се покриваха с lpg/ml LAI-gpl20 (CHO-derived protein, Intracel). Серумните проби бяха нанасяни след разреждане 1:100 и белязани със свързан с алкална фосфатаза анти-човешки IgG 1 (Mouse anti-human IgG 1-АР, cat # 9050-04, Sothem Biological Associates. Inc. Birmingham, A.L.) и р-нитрофенил фосфат. Отчитането на O.D. беше правено при 405 nm ELISA # 4: ELISA беше проведена както при тест #3, с тази разлика, че платките се покриваха с 1 pg/ml от IIIB-gpl20 (baculovirus-derved protein, Intracel, cat# 12001, Cambridge, MA). ELISA #5: ELISA бе изпълнена както при тест #3, с изключение на това, че платките се покриваха с 1 pg/ml лизат от ШВ вирус (Organon Teknika Co., Durham, N.Y.).
Неутрализационни определения.
Неутрализационни определения бяха проведени с лабораторни или първични изолати [Montefiori et al., J. Clin. Microbiol. 26:231-237 (1988); Montefiori et al., Journal of Infectious Diseases 173:60-67 (1996)]. Лабораторни изолати: вирусът се смесваше с 1:20 разреждане от всяка серумна проба и материалът се нанасяше на МТ-2 или СЕМ-Х174 клетки. Използвано бе багрилото неутрално червено за определяне жизнеността на клетките. Намаление с 35-40% на мъртвите клетки в сравнение с контролните проби бе прието като положително отклонение. Първични изолати: Вирусът се смесваше с 1:4 разреждане на всяка серумна проба и материалът се нанасяше на РНА-стимулирани РВМС. Пробите са отчитани по р24. Намаление на инфекциозността с най-малко 75% в сравнение с контролните култури е изискване за положителен резултат.
Резултати
Получаване на оригинални VVenv рекомбинантни vaccinia вируси.
За получаване на нови VV рекомбинанти (VVenv), всеки един от които експресира уникален HIV-1 Env белтък, най-напред беше изолирана ДНК от HIV-1 проби. Повечето ДНКи бяха от кръв на индивиди, които нямаха проявени външни признаци на заболяване и които при първата диагноза бяха определени като HIV-1 заразени. Допълнително ДНК беше взета от пациенти със спин или от вируси, предоставени от AIDS Research and Reference Reagent Repository. Проведен беше PCR c праймерни двойки, обхващащи Kpnl и BsmI рестрикционни места. След това фрагментите бяха включени чрез заместване в pVenv4 вектора изобразен на фигура 5 (pVenv4 оригинално експресира един скъсен HIV-1 белтък, ВН10) при Kpnl и BsmI рестрикционните места. По този начин последователностите gp 120 (V1-Y5) и gp41 от ВН10 бяха заменени със съответните последователности в PCR продуктите. С всеки субституиран плазмид, беше получен един нов VV рекомбинантен вирус (VVenv).
Този метод предоставя прост начин, по който голямо разнообразие от Env последователности може да бъде включено в уникални VV рекомбинанти (VVenv). Интересен е фактът, че по-голямата част от последователностите са иму ногенни, което насочва че Env последователностите в провирусните геноми (от които произхождат повечето PCR продукти) рядко са дефектни. Огромно разнообразие съществува измежду VVenv, използвани за ваксинната смес.
Имунизация на шимпанзета с единични или смесени VVenv.
Използвани са четири шимпанзета за тестиране на единични или смесени VVрекомбинантни ваксини. Схемата за имунизации е представена на таблица 2. Първите три инжекции съдържат VV, докато последната инжекция съдържа комбинация от gpl20, gp41 и стипца, въведени интрамускулно. Шимпанзета 1 и 2 са получили само един vaccinia вирус и съответно един белтък на обвивката, въведени с всяка от първите три инжекции. Шимпанзета 3 и 4 са получили смес от 10 рекомбинантни VV (и респективно Env в първата инжекция), 10 допълнителни Env във втората инжекция и 10 допълнителни уникални Env с последната имунизация, общо 30 различни вектори преди белтъчния усилвател. Всички шим5 панзета са получили подобни количества от тоталния vaccinia вирус в плакообразуващи единици и подобни количества от тоталните рекомбинантни белтъци.
ТАБЛИЦА 2
Схема за имунизация на шимпанзета със смесени W
рекомбинанти
Дата Инжекция
Шимпанзе 1 и 2 1/9/96 W (Env#1)
4/16/96 W (env #1)
6/11/96 W(Env#1)
7/30/96 рекомбинантен др120 и рекомбинантен др41+стипца
Шимпанзета 3 и 4 1/9/96 W (Env# 1-10)
4/16/96 W (Env #11-20)
6/11/96 W (Env #21-30)
7/30/96 рекомбинантен др120 и рекомбинантен др41 +стипца
Рекомбинантен VVenv може да бъде въведен без предизвикване на лезия.
Всичките четири шимпанзета бяха контролирани за признаци на системно заболяване и образуване на лезии на мястото на инжекцията. Животните бяха анализирани ежедневно за диария, хрема, кашлица, кихане, учестено дишане, летаргия, ограничение на движенията и загуба на апетит. Нито един от тези симптоми не беше проявен и в четирите животни по всяко време на експеримента. Фото снимки са правени на мястото на инжектиране през равни интервали от време. Първата VV имунизация предизвика подуване в четирите животни. Умерени лезии се появиха на мястото на инжектиране у шимпанзе 1 и 3, наподобяващи ваксинация за едра шарка, при шимпанзе 2 и 4 нямаше видими лезии. След втората, третата или четвъртата инжекция нямаше проявени симптоми на заболяване, подуване или лезии у никое от животните, което демонстрира, че е пре35 дизвикан VV-специфичен имунитет от първата инокулация.
Инжектиране на VVenv последвано от реимунизации води до получаване на ELISA-noложително антитяло.
HIV-специфичните антитела бяха мониторирани по време на програмата за имунизация чрез пет различни ELISA тестове. ELISA са използвани за измерване на относителното качество, а не абсолютните количества на антителата във всяко животно. В повечето случаи, тестовете са правени с вирусни фрагменти, които са загубили тримерната и олигомерната структура, типична за природния Env. В тези случаи се очаква ELISA да свързва само един подклас от HIV-специфични антитела. Резултатите, получени с Abbott ELISA са представени на фигура 6. Шимпанзе 3 превишава прага за позитивен резултат след първата VV имунизация, докато шимпанзе 4 превишава прага след втората VVenv имунизация. Имун ните отговори на шимпанзетата 3 и 4 след завършване на имунизационната схема превишават силно тези на шимпанзета 1 и 2. При ELISA #2 с MN gpl60, шимпанзе 3 единствено прояви силен отговор. Този отговор се прояви преди белтъчното усилване и не беше повлияно от реимунизацията. Отговорът на СНО-LAI, проявен с ELISA (ELISA #3) платка при ползване на същия антиген, като този приложен за реимунизация с пречистен белтък, беше силно проявен само у шимпанзе 3. При ELISA 4 платка със свързан IIIB-gpl20, шимпанзе 2 показа най-силен отговор, вероятно поради високата основна активност при това животно. Отговорите на петте ELISA, Organon Technika III вирусен лизат, бяха положителни със серуми от всичките четири животни.
Неутрализационни отговори срещу първични и лабораторни изолати.
Неутрализационни тестове бяха проведени със серуми от всяко животно срещу лабораторни и първични изолати. Първото определение бе проведено с Т-клетьчна линия, докато следващите определения бяха изпълнени на серонегативни РНА-стимулирани РВМС. Във всички случаи резултатите от изолатите не са в противоречие с тези представени за HIV-1 ваксините.
Както е показано на таблица 3, пробите от шимпанзе 2, шимпанзе 3 и шимпанзе 4 предизвикват положително отклонение (35-40% инхибиране на вирусния растеж) спрямо лабораторния изолат MN у Т клетки. Тестиране с два други лабораторни вируса (един IIIB [Lockey et al., Aids Res. Hum. Retroviruses 12:1297-1299 (1996)] и един SF2 щок) не се бележат положително с никоя проба. Представени са резултатите от неутрализационните определения [Montefiori et al., 1988, по-горе; Montefiori et al., 1996, по-горе] c четири първични изолати тестирани с РНА-стимулирани РВМС. Вирусът се разглежда като трудно неутрализиращ при тези определения, тъй като серумите от пациенти много често дават отрицателни резултати, дори когато са използвани разреждания 1:2 [Fenyo et al., AIDS 10:S97S106 (1996): Moore and Ho, AIDS 9:S117-S136 (1995); Montefirori etal., 1996, по-горе]. Интересен факт е, че 1:4 разреждане на серум от шимпанзе 4 може да неутрализира един от тестираните първични изолати. Ситуацията се различава от резултатите на други автори с Env ваксини, както е в много от предишните случаи, при които серуми от Env-имунизирани индивиди дават отрицателни резултати в Неутрализационни определения с първични изолати [Steele, Journal ofNIH research 6:40-42 (1994); Moore, Nature 376: 115 (1995)].
ТАБЛИЦА 3
Неутрализация със антисеруми от шимпанзета на вируси неспецифично представени във ваксината
Изолат Шимп.1 Шимп.2 Шимп.З Шимп.4
Лабораторен положит. положит. положит.
отклонение отклонение отклонение
Първичен #1 - - -
Първичен #2 - - -
Първичен #3 - - положит.
Първичен #4 - - -
Смесен VVenv предизвиква образуването на HIV-1 специфични антитела с по-високо качество, отколкото само VVenv.
Резултатите от ELISA и неутрализационните тестове са обобщени на таблица 4, на ко- 5 ято са представени резултатите за шимпанзетата, чиито серуми проявяват по-силни отгоТАБЛИЦА 4 вори в седемте описани по-горе тестове. Както се забелязва от таблицата, шимпанзета 3 и 4 реагират положително на общо пет от седемте теста, докато при шимпанзета 1 и 2 положителни са три от седемте теста. Този резултат може да отразява по-високо качество на антителата, предизвикани от Polyenv в сравнение само с Env ваксини.
Обобщени данни от ELISA и неутрализац йонните тестове
Тест По-силни отговори у По-силни отговори у ши мп. имуниз. само с шимп. имуниз.със смес една W от W
Abbott (IIIB-gp41)- ELISA#1 - шимп.З и шимп.4
MNgp160BAC ELISA #2 шимп.З
IIIB-gp120-BAC- ELISA шимп.2
LAI-gp120-CHO- ELISA#4 шимп.З
III b вирусен лизат ELISA #5 шимп.1 и шимп.2 шимп.З и шимп.4
Лаб.изолат-неутрализация шимп. 2 шимп.З и шимп.4 (дефлексия)
Първичен изолатнеутрализация шимп.4
Обсъждане
Експериментите, описани в този пример, бяха планирани за тестиране безопасността на HIV-1 ваксина, разработена на базата на vaccinia-вирус и да се сравни ефикасността на инициирането на имунизацията с ваксини от единичен белтък на обвивката и на коктейли от обвивки. Резултатите показват първо, че vaccinia вирусът може да бъде използван като имуноген, без да предизвиква открити лезии и второ, че с коктейл от обвивки може да бъде предизвикана широкообхватна HIV-1-специфична активност.
Моделът с шимпанзета позволява да бъде изследвана безопасността на PolyEnv у примати. Ние особено сме заитересовани от степента на образуване на открити лезии, тъй като при открити лезии инокулацията на VV може да отвори път за пренос на живи вируси у неимунизирани индивиди. В случая с HIV това е сериозна тревога, тъй като болният от СПИН може да не е в състояние да блокира VV инфекцията. С оглед на това, ние изпитахме приложението на подкожни ваксинации в шимпанзета, запитвайки се дали една отворена лезия може да бъде избегната. Наистина, само две от четирите шимпанзета получиха отворени лезии. Подобни резултати бяха наблюдавани при подкожни инокулации на култури от NYCDH vaccinia вируси при клинични изпитания на ваксина за едра шарка [Connor et al., Journal of Infectious diseases 135:167-175 (1977); Benenson et al., Journal of Infectious diseases 135:135-144 (1977)].
Възможно е c допълнително атенюиране на инжекционната процедура и последващи грижи за мястото на инжекцията, за да бъдат избегнати откритите лезии във всички случаи. Тези резултати демонстрират, че от съображения за безопасност, не следва да се спира приложението на vaccinia вируса като HIV-1 вектор за ваксина.
Коктейли от обвивката са тестирани в експерименти с мишки (пример 2) и зайци. В експериментите с мишки анти-HIV антителата са мониторирани след еднократно инжектиране на VVenv, докато при зайци VVenv са използвани за усилване на отговорите, възникнали въз основа на ДНК. Експериментите показват, че HIV-1 специфичните антитела могат да бъдат инициирани или усилени с VVenv и че първичните изолати могат да бъдат неутрализирани с отговорите на антителата. За изпитване потенциала на смесените VVenv (PolyEnv), шимпанзетата бяха разделени на две групи. Първите две шимпанзета получаваха само една VVenv, докато шимп. 3 и шимп. 4 получаваха коктейл, състоящ се от общо 30 различни VVenv.
След получаване на имунизация с vaccinia вирус, имунизацията у всичките четири шимпанзета бе усилена чрез еднократно инжектиране на gpl20/gp41 белтъчна смес в стипца. Серумите на всяко от четирите шимпанзета бяха тестирани в пет различни ELISA, всеки един използващ различен фрагмент и/ или конфигурация от Env. Интересно е, че шимп. 1 и шимп. 2 отговарят силно само в един от тези ELISA тестове, докато серумите от шимп. 3 и шимп. 4 проявяват силен отговор в 4 такива тестове. Тъй като всяко определение измерва само една фракция от HIV-1 специфичното антитяло във всяко животно, резултатите е възможно да отразяват по-големия обхват на свързващите активности на антителата, получени със смесената ваксина.
Проведени бяха също неутрализационни определения както срещу лабораторни, така и срещу първични изолати. Интересно е, че положителен отговор срещу първичен изолатбе отбелязан при шимп. 4, въпреки че първичният изолат не беше специфично представен във ваксинната смес. Тези резултати отново демонстрират по-големия обхват на антителата, получените с PolyEnv ваксинния коктейл. Може да се очаква, че повишаването на антигенната сложност на една ваксина ще води до нарастване на разнообразието от лимфоцити, а съответно и на антителата.
Демонстрирането, че неутрализиращи антитела могат да бъдат предизвикани срещу един първичен изолат, който не е представен във ваксината показва, че белтъци с различна първична структура имат обща конформационна структура. Това твърдение също се демонстрира чрез имунните отговори на инфектирани с HIV-1 пациенти, в това че всеки два индивида, които са изложени на много хиляди взаимно изключващи се вируси, са общо протектирани от суперинфекция, когато са подложени на кръстосано заразяване. Приложението на PolyEnv представлява първи опит при модел шимпанзе да се наподоби ситуацията при HIV-1 пациенти, т.е. неутрализиращи антитела с широк спектър се предизвикват не с един единствен, Env белтък, а от разнообразни белтъци на обвивката.
Като обобщение, ние тестирахме един ваксинен коктейл на базата на VV-HIV-1, наречен PolyEnv на модел шимпанзета. Този пример демонстрира:
1. VV може да бъде използвана като ваксина без да се образува отворена кожна лезия.
2. С тази ваксина могат да бъдат получени антитела с широкообхватна HIV-1 специфична активност; и
3. Коктейл от Env конструкти (PolyEnv) продуцира висококачествени неспецифични антитела, в сравнение с единичен Env конструкт.
Отдавна е известно, че vaccinia вирусът е мощна ваксина, както във формата на див тип, така и като рекомбинантна форма. Силата на VV се заключава в неговата способност да мобилизира както В-, така и цитотоксичните Т-лимфоцитни компартименти на имунния отговор. VV представлява единствената ваксина, способна да изкорени едно заболяване (едра шарка) от човечеството. Данните от този експеримент показват, че рекомбинантните VV вектори могат да допринесат за бъдещ контрол наН1У-1.
Пример 4: Получаване на бифункционален плазмид
Показано бе, че ДНК ваксините предизвикват силни отговори за антитела и CTL в няколко различни системи (инфлуенца, HIV-1 и т.н.). ДНК-ваксини за инфлуенца и HIV-1 са вече в процес на клинично изпитване при здрави възрастни индивиди. Vaccinia вирусът служи също като стабилна основа за ваксинационни програми. В действителност, vaccinia вирусът е не само единствената ваксина, способна да изкорени една болест (едрата шарка) от човечеството. Многобройни рекомбинантни vaccinia вируси предизвикват протективни имунни отговори, което е показано в експерименти с животни. Данните, представени по-горе, демонстрират ефективността на polyenv ваксината и на комбинирани ваксинационни стратегии, например ДНК ваксини и вирусни ваксини.
Конструиран е бифункционален плазмид, който може да действа като ДНК ваксина и като VV рекомбинантен вектор. Фигура 7 представя карта на този плазмид, който включва един CMV промотор за експресия в клетки на бозайници и ранен и късен промотор на vaccinia за получаване на рекомбинантна vaccinia. Директното инжектиране на пречистена плазмидна ДНК би могло да се прилага за получаване на имунни отговори срещу HI Venv белтък у тези индивиди. Плазмидът би могъл също да се използва за получаване и тестиране на живи, рекомбинантни vaccinia вируси като вехикулуми за имунизация срещу HIVenv белтъци.
Обектите биха могли потенциално да бъдат ваксинирани според една многоетапна схема, включваща както ДНК ваксинация(ии) така и имунизация(ии) с рекомбинантен vaccinia вирус, прилагани по един ред на еднократно или многократно инжектиране и/или в съчетание с допълнителни ваксинни вехикулуми.
Настоящото изобретение не се ограничава в рамките на описаните тук специфични изпълнения. Наистина, от горното описание и от придружаващите го фигури, за специалистите в тази област ще станат очевидни различни модификации на изобретението като допълнение на описаното тук. Такива модификации са предвидени да попаднат в обсега на приложените претенции. Освен това трябва да се разбере, че всички стойности за броя на базите и на аминокиселините, и всички молекулни тегла или стойности на молекулната маса, дадени за нуклеиновите киселини или пептидите, са приблизителни и са предоставени като описание.
Цитирани са различни публикации, информацията в които е представена в пълнота в самите публикации.
Списък на публикациите
Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. New York, NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995)
Avery’s Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Third Edition, AIDS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987)
Belshe, R.B. et al., J. Am. Med. Assoc. 272: 431-431 (1994)
Berkow et al., eds., The Merck Manual, Fifteenth Edirion, Merck and Co., Rahway, NJ (1987)
Bimboim, H.C. and Doly, J., Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523 (1979)
Buck, C., and Paulino, M.S. eds., American Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera. Chlamydiae and Rickettsiae, 6th Ed., American Type Culture Collection, Rockville, MD(1990)
Burns, D.P.W. and Desrosiers, R.C., Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188: 185-219(1994)
Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol., 5: 3403-3409 (1985)
Cooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1882-1886 (1993)
Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties. W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA (1983)
DeVita Jr., V.T. et al., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3rd edition, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992)
D’Honcht, Vaccine 10 Suppl.: 548-52 (1992)
Dorozynski and Anderson, Science 252: 501-502 (1991)
Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, MA (1985)
Eichberg, Int. Conf. AIDS 7: 88 (1991)
Embretson, J. et al., Nature: 359-362 (1993)
Enami et al., J. Virol. 65:2711 -2713 (1991)
Enami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3802-3805 (1990)
Fauci, Science 264: 1072-1073 (1993)
Goodman et al., eds., Goodman and Gilman’s The Pharmacologi-cal Basis of Therapeutics, Eighth Edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY (1990)
Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2): 141-143 (1994)
Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986)
Graham et al., J. Infect. Dis. 166: 244-252 (1992); J. Infect. Dis. 167: 533-537 (1993)
Grundwald-Bearch et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117: 561-567 (1991)
Hallenger et al., Virology 193: 510-514 (1993)
Hay, R., et al., eds., American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7th Ed., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1992)
Hirsch, M.S., and Curran, J. “Human Immunodeficiency viruses, biology and medical aspects”. In Virology, Fields and Knipe, eds., Raven Press, Ltd., New York, NY (1990), pp. 1545-1570
Hu et al., Nature 328: 721-723 (1987)
Ish-Horowicz, D. and Burke, J.F., Nucleic Acids Res. 9: 2989-2998 (1981)
Ito et al., J. Virol., 65: 5491-5498 (1991)
Ito et al., Cancer Res., 50: 6915-6918 (1990)
Javaherian, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 6768-6772 (1989)
Karzung, ed. Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appelton and Lange, Norwalk, CT (1992)
Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (suppl. 2): S139-143 (1994)
Kieny et al., Int. Conf. AIDS, 5:541 (1989)
Kilpatrick et al., J. Biol. Chem. 262: 116121 (1987)
Luytjes et al., Cell 59: 1107-1113 (1989)
Mackett, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419 (1982)
Mazzara, G.P. et al., Methods in Enz. 217: 557-581 (1993)
McElrath et al., J. Infect. Dis. 169: 41-47 (1994)
Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)
Osol, A., ed., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), pp. 1324-1341
Panicali, D., and Paoletti, E., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 4927-4931 (1982)
Pantaleo, G. et al., Nature 362: 355-358 (1993)
Rhim, J.S. et al., Int. J. Cancer 15: 23-29 (1975)
Richman, AIDS Res. Hum. Retroviruses 8: 1065-1071 (1992)
Richman, Annu Rev. Pharmacol. Toxicol, 33: 149-164 (1993)
Richman, Antimicrob. Agents Chemother. 37:1207-1213 (1993)
Richman, AIDS Res. Hum. Retroviruses 10: 901 (1994)
Richmond and McKinney, eds. Biosafety in microbiological and biochemical laboratories, 3rd Edition, U.S. Dept, of Health & Human Services, Washington DC (1993)
Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)
Sculz, G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978)
Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, [Washington, DC /-wp] (1979), pp. 353-358
Selenka et al., Arch. Hyg. Bakteriol. 153: 244-253 (1969)
Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)
Starcich et al., Cell 45:637 (1986)
Towbin, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76:4350(1979)
Unites States Biochemical, Sequenase Version 2.0 - DNA Sequencing Kit, Nineth
Edition, Amersham Life Sciences, Inc., Boise, Idaho (1994)
Weir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 1210-1214 (1982)
Wellis etal., J. Immunol. 99:1134-9(1967)
Wong-Staal, F., “Human immunodeficiency viruses and their replication”, in Virology, Fields and Knipe, eds., Raven Press, Ltd., New York, MY (1990), pp. 1529-1543
Wrin et al., J. Acquir. Immune Defic.
10 Syndr. 7: 211-219 (1994)
Wu et al., Progr. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21: 101-141 (1978)
Zagury et al., Nature 332: 728-731 (1988)
СПИСЪК HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ (i) ЗА ЯВИТЕЛ: St Jude Children's Research Hospital
332 North Lauderdale PO Box 318 Memphis, TN 38101-0318 United States of America
ЗАЯВИТЕЛИ /ВНОСИТЕЛИ: Hurwitz, Julia L. Coleclough, Christopher Owens, Randall J. Slobod, Karen (ii) ЗАГЛАВИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: ПОЛУЧАВАНЕ И
ПРИЛОЖЕНИЕ НА ВИРУСНИ ВЕКТОРИ ЗА СМЕСЕНИ
ВАКСИНИ ОТ БЕЛТЪЦИ НА ВИРУСНАТА ОБВИВКА СРЕЩУ ЧОВЕШКИ ИМУНОДЕФИЦИТЕН ВИРУС (iii) НОМЕР НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ: 7 (iv) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИ Я (A) АДРЕСАНТ: KLAUBER & JACKSON (B) УЛИЦА 411 HACKENSACK AVENUE (C) ГРАД: HACKENSACK (D) ЩАТ: NJ (E) СТРАНА: USA (F) КОД: 07601 (V) ФОРМА ЗА ЧЕТЕНЕ НА КОМПЮТЕР (A) СРЕДЕН ТИП: Floppy disk (B) КОМПЮТЕР: IBM PC compatible (C) ОПЕРИРАЩА СИСТЕМА: PC-DOS/MS-DOS (D) СОФТУЕР: Patent in Release# 1.0, Version # 1.30 (vi) ДАННИ ЗА СЕГАШНАТА ЗА ЯЗКА:
(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: да се определи (B) ДАТА НА ПРЕДСТАВ ЯЧЕ: настояща (C) КЛАСИФИКАЦИЯ (viii) АДВОКАТ / АГЕНТ ИНФОРМАЦИ Я (A) ИМЕ: Paul F.Fehlner (B) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 35,135 (C) НОМЕР ЗА СПРАВКА/СПИСЪК: 13401011/РСТ (ix) ТЕЛЕКОМУНИКАЦИОННА ИНФОРМАЦИ Я (A) ТЕЛЕФОН: 201-487-5800 (B) ТЕЛЕФАКС: 201-343-1684 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗАSEQ ID NO: 1 (i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 27 базови двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИ Я линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК
AGCAGAAGAC AGTGGCAATG AGAGTGA (2) ИНФОРМАЦИ Я ЗА SEQ ID NO: 2 :
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 30 базови двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИ Я линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 2:
ССАСТССАТС CAGGTCATGT ТАТТССАААТ (2) ИНФОРМАЦИ Я ЗА SEQ ID NO: 3:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 33 базови двойки (B) ТИП: нуклеинова киселин (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижн (D) ТОПОЛОГИ Я линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID NO: 3 :
GTGGGTCACA GTCTATTATG GGGTACCTGT GT (2) ИНФОРМАЦИ ЯЗА SEQ ID NO: 4:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 34 базови двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИ Я линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:5:
CCAGAGATTT АТТАСТССАА CTAGCATTCC AAGG (2) ИНФОРМАЦИ Я ЗА SEQ ID NO: 5:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 28 базови двойки (B) ТИП: нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: едноверижна (D) ТОПОЛОГИ Я линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: кДНК (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:6:
ТАСААТТТСТ GGGTCCCCTC CTGAGG (2) ИНФОРМАЦИ ЯЗА SEQ ID N0:7 :
(i) ХАРАКТЕРИСТИКА НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 880 аминокиселини (B) ТИП: аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: и двете (D) ТОПОЛОГИ Я и двете (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: белтък (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: SEQ ID N0:7:
Lys Glu Gin Lys Thr Val Ala Met Arg Val Lys Glu Ser Gin Met 15 Lys
1 9 10
Lys Gin His Leu 20 Trp Arg Trp Gly Trp 25 Arg Trp Gly Thr Met 30 Leu Leu
Gly Leu Met 35 He Cys Ser Ala Thr 40 Glu Lys Leu Trp Val 45 Thr Val Tyr
Tyr Gly SO Val Pro Val Trp Lys 55 Glu .Ala « Thr Thr Thr 60 Leu Phe Cys Ala
Ser 65 Asp Ala Lys Ala Tyr 70 Asp Thr Glu Val His 7S Asn Val Trp Ala Thr 80
His Ala Cys Val Pro 85 Thr Asp Pro Asn Pro 90 Gin Glu Val Val Leu 95 Val
Asn Val Thr Glu 100 Asn Phe Asn Met Trp 105 Lys Asn Asp Met Val 110 Glu Gin
Met His Glu 115 Asp He lie Ser Lieu 120 Trp Asp Gin Ser Leu 125 Lys Pro Cys
Val Lys 130 Leu Thr Pro Leu Cys 135 Val Ser Leu Lys Cys 140 Thr Asp Leu Lys
Asn 145 Asp Thr Asn Thr Ser 150 Asn Asn Val Thr Ser 155 Ser Ser Trp Gly Arg 160
Asn lie Met Glu Glu 165 Gly Glu Xie Lys Asn 170 Cys Ser Phe Asn lie 175 Ser
Thr Ser lie Arg 180 Gly Lys Val Gin Lys 185 Glu Tyr Ala Phe Phe 190 Tyr Lys
Leu Asp He 195 He Pro He Asp Lys 200 Gly Asn Asp Ser Asn 205 Asp Thr Thr
Ser Tyr 210 Lys Phe Thr Leu Thr 215 Ser Cys Asn Thr Ser 220 Val He Thr Gin
Ala 225 Cys Pro Lys Val Ser 230 Phe Glu Pro He Pro 235 He His Tyr Cys Ala 240
Pro Ala Gly Phe Ala 245 He Leu Lys Cys Asn 250 Asn Lys Thr Phe Asn 255 Gly
Thr Gly Pro Cys 260 Thr Asn Val Ser Thr 265 Val Gin Cys Thr His 270 Gly lie
Arg Pro Val 275 Val Ser Thr Gin Leu 280 Leu Leu Asn Gly Ser 285 Leu Ala Glu
Glu Glu 290 Val Val lie Arg Ser Ala Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr
295 300
lie 305 lie Val Gin Leu Asn 310 Gin Ser Val Glu lie 315 Asn Cys Thr Arg Pro 320
Asn Asn Asn Thr Arg 32S Lys Ser He Arg lie 330 Gin Arg Gly Phe Gly Arg 335
Ala Phe Val Thr 340 He Gly Lys He Leu 345 Gly Asn Met Arg Gin Ala His 350
Cys Asn He 35S Ser Arg Ala Lys Trp 360 Asn Asn Thr Leu Lys 365 Gin lie Asp
Ser Lvs 370 Leu Arg Glu Gin Phe 375 Gly Asn Asn Lys Thr 380 He lie Phe Lys
Gin 385 Ser Ser Gly Gly Asp 390 Pro Glu He Val Thr 395 His Ser Phe Asn Cys 400
Gly Gly Glu Phe Phe 405 Tyr Cys Asn· Ser Thr 410 Gin Leu Phe Asn Ser ТЦг 415 »
Trp Phe Asn Ser 420 Thr Trp Ser Thr \ Lys 425 Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly 430
Ser Asp Thr 435 lie Thr Leu Pro Cys 440 Arg lie Lys Gin He 445 He Asn Met
Trp Gin 450 Glu Val Gly Lys Ala 4S5 Met Tyr Ala Pro Pro 460 He Ser Gly Gin
He 465 Arg Cys Ser Ser Asn 470 He Thr Gly Leu Leu 475 Leu Thr Arg Asp Gly 480
Gly Ala Asn Glu Asn 485 Asn Glu Ser Glu lie 490 Phe Arg Pro Gly Gly Gly 495
Asp Met Arg Asp 500 Asn Trp Arg Ser Glu 505 Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val S10
Lys He Glu 515 Pro Leu Gly Val Ala 520 Pro Thr Lys Ala Lys 525 Arg Arg Val
Val Gin 530 Arg Glu Lys Arg Ala 535 Val Gly Glu He Gly 540 Ala Leu Phe Leu
Gly 545 Phe Leu Gly Ala Ala 550 Gly Ser Thr Met Gly 555 Ala Ala Ser Met Thr 560
Leu Thr Val Gin Ala 565 Arg Gin Leu Leu Ser 570 Gly He Val Gin Gin Gin 575
Asn Asn Leu Leu 580 Arg Ala He Glu Ala 585 Gin Gin His Leu Leu Gin Leu 590
Thr Val Trp 595 Gly He Lys Gin Leu 600 Gin Ala Arg He Leu 605 i Ala Val Glu
Arg Tyr 610 Leu Lys Asp Gin Gin 615 Leu . Leu . Gly lie Trp 620 • Gly Cys Ser Gly
Lys Leu He Cys Thr Thr Ala . Val . Pre > Trp Asn Ala ι Ser Trp Ser Asn
625 630 635 640
Lys Ser Leu Glu Gin lie Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Asp
645 650 655
Arg Glu lie Asn 660 Asn Tyr Thr Ser Leu 66S He His Ser Leu He 670 Glu Glu
Ser Gin Asn 675 Gin Gin Glu Lys Asn 680 Glu Gin Glu Leu Leu 685 Glu Leu Asp
Lys Trp 690 Ala Ser Leu Trp Asn 695 Trp Phe Asn lie Thr 700 Asn Trp Leu Trp
Tvr 705 He Lys Leu Phe He 710 Met He Val Gly Gly 715 Leu Val Gly Leu Arg 720
He Val Phe Ala Val 725 Leu Ser Val Val Asn 730 Arg Val Arg Gin Gly 735 Tyr
Ser Pro Leu Ser 740 Phe Gin Thr His Leu 745 Pro He Pro Arg Gly 750 Pro Asp
Arg Pro Glu 755 Gly He Glu Glu Glu Gly Gly 760 ’ Glu Arg Asp 765 Arg Asp A<g
Ser He 770 Arg Leu Val Asn Gly 775 Ser Leu Ala Leu He 780 Trp Asp Asp Leu
Arg 785 Ser Leu Cys Leu Phe 790 Ser Tyr His Arg Leu 795 Arg Asp Leu Leu Leu 800
lie Val Thr Arg He 805 Val Glu Leu Leu Gly 810 Arg Arg Gly Trp Glu 815 Ala
Leu Lys Tyr Trp 820 Trp Asn Leu Leu Gin 825 Tyr Trp Ser Gin Glu 830 Leu Lys
Asn Ser Ala 835 Val Ser Leu Leu Asn 840 Ala Thr Ala lie Ala 845 Val Ala Glu
Gly Thr 850 Asp Arg Val He Glu 855 Val Val Gin Gly Ala 860 Tyr Arg Ala He
Arg His He Pro Arg Arg He Arg Gin Gly Leu Glu Arg He Leu Leu
865 870 875 880

Claims (25)

  1. Патентни претенции
    1. Polyenv-ваксина, която включва наймалко 4 до около 10,000 различни рекомбинантни вируса, всеки съдържащ един нуклеотиден env вариант, (EV) нуклеотид, кодиращ различен вариант на белтък на обвивка на белтъка на обвивката на човешки имунодефицитен вирус, в която:
    а) EV нуклеотидът кодира, както променлива, така и константна област на варианта на белтъка на обвивката; и
    б) polyenv-ваксината е способна да предизвика у бозайници най-малко един клетъчен и един хуморален имунни отговори срещу HIV щам.
  2. 2. Polyenv-ваксина съгласно претенция 1, която включва от около 10 до около 100 рекомбинантни вируса, обхващащи различни env варианти на HIV.
  3. 3. Polyenv-ваксина съгласно претенция 1, в която рекомбинантните вируси са избрани от групата, състояща се от vaccinia, canary pox вирус, аденовирус и аденосвързан вирус (AAV).
  4. 4. Polyenv-ваксина съгласно претенция 1, в която вариантът на белтъка на обвивката включва gp 120 и част от gp41, достатъчна да позволи олигомеризация на env белтъци.
  5. 5. Polyenv-ваксина съгласно претенция 4, в която EV нуклеотидът съдържа KpnI-BsmI рестрикционен фрагмент от нуклеотида, кодиращ белтъка на HIV-обвивката.
  6. 6. Polyenv-ваксина съгласно претенция 1, в която EV нуклеотидът е изолиран от пациенти, заразени с HIV вирус от географски ограничена област или от пациенти, заразени с HI V вирус от различни популации.
  7. 7. Polyenv-ваксина съгласно претенция 1, която съдържа варианти на белтъка на обвивката, експресирани от рекомбинантния вирус.
  8. 8. Polyenv-ваксина съгласно претенция 1, която съдържа допълнително най-малко един фармацевтично приемлив носител, адювант и антивирусно химиотерапевтично съединение.
  9. 9. Метод за получаване на polyenv-ваксина съгласно претенция 1, включващ комбиниране в сместа на най-малко 4 до около 10,000 различни рекомбинантни вируса, за да се получи polyenv-ваксина, в който
    i) всеки от рекомбинантните вируси съдържа вариант на env (EV) нуклеотид, кодиращ различен вариант на белтък на обвивка на белтък на обвивката на HIV;
    ii) EV нуклеотидът кодира, както променлива, така и константна области на варианта на белтъка на обвивката; и iii) polyenv-ваксината е способна да предизвика у бозайници най-малко един клетъчен и един хуморален имунни отговори срещу H1V щам.
  10. 10. Метод съгласно претенция 9, при който се комбинират от около 10 до около 100 рекомбинантни вируса, включващи различни env варианти на HI V.
  11. 11. Метод съгласно претенция 9, при който рекомбинантните вируси са избрани от групата, състояща се от vaccinia, canary pox вирус, аденовирус и аденосвързан вирус (AAV).
  12. 12. Метод съгласно претенция 9, при който вариантът на белтъка на обвивката включва gpl 20 и част от gp41, достатъчна да позволи олигомеризация на env белтъци.
  13. 13. Метод съгласно претенция 12, при който EV нуклеотидът съдържа KnpI-BsmI рестрикционен фрагмент от нуклеотида, кодиращ белтък на обвивката на HIV.
  14. 14. Метод съгласно претенция 9, при който EV нуклеотидът се изолира от пациенти, заразени с HIV вирус от географски ограничена област или от пациенти, заразени с HIV вирус от различни популации.
  15. 15. Метод съгласно претенция 9, при който ваксината включва варианти на белтъка на обвивката, експресирани от рекомбинантния вирус.
  16. 16. Метод съгласно претенция 9, при който етапът на комбиниране включва добавяне на най-малко един фармацевтично приемлив носител, на адювант и на антивирусно химиотерапевтично съединение.
  17. 17. Polyenv-ваксина, получена по метод съгласно претенция 9.
  18. 18. Използване на polyenv-ваксина съгласно всяка претенция от 1 до 8 за получаване на лекарство, което е ефикасно за предизвикване на хуморален или на клетъчен имунен отговор, или и на двата, срещу човешки имунодефицитен вирус (HIV) у бозайници.
  19. 19. Използване съгласно претенция 18, при което рекомбинантният вирус е vaccinia вирус, а polyenv-ваксината е във форма за подкожно приложение.
  20. 20. Използване съгласно претенция 18, при което заедно с polyenv-ваксината се използва и втора polyenv-ваксина съгласно всяка претенция от 1 до 8, за получаване на лекарство, което е ефикасно за предизвикване на хуморален или на клетъчен имунен отговор, или и на двата, срещу човешки имунодефицитен вирус (HIV) у бозайници, като рекомбинантните вируси на втората polyenv-ваксина са различни видове от рекомбинантните вируси на ваксината съгласно претенция 18.
  21. 21. Използване съгласно претенция 18, което допълнително включва използване на (i) най-малко един рекомбинантен HIV env белтък или на (ii) най-малко един ДНК-вектор, кодиращ експресия за рекомбинантен HIV env белтък, (iii) или и на двата, за получаване на първично или реваксиниращо лекарство, ефикасно за предизвикване на хуморален или клетъчен имунен отговор, или и на двата, при първична ваксинация или при реваксинация.
  22. 22. Използване съгласно претенция 21, при което рекомбинантният HIV env белтък е смесен с адювант или е формулиран за вътремускулно приложение, или и двете; или ДНКвекторът е формулиран за прилагане с генпушка.
  23. 23. Бифункционален плазмид, който може да служи като ДНК ваксина и рекомбинантен вирусен вектор, включващ хетероложен ген и/или инсерционно място за контролиран хетероложен ген или животинска последователност, контролираща експресията е последователност за контрол на вирусна експресия.
  24. 24. Бифункционален плазмид съгласно претенция 23, в който хетероложният ген е вариант на env (EV) нуклеотид, кодиращ както променливи, така и постоянни области на вариант на белтък на обвивка на белтъка на об- 5 вивка на HIV.
  25. 25. Бифункционален плазмид съгласно претенция 23, в който животинската последо вателност, контролираща експресията, е цитомегаловирусен непосредствен ранен (CMV) промотор, а последователността, контролираща вирусната експресия, е vaccinia вирусен ранен промотор, vaccinia вирусен късен промотор или и двата.
BG102712A 1996-01-23 1998-08-21 Смес от рекомбинантни вектори на ваксина като роlyеnv ваксини за нiv BG64711B1 (bg)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/590,288 US5741492A (en) 1996-01-23 1996-01-23 Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG102712A BG102712A (bg) 1999-04-30
BG64711B1 true BG64711B1 (bg) 2005-12-30

Family

ID=24361647

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG102712A BG64711B1 (bg) 1996-01-23 1998-08-21 Смес от рекомбинантни вектори на ваксина като роlyеnv ваксини за нiv

Country Status (29)

Country Link
US (3) US5741492A (bg)
EP (2) EP0876498B1 (bg)
JP (2) JP2000504326A (bg)
KR (1) KR100571479B1 (bg)
CN (1) CN1229501C (bg)
AP (1) AP1200A (bg)
AT (1) ATE278790T1 (bg)
AU (1) AU709174B2 (bg)
BG (1) BG64711B1 (bg)
BR (1) BR9707611A (bg)
CA (1) CA2243570C (bg)
CZ (1) CZ296575B6 (bg)
DE (1) DE69731075T2 (bg)
DK (1) DK0876498T3 (bg)
EA (1) EA002390B1 (bg)
ES (1) ES2230596T3 (bg)
GE (1) GEP20032902B (bg)
HK (1) HK1016218A1 (bg)
HU (2) HU0402182D0 (bg)
IL (2) IL156919A0 (bg)
NO (1) NO322261B1 (bg)
NZ (1) NZ331024A (bg)
OA (1) OA10814A (bg)
PL (1) PL188641B1 (bg)
PT (1) PT876498E (bg)
RO (1) RO120268B1 (bg)
TR (1) TR199801418T2 (bg)
UA (1) UA73712C2 (bg)
WO (1) WO1997027311A1 (bg)

Families Citing this family (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7488485B2 (en) * 2003-09-16 2009-02-10 University Of Kansas Medical Center DNA vaccine compositions and methods of use
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
US6919318B1 (en) * 1998-04-22 2005-07-19 Chiron Corporation Enhancing immune responses to genetic immunization by using a chemokine
WO1999061049A2 (en) * 1998-05-22 1999-12-02 University Of Massachusetts Medical Center Model for infection by a pathogen using administration of nucleic acids
US6562800B1 (en) * 1998-10-30 2003-05-13 University Of Southern California Use of immunopotentiating sequences for inducing immune response
US6759237B1 (en) 1998-11-05 2004-07-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adeno-associated virus serotype 1 nucleic acid sequences, vectors and host cells containing same
JP2002538770A (ja) * 1998-11-10 2002-11-19 ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル ウイルスベクターとその製造及び投与の方法
WO2000039303A2 (en) * 1998-12-31 2000-07-06 Chiron Corporation Modified hiv env polypeptides
AU2487300A (en) 1998-12-31 2000-07-31 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US7935805B1 (en) * 1998-12-31 2011-05-03 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1141313A2 (en) * 1998-12-31 2001-10-10 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
WO2000044410A2 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Stichting Biomedical Primate Research Centre Composition and method for obtaining specific immunisation against one or more antigens using different recombinant vectors
DE19907485B4 (de) * 1999-02-12 2008-01-17 Strathmann Ag & Co. Virus-Vakzine
US6420545B1 (en) * 1999-05-24 2002-07-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania CD4-independent HIV envelope proteins as vaccines and therapeutics
AU3793701A (en) * 1999-11-29 2001-06-04 Orchid Biosciences, Inc. Methods of identifying optimal drug combinations and compositions thereof
US20040105871A1 (en) * 2000-03-02 2004-06-03 Robinson Harriet L. Compositions and methods for generating an immune response
WO2001092470A2 (en) 2000-03-02 2001-12-06 Emory University Dna expression vectors and methods of use
US8623379B2 (en) * 2000-03-02 2014-01-07 Emory University Compositions and methods for generating an immune response
EP1311278A4 (en) * 2000-08-07 2005-01-05 Sloan Kettering Institutefor C METHOD AND IMMUNIZATION COMPOSITION USING MIXED POOLS OF NUCLEIC ACIDS OR MUTED PEPTIDES
DE60239317D1 (de) * 2001-01-12 2011-04-14 Novartis Vaccines & Diagnostic Nukleinsäure mukosale immunisierung
AU2002252199B2 (en) * 2001-03-08 2008-01-03 Emory University MVA expressing modified HIV envelope, GAG, and POL genes
AU2002320314A1 (en) * 2001-07-05 2003-01-21 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP2292772A1 (en) * 2001-07-05 2011-03-09 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. HIV vaccination with a DNA encoding a HIV polypeptide and a HIV polypeptide
GB0118532D0 (en) * 2001-07-30 2001-09-19 Isis Innovation Materials and methods relating to improved vaccination strategies
US20030170614A1 (en) * 2001-08-31 2003-09-11 Megede Jan Zur Polynucleotides encoding antigenic HIV type B polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2003020876A2 (en) * 2001-08-31 2003-03-13 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type b polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20030228327A1 (en) * 2001-11-05 2003-12-11 Lasher Alfred W. DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
US20070269456A1 (en) * 2001-11-05 2007-11-22 Lasher Alfred W DNA-based plasmid formulations and vaccines and prophylactics containing the same
EP1450854A2 (en) 2001-11-30 2004-09-01 Isis Innovation Limited Vaccine
US7094410B2 (en) * 2002-03-02 2006-08-22 The Scripps Research Institute DNA vaccine against proliferating endothelial cells and methods of use thereof
US6923958B2 (en) * 2002-03-02 2005-08-02 The Scripps Research Institute DNA vaccines encoding CEA and a CD40 ligand and methods of use thereof
US20040106566A1 (en) * 2002-05-17 2004-06-03 Shi-Lung Lin RNA-splicing and processing-directed gene silencing and the relative applications thereof
EP2316479B8 (en) * 2002-07-18 2015-03-18 University of Washington Pharmaceutical compositions comprising immunologically active herpes simplex virus (HSV) protein fragments
CA2505583C (en) * 2002-12-03 2014-07-15 University Of Massachusetts Polyvalent, primary hiv-1 glycoprotein dna vaccines and vaccination methods
JP2006528244A (ja) 2003-05-12 2006-12-14 ユニバーシティ オブ フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイティド Ｆｉｖ感染予防接種のための材料と方法
US7658927B2 (en) * 2003-05-12 2010-02-09 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for immunizing against FIV infection
US8076060B2 (en) * 2003-08-04 2011-12-13 Emil William Chynn Vaccination and immunotherapy as new therapeutic modalities in the treatment of glaucoma
EP2055316A1 (en) * 2003-09-09 2009-05-06 VIRxSYS Corporation Lentivirus vector-based approaches for generating an immune response to HIV in humans
EP1675613B1 (en) 2003-09-15 2012-05-23 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Hiv vaccines based on env of multiple clades of hiv
US20070166784A1 (en) * 2003-09-15 2007-07-19 Barnett Susan W Combination approaches for generating immune responses
US20050175627A1 (en) * 2003-09-24 2005-08-11 Oxxon Therapeutics Ltd. HIV pharmaccines
US7622125B2 (en) 2004-05-05 2009-11-24 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Polycistronic HIV vector constructs
US7342107B2 (en) * 2004-05-27 2008-03-11 Centocor, Inc. Cynomolgus prostate specific antigen
CA2570563A1 (en) * 2004-06-15 2006-09-28 Centocor, Inc. Method for screening agents against human prostate disease
AU2005274948B2 (en) * 2004-07-16 2011-09-22 Genvec, Inc. Vaccines against aids comprising CMV/R-nucleic acid constructs
US20080085261A1 (en) * 2004-10-19 2008-04-10 Haynes Barton F Vaccine Adjuvant
EP2266602A3 (en) 2004-11-01 2011-08-10 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination approaches for generating immune responses
AU2005316476A1 (en) * 2004-12-15 2006-06-22 University Of Florida Research Foundation, Inc. Chimeric vectors
US20100098721A1 (en) * 2006-10-18 2010-04-22 St. Jude Children's Reseach Hospital Methods and compositions for preparing a universal influenza vaccine
WO2010093784A2 (en) 2009-02-11 2010-08-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Modified virus vectors and methods of making and using the same
WO2012070974A1 (ru) * 2010-11-22 2012-05-31 Farber Boris Slavinovich Вакцины с повышенной иммуногенностью и способы их получения
CA2826286C (en) * 2011-01-31 2021-09-21 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
AP2013007166A0 (en) 2011-04-06 2013-10-31 Univ Paris Descartes Inst De Rech Pour Le Dev Ird Pharmaceutical compositions for preventing and/or treating an HIV disease in humans
JP2014533290A (ja) 2011-11-14 2014-12-11 ノバルティス アーゲー ポリアニオン性カルボマーとＥｎｖポリペプチドとの免疫原性複合体ならびにその製造法および使用法
WO2013126622A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 President And Fellows Of Harvard College Methods for displaying polypeptides and uses thereof
LT3390430T (lt) * 2015-12-15 2019-11-25 Janssen Vaccines & Prevention Bv Žmogaus imunodeficito antigenai, vektoriai, kompozicijos ir jų panaudojimo būdai
CN113874078A (zh) 2019-04-05 2021-12-31 Tauc3生物制品有限公司 抗tauc3抗体及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198214A (en) * 1983-08-31 1993-03-30 Stolle Research & Development Corporation Anti-mastitis polyvalent vaccine, method of administration and method for production thereof
GR862412B (en) * 1985-09-25 1987-01-23 Oncogen Vaccines and immuinoassays for acquired immune deficiency syndrome
EP0243029A1 (en) * 1986-04-08 1987-10-28 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus gene
US5169763A (en) * 1986-04-08 1992-12-08 Transgene S.A., Institut Pasteur Viral vector coding glycoprotein of HIV-1
US5081226A (en) * 1986-12-30 1992-01-14 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Synthetic peptides sharing sequence homology with the HIV envelope protein
EP0469089B1 (en) * 1989-04-18 1997-11-19 Applied Biotechnology, Inc. Generation of hybrid genes and proteins by virus-mediated recombination
EP1156102A1 (en) * 1991-06-14 2001-11-21 Virogenetics Corporation Immunodeficiency virus recombinant poxvirus vaccine
US5643578A (en) * 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
DE69536091D1 (de) * 1994-01-27 2010-09-09 Univ Massachusetts Medical Immunisierung durch Impfung von DNS Transkriptionseinheit
FR2728794B1 (fr) * 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro

Also Published As

Publication number Publication date
KR100571479B1 (ko) 2007-06-07
PL188641B1 (pl) 2005-03-31
IL125497A (en) 2007-07-04
CA2243570A1 (en) 1997-07-31
EA002390B1 (ru) 2002-04-25
GEP20032902B (en) 2003-02-25
HUP9900389A2 (hu) 1999-06-28
BG102712A (bg) 1999-04-30
WO1997027311A1 (en) 1997-07-31
CZ229398A3 (cs) 1998-12-16
NO983377L (no) 1998-09-23
AU709174B2 (en) 1999-08-26
RO120268B1 (ro) 2005-11-30
OA10814A (en) 2003-01-28
EP1378516A1 (en) 2004-01-07
HK1016218A1 (en) 1999-10-29
DE69731075D1 (de) 2004-11-11
EP0876498A1 (en) 1998-11-11
US6086891A (en) 2000-07-11
NO322261B1 (no) 2006-09-04
ES2230596T3 (es) 2005-05-01
AP9801325A0 (en) 1998-09-30
KR19990081931A (ko) 1999-11-15
EA199800638A1 (ru) 1999-02-25
HU224344B1 (hu) 2005-08-29
NO983377D0 (no) 1998-07-22
US5741492A (en) 1998-04-21
HU0402182D0 (en) 2004-12-28
BR9707611A (pt) 1999-07-27
CA2243570C (en) 2001-08-14
ATE278790T1 (de) 2004-10-15
CN1229501C (zh) 2005-11-30
PT876498E (pt) 2005-02-28
IL156919A0 (en) 2004-02-08
CN1214083A (zh) 1999-04-14
CZ296575B6 (cs) 2006-04-12
US5846546A (en) 1998-12-08
AP1200A (en) 2003-08-29
JP2007259870A (ja) 2007-10-11
UA73712C2 (en) 2005-09-15
JP2000504326A (ja) 2000-04-11
DE69731075T2 (de) 2006-03-09
PL328193A1 (en) 1999-01-18
DK0876498T3 (da) 2005-02-07
TR199801418T2 (xx) 1998-10-21
NZ331024A (en) 2000-02-28
AU1829997A (en) 1997-08-20
EP0876498B1 (en) 2004-10-06
IL125497A0 (en) 1999-03-12
HUP9900389A3 (en) 2001-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5846546A (en) Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein immunogenic composition against human immunodeficiency viruses
WO1997027311A9 (en) Mixture of recombinant vaccinia vectors as polyenv vaccines for hiv
ES2256323T5 (es) Variante del virus Vaccinia Ankara Modificado
US20200071724A1 (en) Intergenic Sites Between Conserved Genes in the Genome of Modified Vaccinia Ankara (MVA) Vaccinia Virus
Earl et al. Comparison of vaccine strategies using recombinant env–gag–pol MVA with or without an oligomeric Env protein boost in the SHIV rhesus macaque model
US7981430B2 (en) Multi-clade chimeric immunogens derived from highly conserved regions of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) consensus proteome
JP5789263B2 (ja) 再構築された挿入部位を含有する組換え改変ワクシニアアンカラ（ｍｖａ）ワクシニアウイルス
JP4125128B2 (ja) ヒト免疫不全ウイルスのキメラタンパク質用組換えポックスウイルス
US20090227658A1 (en) Methods and compositions for immunization against hiv
CA2407303A1 (en) Improved immunogenicity using a combination of dna and vaccinia virus vector vaccines
US6723558B1 (en) Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses