KR19990081931A - Hiv 에 대한 폴리엔브 백신으로서 재조합 백시니아 벡터의혼합물 - Google Patents
Hiv 에 대한 폴리엔브 백신으로서 재조합 백시니아 벡터의혼합물 Download PDFInfo
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- C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
본 발명에서는 각각 상이한 HIV env 변이체 또는 가변성 및 불변성 부위 둘다를 함유하는 그의 일부분을 발현시키는 적어도 4 개 내지 약 10,000 개의 상이한 재조합 바이러스의 혼합물을 포함하는 폴리엔브 백신, 및 HIV 감염의 예방 또는 치료를 위해 생, 약독화 또는 불활성화된 형태로 폴리엔브 백신을 사용하는 것을 포함하여 이러한 폴리엔브 백신 및 바이러스를 제조하고 사용하는 방법이 제공된다. 본 발명의 바이러스성 백신은 재조합 HIV env 추가자극제(booster) 또는 재조합 HIV env 유전자 DNA 초회자극 또는 추가자극 백신과 최적으로 배합된다.
Description
AIDS 바이러스는 2000 년까지는 수천만의 생명을 빼앗아갈 것으로 보이며, 따라서 세계적으로 건강에 관한 최대 관심사가 되고 있다[참조: DeVita, et al., AIDS, Etiology, Diagnosis, Treatment and Prevention, 3rd edition, J.B. Lippincott Co., Philadelphia, PA (1992); Wong-Staal, in Virology, pp 1529-1543; and Hirsch, et al., in Virology, pp 1545-1570]. HIV 의 복제에 관련된 역전사효소는 높은 오류율(error rate)을 가지고 있기 때문에 효과적인 HIV 백신을 고안하는 것은 면역학자들에게는 특별한 도전으로 제안되고 있다. 그 결과, 변이체 단백질 서열을 갖는 외피(outer coat) 또는 피막 단백질을 갖는 수많은 돌연변이 HIV 균주가 생성된다. 이들 변이체 피막 단백질은 때때로, 이종 항원을 중화시키기 위한 유일한 목적으로 하루에 109개 이상의 새로운 림프구를 생성하는 포유동물의 면역계에 의해 상이한 항원으로서 인식된다. B 및 T-세포는 각각 면역반응의 체액성 및 세포성 성분을 구성한다.
이러한 면역반응의 정성적 강도에 대한 좋은 예는 HIV-감염 환자 및 SIV-감염 짧은꼬리원숭이(macaque)에서 볼 수 있다. 각각의 경우에, 감염, 면역성 및 변이체 HIVs 및 SIVs 의 형성으로 된 연속적인 순환이 나타난다[Wrin, et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7: 211-219 (1994); Burns and Desrosiers, Cur. Topics Microbiol. Immunol. 188: 185-219 (1994)]. 각각의 사이클에 따라 HIV 항원결정인자(및 상응하는 면역반응)의 다양성이 증가하여, 이들 면역반응은 광범한 SIV 및 HIV 변이체를 중화시키고 중복감염(superinfection)이 대부분 억제된다.
그러나, AIDS 환자는 HIV 바이러스 감염에 의해 환자의 면역계가 정복되는 것을 예방하기에는 불충분한 손상된 면역반응을 나타낸다. 이것은 부분적으로는, 환자의 면역계에 의해 인지되지 않는 피막 변이체 단백질을 가지고 있어서 파괴되지 않는 HIV 변이체의 형성에 기인하는 것일 것이다(Sci. Amer. Aug. 1995, pp). 이러한 경우에, 면역반응이 새로운 감염(de no infection)(예를들면, 특별히 허가된 격리된 부위에서 바이러스의 지속적인 돌연변이)을 예방할 수 있다고 하더라도, HIV 감염은 결국 환자의 면역반응을 정복하게 될 것이다[Pantaleo et al., Nature 362: 355-358 (1993); Embretson, et al., Nature 362: 359-362 (1993)].
HIV 단백질중에서 B- 및 T-세포 항원결정인자의 확인은 완전하게 이루어지지 않았다. HIV 피막 단백질은 가변성(V1-V5) 및 불변성(C1-C5) 부위를 갖는 것으로 특정화되어 있다. 피막 단백질의 다른 부위들도 면역반응을 일으키는데 관여할 수는 있지만, V3 부위를 대표하는 펩타이드를 주중화결정인자(principal neut- ralizing determinant; PND)[Javaherian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86: 6768-6772 (1989)]라고 부른다. HIV 로부터 얻은 완전한 길이의 피막 단백질은 약 850 내지 900 개의 아미노산을 함유하며, 과돌연변이(hypermutation)로 인해 길이에 변화가 있을 수 있다[Starcich et al., Cell 45: 637 (1986)].
임상시험에서 평가된 HIV 에 대한 첫 번째 백신은 면역계에 대하여 단일의 피막 단백질 또는 그의 부분들을 나타내도록 고안되었다. 그러나, 하나 또는 몇 개의 피막 단백질에 대한 중화반응은 HIV 의 다양한 분리체(isolates)들을 인지하지 못하며, 개체들은 감염으로부터 보호되지 않는다[Belshe et al., J. Am. Med. Assoc. 272: 431-431 (1994): 미합중국특허 제 5,169,763 호; PCT 공보 WO 87/06262; Zagury et al., Nature 332: 728-731 (1988); Kieny et al., Int. Conf. AIDS 5: 541 (1989); Eichberg, Int. Conf. AIDS 7: 88 (1991); Cooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1882-1886 (1993); Graham et al., J. Infect. Dis. 166: 244-252 (1992); J. Infect. Dis. 167: 533-537 (1993); Keefer et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2): S139-143 (1994); Gorse, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10 (Suppl. 2): 141-143 (1994); McElrath et al., J. Infect. Dis. 169: 41-47 (1994); Fauci, Science 264: 1072-1073 (May 1994)].
따라서, HIV 감염을 치료하거나 예방하기에 충분한 면역반응을 유도하는 백신 및 방법을 개발하는 것이 오랫동안 절박한 요구가 되고 있다.
[발명의 요약]
본 발명은 관련 기술분야에서의 하나 또는 그 이상의 단점들은 극복하고자 하는 것이다. 특히, 본 발명의 폴리엔브 백신은 유리하게는 더욱 강력한 면역반응을 제공한다. 본 발명의 강도는 B 세포, 헬퍼 T 세포, 및 효과적인 체액성 및 세포성 면역에 대한 면역반응의 세포독성 T 세포 분획을 보충하는 그의 능력에서 찾을 수 있다. 예를들어, 본 발명은 광범한 HIV-특이 항체 활성을 유도한다. HIV 중화시험은 유도된 항체가 탁월한 품질을 가지고 있음을 입증하였다. 놀랍게도, 본 발명은 "천연(naive)" HIV 균주, 즉 피막 단백질이 폴리엔브 칵테일(cocktail)내에 포함되지 않는 HIV 균주에 대한 면역반응을 야기시킬 수 있다.
더욱 효과적인 HIV 백신을 제공하기 위해서, 본 발명에서는 각각 피막 단백질의 불변성 및 가변성 부위 둘다를 포함하는 상이한 HIV 피막 단백질 변이체 (envelope protein variant; EPV)(또는 그의 상당부분)을 발현시키는 적어도 4 개 내지 약 10,000 개, 바람직하게는 4 개 내지 약 1,000 개, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 100 개의 상이한 재조합 바이러스의 혼합물을 포함하는 폴리엔브 백신을 제공한다. 바람직하게는, 발현된 피막 단백질 변이체 각각은 감염 세포 또는 HIV 지질 이중층(lipid bilayer)내에 존재하는 천연 HIV 피막 단백질과 유사한, 예를들어 올리고머 형태의 구조 및/또는 면역원성을 갖는다. 또한, 본 발명에 따라 이러한 재조합 바이러스 및 폴리엔브 백신을 제조하고 사용하는 방법이 제공된다. 이들을 백신으로서 사용하는 경우에, 각각의 변이체 피막 단백질은 바람직하게는 각각 상이한 피막 단백질에 대해서 반응하고, 따라서 다수의 HIV 변이체에 대해 반응하는 B 및/또는 T 세포의 상이한 서브셋트(subset)를 유도한다. 이러한 다수의 형태 및/또는 구조의 피막 단백질의 혼합물은 광범한 중화활성을 가지고 강력하며 지속적인 HIV-특이적 면역반응을 야기시키는 본 발명에 의해 개발된 방법이다.
바람직한 구체예에서, 재조합 바이러스는 백시니아, 카나리폭스(canary pox) 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus; AAV)로 구성된 그룹중에서 선택된다. 구체적인 예로서 후술하는 바와 같이, 백시니아 바이러스를 폴리엔브 백신을 제조하기 위해 사용한다. 바람직한 구체예에서는, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스 백신을 피하투여한다. 본 발명의 추가의 잇점은 백시니아 바이러스의 피하투여가 병소(lesion)를 형성하지 않기 때문에, 면역타협된 집단에 대한 잠재적 위협이 되는 감염성 백시니아가 유리되는 것을 피할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 재조합 바이러스 폴리엔브 백신은 감염성 바이러스 이외에 발현된 피막 단백질 변이체를 함유하는 바이러스-감염된 성장세포, 예를들면 베로 세포(vero cell)의 용해물(lysate)을 포함한다. 일반적으로 바이러스는 성장세포 용해물로부터 분리 정제되기 때문에, 면역반응을 유도하는 용해물 피막 단백질 변이체의 봉입은 본 발명의 독특한 차별점이 된다.
본 발명의 백신에 있어서, EV 뉴클레오타이드는 지리적으로 제한적 지역에서 HIV 바이러스에 의해 감염된 환자, 상이한 클래드(clades)로 부터의 HIV 바이러스에 의해 감염된 환자, 또는 HIV 의 실험실 분리체로부터 분리될 수 있다.
본 발명자들은 본 발명의 폴리엔브 백신이 각각 불변성 및/또는 가변성 부위 둘다를 함유하며, 바람직하게는 천연 HIV 피막 단백질의 구조와 거의 유사한 구조를 갖는 다수의 피막 단백질 변이체의 발현 및/또는 출현에 의해 예기치 않게 증가된 면역반응을 야기시킨다는 것을 밝혀내었다. 증가된 면역반응은 폴리엔브 백신에 제공된 피막 단백질을 발현시키는 균주이외에 HIV 균주를 인지한다. 따라서, 이러한 백신의 목적은 광범한 HIV 균주에 대하여, 상이한 바이러스 균주에 의한 감염(또는 돌연변이에 기인한 지속적인 감염)을 치료 또는 예방하기에 적합한 증가된 면역반응을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 피막 단백질 변이체(envelope protein variants; EPV)의 적어도 하나의 항원결정인자를 코드화하는(또는 항원결정인자에 대한 상보적인) env 변이체(EV) 핵산을 제공한다. EPV 는 바람직하게는 본 발명의 폴리엔브 백신에서 또한 제공되는 것과 같은 재조합 바이러스에 의해 코드화된다. 변이체 핵산은 코드화된 EPV 에 대해 상이한 항원특성 또는 3 차원 구조를 부여하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리엔브 백신 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 함유하는 백신 조성물을 제공한다. 백신 조성물은 또한, 백신 조성물이 투여되는 포유동물에서 적어도 하나의 HIV 균주에 대한 폴리엔브 백신 면역반응을 증진시키는 아쥬번트(adjuvant) 및/또는 사이토킨을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 폴리엔브 백신은 체액성 면역반응(예를들면 항체) 및 세포성 면역반응(예를들면 B 세포, 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포(CTLs))중의 적어도 하나를 포함하는 면역반응을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한, 적어도 하나의 HIV 군주의 감염에 의해 야기되는 임상적인 HIV-관련 병변으로부터 포유동물을 보호하는 본 발명의 폴리엔브 백신을 포함하는 백신 조성물을 포유동물에게 투여함으로써, HIV 감염에 대한 예방을 목적으로 하여 포유동물에서 HIV 감염에 대한 면역반응을 야기시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 HIV 감염을 치료하기 위하여 포유동물에서 HIV 감염에 대한 면역반응을 야기시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 포유동물에서 적어도 하나의 HIV 군주의 감염에 의해 야기되는 임상적인 바이러스 병변에 대해 대조군에 비하여 증가된 면역반응을 야기시키는, 본 발명의 불활성화되거나 약독화된 폴리엔브 백신을 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함한다.
추가의 구체예에서, HIV 에 대한 면역반응을 야기시키는 예방 또는 치료방법은 적어도 4 개 내지 약 10,000 개의 상이한 재조합 바이러스를 포함하는 또 다른 (예를들어 제 2 의) 폴리엔브 백신의 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 상기의 재조합 바이러스는 전술한 백신의 재조합 바이러스와는 상이한 종의 것이며, 폴리엔브내의 각각의 재조합 바이러스는 HIV 피막 단백질의 상이한 피막 단백질 변이체를 코드화하는 env 변이체 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 폴리엔브 재조합 바이러스 백신에 의해 유발된 HIV-특이적 면역반응은 또한, 적어도 하나의 재조합 HIV env 단백질 또는 DNA 백신 또는 이들 둘다의 유효량을 투여하여 체액성 또는 세포성 면역반응 또는 둘다를 초회자극(priming)시키거나 추가자극(boosting)시킴으로써 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 재조합 단백질 또는 DNA 백신도 또한 폴리엔브 백신이다. 여기에서 제공된 백신 이용방법은 어떤 순서로나 제공될 수 있다. 예를들어, 개체를 재조합 바이러스 폴리엔브 백신으로 초회자극시키고, 이어서 DNA 백신으로 추가자극시킨 다음, 재조합 단백질 백신으로 최종적으로 추가자극시킬 수 있다. 바람직하게는, 재조합 HIV env 단백질은 아쥬번트와의 혼합물 형태이다. 이하에 예시하는 바와 같은 구체적인 특정한 예에서, 재조합 HIV env 단백질은 근육내로 투여된다. 바람직하게는 DNA 백신은 유전자 총(gene gun)을 사용하여 투여한다.
본 발명의 전술한 방법들은 새로운 플라스미드 벡터들을 유전적으로 조작하는 동기를 제공한다. 즉, 추론적인 관점에서 본 발명은 동물 발현조절서열 및 바이러스 발현조절서열 둘다의 조절하에 이종 삽입부위를 포함하며, DNA 백신 및 재조합 바이러스 벡터로서 작용할 수 있는 이작용성 플라스미드를 제공한다. 바람직하게는 동물 발현조절서열은 사이토메갈로바이러스 즉시형 조기(cytomegalovirus immediate early; CMV) 프로모터이고, 바이러스 발현조절서열은 백시니아 바이러스 조기(early) 프로모터, 백시니아 바이러스 후기(late) 프로모터, 또는 이들 둘다이다.
본 발명의 그밖의 목적, 특징, 잇점, 유용성 및 구체예는 본 발명에 대한 이하의 상세한 설명과 실시예로 부터 본 분야의 전문가에게 명백할 것이다.
본 연구는 NCI 허가 R01-CA57419-03 및 캔서 센타 서포트 코어 그랜트(Cancer Center Support Core Grant) P30-CA21765, NIH-NIAID 허가 AI-32529 및 P01-AI31596-04 에 의해 부분적으로 지원되고 있다. 따라서, 미합중국 정부는 본 발명에 대해 어느 정도의 권리를 갖는다.
본 발명은 각각 HIV 피막(envelope) 단백질의 상이한 변이체를 발현시키는 적어도 4-40 개 내지 10,000 개 이하의 재조합 백시니아 바이러스의 혼합물을 포함하는, 인간 면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus; HIV)에 대한 폴리엔브(polyenv) 백신에 관한 것이다. 이 백신은 HIV 감염에 대하여 예상외로 증가된 세포성 및/또는 체액성 면역반응을 제공하기 위해 인간을 포함한 포유동물을 예방접종하는데 적합하다. 또한, 본 발명은 이러한 재조합 백시니아 바이러스와 폴리엔브 백신을 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
도 1 은 백시니아 바이러스 게놈내에서 HIV-1 유전자의 배향을 도식적으로 나타낸 것이다. HIV-1 피막 유전자는 티미딘 키나제 부위의 오른쪽 및 왼쪽 절편(segment)의 사이에 위치한다. HindIII 부위는 HIV-1 피막 유전자의 C-말단에 존재한다. 적절한 삽입에 의해 약 7kb 크기의 HindIII 단편(fragment)이 생성된다. 이러한 패턴에 대한 사우던 블럿(Southern blot)에 의해 HIV-1 피막 유전자의 위치 및 정확한 배향이 확인되었다.
도 2 는 장기간 동안 포유동물 모델에서 HIV-특이 항체반응을 나타내는 데이터를 그래프로 나타낸 것이다. 대표적인 마우스 혈청을 HIV-특이 항체에 대한 ELISA 로 시험한 결과를 나타낸 것이다. 각각의 샘플은 HIV-1-피복된 ELISA 플레이트상에서 시험하기 전에 1:100(까만 막대), 1:1,000(빗금친 막대) 및 1:10,000(흰 막대)의 비로 희석하였다. HIV-1 의 하나의 피막 단백질을 발현하는 백시니아 바이러스 구조물 107pfu를 주사한 후 다양한 시간(1 개월, 4 개월 및 6 개월)에 시험 마우스를 샘플로 취하였다. 대조용 마우스는 피막 서열을 함유하지 않는 백시니아 바이러스로 면역시켰다. 표준오차 막대들도 나타내었다.
도 3 은 백시니아 바이러스 용량이 HIV-특이 항체생성을 포함한 적어도 하나의 면역반응의 유도에 어떻게 영향을 미치는 지를 나타내는 데이터를 그래프로 표시한 것이다. 대표적인 마우스 혈청 샘플을 HIV-1-피복된 플레이트상에서 ELISA 에 의해 시험하였다. HIV-1-피막 단백질을 발현하는 하나의 백시니아 바이러스 105, 106및 107pfu를 주사한 마우스로부터 혈청 샘플을 취하였다. 혈청 샘플은 주사한지 약 3 주후에 시험하였다. 각각의 샘플은 HIV-1-피복된 ELISA 플레이트상에서 시험하기 전에 1:100(까만 막대), 1:1,000(빗금친 막대) 및 1:10,000(흰 막대)의 비로 희석하였다. 표준오차 막대들도 나타내었다.
도 4 는 백시니아 바이러스 구조물들의 혼합이 주사한 포유동물에서 HIV-특이 항체의 유도에 영향을 미치지 않음을 나타내는 데이터를 그래프로 표시한 것이다. 대표적인 마우스 혈청 샘플을 HIV-1 피막 단백질(들)을 발현하는 백시니아 바이러스 107pfu를 주사한지 약 2 개월 후에 ELISA 에 의해 시험하였다. "단일(single)"은 하나의 백시니아 바이러스를 투여한 마우스로부터 얻은 샘플을 나타내는 것이다. "혼합(mix)"은 5 가지의 상이한 피막 단백질을 발현하는 백시니아 바이러스들의 혼합물을 투여한 마우스로부터 얻은 샘플을 나타내는 것이다. 각각의 샘플은 HIV-1-피복된 ELISA 플레이트상에서 시험하기 전에 1:100(까만 막대), 1:1,000(빗금친 막대) 및 1:10,000(흰 막대)의 비로 희석하였다. 표준오차 막대들도 나타내었다.
도 5 는 pEvenv4 BH10 서열을 PCR 생성물로 치환시킴으로서 신규의 백시니아 바이러스 재조합체를 생산하는 방법을 나타낸 것이다. 서열 치환방법을 나타내었다. PCR 생성물은 KpnI 및 BsmI 의 독특한 효소제한부위에서 개개의 BH10 env 서열에 대하여 치환된다. 플라스미드를 절단하고 PCR 생성물과 결합시킨 후에 신규의 플라스미드를 야생형 VV 와 재조합시켜 VV-발현 벡터를 생성시킨다.
도 6 은 면역화한 후에 애보트(Abbott) ELISA 에서의 반응을 나타낸 것이다. 모두 4 마리의 침팬지로부터 얻은 혈청을 애보트 임상시험방법(Abbott clinical assay)에 의해 시험하였다(이하의 '재료 및 방법' 참조). 각각의 혈청 샘플에 대한 결과(Y-축)를 각각의 시험일(X-축)에 대하여 기록하였다. 혼합된 VVenv 백신으로 면역시킨 침팬지에서 높은 반응이 관찰되었다.
도 7 은 DNA 백신 및 VV 재조합 벡터로서 모두 작용할 수 있는 이작용성 플라스미드의 지도이다. 사이토메갈로바이러스(CMV) 즉시형 조기 프로모터 및 백시니아 바이러스(VV) 후기 및 조기 프로모터의 존재는 포유동물 세포 또는 VV 감염 세포 모두에서 이종 유전자의 발현을 가능하게 한다.
혼합 HIV 폴리엔브 백신에 대하여 예기치 않게 증가된 면역반응의 발견: 상이한 HIV 균주에 대한 백신을 제공하기 위한 이전의 시도들은 gp120 또는 gp160 의 하나 이상의 가변성 부위에 초점을 맞추어 왔다. 백신내에 제공된 이러한 가변성 부위는 HIV 감염에 대항하여 광범한 보호작용을 제공할 것으로 기대되었다. 그러나, 백신-유도된 면역반응이 다수의 상이한 HIV 균주를 인지하지 못하는 경우에는 이러한 백신은 성공적으로 사용되지 못하였다. 그러므로, HIV 의 치료 및/또는 예방에 적합하도록 다수의 HIV 균주에 대한 면역반응을 야기시키는 백신을 제공하고자하는 결정적인 필요성이 있다.
본 발명자들은 각각 상이한 피막 단백질 변이체(EPV)를 코드화하는 4 개 이상 1,000 개 이하, 경우에 따라 10,000 개 까지의 재조합 바이러스의 혼합물을 함유하는 폴리엔브 백신을 사용함으로써 수종의 또는 다수의 상이한 HIV 균주에 대하여 예기치않게 증진된 일차 및 이차(추가자극된) 면역반응을 유도할 수 있음을 밝혀내었다. 백신은 또한 예를들어 바이러스 생산을 위해 사용된 숙주세포내에서 생산된 것으로서 바이러스에 의해 발현된 EPVs를 함유할 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 " 초회자극(priming)" 또는 "일차" 및 "추가자극(boost)" 또는 "추가자극하는(boosting)"은 각각 면역학에서 이들 용어가 갖는 일반적인 정의에 따라 초기 및 후기 면역화를 의미하는 것이다.
EPV 코드화 핵산(피막 변이체(EV) 핵산)은 HIV 에 의해 감염된 인간의 동일하거나 상이한 집단(예를들면, 지리학적으로)으로부터 분리될 수 있다. 또한, 상이한 EV 핵산은 어떠한 공급원으로부터도 수득될 수 있으며, 코드화 서열이 상이한 서열을 선별하거나, 공지의 방법에 따라 시험관내 또는 생체내에서 다수의 HIV 균주에 대하여 야기된 체액성 및/또는 세포성 면역반응에 있어서의 차이점을 평가함으로써 선택될 수 있다.
재조합 백시니아 바이러스 백신에 관련된 최초의 발견: 그러나, 당해 기술분야의 전문가에 의해 용이하게 인식될 수 있는 바와 같이, 어떠한 재조합 바이러스라도 본 발명의 백신을 위한 폴리엔브 항원을 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 다수의 바이러스성 백신을 사용함으로써 덜 효과적인 바이러스성 백신에 의한 추가자극을 제공할 수 있는 (격렬한 항바이러스 반응의 가능한 상승작용으로 인하여) 항바이러스성 면역반응을 미연에 방지할 수 있다.
당해기술분야의 전문가에 의해 용이하게 인식될 수 있는 바와 같이, 본 발명자들은 또한 재조합 HIV env 단백질 또는 단백질들, 바람직하게는 단백질들에 의한 추가자극이 또한 본 발명의 면역화방법을 강화시킨다는 것을 밝혀내었다. HIV env 단백질 또는 단백질들은 폴리엔브 백신에서 발현된 HIV env 단백질에 상응할 수 있거나, 이들은 상이한 HIV env 단백질일 수도 있다.
마찬가지로, 당해기술분야의 전문가에 의해 용이하게 인식될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 면역화방법은 DNA 백신을 사용함으로써 증진된다. DNA 백신은 예를들어 재조합 HIV 단백질에 대하여 상술한 바와 같이 추가자극제로서 사용될 수 있다. 또한, 이와는 달리 DNA 백신은 안티-HIV 면역반응을 추가자극하기 위해 사용된 재조합 바이러스성 백신 또는 백신들에 의해 면역성을 초회자극하는데 사용될 수 있다. 재조합 env 단백질 추가자극제 백신과 마찬가지로 DNA 백신은 하나 또는 그 이상의 HIV env 유전자의 발현을 위한 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 또한, HIV env 유전자는 재조합 바이러스 백신에 의해 발현된 유전자에 상응할 수 있거나, 이들은 상이할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 벡터들은 재조합 바이러스 백신내에서 및 DNA 백신의 일부로서 형질감염된 포유동물 세포내에서의 발현을 위해 제조된다.
면역반응(체액성 및/또는 세포성)은 HIV 와 같은 광범한 감염성 바이러스 균주에 대해 효과적인 것으로 확인되었으며, 폴리엔브 백신에 의해 제공된 특이적 피막 단백질 변이체(EPVs)를 발현하는 바이러스 균주에 대해 제한되지는 않는다. 따라서 본 발명은 다수의 HIV 균주에 대하여 예기치 않게 증가된 면역반응을 제공하는 재조합 바이러스성 백신에 의해 코드화된 다수의 EPVs를 제공한다.
폴리엔브 백신 및 예방접종
본 발명의 한가지 관점에 따르면 각각 상이한 피막 단백질 변이체 또는 그의 항원성 부분을 발현하는 4 개 이상 10,000 개 이하의 상이한 제조합 백시니아 바이러스의 혼합물을 사용하는 폴리엔브 백신이 제공된다. 당해기술분야의 전문가에 의해 용이하게 인식될 수 있는 바와 같이, 4 개 내지 약 1000 개, 또는 바람직하게는 약 10 개 내지 약 100 개의 상이한 재조합 바이러스가 사용될 수 있다. 또한, 당해기술분야의 전문가라면 다른 바이러스들을 백신용으로 사용할 수 있음도 잘 알 수 있을 것이다. 백시니아 이외에, 백신용 재조합 바이러스 숙주로 작용할 수 있는 적합한 바이러스의 예로는 카나리폭스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스가 포함된다. 본 발명에서는 또한 이러한 폴리엔브 백신을 제조하고 사용하는 방법도 제공된다.
본 발명의 폴리엔브 백신은 폴리엔브 백신이 투여되는 포유동물에서 체액성 및 세포성 면역반응중의 적어도 하나를 유도하지만, 백신에 대한 반응은 무증상이거나 적어도 하나의 HIV 균주에 대한 적어도 하나의 면역반응을 증가시키는데 유효하여 백신 투여는 예방접종 목적에 적합하다.
바이러스성 백신: HIV 폴리엔브 항원의 투여를 위한 폴리엔브 바이러스성 백신을 제조하기 위해서는 여러 가지 유전적으로 조작된 바이러스 숙주("재조합 바이러스")가 사용될 수 있다. 바이러스성 백신은 바이러스 감염성분이 B 림프구, 헬퍼 T 림프구 및 세포독성 T 림프구의 활성화를 표적으로 하는 활발한 면역반응을 촉진시킨다는 점에서 특히 유리하다. 본 발명의 백신용 재조합 바이러스 숙주로는 수많은 바이러스 종이 사용될 수 있다. 바이러스성 백신용으로 바람직한 재조합 바이러스 는 백시니아 바이러스[국제특허공보 WO 87/06262, 1987. 10. 22, by Moss et al.; Cooney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1882-6 (1993); Graham et al., J. Infect. Dis. 166: 244-52 (1992); McElrath et al., J. Infect. Dis. 169: 41-7 (1994)]. 또 다른 구체예로서, 재조합 카나리폭스가 사용될 수 있다[Pialoux et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 11: 373-81 (1995), erratum in AIDS Res. Hum. Retroviruses 11: 875 (1995); Andersson et al., J. Infect. Dis. 174: 977-85 (1996); Fries et al., Vaccine 14: 428-34 (1996); Gonczol et al., Vaccine 13: 1080-5 (1995)]. 또 다른 대체물로는 불완전 아데노바이러스 또는 아데노바이러스가 있다[Gilardi-Hebenstreit et al., J. Gen. Virol. 71: 2425-31 (1990); Prevec et al., J. Infect. Dis. 161: 27-30 (1990); Lubeck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6763-7 (1989); Xiang et al., Virology 219: 220-7 (1996)]. 그밖의 적합한 바이러스성 벡터에는 양쪽영양성(amphotropic) 숙주범위를 갖는 세포내에 들어있는 레트로바이러스[참조 Miller, Human Gene Ther. 1:5-14 (1990); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, § 9] 및, 이들로 제한되는 것은 아니지만 예를들어 단순포진 바이러스(herpes simplex virus; HSV)[참조예 Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2: 320-330 (1991)], 유두종 바이러스(papillomavirus), 엡스타인바르 바이러스(Epstein Barr virus; EBV), 아데노-관련 바이러스(AAV)[참조예 Samulski et al., J. Virol. 61: 3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol. 63: 3822-3828 (1989) 등과 같은 약독화 또는 불완전 DNA 바이러스가 포함된다.
DNA 백신: 항원과 아쥬번트를 함유하는 전통적인 백신에 대한 대체물로는 대상 개체의 조직의 세포에 의한 항원의 발현을 위해 개체의 조직내로 항원을 코드화한 DNA를 직접 생체내 도입시키는 방법이 포함된다. 이러한 백신을 여기에서는 "DNA 백신" 또는 "핵산-기본 백신"으로 칭한다. DNA 백신은 국제특허공보 WO 95/20660 및 국제특허공보 WO 93/19183 에 기술되어 있다. 바이러스성 단백질을 코드화하는 직접 주사한 DNA 의 보호성 면역반응을 유도하는 능력은 수많은 실험시스템에서 입증되었다[Conry et al., Cancer Res., 54: 1164-1168 (1994); Cox et al., Virol, 67: 5664-5667 (1993); Davis et al., Hum. Mole. Genet., 2: 1847-1851 (1993); Sedegah et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 9866-9870 (1994); Montgomery et al., DNA Cell Bio., 12: 777-783 (1993); Ulmer et al., Science, 259: 1745-1749 (1993); Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 4156-4160 (1993); Xiang et al., Virology, 199: 132-140 (1994)]. 인플루엔자 바이러스의 중화에 있어서 이러한 방법을 평가하기 위한 연구에서는 피막 및 내부 바이러스성 단백질 둘다를 사용하여 항체의 생성을 유도하였지만, 특히 바이러스성 헤마글루티닌 단백질(HA)에 중점을 두었다[Fynan et al., DNA Cell. Biol., 12: 785-789 (1993A); Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 11478-11482 (1993B); Robinson et al., Vaccine, 11: 957 (1993); Webster et al., Vaccine, 12: 1495-1498 (1994)].
보호성 면역반응을 유도하기 위해 HIV env 단백질을 코드화한 DNA를 직접 도입시켜 예방접종하면 세포-개재된 반응 및 체액성 반응 둘다가 야기된다. 이것은 생 바이러스를 사용하여 얻은 결과와 유사하다[Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 9519-9523 (1994); Ulmer, 1993, supra; Wang, 1993, supra; Xiang, 1994, supra]. 흰족제비(ferret)를 사용한 연구는 표면 당단백질과 함께 인플루엔자의 보존된 내부 바이러스성 단백질에 대한 DNA 백신이 불활성 또는 서브비리온(subvirion) 백신에 비해서 인플루엔자 바이러스의 항원성 변이체에 대해 더 효과적임을 시사하였다[Donnelly et al., Nat. Medicine, 6:583-587 (1995)]. 실제로, 마우스에서 동물의 생존기간중에 필수적으로 존속되는 핵단백질을 코드화한 DNA 에 대한 재현가능한 면역반응이 보고되었다[Yankauckas et al., DNA Cell Biol., 12: 771-776 (1993)].
본 기술분야에서 잘 알려져 있는 바와 같이, 항원 유전자의 발현효율 및/또는 DNA 백신의 면역원성에는 다수의 인자들이 영향을 미칠 수 있다. 이러한 인자들의 예에는 접종의 재현성, 플라스미드 벡터의 작제, 항원 유전자 발현을 유도하기 위해 사용된 프로모터의 선택 및 플라스미드내에서 삽입된 유전자의 안정성이 포함된다. 프로모터는 그들의 공급원에 따라 조직특이성 및 mRNA 합성을 개시시키는데 있어서의 효율이 다르다[Xiang et al., Virology, 209: 546-579 (1994); Chapman et al., Nucle. Acids. Res., 19: 3979-3986 (1991)]. 오늘날까지 대부분의 포유동물계의 DNA 백신은 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터 유도된 바이러스성 프로모터를 기본으로하고 있다. 이들은 다수의 포유동물종에서 근육 및 피부 접종 모두에서 우수한 효율을 나타내고 있다. DNA 면역화에 의해 야기된 면역반응에 영향을 미치는 것으로 알려져 있는 또 다른 인자는 DNA 송달방법인데, 비경구적 경로는 낮은 유전자 전이율을 수득할 수 있으며 상당히 가변적인 유전자 발현을 제공한다[Montgomery, 1993, supra]. 유전자총을 사용한 플라스미드의 고속 접종은 아마도 더 큰 DNA 형질감염 효율 및 수상돌기세포에 의한 더 효과적인 항원제시로 인하여 마우스의 면역반응을 증가시켰다[Fynan, 1993B, supra; Eisenbraun et al., DNA Cell Biol., 12: 791-797 (1993)]. 본 발명의 핵산-기본 백신을 함유하는 벡터는 또한 본 기술분야에서 공지되어 있는 다른 방법, 예를들면 형질감염, 엘렉트로포레이션, 미량주사, 형질도입, 세포융합, DEAE 덱스트란, 칼슘포스페이트 침전, 리포펙션(lipofection, 라이소좀 융합) 또는 DNA 벡터 수송체에 의해 목적하는 숙주내로 도입시킬 수 있다[참조예 Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963-967 (1992); Wu and Wu, J. Biol. Chem. 263: 14621-14624 (1988); Hartmut et al., 카나다 특허출원 제 2,012,311 호 (1990. 3. 15 자 출원)].
바이러스 및 DNA 백신을 위한 이작용성 플라스미드: 본 발명의 바람직한 관점은 DNA 백신 및 재조합 바이러스 벡터로서 작용할 수 있는 이작용성 플라스미드의 조작에 관한 것이다. DNA 백신으로서 정제된 플라스미드 DNA 의 직접 주사는 시험 개체에서 플라스미드에 의해 발현된 항원에 대한 면역반응을 야기시킨다. 플라스미드는 또한 생 재조합 바이러스에서 면역화 비히클(vehicle)로서도 유용하다.
본 발명의 이작용성 플라스미드는 2 개의 상이한 발현조절서열, 즉 동물 발현조절서열 및 바이러스 발현조절서열의 조절하에서 이종 유전자 또는 이종 유전자를 위한 삽입부위를 제공한다. 용어 "조절하에서(under control)"는 그의 통상적인 의미로 사용되는데, 즉 작동가능하게 또는 결합하여 작동적으로, 프로모터와 같은 발현조절서열이 이종 유전자의 발현을 위한 발현에 대비한다는 개념으로 사용된다. 바람직한 구체예로서, 동물 발현조절서열은 포유동물 프로모터(조류 프로모터도 또한 본 발명에 의해 예상된다)이며, 특정의 구체예로서 프로모터는 사이토메갈로바이러스 즉시형 조기 (CMV) 프로모터(참조, 도 7)이다. 추가의 특정한 구체예로서, 바이러스 프로모터는 백시니아 바이러스 조기 프로모터 또는 백시니아 바이러스 후기 프로모터, 또는 바람직하게는 둘다이다 (도 7). 대상 개체를 DNA 로서 및 다른 시점에서는 (그러나 순서의 제한은 없다) 재조합 바이러스 백신으로서 투여되는 이작용성 플라스미드로 다단계 방식(multi-tiered regimen)에 의해 예방접종할 수 있다. 본 발명은 DNA 백신으로서 또는 재조합 바이러스 백신으로서, 또는 둘다로서 이작용성 플라스미드를 1 회 또는 수회 투여하는 것을 포함한다. 이 예방접종 방식은 재조합 단백질 백신(후술함)의 투여에 의해 보완될 수 있거나, 추가의 백신 비히클과 함께 사용될 수도 있다.
당해 기술분야에서의 전문가가 잘 이해할 수 있는 것으로서, 본 발명의 이작용성 플라스미드는 폴리엔브 백신 벡터로서 사용될 수 있다. 즉, 이작용성 플라스미드내에 적어도 4 개 내지 약 10,000 개, 바람직하게는 4 내지 1000 개, 더욱 바람직하게는 10 내지 100 개의 상이한 HIV env 유전자를 삽입시킴으로써 폴리엔브 백신으로서 유용한 이작용성 플라스미드의 상응하는 셋트(set)를 제조한다.
재조합 단백질 백신: 본 발명에 따르는 HIV env 단백질 또는 단백질들 예방접종함으로써 야기된 활성 면역성은 세포성 또는 체액성 면역반응을 초회자극하거나 추가자극할 수 있다. HIV env 단백질 또는 단백질들, 또는 그의 항원성 단편은 백신을 제조하기 위해 아쥬번트와의 혼합물로서 제조될 수 있다.
용어 "아쥬번트(adjuvant)"는 항원에 대한 면역반응을 증가시키는 화합물 또는 혼합물을 의미한다. 아쥬번트는 항원을 서서히 유리시키는 조직 데포제(depot)로서 및, 또한 면역반응을 비특이적으로 증가시키는 림프계 활성화제로서 작용할 수 있다(Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park, California, p. 384). 때때로, 아쥬번트의 부재하에서 항원만을 단독으로 사용하여 일차 투여하면 체액성 또는 세포성 면역반응을 야기시키는데 실패할 수 있다. 아쥬번트에는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 완전 프로인드 보조액(complete Freund's adjuvant), 불완전(incomplete) 프로인드 보조액, 사포닌, 수산화알루미늄과 같은 무기겔, 라이소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리애니온(polyanion), 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼과 같은 계면활성제, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanins), 디니트로페놀, 및 BCG(bacille Calmette -Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 아쥬번트가 포함된다. 아쥬번트는 예방접종할 개체에 따라 선택한다. 바람직하게는, 약제학적으로 허용되는 아쥬번트가 사용된다. 예를들어, 인간에게 사용하는 백신에서는 완전 또는 불완전 프로인드 보조액을 포함하여 오일 또는 탄화수소 에멀젼 아쥬번트는 사용을 피하여야 한다. 인간에게 사용하기에 적합한 아쥬번트의 한가지 예는 알룸(알루미나 겔)이다. 특정의 구체예로서는, 후술하는 바와 같이 알룸중의 재조합 HIV env 단백질을 근육내로 투여한다. 다른 방법으로 재조합 HIV env 단백질 백신은 피하, 피내, 복강내, 또는 그밖의 다른 허용되는 백신 투여경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명에 따르면, HIV 에 대한 면역화는 본 발명의 재조합 바이러스성 백신을 단독으로, 또는 DNA 백신이나 재조합 단백질 백신 또는 둘다와 조합하여 사용함으로써 이루어질 수 있다. 특정의 구체예에서는, 알룸중의 재조합 HIV env 단백질은 근육내 투여하여 면역반응을 추가자극시킨다.
바이러스 백신의 각각의 용량에는 각각 상이한 HIV env 유전자를 발현시키는 4 내지 10,000 개, 바람직하게는 4 내지 1000 개, 더욱 바람직하게는 10 내지 100 개의 상이한 재조합 바이러스가 동일하게 함유될 수 있다. 다른 방법으로, 후속 단계의 백신중의 바이러스는 상이한 HIV env 유전자를 발현시킬 수 있다. 또 다른 구체예로서, 후속 단계의 폴리엔브 바이러스성 백신은 몇 개의 바이러스는 전단계 백신의 바이러스와 공통적으로 가지고 다른 바이러스는 다를 수 있다. 예를들어 초회자극용 백신은 임의로 1-10 으로 지정된 HIV env 단백질을 발현시키는 백시니아 바이러스를 함유할 수 있다. 2 차(추가자극용) 백신은 HIV env 단백질 6-15 또는 11-20 등을 발현시키는 백시니아 (또는 바람직하게는 카나리폭스 또는 아데노바이러스와 같은 다른 바이러스) 바이러스를 함유할 수도 있다.
DNA 백신 또는 재조합 단백질 백신은 하나의 HIV env 단백질 항원 또는 다수의 항원을 가질 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 DNA 또는 재조합 단백질 백신은 하나 이상의 HIV env 단백질 항원을 포함한다. 후속 단계에 바이러스성 백신을 사용하는 경우에, HIV env 단백질 또는 DNA 백신 또는 재조합 단백질 백신의 단백질은 폴리엔브 바이러스성 백신내에서 발현된 HIV env 단백질에 상응할 수 있거나, 또는 폴리엔브 env 단백질중의 어느것과도 다를 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 바람직한 구체예는 각각의 예방접종 프로토콜(protocol)에서 이용가능한 최대의 가변성을 제공하여 수용체(recipient)가 최대수의 HIV env 단백질에 노출되도록 하고, 따라서 천연 HIV 분리체와의 교차-반응성을 중화시키는 최대의 기회를 제공하는 것을 포함한다.
피막 단백질 변이체
상기한 바와 같이, 본 발명의 백신에서 사용하기 위한 EPV 는 지리적으로 국소적인 분리체(isolates) 또는 클래드(clades)로부터, 또는 지리학적으로 다양한 분리체, 즉 상이한 클래드로부터 수득될 수 있다. 당해 기술분야의 전문가에게 용이하게 인지될 수 있는 바와 같이, 천연 분리체로부터 env 뉴클레오타이드(즉, 유전자)를 얻는 것은 여러가지 잇점을 갖는다: 즉, 분리체를 쉽게 이용할 수 있으며, EPVs 가 면역성이 요구되는 천연산 단백질에 상응하고, HIV 의 돌연변이가 새로운 분리체로부터 신속하게 포착될 수 있다는 점이다.
EPV 는 또한, 적어도 하나의 에피토프(epitope) 또는 항원 결정인자로서 EPV 아니노산 서열의 아미노산 서열에 의해 야기된 면역원성 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 아미노산 서열은 실질적으로, 공지된 HIV EPV 중의 적어도 하나의 10-900 개의 아미노산 단편 및/또는 동감성 서열(consensus sequence)에 상응한다. 이러한 EPV 는 적어도 하나의 HIV 균주에 대한 면역원성 반응을 야기시키면서, 공지의 피막 단백질 아미노산 서열에 대해 전체적인 상동성(homology) 또는 적어도 50% 의 동일성, 예를들어 50-99% 상동성 또는 이중의 어떤 범위나 값을 가질 수 있다.
상동성 백분율은 예를들어, 서열 정보를 유니버시티 오브 위스콘신 제네틱스 컴퓨터 그룹(the University of Wisconsin Genetics Computer Group; UWGCG)으로부터 이용할 수 있는 버젼(version) 6.0 의 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 비교함으로써 결정될 수 있다. GAP 프로그램은 스미스(Smith)와 워터맨(Waterman)에 의해 개정된 것[Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]으로 니들맨(Needleman)과 분쉬(Wunsch)의 정렬방법[J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)]을 이용한다. 간략하게, GAP프로그램은 두 개의 서열중의 짧은 서열내의 심볼의 총수로 유사한 정렬된 심볼(즉, 뉴클레오타이드 또는 아미노산)의 수를 나눈 것으로서 유사성(similarity)을 규정한다. GAP 프로그램에 대한 바람직한 생략성 파라메터(default parameter)에는 다음이 포함된다: (1) 슈바르츠와 데이호프에 의해 기술된 것[Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC (1979), pp. 353-358]으로서 일단위 비교 매트릭스(unitary comparison matrix)(동일성의 경우에는 1 의 값을, 비-동일성의 경우에는 0 의 값을 함유) 및 그리브스코프와 버기스[Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986)]의 평량된 비교 배트릭스; (2) 각 갭에 대한 페날티(penalty) 3.0 및 각 갭에서 각각의 심볼에 대한 추가의 페날티 0.10; 및 (3) 말단 갭에 대해서는 페날티가 없음.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 EPV 는 적어도 하나의 HIV 피막 단백질의 변이체 형태이다. 바람직하게는, EPV 는 gp120, 및 gp140 으로서 gp41 의 올리고머화 영역을 포함한다[Hallenberger, et al., Virology 193: 510-514 (1993)].
공지의 HIV 피막 단백질은 약 750 내지 900 개의 아미노산을 함유한다. 이러한 서열의 예는 젠뱅크(GENBANK)와 같은 시판되고 있으며 기업적인 HIV 서열 데이터베이스(database), 또는 공개된 편집물[예를들어 Myers et al., eds., Human Retroviruses and AIDS, A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences, Vol. I and II, Theoretical Biology and Biophysics, Los Alamos, NM (1993)]로부터 쉽게 이용할 수 있다. EPV 를 치환 또는 삽입하여, 본 발명의 재조합 바이러스 또는 폴리엔브 백신에서 사용하기 위해 핵산에 의해 코드화된 추가의 EPV를 수득하는 것은 적어도 하나의 아미노산 잔기(예를들어 1-25 아미노산)의 치환 또는 삽입을 포함할 수 있다. 다른 방법으로, EPV 서열로부터 적어도 하나의 아미노산(예를들어 1-25 아미노산)을 결실시킬 수도 있다. 바람직하게는, 이러한 치환, 삽입 또는 결실은 HIV 에 의해 감염된 개체로부터의 핵산을 코드화한 적어도 하나의 EPV 의 뉴클레오타이드 서열결정에 의해 얻은 피막 단백질의 서열 결정을 기초로 하여 확인된다.
이러한 치환, 삽입 또는 결실의 비제한적인 예는 바람직하게는, 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있는 것으로, HIV-1 감염된 환자로부터의 env DNA 또는 RNA 서열을 증폭시켜 피막 단백질 또는 EPV 의 변형된 구조적 및 작용적 특성을 제공하는 것으로 이루어진다. 이렇게 하여 수득된 EPVs 는 바람직하게는 원래의 EPV 와는 다른 항원특성을 갖는다. 이러한 항원성의 차이는 적합한 시험방법에 의해, 예를들면 ELISA 시험에서 HIV 피막 단백질에 대해 특이적인 모노클로날 항체의 패널(panel)을 사용하여 시험함으로써 결정될 수 있다.
생성된 EPV 단백질이 HIV 피막 단백질에 결합하는 항체를 유도하지만, 이 EPV 가 2 차 EPV 에 의해 유도된 항체와는 다른 패턴을 가지는 한 어떠한 치환, 삽입 또는 결실이라도 사용될 수 있다. 상기의 치환, 삽입 또는 결실은 각각 37 C.F.R. § 1.822(p)(2)에서 제공되는 것과 같은 변형되거나 특이한 아미노산을 포함할 수도 있다.
하기 표 1 은 본 발명에 따르는 재조합 바이러스에 의해 코드화될 수 있는 HIVs 의 피막 단백질의 대체용 변이체의 비제한적인 예를 나타낸 것이다.
따라서, 상기한 구체적인 치환의 예를 기초로 하여 통상적인 실험에 의해 대체용 치환을 수행함으로써, 예를들어 피막 단백질 또는 EPV's 내에 상이한 면역반응을 야기시키는 하나 또는 그 이상의 치환, 삽입 또는 결실을 만들어서 본 발명의 대체용 EPVs를 제공할 수 있다.
본 발명의 EPV 에서의 아미노산 서열 변이체는 예를들어 DNA 에서의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 이러한 EPVs 에는 예를들어, 아미노산 서열내에 상이한 아미노산 잔기를 코드화한 뉴클레오타이드를 결실, 삽입 또는 치환시킨 것이 포함된다. 명백하게, EPV를 코드화한 핵산에서 이루어지는 돌연변이는 판독 프레임 으로부터 떨어져 있는 서열에 위치하지 않아야 하며, 바람직하게는 2 차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보적 영역을 생성시키지 않아야 한다[참조예 Ausubel (1995 rev.), infra; Sambrook (1989), infra].
본 발명의 EPV-코드화 핵산은 또한, 본 명세서에 제시된 지침을 기초로 하여 피막 단백질 또는 EPV를 코드화한 DNA 또는 RNA에서 뉴클레오타이드를 증폭 또는 부위-유도된 돌연변이유발시키고, 그후에 코드화 DNA를 합성하거나 역전사시켜 EPV를 코드화한 DNA 또는 RNA를 생성시킴으로써 제조될 수 있다[참조예 Ausubel (1995 rev.), infra; Sambrook (1989), infra].
본 발명의 EPV's, 재조합 EPVs 또는 이것을 코드화한 핵산 벡터를 발현시키는 재조합 바이러스는 본 명세서에 제시된 지침을 기초로 하여 과도한 실험없이, 당해 기술분야의 전문가에 의해 통상적으로 수득될 수 있는 치환 뉴클레오타이드로서 EPV-코드화 서열의 한정된 셋트를 포함한다. 단백질 화학 및 구조에 대한 상세한 설명은 문헌을 참고로 한다[참조 Schulz, G.E. et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY (1978) and Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA (1983)]. 코돈 선호도(preferences)와 같은 뉴클레오타이드 서열 치환의 제시를 위해서는 다음 문헌을 참고로 한다: Ausubel et al., eds, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., New York, NY (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995)(이하에서는 "Ausubel (1995 rev.)"라 칭한다), §§A.1.1-A.1.24, 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), Appendices C 및 D.
따라서, 본 명세서에 제시된 지침에 따라 당해 기술분야의 전문가라면 누구나 어떻게 env DNA 또는 RNA 의 다른 위치에서 다른 아미노산 잔기를 치환시켜 치환, 결실 또는 삽입 변이체를 포함한 다른 대체용 EPVs를 수득할 수 있는 지를 알 수 있을 것이다.
HIV 활성에 관한 선별시험
본 발명의 백신으로 면역화된 개체로부터 혈청 또는 세포의 안티-HIV 활성을 선별하기 위하여는 당해 기술분야에서 공지된 것으로 공지되고/되거나 적합한 선별 시험방법중의 어느 것이라도 사용할 수 있다. 예를들어, 공지의 HIV 시험에는 바이러스 감염성시험[참조예 Chesebro et al., J. Virol. 62: 3779-3788 (1988); Aldovini et al., eds., Techniques in HIV Research pp. 71-76 (1990)]; 중화시험[참조예 Golding et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10: 633-643 (1994); Hanson, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10: 645-648 (1994); Laal et al., Res. Hum. Retrovir. 9: 781-785 (1993); Hanson, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 7: 211-219 (1994)]; 말초단핵(peripheral mononuclear; PMN) 세포 시험[참조예 Ardunio et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37: 1095-1101 (1990)]; 및 세포독성 T-림프구(cytotoxic T-lymphocyte; CTL) 시험[참조예 Hammond et al., J. Exp. Med. 176: 1531-1542 (1992); McElrath et al., J. Virol. 68: 5074-5083 (1994); Walker et al., Cell. Immunol. 119: 470-475 (1989); Weinhold et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 8: 1373 (1992)]이 포함된다. 그밖에 단독으로 또는 어떤 것과 조합하여 사용하기에 적합한 다른 방법에는 전사, 복제, 해독, 비리온 이입, 균력(virulence), 바이러스 수율 및/또는 형태발생의 정량적 및/또는 정성적 측정이 포함되나, 단 이들로 제한되는 것은 아니다.
특정한 구체예: EPV's 를 코드화하는 재조합 백시니아 바이러스, 폴리엔브 백신 및 그의 제조 및 사용방법
개론: HIV 피막 단백질(예를들어 gp41, gp120 및/또는 gp160, 또는 이들의 일부분)을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스(VV)는 바이러스에 대한 체액성 또는 새포성 면역반응중의 적어도 하나를 유도하는 혼합 백신을 제조하고 시험하며, 또한 B-세포 및 CTL 결정인자의 분석하는데 유용한 물질을 제공한다.
본 발명의 폴리엔브 백신은 n 개의 상이한 재조합 백시니아 바이러스의 혼합물로 구성되는데, 여기에서 n 은 약 4 내지 약 10,000 의 총수(또는 이들중의 어떤 범위 또는 값)이며, 각각의 백시니아 벡터 구조물은 HIV-1 피막 단백질(EPV)의 변이체(예를들어 gp41, gp120 또는 gp160)를 발현한다. 재조합 백시니아 바이러스는 작용적으로 EPV를 코드화하며, 야생형 VV를 플라스미드와 재조합시킴으로써 제조된다. EPV를 코드화하는 다수의 상이한 플라스미드는 하나의 EPV 코드화 서열을 예를들어, 제한단편 또는 돌연변이유발을 이용하여 다른 것으로 치환시킴으로써 제조될 수 있다.
재조합 백시니아 바이러스의 제조: 개개 플라스미드(각각 독특한 HIV 단백질 서열을 발현시키는)의 제조방법은 공지의 HIV 피막 단백질 서열(예를들어 NIAID AIDS Research & Reference Reagent Program, Rockville, MD)을 코드화하는 벡터(예를들어 pVenv4 또는 pVenv1 [Hallenberger et al., Virology 193: 510-514 (1993)]내로 분리된 피막 단백질 변이체 서열을 치환시키기 위해 DNA 또는 RNA 증폭을 이용할 수 있다.
RNA 또는 DNA를 증폭시키는 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 본 명세서에 제시된 지침을 기초로 하여 과도한 실험없이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. DNA 또는 RNA를 증폭시키는 공지의 방법에는 폴리머라제 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 및 관련된 증폭방법(참조예, 미국특허 제 4,683,195 호, 4,683,202 호, 4,800,159 호, 4,965,188 호(Mullis et al.); 4,795,699 호 및 4,921,794 호(Tabor et al.); 5,142,033 호(Innis); 5,122,464 호(Wilson et al.); 5,091,310 호(Innis); 5,066,584 호(Gyllensten et al.); 4,889,818 호(Gelfand et al.); 4,994,370 호(Silver et al.); 4,766,067 호(Biswas); 4,656,134 호(Ringold)) 및 이본쇄 DNA 합성을 위한 주형(미합중국 특허 제 5,130,238 호(Malek et al.), 상품명 NASBA)으로서 표적서열에 대한 안티-센스 RNA를 사용하는 RNA 개재된 증폭방법이 포함되나, 단 이들로 제한되는 것은 아니다.
예를들어, 이 경로에 의해 제조된 재조합 백시니아 바이러스 구조물은 면역화 및 HIV-특이적 T 및/또는 B-세포 반응의 유도를 위해 사용할 수 있다. 프라이머(primer)는 보존된 HIV 서열을 이용하며, 따라서 많은 다양한 HIV-1 환자 샘플로부터 env 유전자를 성공적으로 증폭시킨다. 본 명세서에 기술된 기본적인 기술은 HIV 피막 단백질을 코드화한 벡터내에서 발견되는 것 대신에 필드 서열(field sequence)로부터의 env 서열의 작거나 큰 조각을 치환시키기 위하여 PCR 또는 다른 형태의 증폭 프라이머와 함께 유사하게 사용될 수 있다[참조예 Ausubel; infra, Sambrook, infra].
핵산을 코드화한 EPV: 이 기술은 HIV 감염세포로부터 DNA를 분리하고 PCR 에 의해 env 서열을 증폭시키는 것으로 시작한다. PCR 또는 다른 증폭생성물은 HIV 서열을 분리하기 위한 가장 간단한 방법을 제공하지만, 핵산 또는 단백질을 코드화한 EPV 를 클로닝하고 분리하는 것과 같은 그밖의 다른 적합한 공지의 방법을 사용할 수도 있다[참조 Ausubel; infra, Sambrook, infra]. 바람직하게는 효소제한부위를 PCR 또는 다른 증폭 프라이머 서열내에 이입시켜 유전자 클로닝을 용이하게 한다.
PCR을 위한 분리된 DNA 는 HIV+ 환자 및 시험관내에서 바이러스 분리체에 의해 감염된 세포로부터 얻은 신선하거나 동결된 전혈액을 포함한 다수의 바이러스 공급원으로부터 제조할 수 있다.
새로운 HIV env 구조물을 제조하기 위해서는 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 사용하여 각각 상이한 HIV 환자 샘플로부터 얻은 env 유전자의 100-2700 염기쌍(bp)을 증폭시키는 것이 바람직하다. PCR 프라이머는 env 유전자, 분리된 HIVs 또는 다양한 HIV 환자 샘플의 공지된 샘플로부터 얻은 env 유전자를 증폭시키는데 적합한 잘 보존된 HIV 서열를 나타낼 수 있다. 증폭된 DNA 는 바람직하게는 gp120 및 gp41(둘이 함께 gp160을 만든다)의 10-900 개(예를들어 100-400, 400-600 또는 600-900, 또는 이들중의 어떤 범위 또는 값)의 아미노산을 코드화하는 부분을 포함한다. 바람직하게는 PCR 생성물내에 피막 가변성 부위(V1-V5) 및 불변성 부위(C1-C5)중의 하나 이상이 포함되며, 더욱 바람직하게는 V1, C1, V2, C2, V3, C3, V4, C4 및 V5 부위의 대부분이 포함된다. 또한, 증폭된 서열은 gp120/gp41 에 대한 분해부위 이외의 1-200 개의 아미노산을 코드화할 수 있다. 바람직하게는, 완전 env 유전자의 대부분 또는 전부가 증폭된다. 임의로, 증폭된 gp160 코드화 서열은 트랜스멤브레인(transmembrane) 영역 및/또는 세포질 꼬리(cytoplasmic tail) 영역을 코드화하는 서열의 일부 또는 전부가 결실되어 있다[참조예 Hallenberger et al. (1993)].
PCR 프라이머는 제한효소 부위가 백시니아 플라스미드내의 피막 유전자 서열에 인접하게 존재하도록 고안될 수 있으며, 이렇게 하여 이들이 증폭된 DNA 생성물내에 이입되도록 한다. 잘 알려져 있는 치환 클로닝 기술을 이용하여, 예를들어 치환을 위한 제한단편을 사용하여 백시니아 플라스미드내의 env 서열의 상응하는 부분을 환자의 EPV 코드화 서열로 치환시킴으로써 1-10,000 환자로 부터의 피막 단백질 변이체 서열을 발현시키는 백시니아 플라스미드 유도체를 생성시킬 수 있다. 예를들어, pVenv4 플라스미드와 PCR 생성물을 KpnI 및 BsmI 로 처리하여 gp41 의 트랜스멤브레인 영역 및 세포질 꼬리 영역 둘다가 결실된 아미노산 1-639 의 절단된 gp160을 코드화한 서열을 얻는다[참조예 Hallenberger et al. (1993)].
PCR 생성물과 pVenv 생성물을 결합시킨 후에, 박테리아 숙주세포를 예를들어 엘렉트로포레이션(electroporation)을 포함한, 당해 기술분야에서 잘 알려져 있는 다수의 방법중의 어느 것이나를 이용하여 결합생성물로 형질전환시키고, 재조합 콜로니를 수집하여 서열분석에 의해 검사한다.
HIV 피막 단백질을 코드화한 재조합 백시니아 바이러스 구조물: EPV 코드화 백시니아는 그후에 숙주세포내에서 야생형 바이러스와 재결합시키고, EPV 발현 바이러스 플라그를 선별하여 바이러스 스톡(stock)을 만든다. 그후, 각각 상이한 EPV 코드화 서열을 함유하는 VVenv's 로서의 바이러스 스톡을 적어도 4-40 개 및 최대 약 10,000 개의 상이한 재조합 바이러스를 사용하여 혼합시켜 본 발명의 폴리엔브 백신을 형성시킨다.
EPV 서열을 함유하는 재조합 백시니아 플라스미드는 그후에 임의로 HIV 피막 단백질-특이 항체를 사용하여 서열분석하고 선별하여 상이한 EPVs를 확인한다. 생거 방법(Sanger Method)인 디데옥시-쇄 말단화에 의한 서열분석이 바람직하다. 그 과정은 전술한 방법으로부터 변형시키는 것이 바람직하며[Sambrook, et al. (1989), infra; United States Biochemical, Sequenase Version 2.0 - DNA Sequen- cing Kit, Ninth Edition, Amersham Life Science, Inc., (1994)], 프라이머 위치로부터 대략 50-300 bp를 판독해야 한다.
VV 발현 벡터의 제조방법은 당해 기술분야에서 잘 알려져 있다[참조예 Mackett, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 7415-7419 (1982); Panicali, D., and Paoletti, E., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 4927-4931 (1982); 미합중국 특허 제 4,169,763 호; Mazzara, G.P. et al., Methods in Enz. 217: 557-581 (1993), Ausubel et al., infra, at §§ 16.15-16.19]. 전술한 pSC11 벡터[Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3403-3409 (1985)]를 사용하여 바람직하게는 pVenv4 와 같은 env-코드화된 플라스미드를 생성시킬 수 있다.
바이러스성 벡터로서, 백시니아 바이러스는 외인성 DNA 의 큰 단편(20kb 이상)을 클로닝할 수 있는 능력, 외인성 DNA 의 삽입후에 감염성의 보류, 넓은 숙주 범위, 비교적 높은 수준의 단백질 합성, 및 발현된 단백질의 일차구조와 사용된 숙주형태에 의해 지시된 것으로서 적합한 이송, 분비, 처리 및 해독후 변형을 포함하여 다수의 유용한 특성을 가지고 있다. 예를들어 발현된 단백질의 조합뿐만 아니라 N-O-글리코실화, 포스포릴화, 미리스틸화 및 분해가 정확한 방식으로 나타난다.
백시니아 벡터의 여러 가지 변형방법이 개발되었으며, 본 발명에서 사용하기에 적합하다(참조예 Ausubel et al., infra, §§ 16.15-16.19). 가장 일반적으로는, 바이러스 스톡을 수득한 후에(Ausubel, infra at §§ 16.16) EPV를 코드화한 핵산서열을 백시니아 바이러스 프로모터의 조절하에 위치시키고 감염성이 유지되도록 백시니아의 게놈내에 통합시킨다(Ausubel et al., infra at §§ 16.17). 다른 방법으로, EPV를 코드화한 백시니아 프로모터-조절된 유전자를 함유하는 플라스미드를 야생형 백시니아로 감염된 세포내로 형질감염시킴으로써 발현이 이루어질 수도 있다.
바람직하게는 숙주세포 및 백시니아 벡터가 적합하며, 포유동물 및 인간의 에방접종에서 사용하도록 승인되었다. 그후 이들 재조합 바이러스는 다양한 공지의 방법을 사용하여 특정화시킨다(참조예 Ausubel et al., infra, §§ 16.18). 또 다른 변형방법으로, 박테리아 파지 T7 RNA 폴리머라제 쇄는 EPV 코드화 서열이 형질감염된 혈장, 플라스미드 또는 재조합 백시니아 바이러스내에서 T7 프로모터의 조절하에 발현되도록 백시니아 바이러스의 게놈내에 통합시킬 수 있다.
폭스(pox) 바이러스 프로모터를 사용하는 것은 세포성 및 그밖의 다른 바이러스성 프로모터들이 일반적으로 백시니아 전사기구에 의해 인지되지 않기 때문에 바람직하다. 화합물 조기/후기 프로모터는 주 조직적합 클래스(major histocompati- bility class; MHC) I 또는 II 와 함께 재조합 백시니아 바이러스 감염된 숙주세포에서 나타나는 항원으로서 EPV를 발현시키는데 바람직하기 때문에 폴리엔브 백신을 위한 재조합 백시니아에서 바람직하게 사용된다. 이러한 MHC 관련된 HIV 피막 단백질은 세포독성 T 세포 표적을 형성하며, 세포독성 T 세포 반응 및/또는 발현된 HIV EPVs 에 대한 체액성 반응을 위해 예방접종된 포유동물을 초회자극한다. 이것은 이러한 형태의 항원을 위해 숙주세포내에서의 MHC 제시를 유도하는 백시니아 바이러스 벡터의 능력이 감염단계에서 후기에 감소하는 것으로 나타났기 때문이다. 초기에 유래하는 전사물은 서열 TTTTTNT 다음에서 종결되며 부적합한 MHC 제시를 유도한다.
또 다른 방법으로, 숙주세포내에서 피막 단백질 항원의 MHC 제시를 증가시키기 위해서, 유전자의 코드화 서열내의 이러한 종결 모티브는 조기 폭스 바이러스 프로모터가 사용되는 경우에 돌연변이유발에 의해 변형될 수 있다(Earl et al., infra, 1990). 백시니아 바이러스 mRNAs를 모사하기 위해서, 비해독된 리더 및 3'-말단서열은 이들이 HIV EPV 코드화 서열을 이입시키는 백시니아 플라스미드에서 사용되는 경우에는 통상적으로 짧게 유지시킨다.
본 발명에 따르는 백시니아 구조물을 제조하기 위해 사용된 플라스미드는 백시니아 프로모터의 하부에 env 유전자의 삽입을 위한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖도록 고안하는 것이 바람직하다(Ausubel et al., infra, §§ 16.17). 더욱 바람직한 것은 플라스미드가 이미 피막 단백질 코드화 서열을 함유하며, 여기에서 제한부위는 피막 단백질 코드화 서열의 시작 및 끝 부위 각각에 인접하여 독특하게 나타난다. 그후, EPV 코드화 서열의 동일한 제한단편을 플라스미드의 상응하는 서열에 대체시킬 수 있다. 이 경우에 EPV 코드화 서열의 주된 부분은 플라스미드로부터 피막 단백질 코드화 서열의 대부분 또는 전부를 제거한 후에 삽입시킬 수 있다.
바람직하게는 생성된 백시니아 구조물(EPV 코드화 서열 및 백시니아 프로모터를 함유하는)은, 플라스미드를 야생형 백시니아 바이러스로 미리 감염시킨 세포내로 형질감염시켰을 때 동종성 재조합이 가능하도록 백시니아 DNA 에 인접하여 위치한다. 인접하는 백시니아 바이러스 DNA는 재조합이 필수적인 바이러스 유전자를 차단하지 않도록 선택된다.
선별되지 않았을 때, 모 백시니아 바이러스에 대한 재조합 백시니아 바이러스의 비는 일반적으로 약 1:1000 이다. 이러한 빈도는 플라그 하이브리드화(참조 Ausubel et al., infra at §§ 6.3 및 6.4) 또는 면역선별(immunoscreening) (Ausubel et al., infra at §§ 6.7) 방법을 사용하여 재조합 바이러스를 수집하기에 충분할 정도로 높은 것이지만, 재조합 바이러스 동정을 용이하게 하기 위한 다수의 방법이 사용된다. 이러한 선택 또는 선별기술의 비제한적인 예는 당해 기술분야에서 공지되어 있다(참조 Ausubel et al., infra at §§ 16.17). 일반적으로, 발현 카세트(cassette)를 백시니아 티미딘 키나제(TK) 유전자의 절편에 인접하게 위치시켜 재조합으로 인해 TK 가 불활성화되도록 한다. 그후 TK 에 의해 포스포릴화되어 바이러스 게놈내에 치명적으로 혼입되는 5-브로모-데옥시유리딘(5-BrdU)의 존재하에서 TK-세포주를 감염시킴으로써 TK-표현형을 갖는 바이러스를 TK+표현형을 갖는 바이러스로부터 구별할 수 있다. 또한, 또는 다른 방법으로, 재조합 바이러스를 암피실린(amp) 또는 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(gpt)와 같은 박테리아 항생물질 저항성 유전자의 공동-발현(co-expression)에 의해 선별할 수 있다. 추가의 예로서 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) lac Z 유전자의 공동-발현으로 Xgal 에 의한 재조합 바이러스 플라그의 공동-선별이 가능하게 된다(Ausubel, infra, § 16.17).
본 발명의 EPV를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스는 공지의 방법에 따라, 예를들면 가열, 파라포름알데히드 처리, 자외선 조사, 프로프리오락텐 처리, 하이브리드 또는 키메라 형성에 의해, 또는 그밖의 다른 공지의 방법에 의해 임의로 약독화되거나 불활성화될 수 있다[참조예 Zagury et al., Nature 332: 728-731 (1988); Ito et al., Cancer Res. 50: 6915-6918 (1990); Wellis et al., J. Immunol. 99: 1134-9 (1967); D'Honcht, Vaccine 10 (Suppl.): 548-52 (1992); Selenka et al., Arch. Hyg. Bakteriol. 153: 244-253 (1969); Grundwad-Bearch et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 117: 561-567 (1991)]. 예를들어, 60℃ 에서의 가열 불활성화는 바이러스 역가를 상당히 저하시킨다. 불완전한 불활성화는 환자를 사망시킬 수도 있기 때문에 이러한 약독화 기술은 안전성이 시험되어야 한다[Dorozynski and Anderson, Science 252: 501-502 (1991)].
생 백시니아가 투여되는 경우에는 합병증이나 사망이 일어날 수 있기 때문에, 환자가 타협한 면역계를 가질 수 있는 경우에는 이러한 약독화되거나 불활성화딘 재조합 백시니아가 사용된다.
약제학적 조성물
접종 또는 비경구 또는 경구 투여하기에 적합한 본 발명의 약제학적 조성물은 세포 용해물의 형태, 막-결합된 분획, 부분적으로 정제된 형태 또는 정제된 형태로 적어도 4 개 내지 약 10,000 개, 바람직하게는 4 내지 약 1000 개, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 100 개의 상이한 재조합 바이러스를 함유하는 폴리엔브 재조합 바이러스 백신을 포함한다. 바람직하게는, 폴리엔브 백신은 재조합 바이러스에 의해 이미 발현된 EPV 단백질을 추가로 포함하는 재조합 바이러스-함유 세포 용해물(또는 그의 막-결합된 분획)을 포함한다. 본 발명에서는 발현된 EPVs 가 포함되는 것이 일차 항체반응을 증가시키는 것을 발견하였다.
폴리엔브 백신 조성물은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼의 형태일 수 있으며, 또한 당해 기술분야에서 공지되어 있는 보조제 또는 부형제를 함유할 수 있다. 적어도 약 4-40 내지 10,000 개의 상이한 바이러스의 각각은 본 명세서에서 기술하고 있는 바와 같이 상이한 EPV를 코드화하고 발현시킨다. EPVs를 코드화한 DNA 는 AIDS 환자의 격리된 특정집단에 존재하는 EPVs를 나타내도록 선택될 수 있다. 예를들어, 백신은 테네시주의 멤피스(Memphis)로부터 얻은 서열을 나타낼 수 있고 테네시주의 멤피스에서 사용하기 위해 표적화될 수 있다. 지리적으로 제한된 지역을 나타내도록 고안된 백신은 또한 표적화된 집단이외의 집단들에서 사용하기에 유용할 수도 있다.
또한, EPVs 코드화 DNAs 는 클레이드(clades)와 같이 지리적으로 떨어져 있는 집단, 도시 또는 국가를 나타내도록 선택될 수 있다. 예를들어 다수의 클론이 하나의 폴리엔브 백신내에 존재할 수 있다. 폴리엔브 백신 조성물은 또한 바이러스 감염에 대한 면역반응을 강화시키는 사이토킨과 같은 면역조절제(immunomodulator)를 추가로 포함할 수 있다[참조예 Berkow et al., eds., The Merck Manual, Fifteenth Edition, Merck and Co., Rahway, NJ (1987); Goodman et al., eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Edition, Pergamon Press, Inc., Elmsford, NY (1990); Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, Third Edition, AIDS Press, LTD., Williams and Wilkins, Baltimore, MD (1987); and Katzung, ed. Basic and Clinical Pharmacology, Fifth Edition, Appleton and Lange, Norwalk, CT (1992), 이들 문헌 및 여기에 인용된 문헌들은 본 기술분야의 상태를 나타낸 것이다].
당해 기술분야의 전문가에게 이해될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리엔브 백신이 개체에게 적용되는 경우에, 이것은 염류, 완충제, 아쥬번트, 또는 조성물의 효능을 개선시키는데 바람직한 다른 성분들중의 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있는 조성물의 형태일 수 있다. 아쥬번트는 적어도 하나의 면역반응을 특이적으로 강화시키기 위해 사용될 수 있는 성분이다. 일반적으로는 아쥬번트와 조성물을 면역계에 제공하기 전에 혼합시키거나, 별도로 존재하다가 면역화시킬 대상의 동일한 부위에 적용시킨다. 아쥬번트는 그들의 조성에 따라 대략적으로 몇가지 그룹으로 구분될 수 있다. 이들 그룹에는 오일 아쥬번트, 무기염류(예를들어 AlK(SO4)2, AlNa(SO4)2, AlNH4(SO4), 실리카, 카올린 및 탄소), 폴리뉴클레오타이드(예를들어 폴리 IC 및 폴리 AU 핵산), 및 특정의 천연물질[예를들어 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)로부터 수득한 왁스 D, 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum) 또는 보르데텔라 퍼튜시스(Bordetella pertusis)에 존재하는 물질, 및 브루셀라속(genus Brucella)의 멤버]이 포함된다. 이들 물질중에서 아쥬번트로서 특히 유용한 것은 사포닌(예를들어 Quil A., Superfos A/S, Denmark)이다. 백신 조성물에서 사용하기에 적합한 물질의 예는 문헌[예를들어 Osol, A., ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980), pp. 1324-1341]에 기술되어 있다.
본 발명의 약제학적 폴리엔브 백신 조성물은 또한 추가로 적어도 하나의 항바이러스성 화학요법제 화합물을 함유할 수 있다. 그의 비제한적 예는 감마글로부린, 아만타딘, 구아니딘, 하이드록시벤즈이미다졸, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 인터루킨-16(IL-16; Kurth, Nature, 1995. 12. 8); 티오세미카바존, 메티사존, 리팜핀, 리바비린, 피리미딘 동족체(에를들어 AZT 및/또는 3TC), 퓨린 동족체, 포스카넷, 포스포노아세트산, 아사이클로비르, 디데옥시뉴클레오사이드, 프로테아제 억제제(예를들어 사퀴나비르(saquinavir; Hoffmann-La Roche); 인디나비르(indinavir; Merck); 리토나비르(ritonavir; Abbott Labs); AG 1343(Agouron Pharmaceuticals); VX-2/78(Glaxo Wellcome)); 케모카인(chemokines), 예를들어 RANTES, MIP1α 또는 MIP1β[Science 270: 1560-1561 (1995)] 또는 간시클로비르(ganciclovir)로 구성된 그룹중의 적어도 하나로부터 선택될 수 있다[참조예 Richman: AIDs Res. Hum. Retroviruses 8: 1065-1071 (1992); Annu Rev Pharmacol Toxico 33: 149-164 (1993); Antimicrob Agents Chemother 37: 1207-1213 (1993); AIDs Res. Hum. Retroviruses 10: 901 (1994); Katzung (1992), infra, 및 각각 그들의 페이지 798-800 및 680-681 에 인용되어 있눈 문헌].
약제학적 용도
폴리엔브 백신(또는 그것을 야기시키는 항혈청)의 투여는 "예방적(prophylactic)"이거나 "치료적(therapeutic)" 목적일 수 있으며, 바람직하게는 예방목적으로 사용된다. 에방목적으로 제공되는 경우에, 생 폴리엔브 백신 조성물은 HIV 감염 또는 AIDS 질병의 검출이나 증상에 앞서서 제공된다. 화합물(들)의 예방적 투여는 후속 HIV 감염을 예방하거나 약화시킨다.
치료목적으로 제공되는 경우에는, 폴리엔브 백신을 실질적인 감염 증상의 검출에 따라 투여한다. HIV 감염 이후에 생 폴리엔브 백신을 투여하는 것은 환자의 면역계가 부적합한 합병증 또는 사망의 상당한 위험이 없이 생 폴리엔브 백신의 투여에 대하여 반응할 수 있는 것으로 결정된 경우에만 허용되며, 이 경우에 생 바이러스의 투여는 실제의 HIV 감염을 약화시키는데 필요한 용량으로 제공된다.
또한, 환자의 면역반응이 손상되어 있는 경우에, 치료목적의 투여는 우선적으로 재조합 바이러스가 상술한 바와 같이 약독화되거나 불활성되어 있는 약독화 또는 불활성화 폴리엔브 백신 조성물의 사용을 포함한다[참조예 Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra and Katzung (1992), infra, Dorozynski and Anderson, Science 252: 501-502 (1991)].
조성물은 그의 투여가 수용체 환자에 의해 허용될 수 있는 경우에는 "약제학적으로 허용되는"이라고 말한다. 이러한 제제는 투여되는 양이 생리학적으로 유의적인 경우에 "치료학적으로 또는 예방적으로 유효한 양"으로 투여된다고 한다. 본 발명의 백신 또는 조성물은 그의 존재가 바람직하게는 HIV 에 대한 체액성 또는 세포성 면역반응을 증가시킴으로써 수용체 환자의 생리학에서 검출가능한 변화를 나타내는 경우에 생리학적으로 유의적이다.
"보호(protection)"는 절대적일 필요는 없으며, 즉 HIV 감염이나 AIDS 질병이 완전히 예방되거나 근절될 필요는 없으며, 단지 대조집단에 비해 통계학적으로 유의적인 개선이 있으면 된다. 보호는 질병의 증상의 발현의 중증도 또는 신속도를 완화시키는 것으로 제한될 수 있다.
약제학적 투여
본 발명의 백신은 하나 또는 그 이상의 HIV 균주에 대하여 저항성을 부여할 수 있다. 따라서 본 발명은 적어도 하나의 HIV 균주에 의한 감염을 예방하거나 약화시키는 수단에 관한 것이며, 그 수단을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로, 개체에 대한 백신의 투여가 질병의 증상 또는 상태를 완전히 또는 부분적으로 약화(즉, 억제)시키거나, 질병에 대하여 개체가 완전하거나 부분적인 면역성을 갖도록한다면 백신은 질병을 예방하거나 약화시킨다고 말한다.
본 발명의 적어도 하나의 폴리엔브 백신은 본 명세서에 기술한 바와 같은 약제학적 조성물을 사용하여 의도하는 목적을 성취하는 어떠한 수단으로도 투여될 수 있다.
예를들어, 이러한 조성물은 피하, 정맥내, 피내, 근육내, 복강내, 비내, 경피 또는 구강내 경로와 같은 다양한 비경구적 경로에 의해 투여될 수 있다. 피하투여가 바람직하다. 비경구 투여는 농축괴(bolus) 주사에 의해 또는 시간에 따른 단계적 관류(gradual perfusion)에 의해 이루어질 수도 있다[참조예 Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra, and Katzung (1992), infra].
활성 특이적 세포성 면역요법에 의한 세포성 면역반응에 의해 완화될 수 있는 질병 또는 상태를 예방, 억제 또는 치료하는 대표적인 방법에는 상술한 바와 같은 백신 조성물의 유효량을 1 주일 내지 약 24 개월의 기간에 걸쳐 단일 투여에 의해 투여하거나 증가 또는 추가자극용량으로 반복투여하는 투여방법이 포함된다.
본 발명에 따르면, 백신 조성물의 "유효량"은 목적하는 생물학적 효과, 본 발명의 경우에는 HIV 에 대한 적어도 하나의 세포성 또는 체액성 면역반응을 얻기에 충분한 양이다. 유효용량은 수용체의 연령, 성별, 건강 및 체중, 있다면 병용하는 치료법의 종류, 치료 빈도, 및 목적하는 효과의 성질에 따라 달라진다. 이하에 제공되는 유효용량 범위는 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니며, 바람직한 용량범위를 나타낸 것이다. 그러나, 가장 바람직한 용량은 과도한 실험없이 당해 기술분야의 전문가에게 이해되고 결정될 수 있는 것으로서 개개 환자에게 적합하여야 한다[참조예 Berkow (1987), infra, Goodman (1990), infra, Avery (1987), infra, Ebadi, Pharmacology, Little, Brown and Co., Boston, MA (1985), and Katzung (1992), infra].
일반적으로, 성인에 대한 용량은 투여당, 약 105-109플라그 형성단위(pfu)/㎏ 또는 콜로니 형성단위(CFU)/㎏ 이며, 바람직하게는 106-108이다. 어떠한 용량이 사용되더라도 그 용량은 본 명세서에 기술한 바와 같은 공지의 방법에 의해 결정된 것으로서 안전하며 효과적인 양이어야 한다.
대상
본 발명의 백신의 수용체(recipient)는 HIV 에 대한 세포성 또는 체액성 면역반응을 통하여 특이적인 면역성을 획득할 수 있는 포유동물이면 어느 것이라도 가능하다(여기에서 세포성 반응은 MHC 클래스 I 또는 클래스 II 단백질에 의해 매개된다). 포유동물중에서 바람직한 수용체는 영장류(인간, 침팬지, 꼬리없는 원숭이(ape) 및 원숭이(monkey)를 포함)의 포유동물이다. 가장 바람직한 수용체는 인간이다. 대상 개체는 바람직하게는 HIV 로 감염되거나 HIV 감염의 모델을 제공한다[예를들어 Hu et al., Nature 328: 721-723 (1987)].
지금까지는 본 발명을 일반적으로 기술하였으며, 이러한 본 발명은 설명을 목적으로 제공된 것으로서 본 발명을 제한하는 것은 아닌 이하의 실시예를 참고로 하여 더 용이하게 이해될 수 있을 것이다.
실시예 1
HIV Env 단백질 발현을 위한 백시니아 바이러스 벡터의 제조
명명법: 참고를 목적으로, 재조합 백시니아 바이러스 구조물은 본 명세서에서 달리는 VVenv 구조물이라고 칭하며, 특정한 백시니아 바이러스 구조물은 환자에 따라 또는 기탁기관(예를들어 ATCC 또는 구조물내의 env DNA 의 GenBank 공급원)에 따라 명명된다. 예를들어, VVenv-Doe 는 환자 도우(Doe)로부터 얻은 env 서열을 갖는 백시니아 바이러스 벡터 구조물을 의미하는 것이고, VVenv-U28305 는 젠뱅크(GenBank) 기탁번호 U28305 로 존재하는 env 서열을 갖는 백시니아 바이러스 벡터를 의미한다.
폴리엔브 백신은 각각 독특한 HIV-1 피막 단백질을 발현하는 4-100 개의 상이한 재조합 백시니아 바이러스로 구성된다. 참고를 목적으로 하여, 각각의 개개 바이러스는 VVenv 라고 칭하며, 최종 바이러스 혼합물은 폴리엔브(polyenv)라고 불린다.
개개 VVenv 의 제조에는 플라스미드 pVenv4 및 후술하는 NYCDH 로 명명된 야생형 백시니아 바이러스를 사용한다. 추가의 상세한 것은 문헌을 참고로 한다[Ryan et al., "Preparation and Use of Vaccinia Virus Vectors for HIV Protein Expression and Immunization", in Immunology Methods Manual, Lefkovits, ed., Academic Press (1996)].
벡터 및 숙주세포: 전술한 pSC11 벡터[Chakrabarti, S. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3403-3409 (1985)]가 VV 게놈내로 다수의 HIV 유전자를 재조합시키기 위해 사용될 수 있다. pSC11 플라스미드의 구성요소에는 lacZ 유전자(이것에 의해 형질전환된 박테리아 및 VV 재조합체가 β-갈락토시다제 활성을 갖는 것으로 쉽게 확인될 수 있는 리포터(reporter) 유전자), 티미딘 키나제(TK)를 코드화한 유전자의 일부분, 및 암피실린 저항성 유전자(amp)가 포함된다. pSC11 내에 클로닝된 유전자는 야생형 바이러스의 TK 유전자와 pSC11 내에 함유된 TK 유전자의 부분들 사이에서 동종 재조합에 의해 VV 게놈내에 삽입된다. 바이러스성 TK 부위에 플라스미드 DNA를 삽입시키면 바이러스 유전자가 불활성화되어 재조합 바이러스를 브로모데옥시유리딘(BUdR)내에서의 성장에 의해 TK+바이러스의 배경으로부터 용이하게 선별할 수 있다. 재조합 TK-바이러스가 이 선택단계에서 생존하기 위해서는 이들이 활성 TK 효소를 제공하지 않는 세포, 예를들어 VV 의 성장을 지지하는 골육종 세포주[Rhim, J.S. et al., Int. J. Cancer 15:23-29 (1975)]인 인간 세포주 R970-5 의 TK-결핍성 유도체인 TK-143 세포주내에서 성장하여야 한다[Weir et al., infra (1982)]. HIV 유전자 절편 발현은 pSC11 벡터의 SmaI 부위내로 완전한 유전자를 삽입시킴으로써 얻어질 수 있다. 전길이의 유전자는 P7.5K 프로모터의 조절하에서 발현될 수 있다.
완전한 HIV 유전자의 클로닝에 대한 대체용으로, pSC11 내에 미리 클로닝된 HIV 유전자를 부분 유전자 서열로 치환시킬 수 있다. 예를들어, pVen1 이라고 불리는 구조물은 pSC11 로부터 제조되었으며, BH10 HIV 피막 단백질(env) 유전자를 발현시킨다[Hallenberger et al., infra, (1993); Kilpatrick et al., J. Biol. Chem. 262: 116-121 (1987)]. 구조물은 현장 HIV 분리체로 부터의 가변성 피막 단백질 부분을 치환시키고 발현시키는 모벡터로 사용될 수 있다. 마찬가지로, pVenv4 로 칭하는 벡터는 pSC11 로부터 작제되어 BH10 env 단백질을 발현하며, 올리고머화 영역은 유지시키면서, 트랜스멤브레인 및 세포질 꼬리 영역 코드화 gp41 서열이 배제되도록 절단된다[Hallenberger et al. (1993), infra]. 전문가에 의해 이해될 수 있는 것으로서, 용어 "올리고머화 영역"은 작용적으로, env 단백질의 올리고머화를 가능하게 하는, 즉 올리고머화하기에 충분한 구조가 있는 gp41 의 일부분을 칭하기 위해 사용된다. pVenv4 벡터는 HIV 감염된 세포의 세포 표면에 존재하는 것으로 처리된 gp41/gp120 올리고머(다이머, 트라이머 또는 테트라머)의 구조와 유사한 3 차 구조를 형성하는 것으로 밝혀진 절단된 gp160(또한 gp160t, gp140)을 코드화한다. 이 3 차 구조는 분비되고, 막 결합된 형태 둘다로 유지된다[Hallenberger et al., (1993)]. 이 벡터는 대체용으로 분리된 env 서열의 치환을 위한 모벡터로서 바람직하게 사용된다.
본 실시예에서 각각의 VVenv 구조물의 제조에는 이하에 상세히 기술하는 바와 같이, pVenv4 및 야생형 백시니아 바이러스 NYCDH 및 적절한 숙주세포의 사용이 포함된다.
pVenv4: pVenv4 벡터는 pSC11 백시니아 바이러스 재조합 벡터내에 HIV-1-피막 코드화 서열을 삽입시켜 미리 제조하였다[Hallenberger, et al., Virology 193: 510-514 (1993); Chakrabarti et al., Mol. Cell Biology 5: 3403-3409 (1985)]. HIV-1 서열은 생 바이러스의 실험실 저장물로부터 유도되었다. 서열은 "BH10"으로 명명하였다[Ratner et al., Nature 313: 277-284 (1985)]. PCR 기술에 의해, HIV-1 감염된 환자로부터 얻은 독특한 피막 서열을 증폭시키고 BH10 env 서열내로 치환시켜 새로운 벡터를 생성시킬 수 있다. 예를들어 다음과 같은 프라미어가 PCR을 위해 사용된다.
(A) 센스, 위치 5785 (SEQ ID NO:1):
AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA
(B) 안티센스, 위치 7694 (SEQ ID NO:2):
CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTCCAAAT
(C) KpnI-센스, 위치 5903 (SEQ ID NO:3):
GTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGT
(D) BsmI-안티센스, 위치 7659 (SEQ ID NO:4):
CCAGAGATTTATTACTCCAACTAGCATTCCAAGG
(E) (임의의) DraIII-센스, 위치 6153 (SEQ ID NO:5):
CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG
(F) (임의의) Bsu361-안티센스, 위치 6917 (SEQ ID NO:6):
TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG
이들 프라이머는 5에서 3 방향으로 쓰여져 있다. 제한부위는 밑줄을 그었다(위치 표시는 BH10 서열을 기초로 한 것이다)[Ratner et al., Nature 313: 277-284 (1985)].
PCR 방법: 새로운 HIV-1 env 구조물을 제조하기 위해서 폴리머라제 연쇄반응(PCR)을 사용하여 40 개의 상이한 HIV-1 환자 샘플로 부터의 피막 유전자의 1800 염기쌍(bp)을 증폭시킨다. PCR 프라이머는 잘 보존된 HIV-1 서열을 나타내며, 따라서 많은 다양한 HIV-1 환자 샘플로부터 env 유전자를 성공적으로 증폭시킨다. 증폭된 DNA 는 단백질의 아미노 말단에서 대략 10 개의 잘 보존된 아미노산을 제외하고는 전체 gp120 단백질을 포함한다. PCR 생성물내에는 모든 피막 가변성 부위(V1-V5)가 포함된다. 또한, 증폭된 서열은 gp120/gp41 에 대한 분해부위 이외의 대략 100 개의 아미노산을 코드화한다.
pVenv4에서 BH10 피막 유전자 서열을 인접시키는 KpnI 및 BsmI 에 대한 제한효소 부위를 수반하는 PCR 프라이머를 증폭된 DNA 생성물내에 이입시킨다.
일차 PCR: 500㎕ 미소원심분리관에서 다음의 성분들을 혼합시킨다:
- 1㎕ 프라이머 A(SEQ ID NO:1), 300ng/㎕
- 1㎕ 프라이머 B(SEQ ID NO:2), 300ng/㎕
- 2.5㎕, 각각 10mM 인 4 dNTPs
- 1㎍ DNA
- 10㎕ 10×PCR 완충액; 및
- 99㎕ 까지 HPLC H20
taq 스톡을 소용돌이를 일으키고 PCR반응에 1㎕를 분배하였다. 잘 혼합하였다. 광유로 피복시켰다.
열-순환기(thermal-cycler)상에서는 다음과 같이 수행하였다:
- 95℃에서 3 분 동안 배양하여 DNA를 용융시킨다.
- 40 사이클을 수행한다: 95℃, 1 분; 45℃ 2 분; 72℃, 3.5 분.
2 차 PCR: DNA 없이 프라이머 C 및 D(각각 SEQ ID NOS: 3 및 4)를 사용하여 상기한 바와 같이 PCR 반응을 준비하였다. 최종 용액을 95㎕ 로 만들고, 광유로 피복시켰다. 마개를 한 선단을 이용하여 일차 PCR 반응액 5㎕를 분리하였다(오일층 아래 부분으로부터). 샘플을 오일층 아래의 2 차 반응액과 혼합시키고 전술한 바와 같이 사이클(cycle)을 시작하였다. 일반적으로 30 사이클이 적절하다. 약 1800bp 의 명확한 밴드가 확인될 때 까지 매 10 사이클후마다 2㎕를 분리하여 겔 분석함으로써 생성물을 모니터하는 것이 바람직할 수 있다.
잘 알려져 있는 치환 클로닝 기술을 이용하여 BH10 피막 서열 대신에 40 명의 환자중의 하나로부터 얻은 env 서열을 발현시키는 pVenv4 유도체를 생성시켰다. 간략하게 설명하면, pVenv4 플라스미드와 PCR 생성물을 KpnI 및 BsmI 로 절단하고 절단된 pVenv4를 아가로즈 겔상에서 처리하여 큰 단편을 분리시켰다. BH10 env 의 작은 단편(1800bp 단편)은 버렸다. 절단된 PCR 생성물을 또한 분리시키고, 큰 pVenv4 단편과 결합시켜 환자의 DNA 로 부터의 변이체 env 의 1800bp를 함유하게 된 키메릭(chimeric) 피막 서열을 생성시켰다. PCR 생성물과 pVenv 생성물을 결합시킨 후에, 당해 기술분야에서 잘 알려져 있는 여러 가지 방법중의 어느 것, 예를들면 엘렉트로포레이션을 사용하여 이 결합 혼합물로 박테리아 숙주세포를 형질전환시키고, 재조합 콜로니를 선택하여 서열분석에 의해 검사하였다.
플라스미드 pVenv4 또는 pVenv4 로 만든 재조합체는 야생형 바이러스의 티미딘 키나제(TK) 유전자와 플라스미드내의 TK 서열사이에서의 동종성 재조합에 의해 백시니아 바이러스 게놈내로 유전자가 삽입되는 것을 용이하게 해준다. 바이러스성 TK 부위에 pVenv4 DNA 를 삽입시킴으로써 P7.5K 조기/후기 프로모터의 조절하에서 발현된 HIV-1 피막 유전자를 갖는 백시니아 바이러스를 수득한다. 바이러스는 TK 부위의 파괴로 인하여 성장활성면에서 약독화된다. pVenv4 의 추가의 구성요소는 β-갈락토시다제 활성을 코드화한 lacZ 유전자이다. lacZ 활성은 백시니아 바이러스 재조합체를 선별하기 위해 사용될 수 있다(이하 참조).
pVenv4 에 의해 발현된 피막 유전자를 절단하여 트랜스멤브레인/C-말단 gp41 서열을 제외시킨다. 벡터는 세포내에 존재하며 분비되는 형태인 올리고머 구조로서 발현된다.
백시니아 바이러스-NYCDH: 새롭게 치환된 플라스미드를 각각 개별적으로 야생형 백시니아 바이러스 NYCDH 와 재결합시켰다. 이 바이러스는 ATCC(기탁번호 VR-325)로부터 얻었으며, 사용하기 전에 플라그-정제하였다(Buck, C., and Paulino, M.S., eds., American Type Culture Collection Catalogue of Animal Viruses and Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae, 6th Ed., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1990), p. 138).
박테리아 숙주세포: 플라스미드는 당해 기술분야에서 공지된 바와 같이 적합한 숙주상에서 성장시킬 수 있다[참조예 Ausubel, infra (1995 rev), §§ 16.15- 16.19]. 비제한적인 예로는 DH5α 세포가 있다.
TK-결핍성 세포: 형질전환 및 백시니아 바이러스 치환은 VV 의 성장을 지지하는 골육종 세포주[Rhim et al. (1975), infra]인 인간 세포주 R970-5 의 TK-결핍성 유도체인 TK-143B 세포주상에서 수행한다[Weir et al. (1982), infra ]. 독특한 HIV env 유전자 서열을 함유하는 각각의 백시니아 바이러스 재조합체를 lacZ 유전자의 발현을 기초로 하여 선택하였다(바이러스 플라그를 Bluo-gal 로 피복시키고 청색이 발색되는 것으로 판단되는 β-갈락토시다제 활성에 관하여 선택한다). 2 회의 PCR을 수행할 수 있다.
실시예 2
폴리엔브 백신의 제조
베로(Vero) 세포: 최종 제조단계는 ATCC로부터 새로이 구입하여(기탁번호 CCL81 또는 X38) 바이러스 성장을 위해 클로닝하고 증량된 베로(Vero) 세포상에서 n 개의 VVenv 구조물을 성장시키는 것이다. 베로 세포주는 백신 생성을 위해서 세계보건기구(World Health Organization)에 의해 승인된 것이다[Hay, R., et al., eds., American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, 7th Ed., American Type Culture Collection, Rockville, MD (1992), page 48].
베로 세포를 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium; Bio-Whittaker), 글루타민 보충물(Bio-Whittaker) 및 열-불활성화된 송아지 태자 혈청(Hyclone, Inc.)를 이용하여 성장시킨다. 또한 다른 방법으로는 혈청을 함유하지 않는 배지를 사용할 수도 있다. VVenv 구조물 각각을 베로 세포의 별개의 융합층상에 접종시키고, 세포가 바이러스 감염으로 인해 세포변성 효과(cytopathic effect)를 나타낼 때 수거한다. 세포를 수거한 후, 동결시키기 전에 세포 추출물을 PBS(Bio-Whittaker)로 철저히 세척한다. 그후, 세포를 동결-해빙, 음파파쇄 또는 원심분리기내에서의 저속 원심분리에 의해 파쇄시킨다(임의단계). 그후, 상등액의 분취액을 -70℃에서 저장한다. 피막 단백질은 VV를 약독화시키더라도, 예를들어 prep를 60℃에서 1 시간 동안 가열하더라도, 포유동물 모델에서 HIV 피막 단백질-특이 항체(ELISA 에 의해 검출가능한 것으로)를 유도하기에 충분한 농도로 용해물내에 존재한다.
백신 생성물: 베로 세포로 부터의 각각의 바이러스(VVenv 구조물) 스톡을 개별적으로 동결시키고, 이어서 역가 및 안전성을 시험한다. 시험을 완료한 후에, 각각의 바이러스의 분취량을 혼합하여 총 108pfu/㎖("pfu"는 플라그-형성 단위를 나타낸다)의 스톡 백신을 수득한다. 40 개의 VVenv 구조물이 사용되는 경우에, 각각의 VVenv 는 바람직하게는 동량으로 존재하며, 각각의 VVenv 는 백신 생성물내에서 2.5×106pfu/㎖ 의 역가로 사용된다. 이렇게 하여 총 1×108pfu를 수득한다.
폴리엔브 백신의 평가
마우스: 마우스는 0.1×107pfu 의 env-발현 VV를 복강내 주사하여 감염시킬 수 있다. VV 주사한지 3 주후에, 상술한 바와 같이 HIV ELISA 또는 중화 시험방법에 의해 항체를 확인할 수 있다.
인간에게 사용하기 위한 폴리엔브 백신을 제조하기 전에, 백신을 마우스에서 시험하기 위한 목적으로 유사한 그룹의 바이러스들을 준비하였다. 이들 바이러스를 복강내 또는 피하 경로에 의해 마우스에게 투여하였다. 그후, 효소결합 면역흡착시험(ELISA)에 의해 혈청중의 HIV-1-특이 항체의 활성을 시험하였다. 시험방법은 파괴된 전체 HIV-1(HTLVIIIB)를 ELISA 플레이트상에 도말하고 플레이트를 소 혈청알부민으로 블로킹시키는 것을 포함한다. 그후, 혈청 샘플을 인산염-완충 식염수중의 1:100, 1:1,000 및 1:10,000 의 희석액으로 가하였다. 반응액을 알칼리성 포스파타제-컨쥬케이트된 고우트(goat)-안티-마우스 면역글로불린 항체 및 p-니트로페닐포스페이트로 발색시켰다. 발색반응을 수산화나트륨 용액으로 중지시키고, 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기상에서 405㎚에서 판독하였다.
도 2에서 보는 바와 같이, 106-107pfu 백시니아 바이러스의 세포 용해물 제제(단일의 HIV-1/피막 단백질 코드화 서열 및 막 결합된 발현 피막 단백질을 함유)로 1 회 접종함으로써 6 개월의 실험기간에 걸쳐 유지되는 HIV-1 에 대한 강력한 항체반응이 유도되었다. 이러한 항체반응은 이전에 다른 면역화방법에서 보고된 것보다 현저하게 더 높은 것이다. 이러한 높은 항체반응은 백신 제제내의 막 결합된 피막 단백질의 존재에 기인할 수 있다. 도 3에서 보는 바와 같이, 이들 반응은 용량 의존적이다. 107pfu 의 용량을 투여한 포유동물에서 보다 106pfu 의 용량을 투여한 포유동물에서 더 낮은 반응이 나타났다.
상이한 HIV-1 피막 단백질을 발현하는 백시니아 바이러스의 혼합물도 또한 제조되었다. 마우스에게 5 가지 바이러스의 혼합물 107pfu를 투여하면, 그들의 반응은 단일 백시니아 바이러스 재조합체 107pfu 에 대하여 나타난 반응과 거의 동일한 크기였다(도 4). 다수의 여러가지 env-발현 백시니아 바이러스의 혼합은 보고되어 있지 않으며, 광범한 스펙트럼의 중화항체를 제공할 것으로 기대된다.
인간: 임상실험을 하기 전에 혼합 바이러스 스톡에 대한 시험을 수행하였는데, 그 첫 번째는 용량 증가 및 안전성 시험을 목적으로 하는 것이다.
임상실험은 4 개의 지원자 그룹의 조합을 포함하는 용량 증가 시험이다. 각각의 그룹에는 다음의 백신 용량중의 하나를 투여하였다:
(1) 2×104pfu
(2) 2×105pfu
(3) 2×106pfu
(4) 2×107pfu
각각의 지원자에게는 식염수 0.5㎖ 중의 혼합 바이러스 백신을 피하주사에 의해 투여하였다.
실시예 3
침팬지에서 멀티-피막 백시니아 바이러스-기본 HIV-1 백신에 의한 일차 분리체 중화면역성의 유도
HIV-1 분리체의 집단은 피막 단백질의 불순화된 배열을 가지고 있다. env 단백질이 유일하게 바이러스적으로 코드화된 외부 단백질 및 중화항체 활성의 표적이지만, 하나의 분리체에 대해 유도된 항체는 다른 것을 반드시 중화시키지는 않을 것이다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 다수의 Env 단백질을 발현하는 HIV-1 백신 칵테일, 폴리엔브(PolyEnv)를 제조하였다. 백신 제조는 각각 별개의 Env 단백질을 발현하는 30 개의 별개의 VV-재조합체의 제조로부터 시작하였다. 그후, VVenv를 침팬지 모델에서 개별적으로 및 조합하여(PolyEnv) 시험하였다. 단일 VVenv(침팬지 1 및 2) 또는 폴리엔브(침팬지 3 및 4)을 3 회 피하주사하고, 이어서 알룸(alum)내의 재조합체 gp120/gp41 단백질을 근육내 1 회 주사하여 4 마리의 침팬지를 면역시켰다. 4 마리의 동물 모두에서 안전성이 입증되었으며, 이들중 단지 2 마리의 동물이 주사부위에 궤양의 징후를 나타내었다. 혈청 샘플은 HIV-결합 및 중화에 대한 여러 가지 시험방법으로 모니터하였다. 침팬지 3 및 4 의 항체는 최고의 질의 항체활성을 나타내었다. 중화기능은 실험실 분리체 및 HIV-1 의 일차 분리체 모두에 대해 입증되었으며, 이들중 어떤 것도 백신에서 특이적으로 나타나지는 않았다. 따라서, 혼합 env 단백질에 의한 림프구의 초회자극은 다양한 HIV-1 에 대해서 높은 품질의 항체를 야기시킬 수 있는 유망한 방법을 제공한다.
재료 및 방법
VV 재조합 벡터인 pVenv4: BH10-env 서열에 중지코돈(stop codon)을 도입시키고, pSC11 에 변형된 BH10 피막 유전자(env)를 삽입시킴으로써 pVenv4를 미리 제조하였다. pVenv4 는 아미노산 640에서 절단된 Env 단백질 생성물을 발현시켰으며, 분비 및 올리고머화 둘다가 가능하였다. 이러한 절단된 BH10 Env 단백질을 발현하는 재조합 VV 인 Vvenv4 의 제조방법은 이미 문헌에 기재되어 있다[Hallenberger et al., Virology 193: 510-514 (1993)].
HIV-1 감염된 개체로 부터의 env 서열을 증폭시키기 위한 PCR: PCR을 사용하여 HIV env 서열을 증폭시켰다. 일반적으로, 샘플은 HIV-1 감염된 개체로부터 HIV 에 대한 첫 번째 진단시에 채취된 혈액으로부터 유도되었다. 또 다른 샘플은 AIDS 의 임상적 증상을 가지고 있는 개체로부터, 또는 AIDS 리서치 앤드 레퍼런스 리에전트 레포지토리(AIDS research and reference reagent repository)에 의해 제공된 생성물로부터 유도되었다. 혈액 샘플에 대해서는 우선, 혈액 또는 감염된 세포를 SDS-기본 세포 용해 완충액에 적가하고 65℃에서 30 분 동안 배양함으로써 DNA를 제조하였다. 프로나제를 0.5㎎/㎖ 의 농도로 가하고, 용해물을 45℃에서 밤새 더 배양하였다. 2 개의 페놀 추출물을 에탄올 침전시킨 다음, DNA를 물에 재현탁시켰다.
모든 DNA 샘플을 사용하여 표준방법에 의해 2 회의 PCR을 수행하였다. 프라이머 서열은 공개된 BH10 서열을 기초로 하여 선택되었다[Ratner et al., Nature 313: 277-284 (1985)]. 모든 가변성 부위 및 gp41 의 일부분으로부터의 서열을 포함하는 단편을 수득하기 위하여, 실시예 1에 기술된 바와 같은 PCR 프라이머를 사용하였다. 이어서, PCR 생성물을 표준방법을 사용하여 pVenv4 벡터내에 치환시킴으로써 클로닝시켰다. 신규의 플라스미드의 서열 분석은 생거(Sanger) 방법 및 프라이머 CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG(SEQ ID NO:5)를 사용하여 수행하였다.
VVenv 의 제조: 신규의 VV 재조합체(VVenv)는 VV(NYCDH, ATCC)-감염된 세포를 새로이 치환된 재조합 플라스미드로 형질감염시킴으로써 제조하였다(상기 참조). 제조자의 추천에 따라, 트랜스펙탐(Transfectam: Promega) 및 리포펙타민(Lipofectamine: Gibco, BRL)을 사용하여 형질감염을 촉진시킨 다음, VV를 플라그 정제하였다.
면역화: VVenv-감염된 세포 용해물을 피하주사에 의해 침팬지에게 투여하였다. VVenv 는 단독으로 또는 조합하여 사용하였다. pfu 로 나타낸 VV 의 총량은 동물당 매회의 주사(약 107pfu)마다 유사하였다. 접종물당 gp120(Cat #12101, Intracel, Cambridge, MA) 약 40㎍ , gp41(Cat#036001, Intracel) 20㎍ 및 알룸(Rehsorptar Aluminum hydroxide Adsorptive Gel, Intergen Co., Purchase, N.Y.) 500㎍ 의 혼합물을 근육내 주사하였다.
ELISAs: 다음과 같이 5 회의 ELISAs를 수행하였다. ELISA#1 은 애보트사(Abbott Laboratories)로부터 애보트 클리니칼 ELISA(Abbott clincal ELISA)을 구입하여 제조자의 지침(HIVAB HIV-1/HIV-2(γDNA) EIA, Abbott Laboratories, Abbott Park, I.L.)에 따라 수행하였다. ELISA#2 에서는 재조합체 Mn-gp160 (Quality Biological, Inc. Gaithersburg, MD)을 1㎍/㎖ 의 농도로 도말하여 ELISA를 수행하였다. 플레이트를 블로킹시키고, 혈청의 3 배 계열 희석액을 사용하여 시험을 수행하였다. 그후, 플레이트를 세척하고, 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이트된 안티-인간 IgG를 사용하여 판정하였다. ELISA#3 에서는 ELISA 플레이트를 LAI-gp120(CHO-유도된 단백질, Intracel) 1㎍/㎖ 로 피복시켰다. 혈청 샘플을 1:100 희석한 후에 도말하고 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이트된 안티-인간 IgG1(마우스 안티-인간 IgG1-AP, cat#9050-04, Southern Biological Associates, Inc., Birmingham, A.L.) 및 p-니트로페닐포스페이트를 사용하여 판정하였다. O.D. 판독은 405㎚에서 수행하였다. ELISA#4 의 경우는 플레이트를 IIIB-gp120(바큘로바이러스-유도된 단백질, Intracel, cat#12001, Cambridge, MA) 1㎍/㎖ 로 피복시키는 것을 제외하고는 시험 #3 에서와 같이 ELISA를 수행하였다. ELISA#5 에서는 플레이트를 IIIB 바이러스 용해물(Organon Teknika Co., Durham, N.Y.) 1㎍/㎖ 로 피복시키는 것을 제외하고는 시험 #3 에서와 같이 ELISA를 수행하였다.
중화시험: 중화시험은 실험실 분리체 또는 일차 분리체를 사용하여 수행하였다[Montefiori et al., J. Clin. Microbiol. 26: 231-237 (1988); Montefiori et al., Journal of Infectious diseases 173: 60-67 (1996)]. 실험실 분리체: 바이러스를 각각의 혈청 샘플의 1:20 희석액과 혼합시켜 MT-2 또는 CEM-x174 세포상에 도말하였다. 중성 적색 염색을 사용하여 세포의 생존도를 평가하였다. 대조배양물과 비교하여 세포 사망이 35-40% 감소된 것을 양성 편향(positive deflection)으로 정의하였다. 일차 분리체: 바이러스를 각각의 혈청 샘플의 1:4 희석액과 혼합시켜 PHA-촉진된 PBMC 상에 도말하였다. 시험은 p24 에 대해 판정하였다. 대조배양물과 비교하여 감염성이 적어도 75% 감소된 것을 양성 스코어로 하였다.
결과
신규의 VVenv 재조합체 백시니아 바이러스의 제조: 각각 독특한 HIV-1 Env 단백질을 발현시키는 새로운 VV 재조합체(VVenv)를 제조하기 위하여, 우선 HIV-1 샘플로부터 DNA를 분리하였다. 대부분의 DNAs 는 외적으로 질병의 증상이 나타나지 않으며, 애초에 HIV-1 감염일 것으로 진단된 개체의 혈액으로부터 얻었다. 추가의 DNAs 는 AIDS 환자 또는 AIDS 리서치 앤드 레퍼런스 리에전트 레포지토리(AIDS Research and Reference Reagent Repository)에 의해 제공된 바이러스로부터 얻었다. PCR 은 KpnI 및 BsmI 제한부위를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 수행하였다. 그후, 단편들을 도 5 에 도시된 pVenv4 벡터(pVenv4 는 원래 절단된 HIV-1 단백질, BH10을 발현시켰다)내의 KpnI 및 BsmI 제한부위에서 치환시켰다. 이 방법으로 BH10 으로 부터의 gp120(V1-V5) 및 gp41 서열을 PCR 생성물내의 개개 서열로 대체시켰다. 각각의 치환된 플라스미드를 사용하여 새로운 VV 재조합체 바이러스(VVenv)를 제조하였다.
이 방법은 매우 다양한 Env 서열을 독특한 VV 재조합체(VVenv)내에 이입시킬 수 있는 간단한 수단을 제공하였다. 흥미롭게도, 대부분의 서열이 생산적이었으며, 이는 프로바이러스성 게놈(이것으로부터 대부분의 PCR 생성물이 유도된다)내의 Env 서열이 거의 결함이 없음을 시사하는 것이다. 백신 혼합물에서 사용되는 VVenv 중에는 매우 큰 다양성이 존재한다.
단일 또는 혼합 VVenv 에 의한 침팬지의 면역화: 단일 및 혼합 VV-재조합체 백신을 시험하기 위해 4 마리의 침팬지가 사용되었다. 면역화 스케줄은 표 2 에 나타내었다. 첫 번째 3 회의 주사는 VV를 함유하였지만, 마지막 주사시에는 gp120, gp41 및 알룸의 배합물을 근육내로 투여하였다. 침팬지 1 및 2 에게는 첫 번째 3 회의 주사의 각각에서 단지 하나의 백시니아 바이러스와 개개 피막 단백질을 투여하였다. 침팬지 3 및 4 에게는 10 개의 재조합체 VV(및 첫 번째 주사시에는 개개의 Env), 두 번재 주사시에 10 개의 추가의 Env 및 마지막 면역화시에는 10 개의 추가의 독특한 Env의 혼합물을 투여하여 단백질 추가자극시키기 전에 총 30 개의 별개의 벡터를 수득하였다. 모든 침팬지에게 플라그 형성 단위로 유사한 양의 총 백시니아 바이러스 및 유사한 양의 총 재조합체 단백질을 투여하였다.
| 일자 | 주사 | |
| 침팬지 1 및 2 | 1/9/96 | VV (Env #1) |
| 4/16/96 | VV (Env #1) | |
| 6/11/96 | VV (Env #1) | |
| 7/30/96 | 재조합체 gp120 및재조합체 gp41 + 알룸 | |
| 침팬지 3 및 4 | 1/9/96 | VV (Env #1-10) |
| 4/16/96 | VV (Env #11-20) | |
| 6/11/96 | VV (Env #21-30) | |
| 7/30/96 | 재조합체 gp120 및재조합체 gp41 + 알룸 |
재조합체 VVenv 는 병소의 출현없이 투여될 수 있다: 모두 4 마리의 침팬지를 질병의 전신적 증상 및 부사부위에서의 병소 형성에 대하여 모니터하였다.
동물들은 매일 설사, 콧물, 기침, 재채기, 빠른 호흡, 기면상태(lethargy), 제한된 운동 및 식욕상실에 대하여 분석하였다. 어느 동물, 어느 시점에서도 이들중의 어떠한 증상도 뚜렷하게 나타나지 않았다. 일차 VV 면역화후에 일정한 간격을 두고 찍은 주사부위의 사진은 4 마리 동물 모두에서 팽윤 현상을 나타냈다. 스몰폭스(smallpox) 예방접종의 전형이 되는 침팬지 1 및 3 은 주사부위에서 경미한 병소를 나타내었으며, 이와 반면에 침팬지 2 및 4 에서는 병소가 나타나지 않았다. 2 차, 3 차 또는 4 차 주사시에, 어떤 동물에서도 질병 증상, 팽윤 또는 병소는 나타나지 않았으며, 이는 VV-특이적 면역성이 일차 접종에 의해 유도되었음을 입증하는 것이다.
VVenv를 주사한 후, 단백질 추가자극에 의해 면역화시키면 ELISA-양성 항체가 수득되었다: HIV-특이 항체를 5 회의 상이한 ELISAs 에 의한 면역화 과정중에 모니터하였다. ELISAs를 이용하여 각 동물에서 항체의 절대적 양보다는 상대적 질을 측정하였다. 대부분의 경우에, 시험은 천연 Env 의 전형인 3 차원적 올리고머 구조를 갖지 않는 바이러스 단편을 사용하였다. 이들 경우에, ELISAs 는 HIV-특이 항체의 하나의 서브셋트(subset)만을 결합시킬 것으로 예상된다. 애보트(Abbott) ELISA를 사용하여 수득한 결과는 도 6 에 나타내었다. 침팬지 3 은 일차 VV 면역화이후에 양성 한계점을 초과하였으며, 그 반면에 침팬지 4 는 2 차 VVenv 면역화이후에 한계점을 초과하였다. 면역화 과정의 마지막에 침팬지 3 및 4 의 반응은 침팬지 1 및 2 의 반응을 훨씬 초과하였다. MN gp160을 사용한 ELISA#2 에서는 침팬지 3 이 유일한 높은 응답자였다. 이 반응은 단백질 추가자극 전에 나타났으며, 추가자극 주사에 의해 교란되지 않았다. 정제된 단백질 추가자극을 위해 사용된 것과 동일한 항원을 사용한 ELISA(ELISA#3) 플레이트에 결합된 CHO-LAI 에 대한 반응은 침팬지 3 만이 강력하게 반응하는 것으로 나타났다. IIIB-gp120 결합된 플레이트를 사용하는 ELISA#4 에서는 침팬지 2 가 높은 백그라운드(background)를 나타내었으며, 아마도 이 높은 백그라운드에 기인하는 것으로 보이는 모든 동물중의 최대 반응값을 나타내었다. 오르가논 테크니카(Organon Technika) IIIB 바이러스 용해물을 사용하는 5 회째 ELISA 에 대한 반응은 4 마리 동물 모두로부터 얻은 혈청에 대하여 양성이었다.
일차 및 실험실 분리체에 대한 중화반응: 각 동물로부터 얻은 혈청을 사용하여 실험실 및 일차 분리체에 대한 중화시험을 수행하였다. 일차 시험은 T-세포주상에서 수행하였으며, 후자의 시험은 혈청반응음성 PHA-자극된 PBMC 상에서 수행하였다. 모든 경우에, 분리체들은 HIV-1 백신에서 나타난 것에 필적하지 못하였다.
표 3에서 입증되는 바와 같이, 쳄팬지 2, 침팬지 3 및 침팬지 4 로 부터의 샘플은 T 세포내의 MN 실험실 분리체에 대하여 양성 편향(바이러스 성장에 있어서 35-40% 억제)을 나타내었다. 두가지의 다른 실험실 바이러스(하나는 IIIB[Lockey et al., Aids Res Hum Retroviruses 12: 1297-1299 (1996)]이고, 다른 하나는 SF2 스톡이다)를 사용한 시험에서는 어떠한 샘플도 양성으로 판정되지 않았다. PHA-자극된 PBMC 상에서 시험한 4 가지의 일차 분리체에 대한 중화시험[Montefiori et al., 1988, supra; Montefiori et al., 1996, supra]의 결과를 나타내었다. 환자 혈청이 1:2 희석액을 사용하는 경우에도 때때로 음성 결과를 나타내기 때문에, 이들 시험에서 바이러스는 중화시키기 어려운 것으로 보인다[Fenyo et al., AIDS 10: S97-S106 (1996); Moore and Ho, AIDS 9: S117-S136 (1995); Montefiori et al., 1996, supra]. 흥미롭게도, 침팬지 4 의 혈청의 1:4 희석액은 시험 일차 분리체중의 하나를 중화시킬 수 있었다. 대부분의 이전의 경우에 Env-면역화된 개체로 부터의 혈청은 일차 분리체 중화시험에서 음성 결과를 나타내었었기 때문에[Steele, Jornal of NIH research 6: 40-42 (1994); Moore, Nature 376: 115 (1995)], 이러한 상황은 Env 백신을 사용한 다른 실험들과는 상이하였다.
| 분리체 | 침팬지 1 | 침팬지 2 | 침팬지 3 | 침팬지 4 |
| 실험실 균주 MN | - | 양성 편향 | 양성 편향 | 양성 편향 |
| 일차 #1 | - | - | - | - |
| 일차 #2 | - | - | - | - |
| 일차 #3 | - | - | - | 양성 |
| 일차 #4 | - | - | - | - |
혼합 VVenv 는 단일 VVenv 보다 더 고품질의 HIV-1 특이 항체를 유도한다: ELISA 및 중화시험의 결과는 표 4 에 요약하여 나타내었으며, 여기에서는 상술한 7 가지 시험에서 더 높은 반응을 나타낸 것이 어떠한 침팬지의 혈청인지를 기재하였다. 표로부터 알 수 있는 바와 같이, 침팬지 3 및 4 는 7 개의 시험중의 5 가지의 조성물에서 양성으로 판정되었으며, 이 반면에 침팬지 1 및 2 는 7 중의 단지 3 개에서 양성으로 판정되었다. 이 결과는 단일 Env 백신에 비해 폴리 Env 에 의해 유도된 항체가 더 고품질인 것을 반영하는 것이다.
| 시 험 | 단일 VV를 투여한 침팬지중에서 더 큰 반응 | 혼합 VV를 투여한 침팬지중에서 더 큰 반응 |
| Abbott (IIIB-gp41)-ELISA#1 | 침팬지 3 및 침팬지 4 | |
| MNgp160BAC ELISA#2 | 침팬지 3 | |
| IIIB-gp120-BAC-ELISA#3 | 침팬지 2 | |
| LAI-gp120-CHO-ELISA#4 | 침팬지 3 | |
| IIIb 바이러스 용해물 ELISA#5 | 침팬지 1 및 침팬지 2 | 침팬지 3 및 침팬지 4 |
| 실험실 분리체-중화(편향) | 침팬지 2 | 침팬지 3 및 침팬지 4 |
| 일차 분리체-중화 | 침팬지 4 |
고찰
본 실시예에 기술된 실험은 백시니아 바이러스-기본 HIV-1 백신의 안전성을 시험하고, 피막 칵테일 및 단일 피막 백신에 의한 초회자극(priming)의 효능을 비교하기 위해 고안된 것이다. 그 결과는 우선, 백시니아 바이러스는 개방 병소(open lesion)를 유도하지 않으면서 면역원(immunogen)으로 작용할 수 있으며, 두 번째로 피막 칵테일에 의해 폭넓은 HIV-1-특이 활성이 유도될 수 있다는 것을 입증하였다.
침팬지 모델을 사용하여 영장류에서 폴리엔브(PolyEnv) 의 안전성을 시험하였다. VV 접종이 면역화되지 않은 개체에 대한 생 바이러스의 전이의 위험을 초래할 수 있었었기 때문에 본 발명자들은 특히 개방병소 형성의 정도를 결정하는데 관심을 가지고 있었다. HIV 의 경우에 이것은 AIDS 환자가 VV 감염을 차단시킬 수 없다는 점에서 중요한 관심사이다. 이 관심사를 다루기 위하여 본 발명자들은 침팬지에서 피하 예방접종의 사용이 개방 병소를 피할 수 있는지 여부를 물어보는 시험을 수행하였다. 실제로, 4 마리의 침팬지중에서 단지 2 마리만이 개방병소를 나타내었다. 유사한 결과가 스몰폭스 백신의 임상실험에서 NYCDH 백시니아 바이러스 스톡의 피하접종을 사용한 경우에 관찰되었다[Conner et al., Journal of Infectious diseases 135: 167-175 (1977); Benenson et al., Journal of Infectious diseases 135: 135-144 (1977)].
주사과정과 주사부위의 추적 검사에 대한 추가의 관심에 의해 개방병소는 모든 경우에 피할 수 있는 것으로 보인다. 이들 결과는 안전성 문제가 HIV-1 백신 벡터로서 백시니아 바이러스의 사용을 방해하지는 않음을 입증하는 것이다.
피막 칵테일은 마우스(실시예 2) 및 토끼 실험에서 시험하였다. 마우스 실험에서는 VVenv 의 1 회 주사후에 안티-HIV 항체를 모니터한 반면에, 토끼 실험에서는 VVenv를 DNA-기본으로 하여 야기된 반응을 추가자극시키는데 사용하였다. 이 실험들은 HIV-1 특이 항체가 VVenv 에 의해 유도되거나 추가자극될 수 있었으며, 일차 분리체는 항체반응에 의해 중화될 수 있었음을 시사하였다. 혼합 VVenv(PolyEnv)의 가능성을 검사하기 위하여 침팬지를 2 그룹으로 나누었다. 첫 번째 2 마리의 침팬지에게는 하나의 VVenv 만을 투여하는 반면에 침팬지 3 및 4 에게는 총 30 개의 상이한 VVenv 로 구성된 칵테일을 투여하였다.
백시니아 바이러스로 면역화시킨 후에, 4 마리의 침팬지 모두에게 알룸중의 단일 gp120/gp41 단밸질 혼합물을 갖는 추가자극제(booster)를 투여하였다. 4 마리의 침팬지 각각으로부터 얻은 혈청을 5 회의 상이한 ELISAs 로 시험하였는데, 매회 상이한 단편 및/또는 Env 배향을 이용하였다. 흥미롭게도, 한의 조합(composite)우로서의 침팬지 1 및 2 는 이들 ELISAs 중의 단지 한예에서 강력하게 반응하였으며, 그 반면에 하나의 조합으로서 침팬지 3 및 4 로 부터의 혈청은 4 회의 이러한 시험에서 강력하게 반응하였다. 각 시험은 각 동물에서 HIV-1 특이 항체의 분핵만을 측정하였기 때문에, 시험결과는 혼합 백신에 의해 유도된 탁월한 항체 결합활성을 반영한 것으로 보인다.
중화시험은 또한 실험실 및 일차 분리체 둘다에 대해 수행하였다. 흥미롭게도, 일차 분리체가 백신 혼합물내에서 특이적으로 나타나지는 않았지만, 일차 분리체에 대한 양성 반응은 침팬지 4에서 관찰되었다. 이들 결과는 역시 폴리엔브(PolyEnv) 백신 칵테일에 의해 유도된 더 폭 넓은 항체를 입증하는 것이다. 백신의 항원 복합성에 있어서의 증가로 인해 림프구 및 개개 항체반응의 증가된 다양성을이 제공되는 것으로 기대된다.
중화항체가 백신내에 존재하지 않는 일차 분리체에 대해 유도될 수 있다는 입증은 선형으로 구별되는 단백질들이 배향구조를 공유함을 입증하는 것이다. 이러한 개념은 HIV-1-감염된 환자의 면역반응에 의해 또한 입증되는데, 여기에서 상호 배타적인 무수한 바이러스들에 노출된 2 명의 개체는 일반적으로 교차-노출(cross-exposure)이 나타나는 중복감염(superinfection)으로부터 보호된다. 폴리엔브(PolyEnv) 의 사용은 HIV-1 환자에서의 상황을 모사하기 위하여 침팬지 시스템에서 일차적으로 시도되었다. 즉, 중화항체는 단일이 아닌 대규모 배열된 Env 단백질에 의해 유도된다.
요약하면, 본 발명자들은 폴리엔브(PolyEnv) 라고 불리는 VV-기본 HIV-1 백신 칵테일을 침팬지 모델에서 시험하였다. 이 실험에서는 다음이 입증되었다:
1) VV 는 개방 피부병변을 유도함이 없이 백신으로서 사용할 수 있었다;
2) 이 백신에 의해 폭 넓은 HIV-1 특이 항체활성이 유도될 수 있었다; 및
3) Env 구조물의 칵테일(PolyEnv)로 단일 Env 구조물에 비해 월등한 품질의 HIV 특이 항체를 수득하였다.
백시니아 바이러스는 야생형 및 재조합형 모두가 강력한 백신인 것으로 오랫동안 알려져 왔다. VV 의 강도는 면역반응의 B- 및 세포독성 T-림프구 구획 둘다를 보충하는 그의 힘에 달려 있다. VV 는 인간 집단으로부터 질병(스몰폭스)을 근절시킬 수 있는 유일한 백신을 포함하고 있다. 본 실시예에서의 데이터는 재조합 VV 벡터가 HIV-1 의 장래의 조절에 기여할 것임을 시사한다.
실시예 4
이작용성 플라스미드의 제조
DNA 백신은 여러개의 서로 다른 시스템(인플루엔자, HIV-1 등)에서 강력한 항체 및 CTL 반응을 야기시키는 것으로 나타났다. DNA-기본 인플루엔자 및 HIV-1 백신은 이미 건강한 성인 지원자를 이용하여 임상실험중에 있다. 백시니아 바이러스는 또한 예방접종 프로그램을 위한 강력한 기본물질로 작용한다. 실제로, 백시니아 바이러스는 인간 집단으로부터 질병(스몰폭스)을 근절시킬 수 있는 유일한 백신으로 되어 왔다. 여러 가지 재조합 백시니아 바이러스가 동물실험에서 입증되는 바와 같이 보호성 면역반응을 야기시켰다. 상기에서 제시된 데이터는 폴리엔브(PolyEnv) 백신 및 예방접종 방법의 조합, 예를들면 DNA 백신과 바이러스성 백신의 조합의 유효성을 입증하는 것이다.
DNA백신 및 VV 재조합 벡터 둘다로서 작용하는 이작용성 플라스미드가 작제되었다. 도 7 은 포유동물 세포에서의 발현을 위한 CMV 프로모터 및 재조합 백시니아의 제조를 위한 백시니아 조기 및 후기 프로모터를 포함하는 이 플라스미드의 지도를 나타낸 것이다. 정제된 플라스미드 DNA의 직접 주사를 이용하여 시험 대상에서 HIV env 단백질에 대한 면역반응을 야기시켰다. 이 플라스미드는 또한 HIV env 단백질 면역화 비히클로서 생 재조합 백시니아 바이러스를 제조하고 시험하기위해 사용된다.
개체는 DNA 예방접종(들)과 재조합 백시니아 바이러스 면역화(들) 둘다를 어떠한 순서로든 일회 또는 수회 주사하고/하거나 추가의 백신 비히클을 함께 이용하는 다단계 방식에 의해 잠재적으로 예방접종될 수 있었다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 특정의 구체예에 의한 범주로 제한되는 것은 아니다. 실제로, 본 명세서에 기술된 것이외에 본 발명을 다양하게 변형시킬 수 있음은 전술한 설명이나 첨부된 도면으로부터 당해 기술분야의 전문가에게는 명백할 것이다. 이러한 변형도 특허청구범위의 범주내에 포함되는 것이다. 또한, 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 주어진 염기 크기 또는 아미노산 크기 및 분자량 또는 분자 매스(molecular mass) 값은 모두 대략적인 것이며 설명을 위해 제시된 것임을 이해하여야 한다.
본 명세서에는 다양한 문헌이 인용되어 있으며, 그의 기술내용은 그의 전부를 참고로 이용하였다.
문헌 리스트
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서열목록
(1) 일반적 정보
(ⅰ) 출원인: 세인트 쥬드 칠드런즈 리서치 허스피탈
미합중국 테네시 38101-0318 멤피스
피오박스 318 노스 라우더데일332
출원인/발명자: 쥴리아 엘. 후르비쯔
크리스토퍼 콜레클로우
랜달 제이. 오웬스
카렌 슬로버드
(ⅱ) 발명의 명칭: 인간 면역결핍 바이러스에 대한 혼합 피막 단백질 백신용 바이러스성 벡터의 제조 및 용도
(ⅲ) 서열의 수: 7
(ⅳ) 연락처 주소
(A) 수신자: 클라우버 앤드 잭슨(KLAUBER & JACKSON)
(B) 거리: 하켄색 애비뉴 411
(C) 도시: 하켄색
(D) 주: 뉴저지
(E) 국가: 미합중국
(F) 우편번호:07601
(ⅴ) 컴퓨터 판독 형태
(A) 매체 형태: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 구동시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 #1.30
(ⅵ) 현재의 출원 데이터
(A) 출원번호: 지정될 것임
(B) 출원일: 이것과 함께 제출
(C) 분류:
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(A) 성명: 폴 에프. 휄너
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CCACTCCATC CAGGTCATGT TATTCCAAAT
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Claims (24)
- 각각 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 피막 단백질의 상이한 피막 단백질 변이체를 코드화한 env 변이체(EV) 뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 4 개 내지 약 10,000 개의 상이한 재조합 바이러스를 함유하며, 여기에서 a) EV 뉴클레오타이드는 피막 단백질 변이체의 가변성 및 불변성 부위 둘다를 코드화하며, b)폴리엔브 백신은 포유동물에서 HIV 균주에 대한 세포성 및 체액성 면역반응중의 적어도 하나를 야기시킬 수 있는 폴리엔브(polyenv) 백신.
- 제 1 항에 있어서,HIV 의 상이한 env 변이체를 포함하는 약 10 내지 약 100 개의 재조합 바이러스를 함유하는 폴리엔브 백신.
- 제 1 항에 있어서,재조합 바이러스가 백시니아, 카나리 폭스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV)로 구성된 그룹중에서 선택되는 폴리엔브 백신.
- 제 1 항에 있어서,피막 단백질 변이체가 env 단백질의 올리고머화를 가능하게 하기에 충분한 gp120 및 gp41 의 일부분을 함유하는 폴리엔브 백신.
- 제 4 항에 있어서,EV 뉴클레오타이드가 HIV 피막 단백질 코드화 뉴클레오타이드의 KpnI-BsmI 제한단편을 함유하는 폴리엔브 백신.
- 제 1 항에 있어서,EV 뉴클레오타이드가 지리적으로 제한된 지역으로 부터의 HIV 바이러스로 감염된 환자로부터 또는 상이한 클래드로 부터의 HIV 바이러스에 의해 감염된 환자로부터 분리되는 폴리엔브 백신.
- 제 9 항에 있어서,백신이 재조합 바이러스에 의해 발현된 피막 단백질 변이체를 함유하는 폴리엔브 백신.
- 제 1 항에 있어서,약제학적으로 허용되는 담체, 아쥬번트 및 항바이러스성 화학요법제 화합물중의 적어도 하나를 추가로 함유하는 폴리엔브 백신.
- 적어도 4 개 내지 약 10,000 개의 상이한 재조합 바이러스를 혼합물로 배합시켜 폴리엔브 백신을 수득하고, 여기에서 i) 각각의 재조합 바이러스는 HIV 피막 단백질의 상이한 피막 단백질 변이체를 코드화한 env 변이체(EV) 뉴클레오타이드를 포함하며, ii) EV 뉴클레오타이드는 피막 단백질 변이체의 가변성 및 불변성 부위 둘다를 코드화하고, iii) 폴리엔브 백신은 포유동물에서 HIV 균주에 대한 세포성 및 체액성 면역반응중의 적어도 하나를 야기시킬 수 있음을 특징으로 하여 폴리엔브 백신을 제조하는 방법.
- 제 9 항에 있어서,HIV 의 상이한 env 변이체를 함유하는 약 10 내지 약 100 개의 재조합 바이러스를 배합시키는 방법.
- 제 9 항에 있어서,재조합 바이러스가 백시니아, 카나리 폭스 바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV)로 구성된 그룹중에서 선택되는 방법.
- 제 9 항에 있어서,피막 단백질 변이체가 env 단백질의 올리고머화를 가능하게 하기에 충분한 gp120 및 gp41 의 일부분을 함유하는 방법.
- 제 12 항에 있어서,EV 뉴클레오타이드가 HIV 피막 단백질 코드화 뉴클레오타이드의 KpnI-BsmI 제한단편을 함유하는 방법.
- 제 9 항에 있어서,EV 뉴클레오타이드가 지리적으로 제한된 지역으로 부터의 HIV 바이러스로 감염된 환자로부터 또는 상이한 클래드로 부터의 HIV 바이러스에 의해 감염된 환자로부터 분리되는 방법.
- 제 9 항에 있어서,백신이 재조합 바이러스에 의해 발현된 피막 단백질 변이체를 함유하는 방법.
- 제 9 항에 있어서,배합단계가 약제학적으로 허용되는 담체, 아쥬번트 및 항바이러스성 화학요법제 화합물중의 적어도 하나를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 9 항에 따르는 방법에 의해 수득된 폴리엔브 백신.
- 포유동물에게 제 1 항 내지 8 항중의 어느 하나에 따르는 폴리엔브 백신의 유효량을 투여함을 특징으로 하여, 포유동물에서 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 체액성 또는 세포성 면역반응, 또는 둘다를 유도하는 방법.
- 제 18 항에 있어서,재조합 바이러스가 백시니아 바이러스이고, 폴리엔브 백신은 피하로 투여하는 방법.
- 제 18 항에 있어서,포유동물에게 제 1 항 내지 8 항중의 어느 하나에 따르는 또 다른 폴리엔브 백신의 유효량을 추가로 투여하고, 여기에서 다른 폴리엔브 백신의 재조합 바이러스는 제 18 항의 백신의 재조합 바이러스와는 상이한 종인 방법.
- 제 18 항에 있어서,추가로 (i) 적어도 하나의 재조합 HIV env 단백질의 유효량을 투여하거나, (ii) 재조합 HIV env 단백질을 위한 발현에 대해 코드화한 적어도 하나의 DNA 벡터의 유효량을 투여하거나, 또는 (iii) 둘다의 방법에 의해 체액성 또는 세포성 면역반응 또는 둘다를 초회자극(priming) 또는 추가자극(boosting)시키고, 여기에서 DNA벡터는 재조합 HIV env 단백질 투여 전, 후 또는 동시에 투여될 수 있는 방법.
- 제 21 항에 있어서,재조합 HIV env 단백질이 아쥬번트와의 혼합물 형태이거나, 근육내 투여되거나, 둘다이거나; 또는 DNA 벡터를 유전자총으로 투여하는 방법.
- 제 24 항에 있어서,동물 발현 조절서열이 사이토메갈로바이러스 즉시형 조기(CMV) 프로모터이고, 바이러스 발현 조절서열이 백시니아 바이러스 조기 프로모터, 백시니아 바이러스 후기 바이러스 또는 둘다인 이작용성 플라스미드.
- 제 24 항에 있어서,HIV 피막 단백질의 피막 단백질 변이체의 가변성 및 불변성 부위 둘다를 코드화한 env 변이체(EV) 뉴클레오타이드인 이종 유전자를 함유하는 이작용성 플라스미드.
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