CZ296575B6 - Polyenv vakcína - Google Patents

Abstract

Polyenv vakcína, která je vybraná ze skupiny slozené z: a) polyenv vakcíny zahrnující alespon 4 az 10 000 odlisných rekombinantních viru, z nichz kazdý obsahuje nukleovou kyselinu obalové (env) varianty (EV) kódující odlisnou variantu obalového proteinu lidského viru imunodeficience (HIV) nebo b) polyenv vakcíny zahrnující alespon 4 az 10 000 odlisných DNA vektoru, z nichz kazdý obsahuje nukleovou kyselinu obalové (env) varianty (EV) kódující odlisnou variantu obalového proteinu lidského viru imunodeficience (HIV); kde je polyenv vakcína schopna vyvolat imunitní odpoved na více nez jednu, ale nutne ne na vsechny obalové (env) varianty (EV) obsazené v polyenv vakcíne, kde nukleová kyselina obalové (env) varianty (EV) kóduje jak variabilní,tak konstantní oblasti varianty obalového proteinu, a kde polyenv vakcína je schopna vyvolat alespon jednu z bunecné a humorální imunitní odpovedi u savce proti kmenum viru HIV.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález popisuje polyenv vakcínu pro lidský virus imunodeficience (HIV), skládající se ze směsi alespoň 4 až 40 a až 10 000 rekombinantních virů vakcinie, z nichž každý exprimuje odlišnou variantu obalového proteinu env viru HIV. Tato vakcína je vhodná pro vakcinaci savců, včetně lidí, aby neočekávaně zvýšila buněčnou a/nebo humorální imunitní odpověď na HIV infekci. Navíc vynález popisuje použití výroby a použití těchto rekombinantních virů vakcinie a polyenv vakcíny.

Dosavadní stav techniky

Virus AIDS pravděpodobně nakazí do roku 2000 desítky miliónů lidí a stává se díky tomu problémem světového zdravotnictví s vrcholnou prioritou (viz DeVita, et al., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3^rd edition, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992); Wong-Staal, Virology, pp 1592-1543; Hirsch, et al., Virology, pp 1545-1570). Vytvoření efektivní HIV vakcíny představuje značný problém pro imunology, neboť enzym reverzní transkriptáza, účastnící se replikace HIV, způsobuje při přepisu vysoké procento chyb. To vede ke vzniku mnoha mutantních HIV kmenů majících vnější obal složený z proteinů s odlišnou sekvencí. Tyto variantní obalové proteiny jsou pak rozeznávány jako odlišné antigeny imunitním systémem savců, který produkuje více než 10⁹ nových lymfocytů denně za účelem eliminace cizorodých antigenů. Humorální a buněčný typ imunitní odpovědi je zajištěn B a T lymfocyty.

Dobrý příklad kvalitativní intenzity těchto imunitních reakcí je ukázán na HIV infikovaném pacientovi a SIV infikovaném makakovi. V obou případech dochází k následujícím fázím infekce, imunitní reakce a selekce variantních kmenů HIV a SIV (Wrin et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994); Bums and Desrosiers, Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188:185-219 (1994)). S každým následujícím cyklem diverzita antigenních determinant viru HIV (a odpovídající imunitní odpovědi) narůstá, takže imunitní odpovědi neutralizují široké spektrum variant SIV a HIV a vznik superinfekce je velkou měrou inhibován.

Nicméně pacienti infikovaní AIDS vytváří kompromisní odpověď, která se stává nedostatečná na to, aby zdolala virovou infekci HIV, která nakonec překoná pacientův imunitní systém. To může být částečně i díky tomu, že nově vzniklé viry HIV s variantním obalovým proteinem nejsou rozeznávané imunitním systémem a unikají tak zničení (Sci. Amer., Aug 1995, pp.). V těchto případech, třebaže imunitní odpověď by byla schopna zvládnout infekci de novo (např. perzistující mutace viru v privilegovaných izolovaných místech), infekce HIV může nakonec překonat pacientův imunitní systém (Pantaleo et al., Nátuře 362:355-358 (1993); Embretson etal., Nátuře 362:359-362 (1993)).

Identifikace B a T antigenních determinant proti HIV proteinům je stále nekompletní. Obalové proteiny viru HIV jsou složeny, jak bylo zjištěno z variabilních (VI až V5) a konstantních (Cl až C5) oblastí. Peptid představující region V3 byl nazván hlavní neutralizační determinanta (PND) (Javaherian et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 86:6768-6772 (1989)), ačkoliv i ostatní oblasti proteinu obalu mohou být příčinou vyvolání imunitní odpovědi. Celá délka proteinu obalu viru HIV obsahuje mezi 850 až 900 aminokyselinami, s variabilní délkou způsobenou hypermutací (Starcích et al., Cell 45:637 (1986)).

První vakcíny proti HIV testované v klinické praxi byly vytvořené tak aby prezentovaly jeden obalový protein, nebo jeho části, imunitnímu systému. Avšak neutralizační odpověď proti jednomu nebo několika obalovým proteinům nerozeznává odlišné kmeny HIV a jednotlivec pak není chráněn proti infekci (Belshe et al., J. Am. Med. Assoc. 272:431-431 (1994); patent

-1 CZ 296575 B6

US 5 169 763; PCT publication WO 87/06262; Zagury et al., Nátuře 332:728-731 (1988); Kieny et al., Int. Conf. AIDS 5:541 (1989); Eichberg, Int Conf. AIDS 7:88(1991); Cooney et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:1882-18886 (1993); Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-252 (1992); J. Infect. Dis. 167:533-537 (1993); Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2):S 139— 143 (1994); Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. (Suppl. 2):S141—143 (1994); McElrath et al., J. Infect. Dis. 169:41-47 (1994); Fauci, Science 264: 1072-1073) (May 1994)).

Z toho vyplývá, že vytvoření vakem a metod, které budou schopné stimulovat imunitní odpověď tak, aby byla dostatečná k léčení nebo prevenci HIV infekce, je zcela naléhavé.

Podstata vynálezu

Komplikace dosavadního stavu techniky překonává polyenv vakcína podle vynálezu, která je vybraná ze skupiny složené z

a) polyenv vakcíny zahrnující alespoň 4 až 10 000 odlišných rekombinantních virů, z nichž každý obsahuje nukleovou kyselinu obalové (env) varianty (EV) kódující odlišnou variantu obalového proteinu lidského viru imunodeficience (HIV) nebo

b) polyenv vakcíny zahrnující alespoň 4 až 10 000 odlišných DNA vektorů, z nichž každý obsahuje nukleovou kyselinu obalové (env) varianty (EV) kódující odlišnou variantu obalového proteinu lidského viru imunodeficience (HIV);

kde je polyenv vakcína schopna vyvolat imunitní odpověď na více než jednu, ale nutně ne na všechny obalové (env) varianty (EV) obsažené v polyenv vakcíně, kde nukleová kyselina obalové (env) varianty (EV) kóduje jak variabilní tak konstantní oblasti varianty obalového proteinu, a kde polyenv vakcína je schopna vyvolat alespoň jednu z buněčné a humorální imunitní odpovědi u savce proti kmenům viru HIV.

Konkrétně, polyenv vakcína podle vynálezu, indukuje daleko rozsáhlejší imunitní odpověď. Výhodou navrhovaného vynálezu je schopnost stimulovat populace B buněk, T-helperů a T-cytotoxických buněk k efektivní imunitní odpovědi v oblasti buněčné i humorální imunity. Například, vakcína navrhovaná vynálezem je schopna stimulovat protilátkovou imunitní odpověď proti HIV s velmi širokým spektrem specifit. Testy s neutralizací viru dokazují, že se jedná o protilátky s vysokou úrovní specifity. Je zajímavé, že vakcína navrhovaná vynálezem generuje imunitní odpověď i vůči kmenům HIV, které jsou vůči ní „naivní“, tzn. kmeny HIV, jejichž obalové proteiny nebyly zahrnuty v polyenv koktejlu.

Ke zvýšení účinnosti HIV vakcín, předkládaný vynález navrhujepolyenv vakcínu, která se skládá z alespoň 4 až 10 000, lépe pak okolo 4 až 1000 a nejlépe pak od 10 do 100, odlišných rekombinantních virů exprimujících na svém povrchu odlišné varianty obalového proteinu (EPV) viru HIV (nebo jejich části), které obsahují jak konstantní, tak variabilní oblasti obalového proteinu. Je s výhodou pokud každá z exprimováných variant obalového proteinu má strukturu a/nebo imunologickou podobu struktury, která se vyskytuje na přirozených obalových proteinech viru HIV nacházejících se na povrchu infikovaných buněk, nebo v lipidické membráně viru ve formě oligomeru. Také je zde uváděn způsob výroby a použití těchto rekombinantních virů jako polyenv vakcíny. Pokud je tato směs použita jako vakcína, každá z variant obalového proteinu indukuje odlišnou subpopulaci B a/nebo T buněk, odpovídající specifity vzhledem k variantě obalového proteinu, a tím pádem násobí intenzitu imunitní odpovědi. Směs o tomto složení, typu a/nebo struktuře obalového proteinu je nově objeveným způsobem, jak vyvolat silnou, dlouhodobou HlV-specifickou imunitní odpověď s širokým spektrem neutralizační aktivity.

-2CZ 296575 B6

V preferované variantě vynálezu jsou rekombinantní viry vybrány z této skupiny: vakcinie, virus kanářích neštovic (canary pox virus), adenovirus a adeno-associated virus (AAV). V tomto případě, byl pro přípravu vybrán virus infra vakcinie. V preferované variantě vynálezu byla vakcína, složená z rekombinantních variant viru vakcinie, aplikována podkožně. Další výhodou tohoto vynálezu je, že vakcína vakcinie podaná podkožně nezpůsobuje tvorbu lézí a tedy znemožnění nárůstu populace infekční vakcinie tak, aby se stala dostatečnou pro vyvolání imunitní odpovědi.

Je s výhodou, pokud virová polyenv vakcína navrhovaná vynálezem obsahuje lyzát virem infikovaných rostoucích buněk, např. vero buněk, který obsahuje další varianty obalového proteinu, navíc k těm exprimovaným infekčním virem. Zahrnutí variant obalového proteinu obsažených v lyzátu, které také indukují imunitní odpověď, je podstatnou částí tohoto vynálezu, neboť obecně je virus z buněčného lyzátu vyčištěn.

Ve vakcíně navrhované vynálezem, mohou být nukleotidy pro EV izolované z pacientů infikovaných virem HIV z geograficky vzdálených oblastí, od pacientů infikovaných virem HIV z rozdílných prostředí, nebo z laboratorně izolovaných virů HIV.

Navrhovatel zjistil, že navrhovaná polyenv vakcína stimuluje neočekávaně intenzivní imunitní odpověď, díky expresi a/nebo prezentaci mnoha variant obalového proteinu, kde všechny obsahují jak konstantní, tak variabilní oblasti pokud možno mající strukturu která je alespoň částečně podobná přirozeným formám obalového proteinu viru HIV. Zvýšená imunitní odpověď rozeznává další kmeny HIV navíc k těm, které exprimují obalové proteiny použité v polyenv vakcíně. Tedy, záměrem této vakcíny je stimulovat imunitní odpověď na široké spektrum virů HIV, tak, aby tato reakce byla natolik intenzivní, aby zvládla odstranění viru z organizmu nebo preventovala před infekcí (nebo zvládla díky mutaci pokračující infekci) různými kmeny viru.

Navrhovaný vynález také popisuje env varianty (EV) nukleových kyselin kódujících (nebo k nim komplementárních) alespoň jednu antigenní determinantu variantního proteinu env (EPV). EPV je pokud možno, kódováno rekombinantním virem, dále použitým v polyenv vakcíně navrhované předkládaným vynálezem. Varianty nukleových kyselin obsahují alespoň jednu mutaci, která má jiné antigenní vlastnosti, nebo prostorovou strukturu, než kódovaná EPV.

Navrhovaný vynález také popisuje složení vakcíny, obsahující polyenv vakcínu navrhovanou vynálezem a farmaceuticky přijatelný nosič nebo rozpouštědlo. Směs vakcíny může dále obsahovat nějaké adjuvans a/nebo cytokiny, které zesilují u savců vystavených působení vakcíny imunitní reakci, vyvolanou polyenv vakcínou, na alespoň jeden kmen HIV. Polyenv vakcína navrhovaná vynálezem je schopná indukovat alespoň částečnou imunitní odpověď, a to buď humorální imunitní odpověď (tzn. protilátkovou odpověď), nebo buněčnou (tzn. aktivované B buňky, pomocné T buňky a cytotoxické T buňky (CTL)).

Navrhovaný vynález také popisuje způsob vyvolání imunitní odpovědi na HIV infekci u savců, který má profylaktický účinek pro následnou HIV infekci, kdy tato metoda představuje vystavení savce směsné vakcíně obsahující polyenv vakcínu navrhovanou vynálezem, která bude jedince chránit proti klinicky vyvolané HIV patogenezi způsobené infekcí alespoň jedním HIV kmenem. Další možností je profylaktická nebo terapeutická metoda vyvolání imunitní odpovědi na HIV, představující vystavení efektivního množství jiné (např. druhé) polyenv vakcíny skládající se z alespoň 4 až 10 000 rozdílných rekombinantních virů, kdy rekombinantní viry jsou odlišného druhu od těch použitých v předchozí vakcíně, a každý z rekombinantních virů v polyenv vakcíně obsahuje variantu nukleové kyseliny kódující odlišnou variantu obalového proteinu viru HIV.

HIV specifická imunitní odpověď indukovaná polyenv vakcínou tvořenou rekombinantním virem vakcinie navrhovanou vynálezem, může být dále zesílena podpořením nebo stimulací imunitní odpovědi buď humorálního, buněčného, nebo obou typů, přidáním efektivního množství buď rekombinantního HIV env proteinu, nebo DNA vakcíny, nebo dokonce obou. Pokud možno, je rekombinantní protein nebo DNA vakcína součástí polyenv vakcíny. Všechny vakcinační strate-3 CZ 296575 B6 gie zde popisované mohou probíhat v libovolném pořadí. Například, subjektu může být aplikována rekombinantní polyenv vakcína, následovaná podpůrnou DNA vakcínou a poté rekombinantní proteinovou vakcínou. Je vhodné aby rekombinantní env protein byl podáván v adjuvans. Ve specifickém případě, uváděném jako příklad byl infra rekombinantní HIV env protein podáván intramuskulárně. Je preferováno, aby DNA vakcína byla podávána pomocí zařízení zvaného „gene gun“.

Výše popsané metody, navrhované vynálezem přinášejí nové možnosti pro genové inženýrství a nové plazmidové vektory. V důsledku tedy navrhovaný vynález popisuje bifunkční plazmid, který může sloužit jako DNA vakcína nebo rekombinantní virový vektor, obsahující rozmanité heterogenní oblasti které jsou regulovány jak regulačními sekvencemi hostitelského zvířete, tak původními virovými regulačními oblastmi. Pokud možno, zvířecí regulační sekvence je velmi časný promotor cytomegaloviru a virové sekvence regulující expresi mohou být časný nebo pozdní promotor viru vakcinie, nebo oba dva.

Další záměry, rysy, výhody, způsoby použití a konkrétní varianty vynálezu budou zřejmé odborníkům v oboru z následujícího detailního popisu a příkladů vztahujícím se k tomuto vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 Schématické znázorněné orientace HIV-1 genu v genomu viru vakcinie

Gen obalového proteinu HIV-1 je umístěn mezi pravým a levým segmentem lokusu thymidin kinázy. Na C- terminálním konci genu pro obalový protein HIV-1 leží restrikční místo pro HindlII. Vhodná velikost inzertního fragmentu získaného pomocí HindlII je přibližně 7 kb. Southem blot tohoto vzorku ověří správnou pozici a orientaci genu pro obalový protein HIV-1.

Obr. 2 Grafické znázornění dat dokazujících že HIV specifická protilátková odpověď má na savčím modelu dlouhodobou účinnost.

Jsou zde znázorněny výsledky testu reprezentativního vzorku myších sér na HIV specifické protilátky pomocí ELISA techniky. Před ELIS A testem byl každý vzorek ředěn 1:100 (plný sloupec), 1:1000 (mřížkovaný sloupec) a 1:10 000 (prázdný sloupec). Myši byly odebírány po různé době (1 měsíc, 4 měsíce a 6 měsíců) od aplikace 10⁷ pfu konstruktů viru vakcinie exprimujících jeden obalový protein HIV-1. Jako kontrolní myši byly považovány myši imunizované virem vakcinie bez rekombinantní sekvence pro obalový protein. Jsou znázorněny standardní odchylky.

Obr. 3 Grafické znázornění dat dokazujících, že virus vakcinie ovlivní indukci imunitní odpovědi, včetně produkce HIV specifických protilátek.

Pomocí ELISA techniky na HIV-1 potažených destičkách byly testovány reprezentativní vzorky myších sér. Vzorky sér byly získány z myší imunizovaných s 10⁵, 10⁶ a 10⁷ pfu virů vakcinie exprimujících jeden HIV-1 obalový protein. Sérové vzorky byly testovány přibližně 3 týdny po imunizaci. Každý vzorek byl před ELISA testem na HIV-1 potažených destičkách ředěn 1:100 (plný sloupec), 1:1000 (mřížkovaný sloupec) a 1:10 000 (prázdný sloupec). Jsou znázorněny standardní odchylky.

Obr. 4 Grafické znázornění dat dokazujících, že smíchání konstruktů viru vakcinie nezpůsobí snížení intenzity HIV specifické protilátkové odpovědi u savců.

Pomocí ELISA techniky byly testovány reprezentativní vzorky myších sér přibližně dva měsíce po imunizaci s 10⁷ pfu virů vakcinie exprimujících HIV-1 obalový protein(y). „Jeden“ označuje vzorky získané z myší imunizovaných pouze jednou variantou rekombinantního viru vakcinie.

„Směs“ označuje vzorky získané z myší, které byly imunizované směsí rekombinantních virů

-4CZ 296575 B6 exprimujících 5 odlišných variant obalového proteinu. Každý vzorek byl před ELISA testem na

HIV-1 potažených destičkách ředěn 1:100 (plný sloupec), 1:1000 (mřížkovaný sloupec) a 1:10 000 (prázdný sloupec). Jsou znázorněny standardní odchylky.

Obr. 5 Produkce nových rekombinantních virů vakcinie substitucí PCR produkty do sekvence pEvenv4 BH10.

Je znázorněna metoda substituce. PCR produkty byly substituovány do BH10 env sekvence na jedinečná restrikční místa Knpl a Bsml. Následovala restrikce plazmidu a ligace sPCR produkty, nové plazmidy byly pak rekombinovány s divokým typem VV tak aby vznikly VV-expresní vektory.

Obr. 6 Reakce následující imunizaci testovaná pomocí Abbott ELISA techniky.

Série ze čtyřech pokusných šimpanzů byla testována pomocí Abbott clinical assay (viz. Materiál a Metody, infra). Závěr pro každý vzorek séra (osa Y) byl vynesen pro každé získané hodnoty (osa X). Vysoké hodnoty byly zjištěny u šimpanzů imunizovaných směsí VVenv vakcíny.

Obr. 7 Mapa bifunkčního plazmidu, který může sloužit buď jako DNA vakcína, nebo jako VV rekombinantní vektor. Přítomnost velmi časného cytomegalovirového promotoru a časných I pozdních promotorů viru vakcinie (VV) zajišťuje expresi cizorodého genu jak v savčích buňkách tak v VV infikovaných buňkách.

Dřívější pokusy vyvinout vakcínu proti různým kmenům HIV byly zaměřeny na jeden či více variabilních oblastí vgpl20 nebo gpl60. Očekávalo se, že některá z variabilních oblastí, použitých ve vakcíně, zajistí širokou ochranu proti HIV infekci. Tyto vakcíny však nebyly úspěšné, neboť vakcínou indukovaná imunitní odpověď nebyl schopna rozeznat řadu odlišných kmenů HIV. Bylo nezbytně nutné vyvinout takovou vakcínu, která by indukovala imunitní odpověď proti různým kmenům HIV, tak, aby byla použitelná pro terapii a/nebo prevenci před HIV.

Tato práce popisuje, že značně zvýšená primární a sekundární (podpůrná) imunitní odpověď může být indukována proti několika, nebo celé řadě rozdílných kmenů HIV, použitím polyenv vakcíny obsahující směs alespoň 4 a až 1000, možná dokonce 10 000, rekombinantních virů, kdy každý z nich kóduje odlišnou variantu obalového proteinu (EPV). Vakcína může také obsahovat EPV exprimované virem, např. produkované v hostitelské buňce a použité na tvorbu viru.

Termíny primární a sekundární (podpůrná) zde používané popisují první a následnou imunizaci, tzn. stejně jako jsou tyto termíny používány běžně v imunologii.

Nukleová kyselina kódující EPV (nukleová kyselina kódující variantu obalového proteinu (EV)) může být izolovaná ze stejné nebo odlišné populace (např. geograficky) lidí infikovaných virem HIV. Je také možné odlišné varianty nukleových kyselin kódujících EV získat z jednoho zdroje a pomocí screeningu sekvencí najít odlišnosti v kódující sekvenci, nebo vyhodnotit rozdíly v humorální a buněčné imunitní odpovědi vyvolané několika kmeny HIV in vitro nebo in vivo, pomocí známých metod.

Původní objev popisuje rekombinantní vakcíny viru vakcinie. Jak je však každému odborníkovi jasné, pro expresi antigenů polyenv vakcíny, jak ji popisuje vynález, je možné použít jakýkoliv rekombinantní virus. Navíc použití několika typů virových vakcín eliminuje možnost indukce imunitní odpovědi proti přirozeným antigenům rekombinantního viru což snižuje účinnost virové vakcíny (díky silné antivirové odpovědi).

Jak si každý odborník uvědomí, navrhovatelné vynálezu také zjistili, že rozšíření vakcíny o rekombinantní HIV env protein nebo proteiny, preferovaná je směs proteinů, umocní imuni-5CZ 296575 B6 začni efekt vynálezu. HIV env protein nebo proteiny mohou odpovídat HIV env proteinům exprimovaným vektory obsaženými vpolyenv vakcíně, nebo mohou být zcela odlišné.

Podobně, jak bude oceněno každým odborníkem, imunizační efekt metody dle navrhovaného vynálezu může být také zesílen použitím DNA vakcíny. DNA vakcína může být použita pro umocnění efektu, např. jak bylo popsáno výše pro rekombinantní HIV proteiny. Jinou variantou je použití DNA vakcíny jako přípravné první dávky v kombinaci s rekombinantní virovou vakcínou nebo vakcínami používanými pro zesílení anti-HIV imunitní odpovědi. Stejně jako zesilovací vakcína složená z rekombinantního env proteinu, tak i DNA vakcína může obsahovat buď jednu, nebo více variant vektorů exprimujících jeden či více HIV env genů. Navíc HIV env geny mohou být stejné jako geny exprimované viry v rekombinantní vakcíně, nebo mohou být zcela odlišné. V preferované variantě jsou vektory připraveny pro expresi v rekombinantní virové vakcíně a v transfektovaných savčích buňkách jako součást DNA vakcíny.

Indukovaná imunitní odpověď (humorální a/nebo buněčná) je účinná pro širší spektrum kmenů infekčního viru, jako je HIV, a není zdaleka limitována na kmeny viru exprimujícím specifické varianty obalového proteinu (EPV) použité v polyenv vakcíně. Navrhovaný vynález tedy popisuje mnoho EPV kódovaných rekombinantní virovou vakcínou, která silně stimuluje imunitní odpověď proti mnoha kmenům viru HIV.

Polyenv vakcína a vakcinace

Navrhovaný vynález tedy popisuje, v jednom aspektu, polyenv vakcínu složenou ze směsi alespoň 4 až 10 000 odlišných rekombinantních variant viru vakcinie z nichž každý exprimuje odlišnou variantu obalového proteinu, nebo jeho části s antigenní determinantou. Jak může tedy každý odborník předpokládat může být použito, 4 až asi 1000, lépe pak 10 až asi 100, odlišných variant rekombinantního viru. Každému odborníkovi v oboru je jasné, že pro vakcinaci mohou být použity i jiné viry. Jako příklady virů použitelných jako hostitelské organizmy pro vakcínu mohou být, kromě viru vakcinie uvedeny např. virus kanářích neštovic, adenovirus a adeno-associated virus. Jsou zde také popsané metody výroby a použití těchto polyenv vakcín. Polyenv vakcína popisovaná navrhovaným vynálezem indukuje alespoň buď humorální, nebo buněčnou imunitní odpověď u savců imunizovaných polyenv vakcínou, ale odpověď na vakcínu je subklinická, nebo účinně zesiluje alespoň jeden typ imunitní odpovědi proti alespoň jednomu kmenu HIV, takže vakcína je použitelná k vakcinaci proti infekci.

Virové vakcíny

Rada geneticky modifikovaných virových přenašečů („rekombinantních virů“) může být použita k přípravě polyenv virové vakcíny pro expresi HIV polyenv antigenů. Virové vakcíny jsou obzvláště výhodné vtom případě že komponenty virové infekce stimulují silnou imunitní odpověď která zahrnuje aktivaci B buněk, pomocných T lymfocytů a cytotoxických T lymfocytů. Celá řada virů může být použita jako rekombinantní virové vektory použitelné ve vakcíně navrhované vynálezem. Preferovaný rekombinantní virový vektor pro virovou vakcínu je virus vakcinie (Intemational Patent Publication WO 87/06262, October 22, 1987, by Moss et al., Cooney et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:1882-6 (1993), Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-52 (1992), McElrath et al., J. Infect. Dis. 169:41-7 (1994)). V jiné variantě vynálezu byl použit rekombinantní virus kanářích neštovic (Pialoux et al., AIDS Res. Hum Retroviruses 11:373-81 (1995), erratum in AIDS Res. Hum. Retroviruses 11:875 (1995), Anderson et al., J. Infect. Dis. 174:97785 (1996), Fries et al., Vaccine 14:428-34 (1996), Gonczol et al., Vaccine 13:1080-5 (1995)). Jinou alternativou je defektní adenovirus nebo adenovirus (Gilardi-Hebenstreit et al., J. Gen. Virol. 71:2425-31 (1990), Prevec et al., J. Infect. Dis. 161:27-30 (1990), Lubec et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:6783-7 (1989), Xiang et al., Virology 219:220-7 (1996)). Mohou být použity také další vhodné virové vektory včetně retrovirů, které jsou sestavovány v buňce s širším rozsahem hostitelů (Miller, Human Gene Ther. 1:5-14 (1990), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, §9) a atenuované nebo defektní DNA viry jako například herpes simplex

-6CZ 296575 B6 virus (HSV) (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)) papilomavirus, EpstainBarr virus (EBV), adeno-associated virus (AAV) (Samulski etal., J. Virol. 61:3096-3101,

Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989)), a podobně.

DNA vakcíny

Variantu klasické vakcíny složené z antigenu a adjuvans, představuje in vivo přímé zavedení DNA, kódující antigen, do tkáně, což vede k expresi cizorodých antigenů na buňkách organizmu vlastních. Tyto vakcíny jsou tedy nazývány „DNA vakcíny“ nebo „vakcíny založené na nukleových kyselinách“. DNA vakcíny jsou popsány v Intemational Patent Publication WO 95/20660 a International Patent Publication WO 93/19183. Možnost přímo injikovat DNA kódující virový protein tak aby vyvolala ochrannou imunitní reakci, byla popsána v řadě experimentálních systémů (Conry et al., Cancer. Res., 54:1164-1168 (1994), Cox et al., Virol, 67:5664-5667 (1993), Davis et al., Hum. Mole. Genet., 2:1847-1851 (1993), Sedegah et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 91:9866-9870 (1994), Montgomery et al., DNA Cell Bio., 12:777-783 (1993) Ulmer et al., Science 259-1745-1749 (1993), Wang et al„ Proč. Nati. Acad. Sci., 90:4156-4160 (1993) Xiang et al., Virology, 199:132-140 (1994)). Studie pokoušející se použít tuto strategii k neutralizaci chřipkového viru, používá jak obalové tak vnitřní virové proteiny k indukci produkce protilátek, je však zaměřena zejména na virový hemaglutinační protein (HA) (Fynan et al„ DNA cell Biol., 12:785-789 (1993A), Fynan et al., proč. Nati. Acad. Sci., 90:11478-1482 (1993B), Robinson et al., Vaccine, 11:957 (1993), Webster et al., Vaccine, 12:1495-1498 (1994)).

Vakcinace pomocí aplikace DNA kódující HIV env protein indukuje jak humorální, tak buněčnou imunitní odpověď. To odpovídá závěrům získaným se živým virem (Raz et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 91:9519-9523 (1994), Ulmer, 1993, supra, Wang, 1993, supra, Xiang, 1994, supra). Studie s fretkami ukazují, že DNA vakcíny kódující konzervativní interní virové proteiny chřipky, zároveň s povrchovými glykoproteiny jsou účinnější proti antigenním variantám chřipkového viru, než buď inaktivované, nebo subvirionové vakcíny (Donnellyet al., Nat. Med., 6:58— 587 (1995)). Navíc, u myší byla prokázána opakovatelně indukovaná imunitní odpověď proti DNA kódovaným nukleoproteinům, která přetrvala po celý čas života pokusného zvířete (Yankauckas et al., DNA Cell Biol., 12:771-776 (1993)).

Jak je známo, účinnost exprese antigenních genů a/nebo imunogenicitu DNA vakcín může ovlivnit široké spektrum faktorů. Příkladem těchto faktorů může být například reproducibilita inokulace, konstrukce plazmidového vektoru výběr promotoru použitého k řízení exprese antigenního genu a nebo stabilita inzertovaného genu v plazmidu. V závislosti na svém původu, promotory se odlišují v tkáňové specifítě a účinnosti iniciace syntézy mRNA (Xiang et al., Virology, 209:564— 579 (1994), Chapman et al., Nucle Acid Res., 19:3979-3986 (1991)). V současnosti je většina virových vakcín v savčích systémech pod kontrolou virových promotorů odvozených od cytomegaloviru (CMV). Takový systém má dobrou účinnost jak při svalové tak kožní inokulaci u celé řady savčích druhů. Další známý faktor který ovlivňuje míru indukce imunitní reakce indukované DNA imunizací, je způsob zavedení DNA; parenterální cesta nezajišťuje dostatečný přenos genu do buněk a míra exprese genu je pak značně variabilní (Montgomery, 1993, supra). Vysokorychlostní zavedení plazmidu pomocí zařízení gene-gun, zvyšuje imunitní reakci u myší (Fynan, 1993B, supra, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol., 12:791-797 (1993)), především díky vysoké účinnosti transfekce efektivnější prezentaci antigenů dendritickými buňkami. Vektory obsahující vakcínu složenou z nukleových kyselin mohou být do požadovaného objektu zavedeny i jinými metodami, dnes již dobře známými např. transfekcí, elektroporací, mikroinjekcí, transdukcí, buněčnou fůzí, DEAE dextranem, kalcium fosfátovou precipitací, lipofekcí (fůzí lipozómů) nebo pomocí transportéru DNA vektorů (Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992), Wu and Wu J. Biol. Chem., 263:14621-14624 (1988), Hartmut etal., Canadian Patent Application No 2,012,311, March 15, 1990).

-7CZ 296575 B6

Bifunkční plazmidy pro viry a DNA vakcíny

Preferovaná varianta tohoto vynálezu se zaměřuje na konstrukci bifunkčních plazmidů, které mohou sloužit jako DNA vakcíny a rekombinantní virové vektory. Přímá injekce vyčištěné plazmidové DNA, tzn. ve formě DNA vakcíny, bude indukovat imunitní odpověď organizmu proti antigenu tímto genem kódovanému. Tento plazmid může být použit ve formě živého rekombinantního viru použitého jako imunizačního prostředku.

Bifunkční plazmid navrhovaný vynálezem popisuje heterologní gen, nebo inzerční místo heterologního genu, pod kontrolou dvou odlišných sekvencí regulujících expresi: zvířecí regulační sekvence a virové regulační sekvence. Termín „pod kontrolou“ je použit v obvyklém významu, tzn. funkčně nebo operativně spojený s, ve smyslu, že regulační sekvence, jako je promotor, ovlivňuje expresi heterologního genu. V preferované variantě je zvířecí regulační sekvence savčí promotor (navrhovaný vynález však zahrnuje i ptačí promotory), konkrétně, promotorem může být velmi časný promotor cytomegaloviru (CMV) (viz Obr. 7). V jiné konkrétní variantě může být jako virový promotor použit časný promotor viru vakcinie, nebo pozdní promotor viru vakcinie, nejlépe pak oba (Obr. 7). Subjekt může být vakcinován podle střídavého protokolu bifunkčním plazmidem a zároveň, ale v jiném časovém schématu v libovolném pořadí, rekombinantním virem vakcinie, nebo obojím. Tento vakcinací protokol může být doplněn aplikací rekombinantních proteinů vakcinie (infra), nebo může být použit s jinými vakcinačními prostředky.

Jak si každý odborník uvědomí, bifunkční plazmidy navrhované vynálezem, mohou být použity jako vektory polyenv vakcíny. Tedy, inzercí alespoň 4 až 10 000, lépe pak 4 až 1000, nejlépe 10 až 100, odlišných HIV env genů do bifunkČního plazmidů, vznikne odpovídající sada bifunkčních plazmidů použitelných jako polyenv vakcína.

Rekombinantní virové vakcíny

Aktivní imunita vyvolaná vakcinací s HIV env proteinem nebo proteiny dle navrhovaného vynálezu, může zvýšit nebo zesílit buněčnou nebo humorální imunitní odpověď. HIV env protein nebo proteiny, či jejich antigenní fragmenty, mohou být pro přípravu vakcíny smíchány s adjuvans.

Termín adjuvans označuje látku nebo směs látek, která zesiluje imunitní reakci na antigen. Adjuvans může v tkáni sloužit jako zásobník, který pomalu uvolňuje antigen a zároveň jako nespecifický aktivátor imunitního systému zesilující imunitní odpověď (Hood et al., Immunology sec. ed. 1984, Benjamin/Cumings: Menlo Park, California, p. 384). Ve většině případů, by první aplikace antigenu bez adjuvans nevyvolala dostatečnou imunitní reakci. Jako adjuvans se používají např. kompletní Freundovo adjuvans, nekompletní Freundovo adjuvans, saponin, minerální gely, jako je hydroxid hlinitý, povrchově aktivní látky jako je lysolecithin, pluronic polyoyly, polyanionty, peptidy, olejové nebo cukerné emulze, hemocyanin mořských přílipek, dinitrofenol a potenciálně použitelné lidské adjuvans jako je BCG (bacille Calmette-Guerin) a Corynebacterium Parvum. Výběr adjuvans je závislý na subjektu, který má být vakcinován. Pokud možno, jsou používána farmaceuticky přijatelná adjuvans. Například při vakcinací lidí není vhodné použít oleje nebo cukerné emulze včetně kompletního a nekompletního Freundova adjuvans. Příkladem adjuvans použitelného pro vakcinací lidí je aluum precipitát (hlinitý gel). V konkrétním případě, infra, rekombinantní HIV env protein je podáván intramuskulámě v aluum precipitátu. Samozřejmě, že HIV env rekombinantní proteinové vakcína může být podávána subkutánně, intradermálně, intraperitoneálně, nebo jiným přijatelným způsobem obvyklým pro vakcinací.

Podání vakcíny

Dle vynálezu, může být imunizace proti HIV prováděna pomocí samotné rekombinantní virové vakcíny navrhované vynálezem, nebo v kombinaci s DNA vakcínou nebo rekombinantní protei-8CZ 296575 B6 novou vakcínou, nebo s oběma. V konkrétním případě, rekombinantní HIV env protein v aluum precipitátu je použit i.m. k zesílení imunitní odpovědi.

Každá dávka virové vakcíny může obsahovat 4 až 10 000, lépe pak 4 až 1000, nejlépe pak 10 až 100, odlišných forem rekombinantního viru, kde každá varianta obsahuje jiný HIV env gen.

V jiné konkrétní variantě vynálezu, následné polyenv virové vakcíny mohou mít některé viry společné a jiné odlišné vzhledem k předchozí vakcíně. Například, první vakcína může obsahovat viry vakcinie exprimující HIV env proteiny náhodně označené 1 až 10. Druhá (zesilující) dávka vakcíny pak může obsahovat viry vakcinie (lépe pak jiného viru, jako je virus kanářích neštovic, nebo adenovirus) exprimující varianty HIV env proteinu označené 6 až 15 nebo 11 až 20 atd.

DNA vakcína nebo rekombinantní proteinová vakcína může být složena z jednoho HIV env proteinového antigenu, nebo mnoha variant antigenu. Je preferováno aby DNA vakcína nebo rekombinantní virová vakcína navrhovaná vynálezem obsahovala více než jeden HIV env proteinový antigen. Stejně jako u následných virových vakcín, HIV env protein nebo protein kódovaný DNA vakcínou nebo rekombinantní proteinová vakcína může být stejná jako HIV env protein exprimovaný v polyenv virové vakcíně, nebo se může částečně či zcela od něj odlišovat. Shrnuto, preferovaná varianta vynálezu představuje použití co největšího možného spektra možností v každém vakcinačním protokolu tak, aby byl objekt vystaven maximálnímu počtu variant HIV env proteinu a měl tedy co možná největší šanci vyvinout neutralizující křížovou reaktivitu proti naivnímu HIV izolátu.

Varianty obalového proteinu

Jak bylo řečeno výše, EPV použitelné jako složky vakcíny navrhované vynálezem, mohou být získány z geograficky podobných izolátů, nebo z izolátů z geograficky odlišných lokalit. Jak si každý odborník uvědomí, získání nukleotidů kódujících env (genů) z přirozených izolátů, má řadu výhod: izoláty jsou snadno dostupné, EPV odpovídají přirozeně se vyskytujícím proteinům proti kterým je třeba indukovat imunitní reakci a nové mutace HIV mohou být zachyceny okamžitě z čerstvých izolátů.

Zkratka EPV také zahrnuje polypeptidy s imunogenní aktivitou danou jejich aminokyselinovou sekvencí podobnou epitopu či antigenní determinantě EPV. Tato aminokyselinová sekvence se značně podobá alespoň jednomu z 10 až 900 aminokyselinových fragmentů a/nebo odpovídá sekvenci známého HIV EPV. Tyto EPV mohou mít celkovou homologii nebo identitu jak alespoň 50 % vzhledem ke známým aminokyselinovým sekvencím obalového proteinu, tak 50 až 99 % homologie nebo libovolnou hodnotu v tomto rozmezí, aby indukovali imunitní odpověď proti alespoň jednomu kmenu HIV.

Procento homologie může být určeno například porovnáním sekvence pomocí počítačového programu GAP, verze 6.0, dostupného od University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Program GAP používá porovnávací metodu podle Needlemana a Wunsche (J. Mol. Biol. 48:443 (1970)), upravenou dle Smitha a Watermana (Adv. Apl. Math. 2:482 (1981)). Zkráceně, program GAP definuje podobnost jako počet seřazených symbolů (např. nukleotidů či aminokyselin), které jsou shodné, děleno, celkovým počtem symbolů v kratším z řetězců. Preferované předvolené parametry programu GAP zahrnují: (1) jednotné porovnání matrix (s výstupní hodnotou 1 pro podobné a 0 pro odlišné sekvence) a vážené porovnání matrix dle Gribskova a Burgesse (Nucl. Acid. Res. 14:6745 (1986)), jak bylo popsáno Schwarzem aDayhoffem (eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Resech Foundation, Washington, DC (1979) (2) odečet 3,0 pro každou nekomplementaritu a další odečet 0,10 pro každý symbol v každé nekomplementaritě a (3) žádný odečet pro koncové nekomplementarity.

V preferované variantě vynálezu, EPV navrhované vynálezem jsou varianty alespoň jednoho obalového proteinu viru HIV. Je preferováno aby EPV zahrnovaly gpl20 a oligomerizační doménu gp41 stejně jako gpl40 (Hallenberger et al., Virology 193:51-514 (1993)).

-9CZ 296575 B6

Známé obalové proteiny viru HIV obsahují od 750 do 900 aminokyselin. Příklady těchto sekvencí jsou dostupné z komerčních a institucionálních HIV sekvenčních databází, jako je GENEBANK, nebo z publikovaných kompilačních prací, jako je Myers et al., Human Retrovirus and AIDS, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Vol. I and II., Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, NM (1993). Substituce a inzerce do EPV vedoucí k získání dalších EPV, kódovaných nukleovými kyselinami, pro použití v rekombinantním viru nebo polyenv vakcíně dle navrhovaného vynálezu, zahrnují substituce nebo inzerce alespoň jedné aminokyseliny (přesněji 1 až 25 aminokyselin). Je samozřejmě možné provést deleci alespoň jedné aminokyseliny (přesněji 1 až 25 aminokyselin) z řetězce EPV. Je preferováno aby tyto substituce inzerce a delece byly identifikovány pomocí určení sekvence obalových proteinů získaných nukleotidovým sekvenováním alespoň jedné nukleové kyseliny kódující EPV získané z jedince infikovaného HIV.

Nelimitující příklady těchto substitucí, inzercí a deleci mohou být vyrobeny amplifikací DNA a RNA sekvencí kódujících env protein, získaných z pacienta infikovaného HIV-1, a mohou být determinovány běžnými metodami k určení strukturních a funkčních vlastností obalového proteinu nebo EPV. Získané EPV mají pak většinou jiné antigenní vlastnosti než původní EPV. Tyto antigenní vlastnosti mohou být určeny vhodnými metodami např. testováním na panelu monoklonálních protilátek specifických pro obalové proteiny viru HIV pomocí ELISA techniky. Jakékoliv substituce, inzerce, či delece jsou přijatelné dokud výsledný EPV protein indukuje produkci protilátek které se vážou na obalové proteiny viru HIV, ale odlišují se od spektra protilátek indukovaných jiným EPV. Každá z výše popsaných substitucí, inzercí nebo deleci může také zahrnovat modifikovanou nebo neobvyklou aminokyselinu, např. jak je popsáno v 37 C.F.R. § 1.822(2).

Následující Tabulka 1 představuje nelimitující příklady alternativních variant obalových proteinů viru HIV, které mohou být kódované rekombinantním virem dle navrhovaného vynálezu.

-10CZ 296575 B6

TABULKA 1: varianty obalového proteinu	O rO		í-	»-t	X	>*
	σ\	0		-4	H
CO	2	0	u	H	H4
C		X	X
<0	3	í-
tn	O
	3	w	X
-o	X	X		►—1	(Ό
CM	3	.-1
r-l	u	3	a:		ω
O CM		X	*Zi	o	Ot	o
	G\	o	Pí	Z	X	3:
CO	κ	o	>·	í£	Q
Γ-	54	X	ω	ω
kĎ	X	X	X	o	t-
<n	o	ce	X	o	ω
xr	co	H	«—<		X
m	ω	O	X
CM	X	X		X
-	>	<
O Ή		x			w
		X
<x>
t*·	>	X
AO	E-
tn	X
V	o
	fxj
CM	X
r-4		ω
	Ή

o u>	4-	ω	>	z	<
	<n
	CD	ta	Q
	Γ'	X	ω
	vo	X
	tn	>	H
	\r	Oi
		>	!·<
	CM	o
	rM	>	<o	<
o in
		>
	<x>	ř-
	C-	>
	k£>	3	><
	tn	u
	Ό·	X	o	Q	z
	m	ω	CQ	O	o	>
	CM	£-»	>	<	PÍ	«
	·—<	<	>	O	J-i	X
o <r
	CA	CO
	CO	u	ω	•4
	t	M	H	η»	Q
	w	X	M		cl
	tn	u	M	X	(-
	Tj*	0	3	1-4	u	<
	m	u	<JU	et	X
	CM	*4	n	X	<	£-·
	—4		a		1-4
	r-H rO

90 L	a
	<A	Q	z	o
	co	£-
	Γ	Pl
	kO	>
	tn	<J
	-j*	<t
	rq	X	>*	o
	CM	[-·	(Λ	X
	τ~1
o 00		3	CJ
	cn	>	M
	a>	z	X
	r-	X
	w	>	<t	X	o	X
	tn	PÍ
	'T	(-<	Pí	<	X	CL
	m	a	V)	X	rt	Γ4
	CM	r><	z	H
	r4	<	H	co	.4
o r·		X	X	z
	<A		Pí
	00	Q	ω
	r-	w
	\O	<
	m	u
	M*	í*4
	m
	CM	f-	>
	<—4	H	CL
	,4 to

-11 CZ 296575 B6

O CÍ r-4	——Ί	♦M
	CA	W	>
	00	Q
	Γ'	W
	to	Z	O
	m	Σ
	xr	O
	m	id	Q	χζ
	ΓΜ	>
	»H	X
O *-< rH		a	z	to	>
	ťh	Z
	ca	hť.		í-
	e-	3:
	to	X	»-4
	to	z	Q
	tt*	ω
	m	*z	M		Q	-
	<N	M	0	Q
		H
O O r-1		>
	CA	Z	to
	CO	>	o	M	cu
	f''	u	X
	MS	>	►4	>·	a	V)
	IO	>	w	a	X	0.
	•Kř	M
	co	O	z	tx	><
	(N	Cu
	rH	z	a	<0	í-
	ri Ο»

o in ·—1		Z	íd	ř-	M	w
	<h	H	ω	X
co	CJ	<	0
c*	&	1-
to	z	f<	0	íX	a
in	a	>	>4	a	fcu
*#·	£3	se	Z	O	iZ
			>-4	sc	0
CN	o
H	z	z	Cl	ÍO	M
140 i		a	X
ch	co		z	o
co	>
r-	o
MO	*.3	u
LQ	th	a
xr	H
co	a	X
n	a	>	o
	>	ω
O ro r-i		o
	<n	A,
<o	Z
r-	a
w	u)
in	o	14
Ό*	o	ω
r*>	s
m	a
r-4	<0	z
	r~4 Λ1 »Ή

O co rH		UJ	0	z	b-i	ω
	ca	H	id	&
	03	<0	h
	r*	w	>	o	X	t*
	to	&		>*	o
	to	U	>«
	xr	ÍZ)	&	f-	«
	m	O
	CM	z	tz
	r-i		H	Ctí	o
O Γ-		►-4	X	>
	CA	ω		0		a
	CO	0	ω	*x	ω	z
	r*	ω	ez	o	0	z
	to	ω	Q	o
		X	H	1-	M	>
	xř*	Μ	w	z
	ro	&	(X	tú	>
	<N	ε£	hZ	z	3:	0
		0	X	ω	o
o to		3ř	z	M	(Λ	a
	&l	uj	Z	f-«
	CO	UJ		>	0
	f*	UJ	E->	z
	CO	E-
		> 1	X
	-	i x7	w
	rO	z	U)
	04	U)	X	ω
	<~Í	H	z
	<s to r-i

-12CZ 296575 B6

O CM	Q	«ť	to
	to	Z	a	H	ω
	CD
	Γ'		cx
	to	to	Z
	in	Q	Ι-»
	tr	Z	O
	•Ό	o	to
	ΓΜ		a	Z	o
	rM			0	ω	z
O O CM			>	0
to	CX	o	Ní	ta	Z
	CO	M		<	X	to
	r·	1 4	>
	\0	o
	tn	u			cx	to
	M*	Z	z	cx		>
	m	><	CX	n:	Z
	CM	í>,	.4
	r—i	[1,	.1		H	X
O Ch f-i			to	í-
	<n	>♦	z	cx	to
	CD	ta	Q	>	<	o
	Γ'		CX	CX	1«
	to	o	iX	X	ω
	ΜΊ	>	>-<	X	X	o
	'T	SX	CX	o	ω
		o	a	z
	CM	rx	o	z	to	i-
	-	>-<	.j	>	tx
	Ι-Ί CD r~4
_		_______

210 i	ta	O	Q
	to	u*
	<D	to	(H
		>
	to	sx
	m	ÍX	to
	v*	O
	rri
	CM	o
	r-4	H	Ní
230			>	u
O\	>		<	h4
	CO	to	£-
	í	l-	ť>:	ω
	V)	Z	to	Q
	U1	<J
	M·	to	X	Z	ť
	m	H	H4
	CM	,1	M
	, 4	H	CX	M	tx	X
O Γ1 CM		ta	Ní	><
			z
	CD	y.	H	o:	0
	r-	><
	to	to	Z
		H
	Xť		z	M
	rT		£-	Z
	CM		H	to
	«—4	f-	to		to
	H , 4 ΓΜ

o Γ CM	to	Z
	X	w	to	a
GD	O
r-	cx	cx	to	H	n
to	0	ta
to	H	íx:	to
	O
r*i	z	to	ta
CM	ÍJL.
r-4	H	w	W	O	o
CJ to CM			*<	n<	ω	H
cn	Z	Q	to
a>	Z		CX
r-	O
to	Ní
to	^3	ta
xr		X	..1
Γ-Ί	<	>
CM	ta	>«
«—i	o
O to <N		<	f-
to	CX	0
co		E-<
Γ*'	u
u>	>	ta	X
to	X
vr	í-4	X
rn	cx	ta
CM	w
«—4	a-
	r-4 CM

- 13 CZ 296575 B6

O o m		>	se	IX	H	X
	<h	>	w	a	o
co	ta	o	<x	X	O
r-	M	o	X	tx
w	td	X	cx
in	*<	co
	u
m	tf)
ca	o
ή	x
290 '			M	<n
<h	.□
co
r·'	o	X
\o
U)	W	F*
	>
m	>	w	{..
cm	Cl.
»-<	Cť		ÍA
O co Oi		Hi
Ch	o
00	w
r- MD	O				—
m	o	H	X
<r	>	<X
r\	í-	<Λ	>
ca	to	f-
r-4	>	►“4
	« 4 (*rj

o r-5 <ΤΛ		z			><	o
	<h	z	<o		Cd	X
CD	Cu	Cd
r-	ÍX
to	ř-		<	td	X
in	u	><
<r	sr.	>	H	22
ΛΊ	M	>
CM	Í«1	<	O	>
«Η	>	w
O CM m		<A	Λ
<h	O	Cd	<	a	£-
co	&	«	f-<
c*	.-1
w	o	se	H
ΙΠ	>
xf*	w	u	>
n	w	»
CM			z	>
»<	S*Í	cx	a
o •H r*>		<	<r**	t-«	<5
m	z	co	o
CQ	o	55	ω
r-	(-	ω	X	<
M3	ω	w	.q	A.	x
in	%	Q
m*		Q	ω	CO	X
n	v>	O	<	>
CM	CZ	Σ
r-4	n	u	>	X
	o m

O M3 Ch
	cn	o	SX	u	íX	>
00	CZ	o
r-	X	r-i	u	ω	H
	z	a	z	H	M
LA	o	<0	<	tk	z
•r	j		a	>	<x
m	í-4	X	V)	o
íN		íX	o	Q	Λζ
rM	o	íX	X	Q	td
O in cn		M	t-4	Pí	►3	X
ΧΛ			>	«	$2«
CD	>	X	>4	ílq	M
r*	u.		Sr	>	>
to		>	f“·	CO	SE
in	ťX	o	X	X
v*	o	X	tx	X
n	u.	&	co
CM	o	<
<~M	ÍX	>-4	<0
o XT m		O	X	Pí
ch	w	£X	X	►3	CO
co		X	X
r»	íX	><	>’	X	Px
to	H4
tn	CO	cx		E->	<5
M*	X	ÍX	o	O
rO	tx	z	w	ft	>
CM	ř-	>		cx
r-C		X	>*	H	EO
	r-4 rh

- 14CZ 296575 B6

O σχ Γ-Ί		>-<	>	f-	X
	σ\	H	V)
co	Ní	o	X
o-	z
<o	z	Ω
tn	o	Ní	Ω
\r	114	>4	u	co
	O	Ní	X	Oí
OJ	íil	Ní		í>
*-<	ní	Ní	o	o	44
1...............388		J	>
<n	Ní	co	o	X	4-4
co	CO	Ní	I-	t>)	U
r-	o	>
to	> 1	>	»□	(-
LT)	o	o	Ní	c>:
Y	Ní	ÍU	O	co	Z
ΟΊ		> 4	>
oj	f-	>	<	44
r—1	z	<	Ní	n:	Q
o Γm			Ní	CO	01	U<
o\	3:
CD	Ní	O	Q	Z	<
o-		ω	H	ní	co
k£>	cť.	o	Ni	ω	<
LH	<0	<	2;
«r	H4	►J	>	>’
r*i	z	Ní	H
ÍN	u
ť—♦	n:	>
	r—< \D Ο»

o CŇ Ύ	Ct	o	z	04	z
	Ch	f-	co	<	0Í
	CD	<0	H	<
	Γ'	z	Q
	CD	CJ
	tn	>
	M*	li.
	Γ’·'	C:.	44
	OJ	ω	Ω
	^4	o
O r-H xa*		o	ní	>		M
	Ch	o	>
	co	z	»-4	H
		bu	J
	AD	V)	z	f ·	X	X.
	in	X
		f-	>:		X
	m	>	f-	ω
	OJ	M	>
	<4	txl
O O xj<		Οι	u	1—<	í>	o
	<n	o
	co	o	o
	r*	o	u
	w	co	<
	m	co	X	Qí	o	t-
	ý	o	X	<o	Ní	z
	m	Ní	z	H	<	ω
	cl	(x.	co	u
	•—1	H4		z	<	Ní
	/~í σ> r-i

o tn Ύ		«	z
	0\	υ
CD	n<	o	u	a
O	u	X	M
U>	H	H	>	Ní
m	> 1	4-3	>
M*	f-	Z	n*	J	Ul
	n	Z	o	01	ní
o|	to	z	ω	X	*
r—t	ϋ	w	x	*í	co
o v		tu	z	CD	o
	Ch	H	X	O	z	<y
	co	Z	<5	Q	to	H
r	ž	co	CD	H	Q
k£)	to	z	n	CD
υΊ	o	X	Ní	CJ	X
NT	Ní	ÍU	Hi	H
m	H	>·<	a	Z	CD
OJ	Ui	o	Q	Ní
«—1	X		Q	Ní	X
o ro		H	z	CD	CO
Οι	co	z	>	O
co	Z	u
Γ	tu		z	co	O
ko	3	><	CJ	z
in	H	M
M*	CO	z	f-	CD	<
ΓΏ	z	co	a	H
OJ »4	O.	n
J	X	4—4
	*4 04 •cr

- 15 CZ 296575 B6

O co XI*
	σι	z
co	co
r-	co		ω	>	H
CO	o	Cx«
U!	ítí	co	Ní	f-
V		u
'’Λ	a	*>	ω	H
ΓΝ	O	K
rH	co	o	o	Z	ω
o r- XT		M	fa	ť-
	σι	O*
co	a	.4
f·	<	Q
\Ď	s
in	X	H		h-í
xr		CO
m	Ní	o	Ctí
(M	o	cn
r-4	>	H	<
O u> xř		ω	O	Ctí	Ní	7>
	tn	o
co	3t
r-		n	«	co	►4
CD	z	Ctí	Ní
tn	>-4	Z>
xr	»-<	tu
m	O	ω
<m	X
-	>-«
	r~t 1-H *r

Q rM UT		z	M
	cn	Q	z
co	ftí	z
r-	s:	Hí
co	Q	z
m	O
xr	O
m	o	L·	<í	>	»1
<N	Ol
•-4	Ctí	ΪΛ
oos		fa		►4
ch	»-<	>	Έ-
co	ÍU	>		>4
(·-	co	E->	ω	Z	M4
AD	w	a	o	ctí
m	Z	CO		X
Xj·	z	H	co	<	Ní
rň	w	O	NÍ	E-*	a
CM	X	Q	(A	<7	ω
r <	<	e·	M	n	c
o <n		ě	>
	cn	o	co
oo	Q
í-	cx	CA
CD	E-	>	ω
lA	►4
XT		M
Γ0	•4	{<	»•4
ťM	O
-	H
	»4 00 •r

540 1
	σι	o	ω	<	3	X
	cd	>	Σ	H
	r-	>	n
	AD	Ctí		X
	in
	xr	Ní	Ctí	co	<
	/*%	<	co	OJ	z	n
	<M	Ní	ítí
	·—l	Eh	CA
o Γ0 tn		CU
<h	ft.
	co	>	Ml
	r-	o	CA
	ID	.4	>-i	U.
	ΙΛ	n<	.4	H
	xj1	Ul	NÍ
	ΓΟ	M	>
	CM	X	a	£4	o	ω
	r-t	>	H4
o CM m		>	Q
<Tt	X
	CO
	r-	Ní	Z
	U3	>·	u*
	in	itíl
	xť	ω	X
	CA	o	z
	Γ1	a:	b-4
	r—1	3
	«-4 r~< σι

-16CZ 296575 B6

O MT	u	>
	Ch	t-	rf
	oo	X		M	>
	O	<Λ	rf	&
	to	kC	>	tx	0	IH
	m	rt
	<J*	0	rf
		X
	04	ír*
	Ή	<n
O w in		0	0
m	#X
	co	<
	1	o	<n
	to	.1
	tn	a.	>
		0
	m	-1	w	04
	03	ω	(Λ	u	» 4
		u	X	>	u>	M
o tn tn				X
cn	0
	n>	M		u	X
	Γ’	bl	►*4	ř-
	tp	0	íi*	>
		>	>4	rf
	tJ·	Λ
	cq	IX
	04		ÍJj
	Ή	M		o
		/-í
		•r
		in

O o MO		cx	X	ω	(X
	Ch	u
03	u	X
r·	:c	o
MD	o
in	o
NP	rf	ť)
m	ω	iX	Cl	o
04	X
tH	<
S in		K	X	X
<Λ	.1
	o>	Cl
r-
tO	2;	<n	Cl
tn	O
•*r	O
CQ	<3	X
04	>
r-1
oss !		0	Ω
cn	<0
co		X
o	J	>
	o	X	u	ÍX	CQ
m	tx	X
	<	Ir*	04	d
Γ0	o	(X	Úu
Γ4	>	o
r-4	H	<x
	*-1 ř'' Wl

o í*i to		0	X
	<n	3E	d
co	M	íx	X	X
r-	0	ω	tň	W	X
u>	J	X
m	-3	ÍX	X
xr	O	ίΧ	řX
	o
Ol	a	tli	5$
r-4	X	a	o	0
O O} \Λ	.3	w
	Oi	>	ω	o
	CO	IX	f<	w
r-'	ω
to	>	u	M
in	<
XT	Cl	o·
m	►“i	>	d
04	K
	<	Cl	f-1
O w to		o	ní
<h	.3
co	O
o-	s«i	<x
to	H4	>
LA	0
*1»	X
	>	l~4
Ol	f-»	ω
«4	o
	r-4 O to

- 17CZ 296575 B6

O u> co	H	x
	Ch	X	í·	J	2
	co	Z	z	X	H
	Γ»	Z	Q	o	O	3:
	UJ
	cn	1-1	ÍX
	vr*	θ'	o	X	CD	Ν'.
	<n	M	Q	z	V)	Ní
	Ol	.4	X	o	>	íX
	«—<	ω	H	z	U
o m kp		X	K	><
<Fl	z	íX
	tn	ω	e>	w
	o	3:
	CO	ω	H	<
	LQ	<	UJ	{4	Z
		z
	ΓΊ
	CQ	o<	X
	r—4	>
o <£>		<	H	Z	íu	<n
cn	(-«
	00	E-	Λ	><
	r<	U
	LP	»-<	>
	m	.4	í-1	u:	M	<
	M*	i*í	íX
	rO	o
	OJ	co	X
	~4	o	Dť
	f-1 r*> UJ

o <n co		ω	o	>
	cn	z
co	»4	M	o	íX
r*	ω	O	Q
CD	o
CA	o
T	z	n	!-'	O
r0	o	<
(N	CO
rH	w	Q	O	z
o 00 co		ω	f-	Oí
<Λ	w	►4
CO	u	FN	tu
t	CD		z
LP	X	>«	u.
m	M
xr	>4		>-í	>	w
m	CD	Z	o	Q
Ol	l·	cn
i—i	>·	>	M
O f^ CD		z	(D
cn	z	Q	ω	<o
CD	M	>
É	ω		X	o
CD	X	x	o
m	o	ω
	3
Γ*Λ	ω	o	X
CN	X	_J	w	o
•~4	3
	•·1 UJ co

o <N Γ*		X	>-J
	cr\	W	>
00	ft.	<
θ'	>4	M
CD	t»4	cx
tn	F-4
Ό*	>	CD
rn
CN	»4
r-J	3
710		Z	o	>4
cn	(-1	UJ
00	M
o·	z	CD	O	Q
co	X	cd	><
cn	z
*r	z	UJ
m	3
OJ
r-i	w	z	o
O o r*		<		X
cn	&
co	z	ω	U)	o
r-	Q	z
CD	t4
cn	ω	o	«c	X	o
rri	»4
OJ	ω	a	<
, -i	o	u	(X	5*í
	r 4 cn co

- 18CZ 296575 B6

O lil Γ-		.1
	σι	ω
	CD	k.l
	Γ	Ctí
		GO	o
	in	>'
	xf	u
	Pí	o	<
	CN	ftí	ίΛ	Z
	rS	>	tu	w
O xr t		ní	W	*z
σ\	z		Ctí
	co	>	>•4
	r	>	»4	u
	kO	40	u	•z
	in		lu
	T	>	>·<
	m	<	<Λ	f <	»4
	CN
	rA
o 1		>-4
σι	ftí
	<n	u	>
	f-	(5
	MD		>-4
	ΙΛ	.4
	xí*	C5	<
	ΓΊ	(5	A
	rs		> -4
	-	> 4	>	A
	«—<
	ÍM
	{ '

O 4D F-	a	o	c*	Ol	A
	σι	M	·>	o	z	U)
	00	<n	3:
	r~	a	t-	e>	bí
	io	Q	o	Ctí	co
	in	ftí	i£
	xF	Q	w
	m	tx	o	o	ω
	n	w	Q
		o
O rc-		o
	<Ti	M	o
	Q0	ω	o
	r-	ω	Q
	u>	>-í
	1Λ	o	Ctí	ω
	XT	Id	Q	o
	m	Ctí	.4	o
	ÍN	íX	O	H
	r-4	n	O	w
o VD r-		Ctí		A
	σι	o	ω
	CD	Ctí	ω	ΰ	o
	r-	Ctí	o	H	Ctí	co
	w>	4-4	>	H	<	o
	m	Ctí	X	<2.	M
	x#*	>3	p	A	Ctí	tu
	n	x	Ctí	>3	Ctí
	<N	H	>—1
	r 1	O
		r—4 in r*·

810	1-4		>	o>	X
	<n	J	(0	O
	co	►4	*í	M
	t'-	►4	íu	o
	M>	Q	X	co
	in	ítí	l<	V)
	xr	•4
	cn	Ctí	►4	co
	<N	X	IX	o
	r-1	>
; 009		ω	u	u
cn	ttí	ω	K
	o	J	</>	H
	r*	o	lu	H	ϋ
	u>		(J	M
	m	w	f-4	Z
	xť	Ctí		O
	n	,4	o
	ín	Q
	r-<	Q	ω	>	O	í-
790		z	>*
	σν	M	tu	u
	co	u	o
	t	A	H	Ctí	O
	u>	.4	co
	1Λ	co	tu	u	u
	XJ*	o
	m	z	Q	X	t-*	co
	C4	>	Ul	Ctí
	«—l		A	IO
	»4 CO Τ'

- 19CZ 296575 B6

O OJ	►4
	m	ω
	co	o		oí
	r-	ω		0	(<	.4
	M3	3
	in	>«
	<r	O	*3	►-.
	ro	.4	>	X	·>	í
	CM	.4	>
	<-<		U)	<	U
O CQ CO		X	o	<
<n	X		U	O
	cn	><	>4	>·<
	c*		re
		>4	w	0
	vn	<	0	w	>	íX
	«9·	tel	Q	X
	m	X	Li
	CM	c	►4	»4
	»«	ÍX	<5
O cs <n		ĚX	X	.4
ch	u		«
	CĎ	u
	r-	..1	»~í		>«
	CD	w	β	ω
	in	>	M	J
		1 <	í-<		•4	>
		IX	J*í
	CM	f-	<	>		X
	<-··<	>		> »
	• 1 »—( OJ

o o CO		>	u		0	>
	ch	ft	1-4	í<	>	u.
co	0	Cí	xC
r*	o	rx
i£>	>
ΙΛ	>	M	0	<c
V	ω	u	<
rn	>·< *
CM	>	»4	<
rH	<x	o
o \D CO		«
O>	H
CO	O	í»ť	K	3
r-	ω	0	π
vo	<	H
\D	>
xr	<	>	v>
<*»	n	>
CM	<
<r-4	H	1-4	>	U
o m co			H
Ge	5?:	«	*c
co	J	řu	>
r-	►4	3	tx
\o		2.
m	>	M	V)	T«
XJ4	<	>	u.
Π	ω
CM	x		<0		-··
—4	&	fX	o
	r< 03

<h <o		o	>
	co	4
		w			íX	VJ
	w	Pí	0
	ΙΛ	ω
		J	fa.	<
	m	o
	CM	o
	r-4	CX
o co co		n	>
Ch	«X
	00	&
	<*·	o*	tc
	\£>	M	>
	tn	X	2;
	M*	cx	>4
	m	M*	U.	>
	ra	<	0
	-	<X	o	H
	- 4 r~ co

-20CZ 296575 B6

Stejně tak, dle výše uvedených příkladů specifických substitucí, alternativní substituce mohou být připraveny pomocí běžných postupů tak, aby vznikly další EPV dle navrhovaného vynálezu, např. uskutečněním jedné či více substitucí, inzercí nebo delecí v obalovém proteinu nebo EPV tak, aby byl umožněn rozvoj další imunitní odpovědi.

Variace v aminokyselinové sekvenci EPV dle navrhovaného vynálezu, mohou být vytvořeny např. mutací DNA. Tyto EPV představují například deleční, inzerční nebo substituční varianty s nukleotidy kódujícími odlišné aminokyseliny v dané aminokyselinové sekvenci. Je jasné, že mutace uskutečněné v nukleových kyselinách kódujících EPV nesmí obsahovat sekvence mimo daný čtecí rámec a pokud možno by neměly vytvářet komplementární domény které by umožnily mRNA vytvářet struktury sekundárního řádu (viz Ausubel (1995 rev), infra Sambrook (1989) infra).

Nukleové kyseliny kódují EPV mohou být, dle navrhovaného vynálezu, připraveny amplifikací nebo cílenou mutací nukleotidů v DNA či RNA kódujících obalový protein nebo EPV a následně syntetizovány nebo pomocí reversní transkriptázy přepsány do DNA tak aby vznikla DNA či RNA kódující EPV (viz Ausubel (1995 rev.), infra, Sambrook (1989), infra) dle návod a rad zde popisovaných.

Rekombinantní viry exprimující EPV dle navrhovaného vynálezu, rekombinantní EPV nebo tyto kódující vektory složené z nukleových kyselin, včetně konečné sady EPV kódujících sekvencí jako substitučních nukleotidů, mohou být vyrobeny každým odborníkem v oboru, bez velkých pokusů, podle návodů a rad zde popsaných. Detailní popis proteinové chemie a struktury uvádí Schultz G.E., et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978) a Creighton T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco., CA (1983). Pro prezentaci substitucí nukleotidových sekvencí, jako jsou výběry kodónů, viz Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene publishing Assoc., New York NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995) dále jen „Ausubel (1995 rev.)“, v §§A.1.1-A.1.24, a Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) v Dodatcích C a D.

Tedy každý odborník v oboru s pomocí návodů a rad zde uváděných, bude schopen substituovat jednu aminokyselinu za druhou v dané pozici DNA nebo RNA kódující protein env, tak aby získal alternativní EPV, včetně substitučních delečních nebo inzerčních variant.

Způsob určování HIV aktivity

Pro určení anti-HIV aktivity séra nebo buněk získaných ze zvířat individuálně imunizovaných vakcínou dle navrhovaného vynálezu, může být použita jakákoliv známá a/nebo vhodná metoda, tak jak je to běžné v praxi. Známé HIV metodiky jsou například metoda virové infektivity (vizChesebro et al., J. Virol. 62:3779-3788 (1988), Aldoviny et al., eds. Techniques in HIV Research pp 71-76 (1990)), neutralizační technika (viz Golding et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:645-648 (1994), Laa et al., Res Hum. Retrovir. 9:781-785 (1993) Hanson J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7:211-219 (1994)), Technika periferních mononukleárů (PMN) (viz Arduino et al., Antimicrob. AgentsChemother. 37:1095-1101 (1990)) a cytotoxický test (Hammond et al., J. Exp. Med 176:1531-1542 (1992), McElrath et al., J. Virol. 68:5074-5083 (1994), Walker etal., Cell Immunol. 119:470-475 (1989), Weinhold et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 8: 1373 (1992)). Další vhodné měřitelné parametry, jednotlivě, nebo v kombinaci, mohou být např. kvalitativní a kvantitativní měření transkripce, replikace, translace, inkorporace virionu, virulence, virového výtěžku a/nebo morfogeneze.

Konkrétní varianta: Rekombinantní virus vakcinie kódující EPV, polyenv vakcína a způsob jejich výroby a použití.

-21 CZ 296575 B6

Přehled: Rekombinantní viry vakcinie (VV) exprimující HIV env proteiny (např. gp41, gpl20 a/nebo gpl60, nebo jejich části) představují materiál použitelný pro produkci a testování směsné vakcíny indukující buď alespoň humorální, nebo buněčnou imunitní odpověď proti viru, stejně jako pro analýzu B buněčných a CTL determinant.

Polyenv vakcína, navrhovaná předloženým vynálezem, se skládá ze směsi n odlišných rekombinantních virů vakcinie, kde n je celé číslo od asi 4 do přibližně 10 000 (nebo jakéhokoliv rozmezí uvnitř této množiny), kde každý vektorový konstrukt exprimuje variantu obalového proteinu viru HIV-1 (např. gp41, gpl20 nebo gp 160). Rekombinantní virus vakcinie funkčně kóduje EPV a je připraven rekombinací divokého viru vakcinie s plazmidem. Mnoho odlišných plazmidů kódujících EPV může být připraveno substitucí jedné sekvence kódující EPV jinou sekvencí, např. za použití restrikčních fragmentů nebo mutagenezí.

Příprava rekombinantního viru vakcinie: Metoda přípravy individuálních plazmidů (každý exprimuje jedinečnou sekvenci proteinu viru HIV) může využít amplifíkaci jak DNA tak RNA pro substituci izolované varianty sekvence kódující obalový protein do vektoru (např. p. Venv4 nebo pVENVl (Hallenberger et al., Virology 193:510-513 (1993)), který kóduje známou sekvenci pro obalový protein viru HIV (např. dostupná vNIAID AIDS Research & Reference Reagent Program, Rockville, MD).

Metody amplifikace DNA na nebo RNA jsou velmi dobře známé a mohou být použity dle navrhovaného vynálezu, bez velkých omylů, podle zde uvedených návodů a rad. Známé metody amplifikace jsou například polymerázová řetězová reakce (PCR) a odvozené amplifikační procesy (viz patent US Nos. 4 683 1995, 4 683 202, 4 800 159, 4 965 188, Mullis et al., 4 795 699 a

921 794 Tábor et al., 5 142 033 Innis, 5 122 464 Wilson et al., 5 091 310 Innis,

066 584 Gyllensten et al., 4 889 818 Gelfant et al., 4 994 370 Silver et al., 4 766 067 Biswas, 4 656 134 Rigold) a RNA zprostředkovanou metodu amplifikace která používá anti-sens RNA proti cílové sekvenci jako templát pro syntézu dvojřetězcové DNA (patent US 5 130 238 Málek et al., s obchodním jménem NASBA).

Například rekombinantní konstrukt viru vakcinie připravený tímto způsobem může býtpoužit pro imunizaci a indukci HIV specifické T a/nebo B buněčné odpovědi. Jako primery jsou použity konzervativní sekvence a tudíž je možné úspěšně amplifikovat env geny z mnoha odlišných vzorků získaných od HIV-1 infikovaných pacientů. Základní technika zde popsaná může být podobně použita pro PCR nebo jiné typy amplifikačních primerů, tak aby bylo možno nahradit menší nebo větší části env sekvence z objemného izolátu za ty přítomné ve vektorech kódujících obalových protein viru HIV, viz Ausubel, infra, Sambrook, infra.

EPV kódující nukleové kyseliny: Technika vychází z izolace DNA z buňky nakažené virem RNA a amplifikace env sekvencí pomocí PCR. PCR nebo jiná amplifikační metoda představuje nejjednodušší způsob izolace HIV sekvencí, je však samozřejmě možné použít jakékoliv jiné vhodné metody, jako je například klonování a izolace nukleových kyselin kódujících EPV, nebo EPV proteinů (viz Ausubel, infra, Sambrook, infra). Restrikční místa pro enzymy jsou většinou uvnitř sekvencí PCR nebo jiných amplifikačních primerů, pro usnadnění klonování genu.

Izolovaná DNA pro PCR může být izolována z mnoha virových zdrojů včetně čerstvé nebo zamražené krve HIV + pacientů a buněk, které byly infikovány in vitro izolovaným virem.

Jelikož cílem je produkce nových HIV env konstruktů, polymerázová řetězová reakce (PCR) je většinou použita k amplifíkaci 100 až 2700 párů bází (bp) z env genu, pokaždé z různých pacientů PCR primer musí být dobře konzervovaná HIV sekvence, vhodná pro amplifikace env genů ze známých vzorců env genů, izolovaných z různých virů HIV nebo HIV pacientů. Amplifikovaná DNA pak obsahuje části kódující 10 až 900 (nebo 100 až 400, 400 až 600, 600 až 900 a nebo libovolné rozpětí v rámci daných hodnot) aminokyselin z gpl20 a gp41 (oba tvoří gp 160).

Jeden či více variabilních regionů obalového proteinu (VI až V5) a konstantních regionů (Cl až

-22CZ 296575 B6

C5) jsou pokud možno obsaženy v produktu PCR, lépe pak jsou-li obsaženy VI, Cl, V2, C2, V3, C3, V4, C4 a V5 regiony. Navíc může amplifikovaná sekvence obsahovat 1 až 200 aminokyselin mimo štěpitelnou sekvenci pro gpl20/gp41. Pokud je to možné je vhodné amplifíkovat celý env gen. Je možné že amplifikovaná sekvence kóduje gpl60 je ztrácená část všech sekvencí kódujících transmembránové domény a/nebo domény cytoplazmatického konce (viz Hallenberger et al., (1994)).

PCR primery mohou být vytvořeny tak aby restrikční místa obklopily sekvenci obalového proteinu v plazmidu vakcinie tak, že jsou inkorporovány do amplifikované DNA. Použitím dobře známé techniky substitučního klonování, mohou být vytvořeny deriváty plazmidu vakcinie, které exprimují varianty sekvencí kódující obalové proteiny získané od 1 až 10 000 pacientů, substitucí částí pacientovy EPV kódující obalové proteiny získané od 1 až 10 000 pacientů, substitucí částí pacientovy EPC kódující sekvence za odpovídající část env sekvence v plazmidu vakcinie, stejně jak při použití restrikčních fragmentů pro substituci. Například pVenv4 plazmid a PCR produkt byl inkubován sKnpI a BsmI tak aby byla získána sekvence kódující zkrácený gpl60 sl až 639 aminokyselinami, který nemá ani transmembránovou ani cytoplazmatickou koncovou doménu gp41 (viz Hallenberger et al., (1993)).

Po ligaci produktu PCR a pVenv produktu, následuje transformace bakteriálních buněk s ligační směsí pomocí jedné z běžně používaných metod, např. elektroporací, rekombinantní kolonie jsou pak kontrolovány sekvenováním.

Rekombinantní konstrukty viru vakcinie kódující obalové proteiny viru HIV: Viry vakcinie kódují EPV jsou pak rekombinovány s divokým virem v hostitelských buňkách a vybrány jsou plaky obsahující viry exprimující EPV a ty jsou pak uskladněny. Zásobní vzorky virů, stejně jako Vvenv, obsahujících sekvence kódující odlišné EPV, jsou pak smíchány, za použití alespoň 4 až 40 a maximálně asi 10 000 odlišných rekombinantních vektorů tak, aby vytvořily vakcínu navrhovanou předloženým vynálezem.

Rekombinantní plazmidy vakcinie obsahující EPV sekvence, je pak možné sekvenovat nebo testovat pomocí protilátek specifických proti obalovým proteinům viru HIV, tak aby se odlišily jednotlivé varianty. Pro sekvenování je preferována Sangerova metoda použití dideoxy nukleotidů. Metodiku je možné modifikovat od výše zmíněné (Sambrook et al., (1989 infra, Uniter States Biochemical, Sequenase Version 2,0 -DNA Sequencing Kit, Ninth Edition, Amersham, Life Science, lne., (1994)) tak aby bylo možné odečítat přibližně 50 až 300 bp od pozice primeru.

Metody produkce VV expresních vektorů jsou v praxi dobře známé (viz Meckett, M. et al., Proč Nati. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419 (1982), Panicali D. and Paolatti E. Proč. Nati. Acad. Sci (USA) 79:4927-4931 (1982), U.S. Patent 4 169 763, Mazzara G.P. et al., Methods in Enz. 217-557-581 (1993), Ausubel et al., infra at §§16,15-16,19). Dříve popsaný pSCll vektor (Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell Biol. 5:3403-3409 (1985) je vhodné použít pro výrobu env kódujícího plazmidu, jako je například pVenv4.

Jako virový vektor má virus vakcinie řadu užitečných vlastností, včetně schopnosti umožnit klonování cizorodé DNA, široké spektrum permisivních buněk, relativně vysokou úroveň syntézy proteinů, vhodný přenos, sekreci, processing a post-translační úpravy diktovaných primární strukturou exprimovaných proteinů a hostitelskou buňkou. Například N-O-glykosylace, fosforylace, myristace a štěpení, stejně jako sestavování exprimovaných proteinů, probíhající přesným způsobem.

Některé existující varianty vektoru vakcinie jsou použitelné v navrhovaném vynálezu (viz

Ausubel et al., infra, §§ 16,15-16,19). Běžně je po vytvoření zásobního vzorku (viz Ausubel et al., infra, §§ 16,16), nukleotidová sekvence kódující EPV umístěna pod kontrolu promotoru viru vakcinie a integrována do genomu vakcinie tak aby si udržel svoji infektivitu (viz Ausubel et al., infra, §§ 16,17). Je také možné expresi zajistit transfekcí plazmidu obsahujícího gen kódující

-23 CZ 296575 B6

EPV, který je pod kontrolou promotoru vakcinie, do buněk, které byly infikovány divokým kmenem viru vakcinie.

Je vhodné aby hostitelská buňka i vektor vakcinie byly použitelné a vhodné pro vakcinaci savců a zejména lidí. Tyto rekombinantní viry mohou být charakterizovány pomocí řady známých metod (viz Ausubel et al., infra, §§ 16,18). V další variantě, polymerázový řetězec bakteriofága T7 může být integrován o genomu vakcinie, takže sekvence kódující EPV je exprimována pod kontrolou promotoru T7, buď v transfekované plasmě, plazmidu, nebo rekombinantním viru vakcinie.

Použité promotoru viru neštovic má tu výhodu, že buněčná či jiné virové promotory nejsou obvykle rozeznány transkripčním aparátem viru vakcinie. Komponenty promotorů časné i pozdní fáze jsou použité v rekombinantních virech obsažených v polyenv vakcíně tak, aby EPV exprimované v hostitelských buňkách infikovaných rekombinantním virem vakcinie byly prezentovány jak antigen v asociaci s hlavním histokompatibilním komplexem (MHC) třídy I nebo II. Tyto MHC asociované obalové proteiny viru HIV budu pak tvoři cíl pro T buňky a připraví tak vakcinovaného savce na cytotoxickou T buněčnou a/nebo humorální odpověď proti EPV exprimovaným HIV virem. To je dané schopností vektorů viru vakcinie indukovat v hostitelských buňkách MHC prezentaci těchto antigenů, kterých v pozdních fázích infekce ubývá. Transkripty vzniklé brzo budou ukončeny po sekvenci TTTTTNT a povedou k neadekvátní HMC prezentaci.

Je možné, že tyto terminační motivy uvnitř kódující sekvence genu mohou být alterovány mutací, pokud je použit časný promotor viru neštovic, z důvodů zvýšení prezentace antigenů obalových proteinů v hostitelských buňkách (Earl et al., infra (1990)). K napodobení mRNA viru vakcinie, nepředkládaná vedoucí a 3'-terminální sekvence, jsou ponechány obvykle krátké, pokud jsou použity v plazmidu vakcinie s inkorporovanou sekvencí kódující EPV viru HIV.

Plazmid použitý pro výrobu konstruktů vakcinie, dle předloženého vynálezu, by měl obsahovat místa rozeznávaná restrikčními endonukleázami aby bylo možné inzertovat gen env za promotor vakcinie (viz Ausubel et al., infra, §§ 16,17). Ještě výhodnější je, pokud plazmid již obsahuje sekvence kódující obalový protein, kde se unikátní restrikční místa nacházejí na začátku a na konci sekvence kódující env protein. Stejné restrikční fragmenty sekvencí kódující EPV mohou pak nahradit odpovídající sekvence v plazmidu. V těchto případech, je hlavní část sekvence kódující EPV inzertována po odstranění většiny sekvence kódující obalový protein z plazmidu.

Je preferováno, aby výsledný konstrukt viru vakcinie (obsahující sekvenci kódující EPV a promotor viru vakcinie) byl obklopen původní virovou DNA, tak aby to umožnilo homologní rekombinaci po transfekci plazmidu do buněk, které byly předtím infikované divokým kmenem viru vakcinie. DNA viru vakcinie obklopující EPV kódující sekvenci je zvolena tak, aby rekombinace neporušila žádný z esenciálních virových genů.

Bez selekce je poměr rekombinantních kparentálním virům vakcinie obvykle okolo 1:1000. Ačkoliv tato frekvence je dostatečná na to aby umožnila plakovou hybridizaci (viz Ausubel etal.,. infra, §§ 6,3 and 6,4) nebo imunoscreening (viz Ausubel et al., infra, §§ 6,7) k určení rekombinantních virů, k identifikaci rekombinantních virů byla vyvinuta celá řada metod. Celá řada těchto selekčních nebo screeningových metod je dnes velmi dobře známá (viz Ausubel et al., infra, §§ 16,17). Obvykle je expresní úsek obklopen segmenty genů vakciniové thymidin kinázy (TK) a rekombinace tedy vede k inaktivaci tohoto enzymu. Viry s TK-fenotypem mohou být pak odlišeny od TK+virů, infekcí TK-buněčné linie v přítomnosti 5-bromo-deoxyuridin (5-BrdU), který musí být thymidin kinázou inkorporovanou ve virovém genomu fosforylován aby se stal letálním. Jiná možnost, která se dá s předchozí variantou kombinovat, je selekce rekombinantních virů pomocí koexprese bakteriálních genů určujících rezistenci k antibiotikům, jako je např. ampicilin (amp), nebo guanninfosforybozyl transferáza (gpt). Dalším příkladem může být

-24CZ 296575 B6 koexprese lacZ genu z Eschericia Coli, která umožňuje výběr rekombinantních virových plaků pomocí Xgal (viz Ausubel et al., infra, §§ 16,17).

Rekombinantní viry vakcinie exprimující EPV, dle navrhovaného vynálezu, mohou být eventuálně atenuované nebo inaktivované pomocí známých metod, jako je inaktivace horkem, inkubací s paraformaldehydem, ozářením ultrafialovými paprsky, inkubace s propriolactenem, formováním hybridů či chimér nebo nějakou jinou metodou (viz Zagary et al., Nátuře 332:728-731 (1988), Ito et al, Cancer Res. 50:6915-6918 (1990), Wellis et al., J. Immunol. 99:1134-1139 (1967), D'Honcht, Vaccine 10 (Suppl).: 548-552 (1992), Selenka et al., Arch. Hyg. Bacteriol. 153:244—253 (1969), Grunwald-Bearch et al., J. Cancer. Res Clin. Oncol. 117:561-567 (1991)). Například inaktivace teplem v 60 °C značně redukují titr viru. Tato inaktivace je bezpečně testována, neboť nekompletní inaktivace mže vést ke smrti pacienta (Dorozynsky and Anderson, Science, 252:501-502 (1991)).

Tato atenuace nebo inaktivace rekombinantního viru vakcinie, musí být použita pokud pacient má narušený imunitní systém a pokud by podání živé vakcíny způsobilo komplikace nebo ohrozilo jeho život.

Farmaceutické složení

Farmaceutická příprava vakcíny, dle navrhovaného vynálezu, vhodná pro inokulaci nebo pro parenterální či perorální podání, zahrnuje polyenv rekombinantní virovou vakcínu složenou z alespoň 4 a až 10 000, lépe pak od 4 do 1000 a nejlépe pak od 10 do 100 odlišných rekombinantních virů, ve formě buněčného lyzátu, membránové frakce, částečně purifikované nebo zcela purifikované formy. Polyenv vakcína složená z rekombinantního viru a obsahující buněčný lyzát (nebo jeho membránovou frakci) by měla také obsahovat EPV proteiny exprimované také rekombinantním virem. Zahrnutí exprimovaných EPV proteinů do vakcíny, výrazně zvyšuje primární protilátkovou odpověď.

Směs polyenv vakcíny by měla mít formu sterilního vodného nebo bezvodého roztoku, suspenze nebo emulze a může také obsahovat pomocné složky nebo vehikula známé v oboru. Každý z alespoň 4-40 až 10 000 odlišných virů, kóduje a exprimuje odlišný EPV, jak je uvedeno výše. DNA kódující EPV mohou být zvoleny tak aby reprezentovaly EPV vyskytující se ve specifické izolované komunitě pacientů s AIDS. Například, vakcína může reprezentovat sekvence vyskytující se v Memphisu, TN a tak může být určena pro použití v Memphisu, TN. Vakcíny vytvořené tak aby reprezentovaly geograficky oddělná území, mohou být však samozřejmě použity i mimo danou cílenou oblast.

DNA sekvence kódující EPV mohou být také vybrány tak aby reprezentovaly určitou geograficky vymezenou komunitu, město nebo stát. V jedné polyenv vakcíně může být přítomná celá řada klonů. Polyenv vakcína může také dále obsahovat imunomodulátory, jako jsou cytokiny, které zesílí imunitní odpověď proti virové infekci (viz Berkov et al., eds. The Měrek Manual, Fifteenth Edition, Měrek and Co., Rakway, NJ (1987), Goodman et al., eds. Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eigtheen Edition, Pergamon Press, lne. Elamsford, NY (1990) Avery's Drug Treatment: Principles and Practise of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Third Edition, AIDS Press, LTD., Wiliams and Wilkins, Baltimore, MD/1987), Katzunk, ed. Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992)), tyto reference a ostatní dosud citované práce zachycují současný stav techniky. Jak je zřejmé odborníkovi, když je vakcína dle navrhovaného vynálezu podávána individuu, může být ve směsi, která bude obsahovat například soli, pufry, adjuvans a jiné substance, které jsou nezbytné pro funkčnost vakcíny. Adjuvans jsou látky, které mohou být použity k specifickému zesílení imunitní odpovědi. Běžně jsou adjuvans a vakcinační směs smíchány před aplikací pacientovi, je však také možné použít oddělené injekce, které je však třeba aplikovat do stejného místa. Adjuvans mohou být rozděleny do několika skupin podle svého složení. Jsou to olejová adjuvans, minerální sole (např. A1K(SO₄)₂, AlNa(SO₄)₂,

-25 CZ 296575 B6

A1NH₄(SO₄)₂, silice, kaolin a karbon), polynukleotidy (např. polylC a polyAU nukleové kyseliny) a některá přirozené substance (např. vosk D z Mycobacterium Tuberculosis, některé složky získané z Corynebacterium parvum nebo Bordetella pertussis a membrány rodu Brucella). Mezi tyto substance prakticky použitelné jako adjuvans patří také saponiny (např. Quil A., Superfos A/S, Denmark). Příklady materiálů, použitelných ve vakcinačních směsích jsou uvedeny v např. Osol, A., ed. Remingtonů Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing, Co., Easton, PA (1980), pp.1324-1341.

Farmaceutická směs polyenv vakcíny dle navrhovaného vynálezu, může také obsahovat alespoň jednu antivirovou chemoterapeutickou složku. Nelimitující příklady mohou být např. gamaglobulin, amantadin, guanidin, hydroxy benzimidazol, interferon-a, interferon-β, interferon-γ, interleukin-16 (IL-16, Kurth, Nátuře, December 8, 1995), thoisemikarbazony, methisazon, rifampir, ribvirin, a analogy pyrimidinů (např. AZT a/nebo 3TC), analogy purinů, foscarnet, kyselina fosfonooctová, acyclovir, dideoxynucleosidy a inhibitory proteázy (např. saquinar (Hoffmann - La Roche), indinavir (Měrek), ritonavir (Abbott Labs)., AG 1343 (Agouron Pharmaceuticals), VX-2/78 (Glaxo Wellcome)), Chemokiny (jako je RANTES, ΜΙΡΙα, nebo ΜΙΡΙβ (Science 270: 1560-1561)) nebo ganciclivir (viz např. Richman: AIDs Res. Hum. Retroviruses 8:1065-1071 (1992), Annu. Rev. Pharmacol. Toxico. 33:149-164 (1993), Antimicrob Agents Chemoter 37:1207-1213 (1993), AIDs Res. Hum. Retroviruses 10:901 (1994), Katzung (1992), infra, a reference citované zde na stránkách 798-800 a 680-681.

Farmaceutické použití

Použití polyenv vakcíny (nebo antiséra které vytváří), může mít buď profylaktický, nebo terapeutický účinek, z čehož výhodnější je profylaktický účinek. Pokud je vakcína použita jako prevence, je živá polyenv vakcína podávána předtím, než jsou detekovány jakékoliv symptomy HIV infekce nebo nemoci AIDS. Profylaktický účinek vakcinační směsi slouží k prevenci jakékoliv následné infekce virem HIV.

Pokud je vakcína podávána s terapeutickým záměrem, je podávána ve chvíli, kdy jsou již bezpečně zjištěny symptomy infekce. Použití živé virové vakcíny u pacientů infikovaných virem HIV je možné pouze pokud je imunitní systém pacienta shledán schopným účinně reagovat na virovou vakcínu, bez případného rizika možných komplikací či dokonce smrti, v případě že živý virus je podáván v množství dostatečném k vyvolání reakce natolik silné aby překonala aktuální virovou infekci.

Pokud je pacientův imunitní systém oslaben, je třeba použít atenuovanou nebo inaktivovanou směs polyenv vakcíny, kde je rekombinantní virus atenuován nebo inaktivován, jak bylo uvedeno výše (viz Berkov (1987) infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra a Katzung (1992), infra Dorozynski a Anderson, Science 252:501-502 (1991)).

Směs je farmakologicky přijatelná pokud je tolerována pacientem kterému je aplikována. Látky obsažené ve směsi jsou podávány v terapeutické nebo profylaktické dávce, pokud se jedná o množství vyvolávající farmaceuticky signifikantní odpověď. Vakcína, nebo směs, dle navrhovaného vynálezu, je farmaceuticky signifikantní pokud její podání vyvolá detekovatelné změny ve fyziologii pacienta, zejména zvýšení humorální nebo buněčné imunitní odpovědi proti viru HIV.

Vyvolaná prevence nemusí být absolutní, tzn. HIV infekce nebo nemoc AIDS nemusí být zcela preventována nebo potlačena, po použití je však zřejmé statisticky významné zlepšení, vzhledem ke kontrolní populaci. Účinek může být omezen na snížení intenzity a rychlosti nástupu symptomů nemoci.

-26CZ 296575 B6

Farmaceutické podání

Vakcína navrhovaná předloženým vynálezem, vyvolává rezistenci k jednomu či několika kmenům viru HIV. Navrhovaný vynález se proto soustředí na způsoby prevence nebo atenuace infekce alespoň jedním kmenem viru HIV. Tak jak je zde použita, řečená vakcína preventuje nebo likviduje chorobu pokud její podání pacientovi vede k totální nebo částečné atenuaci (tzn. supresi) symptomů či projevů choroby, nebo k totální či částečné imunitě k této chorobě.

Alespoň jedna polyenv vakcína dle navrhovaného vynálezu, může být podána způsobem tak, aby bylo dosaženo zamýšleného cíle, za použití farmaceutické směsi, jak zde byla popsána.

Například, tato směs může být podána různými parenterálními způsoby tak jako subkutánně, intravenózně, intradermálně, intramuskulárně, intraperitoneálně, intranasálně, transdermálně nebo bukální cestou. Preferovaná je varianta subkutánního podání. Parenterální podání, může být prostřednictvím injekce tvořící blus, nebo postupnou perfuzí (viz Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (198) infra a Katzung (1992), infra).

Typickým protokolem pro prevenci, supresi, nebo léčbu choroby, nebo podmínkou, kteráusnadní buněčnou imunitní odpověď pomocí aktivní specifické buněčné imunoterapie, představuje aplikace efektivního množství vakcinační směsi, jak byla popsána výše, podáním jedné terapeutické dávky, nebo opakovanou imunizací sekundárními dávkami v období od jednoho týdne do zhruba 24 měsíců.

Podle navrhovaného vynálezu, je efektivní množství vakcinační směsi to, které je dostatečné pro vyvolání požadovaného biologického efektu, v tomto případě je to buď buněčná, nebo humorální imunitní odpověď proti viru HIV. Je samozřejmé, že efektivní dávka závisí na věku, pohlaví, zdravotním stavu a váze pacienta, typu předešlé léčby pokud nějaká proběhla, frekvenci terapie a typu požadovaného efektu. Rozmezí efektivních dávek, uváděné níže, nemůže být bráno jako limit vynálezu a reprezentuje pouze preferované varianty. Nejvhodnější dávkování musí být zvoleno individuálně pro každého pacienta, podle uvážení odborníků, bez velkého experimentování (viz Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (198) infra, Ebadi. Pharmacoogy, Little Brown and Co., Boston, Ma (1985) a Katsung (1992), infra).

Obecně se dá říci, že dávka pro dospělého pacienta bude přibližně od 10⁵ do 10⁹ plaque forming units (pfu)/kg nebo clony forming units (cfu)/kg na dávku, kde je preferováno 10⁶ až 10⁸. Jakákoliv dávka je použita, musí být v bezpečném a přitom efektivním množství determinovatelném známými metodami, jak je zde také popsáno.

Subjekt

Objektem kterému má být aplikována vakcína dle navrhovaného vynálezu, může být jakýkoliv savec, který je schopen vyvinout specifickou imunitu proti viru HIV, kde buněčná odpověď je zprostředkována proteiny MHC třídy I nebo II. Ze savců jsou preferovanými objekty savci z řádu primátů (včetně lidí, šimpanzů, lidoopů a opiček). Nejpreferovanějšími objekty jsou lidé. Subjekty jsou pokud možno infikovány virem HIV nebo modelovou infekcí HIV napodobující (viz Hu et al„ Nátuře 328:721-723 (1987)).

Nyní po obecném popisu vynálezu, je smysl snadněji pochopitelný z referencí a příkladů, které následují, pouze jako ilustrace, a nemohou být brány jako limity daného vynálezu.

-27CZ 296575 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava exprese HIV env proteinu ve virovém vektoru vakcinie

Nomenklatura: pro zjednodušení, je konstrukt rekombinantního viru někdy označována Vvenv konstrukt, zatímco specifický konstrukt viru vakcinie je označován podle pacienta, nebo depozitáře (např. ATCC nebo GenBank), který složil jako zdroj DNA kódující protein env, použité v konstruktu. Např. Vvenv-Doe označuje virový vektor vakcinie ve kterém je použita sekvence ío kódující env protein získaná z pacienta Doe, nebo Vvenv-U28305 označuje virový vektor vakcinie ve kterém je použita sekvence kódující env protein získána z GenBank pod označením No. U28305.

Polyenv vakcína je složena z 4 až 100 odlišných rekombinantních virů vakcinie, z nichž každý 15 exprimuje unikátní obalový protein viru HIV-1. Pro zjednodušení je každý individuální viru označen Vvenv a konečná směs virů se označuje polyenv.

Při přípravě každého Vvenv je použit plazmid označovaný jako pVenv4 a divoký typ viru vakcinie označovaný NYCDH, popsaný dále. Další detaily popisuje Ryan et al., „Preparation and Use 20 of Vaccinia Virus Vectors for HIV Protein Expression and Immunization“ in Immunology Methods Manual, Lefkovits, ed., Academie Press (1996).

Vektory a hostitelské buňky: Dříve popsaný vektor pSC (Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985)) může být použit pro rekombinaci několika HIV genů do genomu viru vak25 cinie. Plazmid pSCll obsahuje lacZ gen (reportér gen, pomocí kterého mohou být transformované bakterie a V V rekombinanty mohou být snadno identifikované díky jeho β-galaktosidázové aktivitě) a další části tohoto plazmidu nesou geny kódující thymidin kinázu (TK) a resistenci kampicilinu (amp). Geny klonované do pSCll jsou inzertované do VV genomu homologní rekombinaci mezi TK genem divokého typu viru a částí TK genu obsaženou vpSCll. Inzerce 30 plazmidové DNA do virového TK lokusu inaktivuje virový gen, takže rekombinantní virus může být snadno selektován z pozadí TK⁺ virů, kultivací v bromdeoxyuridinu (BudR). Tak aby bylo možné vybrat TK' viry, které přežívají v této selekci, musí být inkubovány v buňkách, které neexprimují vlastní aktivní TK enzym, jako je například buněčná linie TKT43, která je TKdeficitním derivátem linie lidského osteosarkomu R970-5 (Rhim, J.S. et al., Int. J. Cancer 15:23— 35 29 (1975)) a umožňuje růst VV (Weir et al., infra (1982)). Produkce expresních genových segmentů viru HIV může být zajištěna inzercí celého genu do restrikčního místa Smál na pSCl 1 vektoru. Exprese celého genu může být kontrolována prostřednictvím P7.5K promotoru.

Jako alternativa ke klonování kompletních HIV genů, může jeden zastoupit částečné genové 40 sekvence, které již byly klonovány do pSC 11. Například konstrukt označený pVenV 1 byl připraven z pSCl 1 a exprimuje gen kódující BH10 HIV obalový protein (env)(Hallenberger et al, infra (1993), Kilpatrick et al., J. Biol. Chem. 262:116-121 (1987)). Konstrukt může být použit jako výchozí vektor, k substituci a expresi variabilních domén obalových proteinů z HIV izolátů. Podobně pVenv4 vektor byl vytvořen zpSCll tak aby exprimoval BH10 env protein zkrácený 45 o transmembránovou a cytoplazmatickou koncovou doménu kódovanou sekvencí gp41 ale se zachovalo oligomerizační doménou (Hallenberger et al., infra (1993). Jak je odborníkovi zřejmé, termín oligomerizační doména je použit pouze funkčně tak, aby popsal tu část gp41, která umožňuje oligomerizaci env proteinů, tzn. jedná se o strukturu zodpovědnou za oligomerizaci. Vektor pVenv4 kóduje zkrácený gpl60 (také gpl60t, gpl40) u kterého bylo zjištěno že vytváří terciální 50 strukturu, podobná té, kterou tvoří gp41/gpl20 oligomer (dimer, trimer nebo tetramer), prezentovaný na povrchu buněk infikovaných virem HIV. Terciální struktura je udržována v obou formách - sekretované i membránové (Hallenberger et al., infra (1993)). Tento vektor je s výhodou použit jako výchozí vektor pro substituci izolovaných alternativních sekvencí proteinu env.

-28CZ 296575 B6

V tomto příkladě, příprava každého Vvenv konstruktu zahrnuje použití pVenv4 a divokého typu viru vakcinie NYCDH a vhodné hostitelské buňky jak bude detailně popsán dále

PVenv4: Vektor pVenv4, byl připraven inzercí sekvence kódující HIV-1 obalový protein do rekombinantního vektoru viru vakcinie pSCll (Hallenberger et al., Virology 193:510-514 (1993), Chakrabarti et al., Mol. Cell Biology 5:3403-3409 (1985)). Sekvence HIV-1 byly derivovány z laboratorních vzorků živého viru. Sekvence byla nazvána BH10 (Ratner et al., Nátuře 313:277-284 (1985)). Jedinečné sekvence kódující obalové proteiny získané z pacientů infikovaných HIV-1 mohou být pomocí PCR technik amplifikovány a substituovány do BH10 env sekvence tak aby vznikl nový vektor. Například následující primery mohou být použity pro PCR.

(A) Sense, pozice 5785 (SEQ ID NO: 1) AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA (B) Antisense, pozice 7694 (SEQ ID NO:2) CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTCCAAAT (C) KpnI-sense, pozice 5903 (SEQ ID NO:3)

GrGGGTCACAGICTATTATGGGGTAGCFGTGT (D) Bsml-antisense, pozice 7695 (SEQ ID NO:4)

CCAGAGATTTATTACTCCAACTAGCATTCCAAGG (E) (volitelné) DrallI-sense, pozice 6153 (SEQ ID NO:5) CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG (F) (volitelné) Bsu361-antisense, pozice 6917 (SEQ ID NO:6)

TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG

Primery jsou zapsány ve směru od 5' do 3'. Restrikční místa jsou podržena (číslování pozic je založeno na sekvenci BH10 (Ratner et al., Nátuře 313:277-284 (1985)).

Strategie PCR: Pro produkci nových HIV-1 env konstruktů, je k amplifíkaci 188 párů bází (bp) genu kódujícího obalový protein, izolovaného ze čtyřiceti odlišných vzorků získaných od pacientů, použita polymerázová řetězová reakce (PCR). PCR primery představují silně konzervativní sekvence viru HIV-1 a je tedy možné úspěšně amplifikovat geny kódující env z celé řady odlišných vzorků získaných od HIV-1 infikovaných pacientů. Amplifikovaná DNA zahrnuje celý protein gpl20 kromě zhruba 10 vysoce konzervativních aminokyselin tvořících amino konec proteinů. V PCR produktu jsou obsaženy všechny variabilní domény obalového proteinu (VI až V5). Navíc tato amplifikovaná sekvence kóduje přibližně 100 aminokyselin za kontaktním místem gpl20/gp41.

-29CZ 296575 B6

PCR primery zahrnují restrikční místa pro enzymy KpnI a BsmI, které obklopují sekvenci kódující obalový protein BH10 vpVenv4 a jsou tedy inkorporovány do amplifíkovaného DNA produktu.

První kolo PCR: v 500ml mikrocentrifugační zkumavce rozmíchat:

• 1 μΐ Primerů A (SEQ ID NO: 1), 300 ng/μΐ • 1 μΐ Primerů B (SEQ ID NO: 2), 300 ng/μΐ • 2,5 μΐ 10 mM každého ze 4 dNTP • 1 μg DNA • 10 pg 10X PCR pufru • HPLC H20 do 99 μΐ

Rozmíchat zásobní roztok taq polymerázy a přidat 1 μΐ k PCR reakci. Dobře promíchat. Přelít minerálním olejem.

Reakci nechat běžet v termálním cycleru následovně:

• Inkubovat při 95 °C, 3 min do roztavení DNA • Nechat proběhnout 40 cyklů: 95 °C, 1 min, 45 °C, 2 min, 72 °C, 3,5 min.

Druhé kolo PCR: připravit PCR reakci stejně tak jak byla popsána výše ale s primery C a D (SEQ ID NO:3 a 4) a bez DNA. Přenést konečný roztok z první reakce do 95 μΐ. Přelít minerálním olejem. Ponořit opatrně špičku a odebrat zpod oleje 5 μΐ z první PCR reakce. Namíchat vzorek na druhou reakci od vrstvou oleje a nechat proběhnout cykly jako napoprvé. Třicet cyklů je obvykle dostačující. Je vhodné kontrolovat produkt odebráním 2 μΐ na gelovou analýzu po každých 10 cyklech, dokud není identifikovatelný zřetelný proužek okolo 1800bp.

Použitím dobře známé substituční klonovací techniky, byly vytvořeny deriváty pVenv4, které exprimují env sekvence od jednoho do až 40 pacientů, namísto BH10 sekvence obalového proteinu. Plazmid pVenv a PCR produkty byly nejprve nastříhány restrikčními endonukleázami KpnI a BsmI, nastříhaný pVenv4 byl pak dělen na agarózovém gelu a byl vyizolován větší fragment. Malý fragment (1800 bp fragment) HB10 env byl odstraněn. Nastříhaný PCR produkt byl také izolován a ligován do velkého fragmentu pVenv4, tak aby vznikla chimérická sekvence kódující obalový protein, nyní však obsahující 1800 bp variantní env sekvence z pacientovy DNA. Následuje ligace PCR produktu a pVenv4 produktu, bakteriální hostitelské buňky jsou transformovány ligační směsí pomocí libovolné, běžně používané metody, včetně např. elektroporace a rekombinantní kolonie jsou selektovány a analyzovány sekvenováním.

Plazmid pVenv4, nebo rekombinanty vyrobené pomocí pVenv4 usnadněné inzerce genů do genu viru vakcinie homologní rekombinací mezi thymidin kinázovými geny (TK) divokého typu viru a TK sekvencí uvnitř plazmidu. Inzercí DNA pVenv4 do virového TK lokusu získáme viry vakcinie s genem kódujícím obalový protein viru HIV-1 pod kontrolou P7.5K časného/pozdního promotoru. Virus je atenuovaný v růstové aktivitě díky přerušení TK lokusu.

Další částí pVenv4 je lacZ gen kódující enzym s β-galaktosidázovou aktivitou. Aktivita genu lacZ může být použita lk selekci rekombinant viru vakcinie (viz níže).

-30CZ 296575 B6

Obalový protein exprimovaný pomocí pVenv4 je zkrácen o transmembránovou/C-terminální gp41 sekvenci. Vektor je exprimován jako oligomemí struktura, která se objevuje uvnitř buněk I jako sekreto váná forma.

Virus vakcinie NYCDH: Každý nový substituovaný plazmid je individuálně rekombinován s divokým typem viru vakcinie NYCDH. Virus byl získán z ATCC (No. VR-325) a byl přečištěn plakovou metodou před použitím (Buck, C. and Paulino, M.S. eds., Američan Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae. 6^th Ed., Američan Type Culture Collection, Rockville, MD (1990)).

Bakteriální hostitelské buňky: Plazmid může být inkubován v libovolném hostitelském organismu, tak, jak je v praxi běžné (viz Ausubel, infra (1995 rev), §§ 16.15-16.19). Nelimitujícím příkladem mohou být buňky DH5oc.

TK-deficitní buňky: Transformace a substituce viru vakcinie je prováděna na lidské Tk 143B linii, která je derivátem lidské osteosarkomální linie R970-5 (Rhim et al., (1975) infra), která umožňuje růst V V (Weir et al. (1992) infra). Každý rekombinant viru vakcinie obsahující unikátní sekvenci HIV env genu je selektován na základě exprese lacZ genu (virové plaky jsou přelity Bluo-gal a β-galaktosidázová aktivita se projeví modrým zabarvením plaku. Mohou proběhnout dvě kola PCR.

Příklad 2: Příprava polyenv vakcíny

Věro buňky: konečným krokem výroby je inkubace Vvenv konstruktů na Věro buňkách nově získaných z ATCC (No. CCL81 neboX38) klonovaných a napěstovaných pro produkci viru. Věro buňky byly doporučeny Světovou Zdravotnickou organizací pro výrobu vakcín (Hay, R. et al., eds. Američan Type Culture Collection Catalogue of Cell Lineš and hybridomas, 7^th Ed., Američan Type Culture Collection, Rockville, MD (1992), p. 48).

Věro buňky rostou v Dulbecco's Modified Eagles Medium (Bio-Whittaker), s doplněným glutaminem (Bio-Whittaker) a tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem (Hyclone, lne.). Je také možné použít bezsérová média. Každý Vvenv konstrukt je inokulován na separátní povlak Věro buněk a sebrán ve chvíli kdy buňky začnou vykazovat znaky cytopathického efektu virové infekce. Buňky jsou po sebrání a před mražením důkladně promyty v PBS (Bio-Whittaker). Buňky jsou pak rozbity pomocí zamražení a roztavení, sonikací nebo centrifugací při nízkých rychlostech v centrifuze. Alikvoty supematantu jsou pak skladovány v -70 °C. Obalový protein je přítomný v lysátu v koncentraci natolik vysoké, aby umožnil tvorbu protilátek specifických proti HIV obalovému proteinu (což je detekovatelné ELISA technikou) v savčím modelu, i když je VV atenuovaný, např. zahřátím preparátu na 60 °C na 1 h.

Produkty vakcinie: každý typ viru (Vvenv konstruktu) z Věro buněk je individuálně zamražen a následně titrován a bezpečně testován. Po ukončení testů, alikvoty těchto virů jsou smíchány tak, aby vznikla vakcína s alespoň 10⁸ pfu/ml (pfu znamená plaque forming unit). Pokud je použito 40Vvenv konstruktů, každý z nich je přítomen ve vakcíně ve zhruba stejném množství, každý Vvenv je použit v titru 2,5x10⁶ pfu/ml v konečné vakcíně. To je celkem 1 x 10⁸ pfu.

Otestování polyenv vakcíny

Myši: myši mohou být infikovány pomocí intraperitoneální injekce 1 x 10⁷ pfu env exprimujících VV. Protilátky mohou být identifikovány pomocí HIV ELISA neutralizační techniky, jak je popsána výše, tři týdny po injekci VV.

Před výrobou vakcíny pro použití u lidí, je třeba připravit podobnou skupinu virů a nechat test proběhnout na myších. Tyto viry byly podávány myším buď intraperitoneálně, nebo subkutánně.

-31 CZ 296575 B6

Pomocí ELISA techniky (enzyme-linked imunosorbent assay) bylo pak otestováno sérum na přítomnosti specifických sérových protilátek proti viru HIV. Tato technika zahrnuje potažení jamek rozbitým HIV-1 (HTLV_mB) a zablokování destiček bovinním sérovým albuminem. Sérové vzorky byly pak přidávány v ředěních 1:100, 1:1000, 1:10 000 vPBS. Byly použity goat-antimouse protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou a jako substrát sloužil p-nitrofenyl fosfát. Barevná reakce byla zastavena roztokem hydroxidu sodného a měření optické denzity proběhlo na ELISA - readeru při 405 nm.

Jak ukazuje obr. 2, jednoduchá aplikace 10⁶ až 10⁷ pfu viru vakcinie (obsahující jednu sekvenci kódující obalový protein HIV-1 a exprimovaný na membráně vázaný obalový protein) s buněčným lyzátem vyvolává silnou protilátkovou odpověď proti HIV-1, která vydržela po celou dobu experimentu - tzn. 6 měsíců. Tato protilátková odpověď je značně silnější, než dříve popisovaná reakce na jinou imunizaci. Takto vysoká protilátková odpověď může být způsobena přítomností na membráně vázaného obalového proteinu ve vakcíně. Jak ukazuje obr. 3 tyto rekce jsou závislé na dávce. Slabší reakce byla pozorována u savců, kterým byla podána dávka 10⁶ pfu než u zvířat kterým bylo podáno 10⁷ pfu.

Byly připraveny také směsi virů vakcinie exprimujících odlišné HIV-1 obalové proteiny. Když bylo myším aplikováno 107pfu směsi virů, intenzita jejich imunitní reakce byla v podstatě stejná, jako při podání jediného rekombinantního viru vakcinie (obr. 4). Smíchání velkého počtu různých env-exprimujících virů vakcinie, nebylo popsáno, ale předpokládá se že povede ke vzniku širokého spektra neutralizačních protilátek.

Lidé: Testování směsi virů je zatím v před klinickou fází, a první pokusy budou prováděny pouze pro určení účinné dávky a testování bezpečnosti.

Klinické pokusy testující maximální možné dávky budou sestaveny ze čtyřech skupin dobrovolníků. Každá skupina pak dostane jednu z následujících dávek vakcíny:

(1) 2xl0⁴pfu (2) 2xl0⁵pfu (3) 3xl0⁶pfu (4) 2xl0⁷pfu

Každý dobrovolník dostane subkutánně směsnou virovou vakcínu v 0,5 ml fyziologického roztoku.

Příklad 3: Indukce primární imunity pomocí virové vakcíny založené na expresi mnoha typů

HIV-1 obalových proteinů virem vakcinie u šimpanzů

Populace izolátů virů HIV-1 je vyzbrojena přesně vypočítaným množstvím typů obalových proteinů. Env proteiny jsou výhradně virem kódované externí proteiny, které jsou cílem neutralizačních protilátek, ačkoliv protilátky indukované jedním izolátem, nemusí nezbytně neutralizovat jiný. Z toho důvodu jsme připravili směs HIV-1 vakcín, polyenv, kde je exprimována celá řada variant env proteinu. Výroba vakcíny začíná přípravou třiceti odlišných W-rekombinantů, z nichž každý exprimuje odlišný envl protein. Vvenv jsou pak testovány, jak individuálně, tak v kombinacích (polyenv) na šimpanzím modelu. Čtyři šimpanzi byly imunizováni subkutánně třemi injekcemi VVenv jednoho typu (šimpanzi 1,2) nebo pomocí polyenv vakcíny (šimpanzi 3,4) následovanými jednou intramuskulámí injekcí rekombinantního proteinu gpl20/gp41 v allum precipitátu. Bezpečnost vakcíny byly možné demonstrovat na všech čtyřech zvířatech, z nichž pouze u dvou se projevili známky ulcerace v místě vpichu. Vzorky séra byly testovány celou řadou testů určujících vazbu na HIV a jeho neutralizační schopnosti. Protilátky ze šimpanzů 3 a 4 měly nej vyšší vazebnou aktivitu. Neutralizační funkce byla demonstrována jak proti laboratornímu tak proti primárnímu izolátu viru HIV-1, z nichž ani jeden nebyl přítomný ve vak-32CZ 296575 B6 cíne. Tedy indukce lymfocytů pomocí směsi env proteinů, tedy představuje účinnou metodu pomocí které mohou být indukovány vysoce kvalitní protilátky proti řadě odlišných kmenů HIV1.

Materiál a metody:

PVenv4 a VV rekombinantní vektor: pVenv4 byl dříve připraven zavedením stop kodonu do BH10 env sekvence a inzercí modifikovaného genu kódujícího env protein BH10 do plazmidu pSC 11. Proteinový produkt env plazmidu pVenv4 je zkrácen na 640 aminokyselin, je však nadále ío schopen sekrece a oligomerizace. Produkce rekombinantních VV, Venv4, exprimujících tento zkrácený BH10 env protein, byl již dříve popsán (Hallenberger et al., Virology 191:510-514 (1993)).

PCR amplifikace env sekvence izolovaných zHIV-1 infikovaných pacientů: Pro amplifikace 15 HIV env sekvencí bylo použito PCR. Konkrétně, ze vzorků izolovaných z krve pacientů pozitivních na HIV-1, u kterých byla již dříve diagnostikována přítomnost viru HIV. Další vzorky byly získány buď izolací z pacientů s klinickými symptomy AIDS, nebo z repozitářů zabývajících se výzkumem AIDS. Z krve nebo ze vzorků infikovaných buněk byla nejprve izolována DNA postupným přikapáváním vzorku do lyzačního roztoku obsahujícího SDS a inkubací po dobu 20 3 0 min. v 65 °C. Po přidání proteináz v koncentraci 0,5 mg/ml, byl lyzát inkubován v 45 °C přes noc. Dvě fenolové extrakce byly následované precipitací v ethanolu a resuspendováním DNA ve vodě.

Všechny vzorky DNA prošly dvěma koly amplifikace PCR podle standardních postupů. Sek25 vence pro primery byly zvoleny podle publikované sekvence BH10 (Ratner et al., Nátuře 313:277-284 (1985)). K získání fragmentů obsahujících sekvence všech variabilních oblastí a částí gp41, byly použity stejné primery, jaké byly popsány v příkladu 1. Produkty PCR byly následně klonovány substitucí do pVenv4 vektoru za použití standardních metod. Sekvenování nového plazmidu proběhlo dle Sangerovy metody za použití primeru CCATGTGTAAAA30 TTAACCCCACTCTGTG (SEQ ID No. 5).

Příprava Vvenv: Nové VV rekombinanty (Vvenv) byly připraveny transfekcí W (NYCDH ATCC) infikovaných buněk s nově substituovaným rekombinantním plazmidem (viz výše). Pro transfekci byly použity Transfectam (Promega) a Lipofectamin (Gibci, BRL), dle návodů přilo35 žených výrobcem. VV byly nakonec vyčištěny plakovou technikou.

Imunizace: Buněčné lyzáty Vvenv infikovaných buněk byly podány šimpanzům subkutánní injekcí, byl použit VVenv buď pouze jednoho typu, nebo ve směsi. Celkové množství VW udávané vpfu bylo podobné ve všech infekcích (asi 10⁷ pfu). Intramuskulámí infekce obsahovala 40 směs přibližně 40 pg gpl20 (Cat # 12101, Intracel, Cambridge, MA), 20 pg gp41 (Cat # 036001,

Intracel) a 500 pg aluum precipitátu (Rehsorptar Aluminium hydroxid Adsorptiv gel, Intergen Co., Purchase, NY) na dávku.

ELISA technika: Pět Elisa technik bylo použito následovně: Abbott ELISA # 1

ELISA # 1 - klinická Elisa do firmy Abbott zakoupena od Abbott Laboratories a provedená dle návodu doporučeného výrobcem HIV AB HIV-l/HIV-2 (rDNA) ELA, Abbott Laboratories, Abbott park, IL).

ELISA # 2 - jako antigen zde sloužil rekombinantní Mn-gpl60 (Quality Biological, lne.

Gaithersburg, MD) v koncentraci 1 pg/jamku. Destičky byly blokovány a testy proběhly s vzorky séra ředěného trojkovou řadou. Destičky byly pak promyty a značeny pomocí anti-human IgG protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou.

-33 CZ 296575 B6

ELISA # 3 - ELIS A destičky byly potaženy sLAI-gpl20 (CHO-derived protein, Intracel) v koncentraci 1 pg/ml. Vzorky séra byly přidány v ředění 1:100 a značeny pomocí anti-human

IgG protilátky (Mouše anti-human IgGl-AP, cat # 9050-4, Southem Biological Associates, lne.

Birmingham, AL) konjugované s alkalickou fosfatázou, jako substrát sloužil p-nitrofenyl fosfát.

Měření optické denzity proběhlo při 405 nm.

ELISA # 4 - tato ELISA byla stejná jako ELISA # 3, s tím rozdílem že ELISA destičky byly potaženy IIB-gpl20 (baculovirus-derived protein, Intracel, cat # 12001, Cambrige, MA) v koncentraci 1 pg/ml.

ELISA # 5 - tato ELISA byla stejná jako ELISA # 3, s tím rozdílem že ELISA destičky byly potaženy lyzátem viru IIB (Organon Teknika Co., Durham, NY) vkoncentraci 1 pg/ml.

Neutralizační technika: Tato technika byla prováděna s laboratorními nebo primárními izoláty (Montefiori et al., J. Clin. Microbiol. 26:231-237 (1988), Montefiori et al., Joumal of Infectious Diseases 173:60-67 (1996)). Laboratorní izoláty: viry byl mixovány s vzorky séra ředěného 1:20 a naneseny na buněčné linie MT-2 nebo CEM-xl74. Pro určení životnosti buněk bylo použito barvení neutrální červení. Jako pozitivní výsledek byla brána 35 až 40 % redukce úmrtnosti buněk vzhledem ke kontrolnímu vzorku. Primární izoláty: viry byly mixovány s vzorky séra ředěného 1:4 a naneseny na PHA stimulované PBMC. Technika byla použita pro p24. Redukce infektivity viru alespoň 75 % vzhledem ke kontrole bylo považováno za pozitivní výsledek.

Závěr

Příprava nových Vvenv rekombinantních virů vakcinie: Z důvodů přípravy nových VV rekombinantů (Vvenv), z nichž každý exprimuje odlišný HIV-1 env protein, byla ze vzorků HIV-1 nejprve izolována DNA. Většina DNA byla izolována z krve pacientů kteří vykazovali vnější příznaky choroby a byly dříve diagnostikováni jako HIV-1 pozitivní. Další vzorky DNA byly získány z AIDS Research and Reference Reagent Repository. PCR proběhlo pomocí páru primerů obsahujících restrikční místa pro Knpl a Bsml. Fragmenty byly pak substituovány do vektoru pVenv4, zobrazeném na obr. 5 (pVenv původně exprimuje zkrácený HIV-1 protein HB10), v restrikčních místech KpnI a Bsml. Tímto způsobem je původní BH10 sekvence pro gpl20 (VI až V5) a gp41 nahrazena sekvencemi získanými jako produkty PCR. Z každého substituovaného plazmidu je připraven nový VV rekombinantní virus (Vvenv).

Tato metoda představuje jednoduchý způsob pomocí kterého je obrovská diverzita env kódujících sekvencí vnesena do unikátní VV rekombinantů (Vvenv). Je zajímavé že většina sekvencí je produktivní, z čehož vyplývá, že env sekvence v provirovém genomu (ze kterého je derivována většina PCR produktů), bývají defektní jen velmi zřídka.

Pokud je směs Vvenv použita ve vakcíně, je možné dosáhnout obrovské diverzity.

Imunizace šimpanzů s jedním nebo se směsí Vvenv: Pro testování jednoho klonu i směsné rekombinantní vakcíny byli použiti čtyři šimpanzi. Protokol imunizace je uveden v tabulce 2. První tři injekce obsahovaly VV, zatímco poslední injekce obsahovala kombinace gpl20, gp41 a aluum precipitátu a byla podána intramuskulámě. Šimpanzi 1 a 2 dostali pouze jednu variantu viru vakcinie, respektive obalového proteinu, podanou ve všech prvních třech injekcích. Šimpanzí 3 a 4 dostali směs 10 rekombinantních VV (respektive env v první infekci), 10 dalších odlišných v druhé injekci a 10 posledních unikátních env variant v poslední injekci, což je celkem 30 odlišných virových vektorů před sekundární imunizační dávkou proteinu. Všichni šimpanzi dostali podobná množství viru vakcinie udávaná v pfu a podobná množství rekombinantního proteinu.

-34CZ 296575 B6

Tabulka 2

Imunizační protokol šimpanzů imunizovaných směsí VV rekombinantů

Šimpanzi 1,2	Datum 9. 1. 1996 16. 4. 1996 11.6. 1996 30. 7. 1996	Injekce VV (Env#l) VV(Env#l) VV(Env#l) rekombinantní gpl20 + rekombinantní gp41 + aluum precipitát
Šimpanzi 3,4	9. 1. 1996	VV (Env#l až 10)
	16.4. 1996	V V (Env #1 až 20)
	11.6. 1996	VV (Env #1 až 30)
	30. 7. 1997	rekombinantní gpl20 + rekombinantní gp41 + aluum precipitát

Rekombinantní Vvenv mohou být aplikovány bez vzniku lézí. Všichni čtyři šimpanzi byli monitorováni kvůli příznakům systémové choroby nebo tvorby lézí v místě infekce.

Zvířata byla denně testována na projevy diarhey, rhionrhey, kašlání, kýchání, rapidní respirace, letargie, omezené pohyblivosti a ztráty chuti, žádný z těchto příznaků nebyl u testovaných zvířat pozorován po celou dobu testu. Fotografie místa injekce pořízené v pravidelných intervalech po první imunizační dávce V V, ukazují zduření ve všech čtyřech případech. Lehké léze vzniklé na místě injikace u šimpanzů 1 a 3, jsou typické pro vakcinaci virem neštovic, u šimpanzů 2 a 4 se neobjevily. Žádné příznaky choroby, zduření či lézí nebyly zřetelné po druhé, třetí I čtvrté injekci u žádného ze zvířat, což ukazuje že specifická anti VV imunita byla indukována první injekcí.

Injekce Vvenv následované sekundární dávkou proteinu indukují tvorbu ELIS A pozitivních protilátek. HlV-specifické protilátky byly testovány během celého imunizačního procesu pomocí pěti odlišných ELISA technik. ELISA techniky byly použity k měření relativní kvality, spíše než absolutní kvantity protilátek v každém zvířeti. Ve většině případů, testy probíhaly s virovými fragmenty, které ztratily prostorovou a oligomerickou strukturu typickou pro nativní env protein. V těchto případech se předpokládá, že se v ELISA testu váže pouze subset HIV specifických protilátek. Výsledky získané Abbott ELISA testem jsou uvedeny na obr. 6. Šimpanz 3 překročil hranice pozitivity po první VV imunizaci, zatímco šimpanz 4 tuto hranici překročil po druhé VVenv imunizaci. Intenzita imunitní reakce šimpanzů 3 a 4 na konci imunizačního procesu překročila dalece odpověď šimpanzů 1 a 2 V případě ELISA testu # 2 s MN gplóO, byl jediným silně odpovídajícím šimpanzem šimpanz 3. Tato reakce byla měřena pouze po prvních třech injekcích a nebyla tedy zesílena sekundární imunizací s proteinem. Reakce na CHO-LAI navázaný na ELISA destičkách (ELISA # 3) za použití stejného antigenu jaký byl použitý ve vyčištěné formě pro sekundární imunizaci, byla silně pozitivní opět u šimpanze 3. V ELISA testu # 4 s destičkami s navázaným IIB-gpl20, šimpanz 2 vykazuje silné pozadí a díky němu 1 pravděpodobně nejvyšší odpověď ze všech zvířat. Reakce měřené ELISA technikou # 5 s Oragon Technika lyzátem viru IIIB byla pozitivní u všech tří zvířat.

Neutralizační reakce proti primárním a laboratorním izolátům. Neutralizační reakce byly testovány se séry všech zvířat, proti primárním a laboratorním izolátům. První technika proběhla na T buněčné linii, pozdější pak na seronegativních PHA stimulovaných PBMC. Ve všech těchto případech neobsahovaly izoláty žádný z kmenů přítomných v HIV-1 vakcíně.

-35 CZ 296575 B6

Jak ukazuje tabulka 3 vzorky ze šimpanzů 2, 3 a 4 vykazují pozitivní ovlivnění (35 až 40 % inhibice růstu viru) efektu proti MN laboratornímu izolátu na T buňkách. Tato technika se dvěma jinými laboratorními viry (první IIIB (Lockey et al., Aids. Res. Hum. Retrovirus 12:1297-1299 (1996) a druhý SF2) nepřinesla pozitivní výsledky s žádným vzorkem. Výsledky neutralizační reakce (Montefíory et al., 1988, supra, Montefiory et al., 1996, supra) se všemi čtyřmi primárními izoláty testované na PHA stimulovaných PBMC, jsou zobrazeny. Virus je zřejmě velmi obtížné tímto způsobem neutralizovat, a séra pacientů vykazují negativní výsledky i když je použito ředění 1:2 (Fenyo et al., AIDS 10:S97-S106 (1996), Moore and Ho AIDS 9:S117-S136 (1995), Montefíory et al., 1996, supra). Je zajímavé, že sérum ze šimpanze 4 ředěné 1:4, bylo schopno neutralizovat jeden z testovaných primárních izolátů. Situace je tedy odlišná od zkušeností ostatních s env vakcínou, stejně jako v mnoha předešlých případech, séra ze zvířat imunizovaných env vykazují negativní neutralizační reakci proti primárním izolátům (Steele Joumal of NIH Research 6:40-42 (1994), Moore, Nátuře 376:115 (1995)).

Tabulka 3

Neutralizace virových kmenů nepřítomných ve vakcíně pomocí šimpanzích antisér

Izolát

Laboratorní kmen MN

Šimpanz 1

Šimpanz 2 pozitivní reakce

Šimpanz 3 pozitivní reakce

Šimpanz 4 pozitivní reakce

Primární # 1

Primární # 2

Primární # 3

Primární # 4 pozitivní

Směs Vvenv indukuje tvorbu kvalitnějších anti HIV-1 specifických protilátek, než jeden kmen Vvenv. Závěry ELISA techniky a neutralizační reakce jsou shrnuty v tabulce 4, která zobrazuje ty šimpanze jejichž séra vykazovala nejsilnější reakci ve výše popsaných sedmi testech. Jak je z tabulky vidět, šimpanzi 3 a 4 reagovali pozitivně v pěti testech ze sedmi, zatímco šimpanzi 1 a 2 reagovali pozitivně pouze ve třech případech ze sedmi. Z toho vyplývá, že polyenv vakcína indukuje tvorby kvalitnějších protilátek, než jeden kmen env vakcíny.

-36CZ 296575 B6

Tabulka 4

Shrnutí výsledků ELISA technik a neutralizačních testů

Technika	Šimpanz s nejsilnější reakcí po aplikaci jednoho typu VV	Šimpanz s nejsilněj reakcí po aplikaci směsi VV
Abbott (IIIB gp41) - ELISA # 1		šimpanz 3 a 4
MNgplóOBAC - ELISA # 2		šimpanz 3
IIIB-gpl20-BAC -ELISA #3	šimpanz 2
LAI-gpl20-CHO -ELISA #4		šimpanz 3
Illb virový lyzát - ELISA # 5	šimpanz 1 a 2	šimpanz 3 a 4
Neutralizační reakce - laboratorní izoláty	šimpanz 2	šimpanz 3 a 4
Neutralizační reakce		šimpanz 4

- primární izoláty

Diskuse

Experimenty popsané v těchto příkladech byly připraveny tak, aby testovaly bezpečnost HIV-1 vakcíny založené na viru vakcinie a srovnaly účinnost indukce imunitní odpovědi vyvolané jedním kmenem viru nebo směsí virů exprimujících obalové proteiny. Závěry ukazují, že virus vakcinie může být použit jako imunogen bez hrozby tvorby otevřených lézí a za druhé bylo prokázáno, že vakcínou obsahující směs obalových proteinů je možné indukovat velmi širokou anti HIV-1 specifickou imunitní reakci.

Šimpanzí model, umožňuje testování bezpečnosti polyenv vakcíny na primátech. Konkrétně jsme se zajímali o případnou tvorbu otevřených lézí, čímž by mohl inokulovaný živý W ohrozit neimunizovaného pacienta. V případě HIV, existuje vážná hrozba, že AIDS pozitivní pacienti by nemuseli být schopnosti zastavit infekci VV. Z tohoto důvodu jsme testovali použití subkutánní vakcinace na šimpanzích, s otázkou, zda je možné vyhnout se tvorbě otevřených lézí. Skutečně, v tomto případě pouze u dvou ze čtyř šimpanzů se otevřené léze objevily. Podobných výsledků jsme dosáhli při klinických testech za použití subkutánní injikace dávek viru vakcinie NYCDH, při očkování proti neštovicím (Connor et al., Journal of Infectious Diseases 135:167-175 (1977), Benenson et al., Journal of Infectious Diseases 153:135-144 (1977)).

Je pravděpodobné, že se zvýšenou opatrností při aplikační proceduře a následnou péčí o místo vpichu se bude možné tvorbě otevřených lézí zcela vyhnout. Tyto výsledky ukazují, že není třeba virus vakcinie vyloučit jako virový vektor v HIV-1 vakcínách, z důvodů bezpečnosti.

Směs obalových proteinů byla testována na myších (příklad 2) a králících. V experimentech na myším modelu byly protilátky testovány pop jedné injekci Vvenv, zatímco u králíků byla primární dávkou DNA vakcína a Vvenv byla použita jako sekundární dávka. Experimenty ukazují,

-37CZ 296575 B6 že VVenv může indukovat jako primární dávka i zesilovat jako sekundární dávka produkci anti

HIV-1 protilátek a primární izoláty mohou neutralizovány touto humorální odpovědí. Ke zjištění potenciálu směsi VVenv (polyenv), byli šimpanzi rozděleni do dvou skupin. První skupinu tvořili dva šimpanzi, kteří obdrželi imunizační dávku pouze jedním kmenem Vvenv, zatímco šimpanzi 3 a 4, byli imunizováni směsí celkem třiceti odlišných typů Vvenv.

Po ukončení imunizace viry vakcinie, všichni čtyři šimpanzi dostali ještě jednu sekundární dávku gpl20/gp41 valuum precipitátu. Séra ze všech čtyřech šimpanzů byla testována pěti odlišnými ELISA testy, z nichž každý používá jiný fragment a/nebo konfiguraci env. Je zajímavé, že šimpanzi 1 a 2 ve směsi odpovídají silně pouze v jednom z těchto ELISA testů, zatímco séra ze šimpanzů 3 a 4 ve směsi odpovídají ve 4 těchto testech. V každém z nich byla však měřena pouze frakce HIV-1 specifických protilátek v každém zvířeti, závěry čehož ukazují že směsná vakcína indukuje široké spektrum protilátek s vysokou vazebnou aktivitou.

Neutralizační technika byla také použita pro testování proti jak laboratorním, tak primárním izolátům. Je zajímavé, že pozitivní odpověď proti primárním izolátům byla zaznamenána u šimpanze 4, ačkoliv primární izoláty nebyly specificky přítomné v směsné vakcíně. Závěry těchto experimentů také poukazují, že směsná polyenv vakcína indukuje široké spektrum protilátek. Zvýšení komplexity antigenu ve vakcíně může vést ke zvýšení diverzity aktivovaných lymfocytů a tedy I protilátkové odpovědi.

Důkazy, že neutralizační protilátky mohou být vytvářeny proti primárnímu izolátu, který však nebyl přítomný ve vakcíně ukazují, že proteiny s odlišnou primární strukturou sdílejí podobné konformační motivy. Toto tvrzení, je také podpořeno důkazy, kdy imunitní odpověď HIV-1 pozitivních pacientů, náhodně vybraných z osob vystavených myriádám mutačně odlišných virů, chrání před superinfekcí podáním jiného kmenu. Použití polyenv reprezentuje první případ, kdy byla na šimpanzím systému modelována situace HIV-1 pozitivních pacientů. To znamená, že neutralizační protilátky jsou indukovány širokým spektrem proteinů, namísto jedním typem env proteinu.

Shrnuto, testovali jsme směsnou HIV-1 vakcínu založenou na VV zvanou polyenv na šimpanzím modelu. Byly demonstrovány tyto příklady:

1) VV může být použit jako vakcína, aniž by indukoval tvorbu otevřených kožních lézí.

2) Tato vakcína indukuje tvorbu širokého spektra anti HIV-1 specifických protilátek

3) Směs env konstruktů (polyenv) vykazuje indukci specifických protilátek vyšší kvality, než jeden env konstrukt.

Virus vakcinie je již dlouho známý jako potenciální vakcína, jak v divoké, tak v rekombinantní formě. Účinnost VV, je v jeho schopnosti indukovat jak cytotoxickou T-buněčnou tak B-buněčnou imunitní odpověď. VV je jediná vakcína, která byla schopna kompletně zlikvidovat chorobu (neštovice) v lidské populaci. Výsledky uváděné v tomto příkladě naznačují, že rekombinantní VV vektory by v budoucnu mohly posloužit ke kontrole HIV-1 infekce.

Příklad 4: Příprava bifunkčního plazmidu

DNA vakcína se ukázala být silným induktorem protilátkové i CTL reakce v řadě odlišných systémů (chřipka, HIV-1, atd.). DNA vakcíny proti chřipce a HIV-1 jsou v současné době v klinické fázi testování se zdravými dospělými dobrovolníky. Virus vakcinie, také slouží jako základ pro řadu dalších vakcinačních programů. Ve skutečnosti je VV jediná vakcína, která byla dosud schopna kompletně zlikvidovat chorobu (neštovice) v lidské populaci. Celá řada rekombinantních virů vakcinie indukuje ochrannou imunitní reakci, což dokazuje mnoho studií se zvířaty.

-38CZ 296575 B6

Výše uvedená data ukazují účinnost polyenv vakcíny a kombinací vakcinačních strategií, např.

DNA vakcíny a virové vakcíny.

Byl vytvořen bifunkční plazmid, který může sloužit jako DNA vakcína i jako VV rekombinantní vektor. Obr. 7, ukazuje mapu tohoto plazmidu, který obsahuje CMV promotor, pro expresi v savčích buňkách a časný a pozdní promotor viru vakcinie, pro přípravu rekombinantního vektoru vakcinie. Přímá injekce vyčištěné plazmidové DNA, může být použita k indukci imunitní odpovědi proti env proteinu viru HIV u testovaných subjektů. Plazmid také může být použit k přípravě a testování živého, rekombinantního viru vakcinie, který slouží jako nosič env proteinu viru HIV.

Pacienti mohou být vakcinováni podle komplikovaného protokolu, používajícího jak DNA vakcinaci tak imunizaci rekombinantním kmenem viru vakcinie, podávaných v libovolném počtu, pořadí, ve směsi či v jednotlivých injekcích a/nebo v kombinaci s dalšími nosiči vakcíny. Smysl navrhovaného vynálezu, není limitován konkrétními příklady tak, jak jsou zde uvedeny. Celá řada variant a možností, které zde nejsou uvedeny, vyplývá ze předchozích popisů a připojených vyobrazení a budou zcela zřejmá každému odborníkovi. Tyto modifikace jsou však zahrnuty ve smyslu připojených nároků. Dále je zřejmé, že všechny uvedené hodnoty týkající se počtu párů bází nukleotidové sekvence, nebo počtu aminokyselin, všechny molekulové váhy, udávané pro nukleové kyseliny a pro polypeptidy, jsou pouze přibližné a jsou zde uváděny jen pro popis.

Je zde citována řada publikací, které jsou zde uváděny v plné délce.

Seznam citací:

Ausubel et al., eds Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., New York, NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995)

Avery's Drug Treatment: Principles and Practise of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Third Edition, AIDS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987)

Belshe et al., J. Am. Med. Assoc. 272:431-431 (1994)

Berkov et al., eds. The Měrek Manual, Fifteenth Edition, Měrek and Co., Rakway, NJ (1987) Bimboim, H.C. and Doly., Nucleic Acid Res. 7:1513-1523 (1979)

Buck, C. and Paulino, M. S. eds., Američan Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae. 6¹¹¹ Ed., Američan Type Culture Collection, Rockville, MD (1990)

Bums and Desrosiers, Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188:185-219 (1994)

Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5:3403-3409 (1985)

Cooney et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:1882-1886 (1993)

Creighton T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, CA (1983)

DeVita, et al., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3^rd edition, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992)

D'Honcht, Vaccine 10 (Suppl.): 548-552 (1992)

Dorozynsky and Anderson, Science 252:501-502 (1991)

-39CZ 296575 B6

Ebadi. Pharmacology, Littlr Brown and Co., Boston, Ma (1985)

Eichberg, Int Conf. AIDS 7:88 (1991)

Embretson et al., Nátuře 362:359-362 (1993)

Enami et al., J. Virol. 65:2711-2713 (1991)

Fauci, Science 264: 1072-1073) (May 1994)

Goodman et al., eds. Goodman and Gilmanů The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eigtheen Edition, Pergamon Press, lne. Elamsford, NY (1990)

Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. (Suppl. 2): S141-143 (1994)

Gribskov a Burgess (Nucl. Acid Res. 14:6745 (1986)

Graham et al., J. Infect. Dis. 166:244-252 (1992), J. Infect. Dis. 167:533-537 (1993)

Grundwald-Bearch et al., J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 117:561-567 (1991)

Hallenberger et al., Virology 193:51-514 (1993)

Hay, R. et al., eds. Američan Type Culture Collection Catalogue of Cell Lineš and Hybridomas, 7^th Ed., Američan Type Culture Collection, Rockville, MD (1992), p. 48

Hirsch, M. S., and Curran, J. „Human imunodeficiency viruses, biology and medical aspects“, Virology, Fields and Knipe, eds., Raven Press, Ltd., New York, NY (1990), pp. 1545-1570

Hu et al., Nátuře 328:721-723 (1987)

Ish-Horowicz, D. and Burke, J. F., Nucleic Acids Res. 9:2987-2998 (1981)

Ito et al., J. Virol. 65:5491-5498 (1991)

Ito et al., Cancer. Res. 50:6915-6918 (1990)

Javaherian et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 86:6768-6772 (1989)

Katzung, ed. Basis and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992)

Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2):S 139—143 (1994)

Kieny et al., Int. Conf. AIDS 5:541 (1989)

Kilpatrick et al., J. Biol. Chem. 262:116-121 (1987)

Luytjes et al., Cell 59:1107-1113 (1989)

Mackett, M. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419 (1982)

Mazzara G. P. et al., Methods in Enz. 217:557-581 (1993)

-40CZ 296575 B6

McElrath et al., J. Infect. Dis. 169:41-47 (1994)

Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443 (1970)

Osol, A., ed. Remingtonů Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), pp. 1324-1341.

Panicali D. and Paoletti E. Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 79:4927—4931 (1982)

Pantaleo et al., Nátuře 362:355-358 (1993)

Rhim, J. S. et al., Int. J. Cancer 15:23-29 (1975)

Richman: AIDs Res. Hum. Retroviruses 7:1065-1071 (1992)

Richman: Annu Rev. Pharmacol. Toxico 33:149-146 (1993)

Richman: Antimicrob Agents Chemother 37:1207-1213 (1993)

Richman: AIDs Res. Hum. Retroviruses 10:901 (1994)

Richmond and McKinney, eds. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, 3^rd Edition, U.S. Dept. of Health & Human Services, Washington DC (1993)

Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)

Schultz G. E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978)

Schwarz a Dayhoff eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Reserch Foundation, Washington, DC (1979)

Selenka et al., Arch. Hyg. Bacteriol. 153:244—253 (1969)

Smith a Waterman Adv. Apl. Math. 2:482 (1981)

Starcích et al., Cell 45:637 (1986)

Towbin, H. et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 76:4350 (1979)

United States Biochemical, Sequenase Version 2,0 - DNA Sequencing Kit, Ninth Edition, Amersham Life Science, lne., (1994)

Weir et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 79:1210-1214 (1982)

Wellis et al., J. Immunol. 99:1134-1139 (1967)

Wong-Staal, „Human Imunodeficienci viruses and their replication“, Virology, Fields and Knipe, eds., Raven Press, Ltd., New York, NY (1990), pp 1529-1543

Wrin et al., J. Acquir. Immune Defíc. Syndr. 7:211-219 (1994)

Wu et al., Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978)

Zagury et al., Nátuře 332:728-731 (1988)

-41 CZ 296575 B6

SEZNAM SEKVENCÍ (1) Celkové informace:

(i) Aplikant: St. Jude Children's Research Hospital

332 North Lauderdale

PO Box 318 Memphis.TN 38101-0318 United States of America

Aplikanti/vynálezci: Hurwitz, Julia L.

Coleclough Christopher

Owens Randall J.

Slobod Karen (ii) Název vynálezu: Způsob přípravy a použití virových vektorů, pro směsnou polyenv vakcínu proti viru HIV (iii) Počet sekvencí: 7 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) Adresa: Klauber & Jackson (B) Ulice: 411 Hackensack Avenue (C) Město: Hackensack (D) Stát: NJ (E) Země: USA (F) zip: 07601 (v) Počítačové médium:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Ralease # 1.0, Verze # 1.30 (ví) Aplikační data:

(A) Číslo aplikace: bude připojeno (B) Datum podání: v příloze (C) Klasifikace:

(vii) Zástupce/Agent:

(A) Jméno: Paul F. Fehlner (B) Registrační číslo: 35,135 (C) Reference/číslo složky: 13401011/PCT (viii) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 201-487-5800 (B) Telefax: 201-343-1684 (2) Informace o sekvenci Č. 1:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 27 párů bází

-42CZ 296575 B6 (B) Typ. nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.l:

AGCAGAAGAC AGTGGCAATG AGAGTA (3) Informace o sekvenci C. 2:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 30 párů bází (B) Typ. nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.2:

CCACTCCATC CAGGTCATGT TATTCCAAAT (4) Informace o sekvenci C. 3:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 32 párů bází (B) Typ. nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.3:

GTGGGTCACA GTCTATTATG GGGTACCTGT GT (5) Informace o sekvenci Č. 4:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 34 párů bází (B) Typ. nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.4:

CCAGAGATTT ΑΊΊ ACTCCAA CTAGCATTCC AAGG

-43 CZ 296575 B6 (6) Informace o sekvenci Č. 5:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 28 párů bází (B) Typ. nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.5:

CATGTGTAA AATTAACCCC ACTCTGTG (7) Informace o sekvenci Č. 6:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 26 párů bází (B) Typ. nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.6:

TACAATJTCT GGGTCCCCTC CTGAGG (8) Informace o sekvenci Č. 7:

(i) Charakteristika sekvence:

(A) Délka: 880 aminokyselin (B) Typ. aminokyselina (C) Počet řetězců: oba (D) Topologie: oba (ii) Typ molekuly: protein (iii) Popis sekvence: SEQ ID No.7:

-44CZ 296575 B6

Lys 1

Glu

Gin

Lys

Thr 5

Val

Ala

Met

Arg

Val 10

Lys

Glu

Ser

Gin

Met 15

Lys

Lys

Gin

His

Leu 20

Trp

Arg

Trp

Gly

Trp 25

Arg

Trp

Gly

Thr

Met 30

Leu

Leu

Gly

Leu

Met 35

Ile

Cys

Ser

Ala

Thr 40

Glu

Lys

Leu

Trp

Val 45

Thr

Val

Tyr

Tyr

Gly 50

Val

Pro

Val

Trp

Lys 55

Glu

Ala

Thr

Thr

Thr 60

Leu

Phe

Cys

Ala

Ser 65

Asp

Ala

Lys

Ala

Tyr 70

Asp

Thr

Glu

Val

His 75

Asn

Val

Trp

Ala

Thr 80

His

Ala

Cys

Val

Pro 85

Thr

Asp

Pro

Asn

Pro 90

Gin

Glu

Val

Val

Leu 95

Val

Asn

Val

Thr

Glu 100

Asn

Phe

Asn

Met

Trp 105

Lys

Asn

Asp

Met

Val 110

Glu

Gin

Met

His

Glu 115

Asp

Ile

Ile

Ser

Leu 120

Trp

Asp

Gin

Ser

Leu 125

Lys

Pro

Cys

Val

Lys 130

Leu

Thr

Pro

Leu

Cys 135

Val

Ser

Leu

bys

Cys 140

Thr

Asp

Leu

Lys

Asn 145

Asp

Thr

Asn

Thr

Ser 150

Asn

Asn

Val

Thr

Ser 155

Ser

Ser

Trp

Gly

Arg 160

Asn

lle

Met

Glu

Glu 165

Gly

Glu

Ile

Lys

Asn 170

Cys

Ser

Phe

Asn

Ile 175

Ser

Thr

Ser

Ile

Arg 180

Gly

Lys

Val

Gin

Lys 1B5

Glu

Tyr

Ala

Phe

Phe 190

Tyr

Lys

Leu

Asp

Ile 195

Ile

Pro

Ile

Asp

Lys 200

Gly

Asn

Asp

Ser

Asn 205

Asp

Thr

Thr

Ser

Tyr 210

Lys

Phe

Thr

Leu

Thr 215

Ser

Cys

Asn

Thr

Ser 220

Val

Ile

Thr

Gin

Ala 225

Cys

Pro

Lys

Val

Ser 230

Phe

Glu

Pro

Ile

Pro 235

lle

His

Tyr

Cys

Ala 240

Pro

Ala

Gly

Phe

Ala 245

Ile

Leu

Lys

Cys

Asn 250

Asn

Lys

Thr

Phe

Asn 2 55

Gly

Thr

Gly

Pro

Cys 2 60

Thr

Asn

Val

Ser

Thr 265

Val

Gin

Cys

Thr

His 270

Gly

Ile

Arg

Pro

Val

Val

Ser

Thr

Gin

i Leu

i Leu

i Leu Asn Gly Ser

Leu

: Ala

Glu

275 280 285

-45CZ 296575 B6

Glu

Glu 230

Val

Val

Ile

Arg

Ser 295

Ala

Asn

Phe

Thr

Asp 300

Asn

Ala

Lys

Thr

Ile 305

I le

Val

Gin

Leu

Asn 310

Gin

Ser

Val

Glu

Ile 315

Asn

Cys

Thr

Arg

Pro 320

Α3Π

Asn

Asn

Thr

Arg 325

Lys

Ser

Ile

Arg

Ile 330

Gin

Arg

Gly

Phe

Gly 335

Arg

Ala

Phe

Val

Thr 34 0

Xle

Gly

Lys

Ile

Leu 345

Gly

Asn

Met

Arg

Gin 350

Ala

His

Cys

As n

11 e 355

Ser

Arg

Ala

Lys

Trp 36 0

Asn

Asn

Thr

Leu

Lvs 365

Gin

Ile

Asp

Ser

Lvs .3 7 0

Leu

Arg

Glu

Gin

Phe 375

Gly

Asn

Asn

Lys

Thr 380

Ile

Ile

Phe

Lys

Gin 385

Ser

Ser

Gly

Gly

Asp 390

Pro

Glu

Ile

Val

Thr 3 95

His

Ser

Phe

Asn

Cys 400

Gly

Gly

Glu

Phe

Phe 405

Tyr

Cys

Asn

Ser

Thr 410

Gin

Leu

Phe

Asn

Ser 415

Thr

Trp

Phe

Asn

Ser 420

Thr

Trp

Ser

Thr

Lys 425

Gly

Ser

Asn

Asn

Thr 430

Glu

Gly

Ser

Asp

Thr 435

lle

Thr

Leu

Pro

Cys 440

Arg

Ile

Lys

Gin

Ile 44 5

Ile

Asn

Met

Trp

Gin 450

Glu

Val

Gly

Lys

Ala 455

Met

Tyr

Al a

Pro

Pro 460

lle

Ser

Gly

Gin

Ile 465

Arg

Cys

Ser

Ser

Asn 470

lle

Thr

Gly

Leu

Leu 475

Leu

Thr

Arg

Asp

Gly 480

Gly

Ala

Asn

Glu

Asn 485

Asn

Glu

Ser

Glu

Ile 490

Phe

Arg

Pro

Gly

Gly 495

Gly

Asp

Me t

Arg

Asd 500

Asn

Trp

Arg

Ser

Glu 505

Leu

Tyr

Lys

Tyr

bys 510

Val

Val

Lys

I le

Glu 515

Pro

Leu

Gly

Val

Ala 520

Pro

Thr

Lys

Ala

Lys 525

Arg

Arg

Val

Val

Gin 530

Arg

Glu

Lys

Arg

Ala 535

Val

Gly

Glu

Ile

Gly 540

Ala

Leu

Phe

Leu

Gly 54 5

Phe

Leu

Gly

Ala

Ala 550

Gly

Ser

Thr

Met

Gly 555

Ala

Al a

Ser

Met

Thr 560

Leu

Thr

Val

Gin

Ala 565

Arg

Gin

Leu

Leu

Ser 570

Gly

lle

Val

Gin

Gin 575

Gin

Asn

Asn

Leu

Leu 580

Arg

Ala

Ile

Glu

Ala 585

Gin

Gin

His

Leu

Leu 590

Gin

Leu

Thr

Val

Trp 595

G1 y

Ile

Lys

Gin

Leu 600

Gin

Ala

Arg

Ile

Leu 605

Ala

Val

Glu

Arg

Tyr 610

Leu

Lys

Asp

Gin

Gin 615

Leu

Leu

Gly

Ile

Trp 6 20

Gly

Cys

Ser

Gly

Lys 625

Leu

Ile

cys

Thr

Thr 630

Ala

val

Pro

i Trp

i Asn 635

. Ala

Ser

Trp

i Ser

Asn 640

Lys

Ser

Leu

Glu

Gin 645

Ile

Trp

Asn

Asn

Met 650

Thr

Trp

Met

Glu

Trp 655

Asp

Arg

Glu

Ile

Asn 660

Asn

Tyr

Thr

Ser

Leu 665

Ile

His

Ser

Leu

Ile 670

Glu

Glu

Ser

Gin

Asn 675

Gin

Gin

Glu

Lys

Asn 680

Glu

Gin

Glu

Leu

Leu 685

Glu

Leu

Asp

Lys

Trp 690

Ala

Ser

Leu

Trp

Asn 695

Trp

Phe

Asn

Ile

Thr 700

Asn

Trp

Leu

Trp

Tyr 705

Ile

Lys

Leu

Pne

Ile 710

Mel.

11 e

Val

Gly

Gly 715

Leu

Val

G1 y

Leu

Arg 7 20

Ile

Val

Phe

Ala

Val 72 5

Leu

Ser

Val

Val

Asn 7 30

Arg

Val

Arg

Gin

Gly 735

Tyr

Ser

Pro

Leu

Ser 740

Phe

Gin

Thr

His

Leu 745

Pro

Ile

Pro

Arg

Gly 750

Pro

Asp

Arg

Pro

G1 u 755

G1 y

Ile

Glu

Glu

Glu. 760

Gly

Gly

Glu

Arg

Asp 765

Arg

Asp

Arg

Ser

Ile 770

Arg

Leu

Val

Asn

Gly 77 5

Ser

Leu

Ala

Leu

Ile 780

Trp

Asp

Asp

Leu

Arg 785

Ser-

Leu

Cys

Leu

Phe 790

Ser

Tyr

His

Arg

Lexj 795

Arg

Asp

Leu

Leu

Leu 800

Ile

val

Thr

Arg

Ile 805

Val

Glu

Leu

Leu

Gly 810

Arg

Arg

Gly

Trp

G1 u 815

Ala

IiKU

bys

Tyr

Trp 820

Trp

Asn

Leu

Leu

Gin 825

Tyr

Trp

Ser

Gin

Glu 830

Leu

Lys

Asn

Ser

Ala 83 5

Val

Ser

Leu

Leu

Asn 840

Ala

Thr

Ala

Iie

Ala 845

Val

Ala

Glu

Gly

Thr 850

Asp

Arg

Val

Ile

Glu 855

Val

Val

Gin

Gly

Al a 860

Tyr

Arg

Ala

Ile

Arg 86 5

His

Ile

Pro

Arg

Arg 870

Ile

Arg

Gin

Gly

Leu 875

Glu

Arg

Ile

Leu

Leu 8 80

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (17)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polyenv vakcína, která je vybraná ze skupiny složené z:

   a) polyenv vakcíny zahrnující alespoň 4 až 10 000 odlišných rekombinantních virů, z nichž každý obsahuje nukleovou kyselinu obalové (env) varianty (EV) kódující odlišnou variantu obalového proteinu lidského viru imunodeficience (HIV) nebo

   b) polyenv vakcíny zahrnující alespoň 4 až 10 000 odlišných DNA vektorů, z nichž každý obsahuje nukleovou kyselinu obalové (env) varianty (EV) kódující odlišnou variantu obalového proteinu lidského viru imunodeficience (HIV);

   kde je polyenv vakcína schopna vyvolat imunitní odpověď na více než jednu, ale nutně ne na všechny obalové (env) varianty (EV) obsažené v polyenv vakcíně, kde nukleová kyselina obalové (env) varianty (EV) kóduje jak variabilní tak konstantní oblasti varianty obalového proteinu, a

   -47 CZ 296575 B6 kde polyenv vakcína je schopna vyvolat alespoň jednu z buněčné a humorální imunitní odpovědi u savce proti kmenům viru HIV.
2. 2. Polyenv vakcína podle nároku 1, která obsahuje od 10 do 100 rekombinantních virů obsahujících odlišné obalové (env) varianty viru lidské imunodefícience (HIV).
3. 3. Polyenv vakcína podle nároku 1, která obsahuje rekombinantní viry, které jsou vybrány ze skupiny složené z viru kanářích neštovic, adenoviru nebo adeno-asociovaného viru (AAV).
4. 4. Polyenv vakcína podle nároku 1, která obsahuje rekombinantní viry, kde varianta obalového proteinu obsahuje gpl20 a část gp41 umožňující oligomerizaci (env) proteinů.
5. 5. Polyenv vakcína podle nároku 4, která obsahuje rekombinantní viry, kde nukleová kyselina obalové (env) varianty (EV) obsahuje Knpl - Bsml restrikční fragment nukleové kyseliny kódující obalový protein lidského viru imunodefícience (HIV).
6. 6. Polyenv vakcína podle nároku 1, která obsahuje rekombinantní viry, kde nukleová kyselina obalové (env) varianty (EV) je izolovaná z pacientů infikovaných virem HIV z geograficky omezených oblastí nebo z pacientů infikovaných virem HIV z odlišných prostředí.
7. 7. Polyenv vakcína podle nároku 1, která obsahuje rekombinantní viry, přičemž dále obsahuje varianty obalového proteinu exprimované rekombinantním virem.
8. 8. Polyenv vakcína podle nároku 1, která obsahuje rekombinantní viry, přičemž dále obsahuje alespoň jeden farmaceuticky přijatelný nosič, adjuvans a antivirovou chemoterapeutickou sloučeninu.
9. 9. Polyenv vakcína podle nároku 1, která obsahuje rekombinantní viry, kde každá znukleových kyselin obalové (env) varianty (EV) kóduje odlišnou variantu obalového proteinu izolátu viru HIV.
10. 10. Polyenv vakcína podle nároku 1, která obsahuje rekombinantní viry pro zvýšení sekundární imunitní odpovědi na lidský vir imunodefícience (HIV) v savci, který již obdržel první polyenv vakcínu obsahující alespoň 4 odlišné rekombinantní viry, obsahující nukleovou kyselinu obalové (env) varianty (EV) k vyvolání primární imunitní odpovědi u savce, kde

    a) rekombinantní viry polyenv vakcíny jsou odlišného druhu od rekombinantních virů přítomných v první polyenv vakcíně, obsahující alespoň 4 odlišné rekombinantní viry, obsahující nukleovou kyselinu obalové (env) varianty (EV) k vyvolání primární imunitní odpovědi u savce, a

    b) množství polyenv vakcíny je účinné pro zvýšení alespoň jedné z buněčné a humorální imunitní odpovědi u savce proti kmenu HIV infikujícímu savce.
11. 11. Polyenv vakcína podle nároku 10, která obsahuje od 10 do 100 rekombinantních virů obsahujících odlišné obalové (env) varianty viru HIV.
12. 12. Polyenv vakcína podle nároku 11, kde rekombinantní viry jsou vybrány ze skupiny složené z viru kanářích neštovic, adenoviru nebo adeno-asociovaného viru (AAV).
13. 13. Polyenv vakcína podle nároku 11, která dále obsahuje adjuvans.
14. 14. Polyenv vakcína podle nároku 10, která je ve formě pro intramuskulámí podávání.
15. 15. Polyenv vakcína podle nároku 1, která obsahuje od 4 do 10 000 odlišných DNA vektorů.

    -48CZ 296575 B6
16. 16. Polyenv vakcína podle nároku 1, která obsahuje DNA vektory obsahující nukleovou kyselinu obalové (env) varianty (EV), kde každá z nukleových kyselin obalové (env) varianty (EV) kóduje odlišnou variantu obalového proteinu izolátu viru HIV.
17. 17. Polyenv vakcína podle nároku 1, která obsahuje alespoň 4 do 10 000 odlišných DNA vektorů pro zvýšení sekundární imunitní odpovědi na lidský vir imunodeficience (HIV) u savce, který již obdržel polyenv vakcínu podle nároku 1 k vyvolání imunitní odpovědi u savce, přičemž množství polyenv vakcíny je účinné pro zvýšení alespoň jedné z buněčné a humorální 10 imunitní odpovědi u savce proti kmenům HIV infikujícím savce.